Methodenartikel

Paradigmen für die Verhaltensbewertung im Drosophila-Modell der Autismus-Spektrum-Störung

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DOI:

10.3791/66649

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6. September 2024

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1Department of Bioscience and Biotechnology, Indian Institute of Technology Kharagpur

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Autismus-Spektrum-Störung (ASS) ist mit einer Beeinträchtigung des sozialen und kommunikativen Verhaltens und dem Auftreten von sich wiederholendem Verhalten verbunden. Um die Wechselbeziehung zwischen ASD-Genen und Verhaltensdefiziten im Drosophila-Modell zu untersuchen, werden in dieser Arbeit fünf Verhaltensparadigmen zur Untersuchung von sozialem Abstand, Aggression, Balz, Pflege und Gewöhnungsverhalten beschrieben.

Zusammenfassung

Die Autismus-Spektrum-Störung (ASS) umfasst eine heterogene Gruppe von neurologischen Entwicklungsstörungen mit häufigen Verhaltenssymptomen, darunter Defizite in der sozialen Interaktion und Kommunikationsfähigkeit, verstärkte eingeschränkte oder sich wiederholende Verhaltensweisen und in einigen Fällen auch Lernbehinderung und motorisches Defizit. Drosophila diente als beispielloser Modellorganismus für die Modellierung einer großen Anzahl menschlicher Krankheiten. Da viele Gene mit ASS in Verbindung gebracht wurden, haben sich Fruchtfliegen als leistungsstarke und effiziente Methode erwiesen, um die Gene zu testen, die angeblich an der Störung beteiligt sind. Da Hunderte von Genen mit unterschiedlichen funktionellen Rollen an ASD beteiligt sind, ist ein einzelnes genetisches Fliegenmodell von ASD nicht möglich; Stattdessen sind einzelne genetische Mutanten, Gen-Knockdowns oder Überexpressions-basierte Studien der Fliegenhomologe von ASD-assoziierten Genen die üblichen Mittel, um Einblicke in die molekularen Signalwege zu gewinnen, die diesen Genprodukten zugrunde liegen. In Drosophila gibt es eine Vielzahl von Verhaltenstechniken, die ein leichtes Auslesen von Defiziten in bestimmten Verhaltenskomponenten ermöglichen. Es hat sich gezeigt, dass der Assay des Sozialraums sowie Aggressions- und Balztests bei Fliegen nützlich sind, um Defekte in der sozialen Interaktion oder Kommunikation zu beurteilen. Das Fellpflegeverhalten bei Fliegen ist eine hervorragende Lektüre für sich wiederholendes Verhalten. Der Gewöhnungsassay wird bei Fliegen verwendet, um die Fähigkeit zum Gewöhnungslernen abzuschätzen, die bei einigen ASD-Patienten beeinträchtigt ist. Eine Kombination dieser Verhaltensparadigmen kann verwendet werden, um eine gründliche Beurteilung des menschlichen ASD-ähnlichen Krankheitszustands bei Fliegen vorzunehmen. Unter Verwendung von Fmr1-mutierten Fliegen, der Rekapitulation des Fragile-X-Syndroms beim Menschen und des POGZ-homologen Row-Knockdowns in Fliegenneuronen haben wir quantifizierbare Defizite in den Bereichen Social spacing, Aggression, Balzverhalten, Pflegeverhalten und Gewöhnung gezeigt. Diese Verhaltensparadigmen werden hier in ihrer einfachsten und unkompliziertesten Form demonstriert, mit der Annahme, dass dies ihre breite Verwendung für die Forschung zu ASS und anderen neurologischen Entwicklungsstörungen in Fliegenmodellen erleichtern würde.

Einleitung

Die Autismus-Spektrum-Störung (ASS) umfasst eine heterogene Gruppe von neurologischen Störungen. Sie umfasst eine Reihe komplexer neurologischer Entwicklungsstörungen, die durch multikontextuelle und anhaltende Defizite in der sozialen Kommunikation und sozialen Interaktion sowie durch das Vorhandensein von eingeschränkten, sich wiederholenden Verhaltens- und Aktivitätsmustern und -interessen gekennzeichnetsind 1. Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation (WHO) wird weltweit bei 1 von 100 Kindern ASS diagnostiziert, wobei das Verhältnis von Männern zu Frauen bei 4,22 liegt. Die Erkrankung macht sich im zweiten oder dritten Lebensjahr bemerkbar. ASD-Kinder zeigen ein mangelndes Interesse an sozial-emotionaler Reziprozität, nonverbaler Kommunikation und Beziehungsfähigkeit. Sie zeigen sich wiederholende Verhaltensweisen wie stereotype motorische Bewegungen, unflexible und ritualisierte Routinebefolgung und intensive Konzentration auf eingeschränkte Interessen. ASD-Kinder zeigen ein hohes Maß an Reaktion auf Berührung, Geruch, Geräusche und Geschmack, während die Schmerz- und Temperaturreaktion vergleichsweise gering ist1. Die Penetranz dieser Störung ist auch bei verschiedenen Patienten, die an ASS leiden, unterschiedlich und daher nimmt die Variabilität zu.

Die derzeitige klinische Diagnose von ASD basiert auf der Verhaltensbewertung der Personen, da es keinen bestätigenden, auf Biomarkern basierenden oder gemeinsamen genetischen Test gibt, der alle Formen von ASDabdeckt 3. Die Entschlüsselung der genetischen und neurophysiologischen Grundlagen wäre hilfreich, um Behandlungsstrategien zu entwickeln. In den letzten zehn Jahren hat eine große Anzahl von Forschungsarbeiten zur Identifizierung von Hunderten von Genen geführt, die entweder gelöscht oder mutiert sind oder deren Expressionsniveaus bei ASD-Patienten verändert sind. Die laufende Forschung konzentriert sich auf die Validierung des Beitrags dieser Kandidatengene anhand von Modellorganismen wie der Maus oder Fruchtfliege, bei denen diese Gene ausgeschaltet oder ausgeschaltet werden, gefolgt von Tests auf ASD-ähnliche Verhaltensdefizite und der Aufklärung der zugrunde liegenden genetischen und molekularen Signalwege, die die Anomalien verursachen. Ein Mausmodell, das Kopienzahlvariationen (CNVs) in den humanen Chromosomenloci 16p11.2 rekapituliert, zeigt einige der ASD-Verhaltensdefekte 4,5,6. Die pränatale Exposition gegenüber einem teratogenen Medikament, Valproinsäure (VPA), ist ein weiteres Mausmodell, das Merkmale aufweist, die der menschlichen ASDähneln 7,8. Darüber hinaus gibt es eine Reihe von Mausmodellen, die genetischen Syndrom-assoziierten Autismus aufweisen, z. B. syndromale Einzelgenmodelle, die durch Mutationen in Fmr1, Pten, Mecp2, Cacna1c verursacht werden, und nicht-syndromale Einzelgenmodelle, die durch Mutationen in Genen wie Cntnap2, Shank, Neurexin oder Neuroligin-Genen verursacht werden5.

Die Fruchtfliege (Drosophila melanogaster) ist ein weiterer prominenter Modellorganismus für die Untersuchung der zellulären, molekularen und genetischen Grundlagen einer Vielzahl von menschlichen Erkrankungen9, einschließlich ASD. Drosophila und Mensch teilen hochkonservierte biologische Prozesse auf molekularer, zellulärer und synaptischer Ebene. Fruchtfliegen wurden erfolgreich in ASD-Studieneingesetzt 10,11,12 um Gene zu charakterisieren, die mit ASDs in Verbindung stehen, und ihre genaue Rolle bei der Synaptogenese, der synaptischen Funktion und Plastizität, dem Aufbau neuronaler Schaltkreise und der Reifung zu entschlüsseln; Es wurde festgestellt, dass Fliegenhomologe von ASD-assoziierten Genen eine Rolle bei der Regulation von sozialem und/oder repetitivem Verhalten spielen 11,13,14,15,16,17,18,19,20,21. Die Fruchtfliege hat auch als Modell für das Screening von ASD-Genen und deren Varianten gedient 15,22,23. Die größte Herausforderung in der ASD-Forschung an Fliegen besteht darin, dass es im Gegensatz zu anderen Krankheitsmodellen kein einzelnes ASD-Fliegenmodell gibt. Um die Auswirkungen von Mutationen oder dem Ausschalten eines bestimmten ASD-Gens zu verstehen, muss ein Forscher validieren, ob die Verhaltensphänotypen die Symptome von ASD-Patienten ausreichend nachahmen, und dann dazu übergehen, die molekularen oder physiologischen Grundlagen der Phänotypen zu verstehen.

Daher ist der Nachweis von ASD-ähnlichen Phänotypen für die ASD-Forschung im Fliegenmodell von entscheidender Bedeutung. Im Laufe der Jahre ist eine Handvoll Verhaltenstechniken entstanden, die es uns ermöglichen, Anomalien wie Defizite im Sozialverhalten/in der Interaktion, in der Kommunikation, in sich wiederholenden Verhaltensweisen und in der Reaktionsfähigkeit auf Reize zu erkennen. Darüber hinaus wurden in verschiedenen Labors verschiedene Modifikationen und Upgrades dieser Verhaltenstechniken vorgenommen, um spezifischen Anforderungen wie Upscaling, Automatisierung von Assays, Auslesungen, Quantifizierungs- und Vergleichsmethoden gerecht zu werden. In diesem Videoartikel werden die grundlegendsten Versionen von fünf Verhaltensparadigmen demonstriert, die in Kombination verwendet werden können, um ASS-ähnliche Verhaltensergebnisse auf einfachste Weise zu erkennen.

Aggression ist ein evolutionär konserviertes angeborenes Verhalten, das das Überleben und die Fortpflanzung beeinflusst24. Aggressives Verhalten gegenüber Artgenossen wird sowohl durch die "Motivation zur Sozialisation"25,26 als auch durch die "Kommunikation"27 beeinflusst, die beide bei ASS-Betroffenen beeinträchtigt sind. Aggressives Verhalten ist bei Drosophila gut beschrieben und seine Quantifizierbarkeit durch den robusten Aggressionsassay 28,29,30 und eine gut verstandene genetische und neurobiologische Basis 31 macht es zu einem geeigneten Verhaltensparadigma32 für die Beurteilung des ASD-Phänotyps in einem Fliegenmodell. Aggression wird durch soziale Isolation abseits eines sozialen Umfelds beeinflusst, was zu verstärkter Aggression führt; Das Gleiche wurde beobachtet, wenn männliche Fliegen einige Tage lang isoliert gehalten wurden33,34. Ein weiterer Verhaltensassay, der die Geselligkeit bei Fliegen quantifiziert, ist der Social Space Assay35, der die Entfernungen zwischen den nächsten Nachbarn und die Abstände zwischen den Fliegen in einer kleinen Gruppe von Fliegen misst, wodurch er sich perfekt zum Testen der Rollen von ASD-Gen-Orthologen in Fliegen 12,21,36,37 sowie umweltinduzierten ASD-Fliegenmodellen38 eignet. 39. Urheberrecht

Der Drosophila-Balztest ist ein weiteres Verhaltensparadigma, das häufig verwendet wird, um Veränderungen in sozialen und kommunikativen Fähigkeiten durch Schaltkreis- oder Genmanipulation zu testen, einschließlich Autismus-bezogener Gene 18,19,21,40. Sich wiederholende Verhaltensmuster sind bei ASD-Patienten weit verbreitet, was sich bei Fliegen durch Pflegeverhalten widerspiegelt - eine Reihe von unterschiedlichen, stereotypen Handlungen, die zum Reinigen und zu anderen Zwecken ausgeführt werden. Es wurde erfolgreich eingesetzt, um die Auswirkungen von ASD-Genmutationen bei Fliegen21,41 sowie die Exposition gegenüber Chemikalien38,39 zu untersuchen. Mehrere Fortschritte und Automatisierungen im Assay wurden bereits vor 16,41,42,43 beschrieben; Hier demonstrieren wir das grundlegendste Assay-Muster, das einfach zu übernehmen und zu quantifizieren ist.

Es ist bekannt, dass ASD die Gewöhnungsfähigkeit, das Lernen und das Gedächtnis bei einigen Patientenbeeinflusst 44,45,46,47,48,49,50, ASD-Modellorganismen 51,52 und auch Defizite in verschiedenen Geruchsverhaltensweisen verursacht50. Die Gewöhnung an Drosophila-Light-Off-Sprünge wurde zuvor verwendet, um nach ASD-Genenzu suchen 23. Die Gewöhnung kann durch ein einfaches Verfahren des olfaktorischen Gewöhnungsassays 53,54,55 bestimmt werden. Wir beschreiben das Verfahren zur Induktion der olfaktorischen Gewöhnung und testen das Ergebnis unter Verwendung eines klassischen Y-Labyrinth-basierten binären Odor-Choice-Assays56, der zur Erkennung von Defekten in der Gewöhnungsstörung bei ASD-Genmutanten oder Gen-Knockdown-Bedingungen verwendet werden kann. Um zu beurteilen, ob der Einfluss einer Mutation (oder eines Gen-Knock-downs) oder einer pharmakologischen Behandlung auf das Verhalten einer Fliege auf einen ASD-ähnlichen Phänotyp hinausläuft, kann man eine Kombination dieser 5 hier beschriebenen Assays verwenden.

Protokoll

In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zu allen Materialien und Reagenzien, die in diesem Protokoll verwendet werden.

1. Aggressions-Assay

  1. Vorbereitung der Aggressions-Assay-Arena
    1. Nehmen Sie eine Standard-24-Well-Platte (Abbildung 1A) und verwenden Sie jede Vertiefung der Platte als eine einzelne "Arena" (Abbildung 1B) für die Aggression der Fliegen. Füllen Sie die Hälfte jeder Mulde mit normalem Fliegenfutter und lassen Sie es über Nacht trocknen.
      HINWEIS: Optional kann ein Brennpunkt für Aggression in die Arena eingebaut werden, z. B. ein Punkt Hefepaste oder ein enthauptetes Weibchen, um die männliche Aggression zu gewährleisten.
    2. Nehmen Sie eine durchsichtige Kunststoff-/Acrylplatte, die ausreicht, um die Oberfläche von etwa drei bis vier Vertiefungen zu bedecken. Perforieren Sie das Blech, um eine kleine Öffnung von ~2,5 mm Durchmesser zu erhalten, durch die Sie einzelne Fliegen in die Vertiefungen einführen können.
  2. Vorbereitung des Fliegensaugers
    1. Nehmen Sie einen 30-50 cm langen Gummi-/Silikonschlauch (Abbildung 1C1).
    2. Nehmen Sie eine 200 μl (oder 1.000 μl) Pipettenspitze und schneiden Sie ~1 cm von der schmalen Spitze ab. Führen Sie das abgeschnittene Ende an einem Ende des Gummischlauchs ein; Diese Spitze ist das "Mundende", das für die Aspiration im Mund verwendet wird.
    3. Nimm eine weitere Pipettenspitze und schneide das schmale Ende dieser Spitze ab, um eine Öffnung zu schaffen, durch die eine Fliege eindringen kann. Führen Sie den Boden dieser Pipettenspitze in das hintere Ende des Röhrchens ein; Dies ist das "Fliegende" des Aspirators, von wo aus die Fliege angesaugt wird (Abbildung 1C2).
    4. Legen Sie ein Stück Netztuch oder eine dünne Schicht Baumwolle auf das "fliegende Ende" des Schlauchs - an der Verbindungsstelle zwischen dem Schlauch und der Spitze. Stellen Sie sicher, dass eine in die Pipettenspitze aspirierte Fliege in der Spitze vor dem Netz gefangen bleibt.
    5. Versiegeln Sie die Verbindungsstellen zwischen dem Rohr und den Pipettenspitzen mit Parafilm.
  3. Vorbereitung von Eingehäuseröhrchen und Fläschchen mit Gruppengehäuse
    1. Vorbereitung von einhausigen Rohren
      1. Geben Sie fast 500 μl frisch zubereitetes Fliegenfutter in ein 2-ml-Mikrofugenröhrchen (Abbildung 1D). Ziehe die Lebensmittel mit einer Mini-Zentrifuge in den unteren Teil des Röhrchens.
      2. Stellen Sie die Lebensmittel so ein, dass sie bei Raumtemperatur fest werden, indem Sie den Deckel über Nacht offen lassen. Decken Sie die Röhren mit einem feinen Stück Stoff ab, um zu verhindern, dass streunende Fliegen in die Röhren eindringen.
      3. Perforieren Sie die Deckel der Mikrofuge-Röhrchen mit Nadeln für die Luftzirkulation und schließen Sie die Deckel, nachdem die Lebensmittel fest geworden sind.
    2. Vorbereitung von Fläschchen für die Gruppenhaltung
      1. Nehmen Sie normale Fliegenfläschchen und füllen Sie ein Minimum der Fläschchen mit frisch zubereiteten Lebensmitteln (Abbildung 1D).
  4. Vorbereitung der Fliegen vor dem Experiment
    1. Bewahren Sie Fliegenlinien der gewünschten Genotypen in normalen Glas-/Plastikflaschen mit Standard-Fliegenfutter in einem Inkubator bei 25 °C in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus auf.
    2. Sammeln Sie neu eingeschlossene (0 bis 24 h) Fliegen des gewünschten Genotyps und trennen Sie sie unter Kohlendioxid-Narkose mit einem Stereomikroskop.
    3. Die Hälfte der männlichen Fliegen wird einzeln in "Ein-Gehäuse-Röhrchen" eingesetzt. Halten Sie die andere Hälfte der männlichen Fliegen in einer Gruppe von 10 Fliegen, während die weiblichen Fliegen in normalen "Gruppenhaltungsfläschchen" gehalten werden, um einen sozialen Zustand zu schaffen. Lagern Sie alle Röhrchen und Durchstechflaschen 5 Tage lang bei 25 °C.
      HINWEIS: Halten Sie eine Temperatur von 24-25 °C und ~50% Luftfeuchtigkeit im Verhaltensraum aufrecht. Die verwendeten Fliegenstämme waren: w1118 und FMR trans-heterozygote mutierte Fliegen (Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M)57. Fmr1-Fliegen , die 5 Tage lang isoliert gehalten wurden, zeigen signifikant verminderte Aggressionsschübe gegenüber einem anderen Männchen (Abbildung 1E).
  5. Durchführung des Aggressionsverhaltensexperiments
    1. Führen Sie das Aggressionsexperiment während des Zeitfensters ZT0-ZT3 durch, da die Fliegen zu dieser Tageszeit die maximale Aktivität zeigen.
      HINWEIS: ZT=Zeitgeberzeit in einem Standard-Hell-Dunkel-Zyklus von 12 Stunden; ZT0= leuchtet an, d.h. der Beginn der Lichtphase, ZT3= 3 h nach Beginn der Lichtphase usw. ZT12= leuchtet aus.
    2. Übertragen Sie zwei männliche Fliegen entweder aus den Einzel- oder Gruppenhaltungskammern durch die Mundaspirationsmethode in die Aggressionsarena durch das Loch im Deckel; Schieben Sie das Loch sofort weg, um sicherzustellen, dass die Fliegen nicht entkommen können.
    3. Lassen Sie die Fliegen 1-2 Minuten in der Arena akklimatisieren. Starten Sie einen Timer für 20 Minuten. Nehmen Sie die Fliegen während der gesamten 20 Minuten auf Video auf, indem Sie eine Kamera oder ein Mobiltelefon mit einem Ständer genau senkrecht über der Arena platzieren. Stellen Sie sicher, dass die Arten von aggressiven Kämpfen im Video sichtbar sind.
      HINWEIS: Sorgen Sie für eine klare Ausleuchtung der Arena und vermeiden Sie, dass Blendung/Reflexion vom Deckel direkt auf das Objektiv der Kamera fällt.
    4. Wiederholen Sie das Experiment mit 15-20 Fliegenpaaren für jeden Genotyp und jede Art von Haltungszustand.
      HINWEIS: Unbewusste Verzerrungen können durch Doppelverblindung der Kontroll- und Testfliegen sowie von Videodateien, die zu mehreren Genotypen gehören, negiert werden.
  6. Analyse der Aggressions-Assay-Daten
    1. Übertragen Sie die Videodateien auf einen Computer mit ausreichend großem Bildschirm, damit die aggressiven Kämpfe sichtbar sind.
    2. Spielt das Video ab und zählt die Gesamtzahl der aggressiven Kämpfe in einer Zeitspanne von 20 min58,59.
    3. Stellen Sie die Daten jedes Genotyps und jedes Haltungsmusters in einer Tabelle zusammen und organisieren Sie sie in einer Tabelle und führen Sie Datenanalysen mit einer beliebigen Statistiksoftware durch. Führen Sie einen zweiseitigen t-Test durch, und stellen Sie die Daten als Quader und Whisker dar.

2. Assay für den sozialen Raum

HINWEIS: Das hier beschriebene Analyseprotokoll, die Arena und die Analyse wurden bereits beschrieben60,61.

  1. Vorbereitung des Social Space Assay (SSA) Arena
    1. Platzieren Sie die beiden dreieckigen Acryl-Abstandhalter (Höhe = 8,9 cm, Basis = 6,7 cm und Dicke = 0,3 cm) flach auf einer rechteckigen Glasscheibe (13,5 cm x 10,4 cm, Dicke 0,3 cm), so dass die rechten Winkel der Acryl-Abstandhalter mit den Ecken der Glasscheibe ausgerichtet sind (Abbildung 2A).
    2. Legen Sie zwei rechteckige Acryl-Abstandhalter (6,7 cm x 1,5 cm, Dicke = 0,3 cm) flach auf die Glasscheibe, ausgerichtet auf die Füße der beiden dreieckigen Abstandhalter. Nach dieser Anordnung ist zu bestätigen, dass die vier Acryl-Abstandhalter auf der rechteckigen Glasscheibe eine dreieckige Arena (~2,16 cm²61) umgeben, die nicht von Abstandhaltern verdeckt ist (Abbildung 2A,B). Kleben Sie einen Aufkleber eines Lineals (Abbildung 2C) auf einen der dreieckigen Abstandshalter und achten Sie darauf, dass er von oben sichtbar ist.
    3. Platzieren Sie nun eine zweite rechteckige Glasscheibe (13,5 cm x 10,4 cm, Dicke 0,3 cm) so auf die Acryl-Abstandhalter, dass sie mit der Glasscheibe unten ausgerichtet ist; Acryl-Abstandhalter würden zwischen dem Glasraum eingeklemmt werden, so dass in der Mitte zwischen zwei Glasscheiben ein dreieckiger Raum entsteht. Verwenden Sie vier kleine Heftklammern, um die Scheiben und Abstandshalter zu halten.
  2. Vorbereitung der Fliegen für SSA
    1. Sammeln Sie neu eingeschlossene (0 bis 24 h) Fliegen des gewünschten Genotyps und trennen Sie sie unter kalter Narkose mit einem Stereomikroskop vom Geschlecht.
      HINWEIS: Kühlen Sie das Kälteanästhesiegerät (es kann eine Petrischale verwendet werden) in einem -20 °C Inkubator. Legen Sie die Fliegen in leere Fläschchen, tauchen Sie diese Fläschchen in Eis (in einen Eiskübel), bis die Fliegen unbeweglich werden, legen Sie sie auf die kalte Petrischale und beginnen Sie mit dem Sortieren.
    2. Lagern Sie die männlichen und weiblichen Fliegen getrennt für 24 h in Futterfläschchen in einem 25 °C Inkubator mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus.
      HINWEIS: Für die hier gezeigten Experimente wurden Fliegenstämme w1118 und FMR-transheterozygote mutierte Fliegen (Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M) verwendet.
  3. Durchführen des SSA-Experiments
    1. Behalten Sie die gleichen experimentellen Bedingungen wie beim Aggressionsassay bei (Temperatur: 24-25°C, Luftfeuchtigkeit ~ 50%) und führen Sie das Experiment während des Zeitfensters ZT0-ZT3 durch.
    2. Entfernen Sie die untere rechte Binderklammer und verschieben Sie den rechteckigen Abstandshalter leicht nach außen, so dass zwischen den beiden rechteckigen Abstandshaltern ein Spalt (~0,5 cm) entsteht.
    3. Fliegen (am Vortag gesammelt) aus dem Futterfläschchen in ein leeres Fläschchen umfüllen. Übertragen Sie sie in die soziale Raumarena (den dreieckigen Bereich) durch sanftes Aspirieren durch den zwischen den rechteckigen Abstandshaltern geschaffenen Raum. Schließen Sie den Raum sofort, indem Sie den rechteckigen Abstandshalter und den Bindeclip wieder in ihre Position schieben und sicherstellen, dass kein Platz mehr bleibt, aus dem die Fliegen entweichen können.
    4. Indem Sie die Kammer in der aufrechten Position halten, klopfen Sie die Kammer vorsichtig 3x auf ein weiches Pad, um sicherzustellen, dass sich zu Beginn des Experiments alle Fliegen am Boden der Kammer befinden.
    5. Klemmen Sie die SSA-Kammer in die aufrechte Position und starten Sie den Timer. Machen Sie nach 20 Minuten ein klares Foto von der Arena, wenn sich die Fliegen an ihren Positionen in der Arena niederlassen und minimale Bewegungen zeigen. Vermeiden Sie Blendung und unregelmäßige Beleuchtung.
    6. Wiederholen Sie das Experiment 3x für dieselbe Fliegenpopulation, indem Sie die Fliegen hämmern und die Schritte aus den Schritten 2.3.5 bis 2.3.7 (interne Replikate) wiederholen. Wiederholen Sie 3x mit einer anderen Population von Fliegen desselben Genotyps/Zustands (unabhängige Wiederholungen).
      HINWEIS: Frieren Sie die Assay-Kammer ein, um die Fliegen aus der Kammer zu entfernen. Wischen Sie die Glas- und Kunststoffoberflächen mit Ethanol ab, um alle Gerüche zu entfernen, nachdem eine Versuchsrunde mit einer Gruppe von Fliegen durchgeführt wurde.
  4. Analyse der Assay-Daten aus dem Sozialraum
    1. Analysieren Sie die Bilder in der ImageJ62-Software , und listen Sie die Entfernungen zwischen den Flügen zum nächsten Nachbarn auf, wie zuvor beschrieben61.
    2. Führen Sie statistische Analysen durch und zeichnen Sie Diagramme mit Statistiksoftware.
      HINWEIS: Bei den für den hier beschriebenen SSA-Assay verwendeten Fliegenstämme handelte es sich um w1118 und Fmr1 trans-heterozygote mutierte Fliegen (Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M)57. Fmr1-Fliegen zeigen einen signifikant vergrößerten Abstand zu den nächsten Nachbarn (Abbildung 2D).

3. Balz-Assay

  1. Die Balzkammer
    1. Setze alle vier Teile der Balzkammer (Abbildung 3A) in der in Abbildung 3B gezeigten Reihenfolge zusammen. Jede Perforation der zentralen Scheibe, die zwischen dem Deckel und den Basisstücken eingeklemmt ist, fungiert als "Balzkammer" (Abbildung 3C).
  2. Gewinnung von vorverpaarten Weibchen
    1. Starten und pflegen Sie mehrere Kulturflaschen mit CS-Fliegen (Canton S, Wildtyp) mit ~60-100 männlichen und weiblichen Fliegen in jeder Futterflasche.
    2. Wenn erwachsene Fliegen schlüpfen, entsorgen Sie alle erwachsenen Fliegen und übertragen Sie die aus diesen Flaschen schlüpfenden Fliegen alle 2-3 Stunden in neue Futterfläschchen, die mit einer winzigen Menge Hefepaste ergänzt werden.
      HINWEIS: Vermeiden Sie eine Überfüllung der Durchstechflaschen. Achten Sie darauf, keine alten Fliegen, Larven oder Puppen in das Paarungsfläschchen zu übertragen.
    3. Inkubieren Sie diese "Paarungsfläschchen" 4 Tage lang, um sicherzustellen, dass sich alle Weibchen gepaart haben.
  3. Vorbereitung von Einhausungsröhrchen für männliche
    1. Geben Sie fast 500 μl Fliegenfutter in jedes 2-ml-Mikrofuge-Röhrchen. Ziehe die Lebensmittel mit einer Minizentrifuge in den unteren Teil des Röhrchens.
    2. Lassen Sie die Lebensmittel über Nacht erstarren, schneiden Sie den Deckel des Mikrofugenröhrchens ab, decken Sie es mit Parafilm ab und perforieren Sie den Parafilm mit einer Nadel für die Luftzirkulation.
  4. Entnahme und Isolierung von jungfräulichen Männchen
    1. Kreuzungen mit 10-15 Männchen und 20-30 jungfräulichen Weibchen der gewünschten Genotypen in separaten Futterfläschchen einrichten.
    2. Sammeln Sie jungfräuliche Männchen der gewünschten Genotypen aus den Nachkommen und halten Sie sie einzeln in "Ein-Haltungs-Röhren" mit dem Aspirator. Sammeln Sie alle 5-6 Stunden neu geschlossene Männchen (bis zu 40-50 Männchen für jeden Genotyp) und isolieren Sie sie in einzelnen Röhrchen mit nur einer Haltung.
    3. Verschließen Sie den Deckel der Tube wieder mit dem Parafilm.
  5. Durchführung des Balz-Assay-Experiments
    1. Nach 5 Tagen Isolation der Testmännchen ist der Balztest während des Zeitfensters ZT0-ZT3 durchzuführen.
    2. Richten Sie die Videoaufzeichnungsgeräte frühzeitig ein und konzentrieren Sie sich dabei auf den Assay-Arbeitsbereich.
    3. Entnehmen Sie mit Hilfe eines Aspirators ein vorverpaartes Weibchen (6-10 Tage alt) aus den Paarungsfläschchen und legen Sie es in eine Balzkammer.
    4. Mit dem Aspirator wird ein Männchen (Kontroll-/Testfliege) vorsichtig aus dem Einzelgehäuseschlauch durch das Übertragungsloch in die Balzkammer mit dem einzigen vorverpaarten Weibchen übertragen. Drehen Sie den Deckel schnell, um die Kammer zu schließen.
    5. Video zeichnet das Verhalten der Fliegen 15 Minuten lang auf.
  6. Videodatenanalyse und Statistik
    1. Übertragen Sie die Videodateien auf einen Computer; Notieren Sie sich die Zeit, die das Männchen während 15 Minuten bei der Balz verbringt, indem Sie das Video manuell durchgehen.
    2. Berechnen Sie den Balzindex (CI) für jede männliche Fliege, der den Bruchteil (oder Prozentsatz) der Zeit angibt, die das Männchen 15 Minuten lang damit verbracht hat, das Weibchen zu umwerben.
    3. Zählen Sie die Gesamtzahl der Kopulationsversuche in 15 Minuten.
    4. Beachten Sie die Dauer der Zeitverzögerung, die das Männchen vor seinem ersten Versuch zu werben als Balzlatenz (CL) anzeigt.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, 40-60 Männer pro Zustand/Genotyp zu analysieren, um eine statistische Aussagekraft zu erreichen und die Konsistenz der CI-Ergebnisse zu bestimmen.

4. Assay des Fellpflegeverhaltens

  1. Arena für Assays für das Pflegeverhalten
    1. Verwenden Sie eine kleine kreisförmige Kammer mit einem Volumen von ~0,4 cm3 als Arena für die Aufzeichnung des Pflegeverhaltens.
      HINWEIS: Dieselbe Balzarena, die in Abschnitt 3 beschrieben ist, kann für die Untersuchung des Pflegeverhaltens verwendet werden.
    2. Da das Pflegeverhalten die Aufzeichnung der Bewegung feinerer Organe wie Beine beinhaltet, verwenden Sie hochauflösende oder kontrastreiche Videoaufnahmen. Um dieses Protokoll zu befolgen, verwenden Sie ein diffuses, glasbedecktes LED-Panel als gleichmäßig beleuchtete Fläche mit den Maßen 20 cm x 20 cm. Platzieren Sie die Balzkammer auf der Platte, um sicherzustellen, dass das Licht von unten durch die Kammer fällt.
  2. Vorbereitung der Fliegen vor dem Experiment
    1. Halten Sie experimentelle Genotyp-Fliegen in Lebensmittelflaschen bei 25 °C mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus.
    2. Sammeln Sie neu eingeschlossene (0 bis 24 h) Fliegen des gewünschten Genotyps und trennen Sie sie unter kalter Narkose mit einem Stereomikroskop, wie im Sozialraum-Assay beschrieben.
    3. Die männlichen Fliegen werden 24 Stunden lang in Röhrchen mit nur einem Gehäuse (wie im Aggressionstest verwendet) isoliert.
      HINWEIS: Für das hier gezeigte Experiment wurden folgende Fliegenstämme verwendet: W1118 und FMR trans-heterozygote mutierte Fliegen (Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M).
  3. Durchführung des Grooming-Verhaltens-Assays
    1. Halten Sie eine Temperatur von 24-25 °C und eine Luftfeuchtigkeit von ~ 50% aufrecht; Führen Sie das Experiment während des Zeitfensters ZT0-ZT316 durch.
    2. Bringen Sie ein Männchen mit einem Gehäuse aus einem Einhauseschlauch in die Fellpflegearena, indem Sie einen Aspirator verwenden. Schieben Sie das Loch im Deckel sofort weg, um sicherzustellen, dass die Fliegen nicht entweichen können.
    3. Platzieren Sie die Putzarena auf einer diffusen LED-Platte und lassen Sie die Fliege 1 Minute lang in der Arena akklimatisieren. Nehmen Sie die Fliege 10 Minuten lang auf Video auf, indem Sie die Kamera genau senkrecht über der Arena auf einem Ständer platzieren. Stellen Sie sicher, dass die Arten von Pflegekämpfen im Video sichtbar und quantifizierbar sind.
      HINWEIS: Das Fellpflegeverhalten umfasst das Reiben von Kopf, Augen, Antennen, Rüssel, Thorax, Bauch, Genitalien und Flügeln mit Beinen (erstes Paar: T1, zweites Paar: T2 oder drittes Beinpaar: T3). Die in dieser Studie berücksichtigten Parameter des Grooming-Verhaltens sind wie in Andrew et al. 41 beschrieben und in Abbildung 4 dargestellt.
    4. Wiederholen Sie den Versuch für jeden Genotyp.
    5. Analyse der Grooming-Verhaltensdaten
      1. Analysieren Sie die Videos und berechnen Sie die folgenden vier Parameter: Grooming-Index (Prozentsatz der Zeit, die für die Pflege aufgewendet wird); Grooming-Latenz (Zeit bis zum ersten Grooming-Kampf); Anzahl der Pflegekämpfe; und die durchschnittliche Dauer des Pflegekampfes (Gesamtdauer des Kampfes/Kampfanzahl).
      2. Markieren Sie einen einzelnen Putzkampf als beendet, wenn eine Fliege entweder keinen der Parameter mehr anzeigt und 2 s lang bewegungslos verharrt oder den Kampf stoppt und mindestens 4 Schritte geht.

5. Assay zur Geruchsgewöhnung

HINWEIS: Wie in Abbildung 5 gezeigt, muss die Endmontage am Tag des Y-Labyrinth-Assays54,56 erfolgen.

  1. Fliegen auf die Gewöhnung vorbereiten
    1. Aufziehen Sie Fliegen der gewünschten Genotypen für alle Experimente in einem Inkubator mit einer Umgebungstemperatur von 25 °C und 70% Luftfeuchtigkeit unter dem Standard 12 h Licht: 12h h Dunkelzyklus (LD).
    2. Sammeln Sie 0-12 h alte, neu geschlossene Fliegen und übertragen Sie ~30-40 Fliegen in eine frische mittelgroße Flasche mit einem festgezogenen Baumwollstopfen.
    3. Weisen Sie jeder Flasche Codes zu, um den Experimentator über die zu experimentierenden Genotypen blind zu halten.
  2. Induktion der olfaktorischen Gewöhnung
    1. Geben Sie 1 ml des bevorzugten Odoriermittels, verdünnt mit Paraffinflüssigkeit (leicht), in ein 1,5 mL Mikrofugenröhrchen. Für die Kontrolle verwenden Sie einfach 1 mL Paraffin-Flüssiglicht in einem 1,5 mL Mikrofugenröhrchen. Den Inhalt 10 Minuten lang in der Tube vortexen, um eine gleichmäßige Durchmischung zu gewährleisten, und dann mit gleichmäßig perforierter Plastikfolie abdecken.
      HINWEIS: Im Video wird 20% Ethylbutyrat verwendet.
    2. Verwenden Sie Draht, um die Röhrchen mit dem verdünnten Odoriermittel oder nur die Verdünnungsflüssigkeit in separate Medienflaschen mit Fliegen aufzuhängen.
    3. Decken Sie die Flaschen gut mit Watte ab und wickeln Sie sie dann mit Kraftpapier ein, um eine Diffusion des Geruchsdampfes zu verhindern. Kennzeichnen Sie die Kontroll- und geruchshaltigen Flaschen als naiv bzw. geruchsexponiert (habituiert). Bewahren Sie diese Induktionsflaschen 3 Tage lang in einem Inkubator unter den oben genannten Bedingungen auf.
  3. Vorbereitung der Fliegen und des Y-Labyrinth-Apparats
    1. Füllen Sie die Fliegen aus den Induktionsflaschen in Fläschchen um, die nur wassergetränktes Filterpapier enthalten.
    2. Lassen Sie sie vor dem Experiment ca. 16-18 Stunden bei Raumtemperatur hungern, um die Motivation zu steigern.
    3. Stellen Sie sicher, dass die Komponenten des Y-Labyrinth-Geräts sauber und geruchsfrei sind. Bauen Sie die vier Teile vertikal zusammen. Befestigen Sie die Kletterkammern am Y-Labyrinth, das dann mit der Oberseite des Adapters verbunden wird. Befestigen Sie den Boden des Y-Labyrinths fest mit dem Einführungsfläschchen, das als zentraler Stiel an der Unterseite dient, wie in Abbildung 5 gezeigt.
    4. Verbinden Sie das sich verjüngende Ende jeder Kletterkammer mit den Reagenzflaschen, die das Odormittel enthalten (10-3 Verdünnung mit destilliertem Wasser), mit geruchsfreien Silikonschläuchen.
    5. Pumpen Sie das Odormittel mit Hilfe einer Vakuumpumpe mit gleicher Durchflussrate (~120 mL/min) aus den Gasflaschen zu den beiden Armen des Y und lassen Sie es 15 Minuten lang sättigen, um die Konsistenz zu gewährleisten.
  4. Durchführung des klassischen Y-Labyrinth-Assays
    1. Führen Sie die ausgehungerten Fliegen jedes Fläschchens vorsichtig in das Eingangsfläschchen des Y-Labyrinth-Setups ein.
    2. Lassen Sie sie sich für eine kurze Zeit akklimatisieren; Verbinden Sie das Einführfläschchen mit dem Y-Maze-Adapter, um den Test zu starten. und lass die Fliegen die Y-Labyrinth-Arme erklimmen und in den beiden Sammelkammern gefangen werden. Legen Sie die Zeitdauer jedes Tests auf 1 Minute fest.
    3. Wenn der Vorgang abgeschlossen ist, klopfen Sie die Fliegen zurück an den Boden des Einführfläschchens und ändern Sie die Position der Arme des Y-Labyrinths, um eine seitliche Verzerrung zu vermeiden. Nehmen Sie vier Messungen für denselben Satz Fliegen vor.
    4. Notiere die Anzahl der Fliegen, die jeden der beiden Arme des Y-Labyrinths innerhalb der Zeitdauer erklimmen.
    5. Wiederholen Sie den Assay für mindestens 8 Chargen, um einen repräsentativen Datensatz zu erhalten.
  5. Analyse und Interpretation der gesammelten Daten
    1. Quantifizieren Sie die Ergebnisse, indem Sie den Performance Index (PI) berechnen, der als Differenz zwischen der Anzahl der Fliegen, die den Luftarm (A) wählen, und der Anzahl der Fliegen, die den Geruchsarm (O) wählen, als Bruchteil der Gesamtzahl der teilnehmenden Fliegen dargestellt werden kann.
    2. Verwenden Sie statistische Tests (ungepaarter Student's t-Test), um zu überprüfen, ob die PI von naiven und geruchsexponierten Fliegen signifikant ist.

Ergebnisse

Aggressions-Assay
Als Fliegen-ASD-Modell wurden Fmr1-mutierte Fliegen verwendet63,64. w1118 Männchen wurden als Kontrolle und Fmr1 trans-heterozygote Fmr1Δ113M/Fmr1Δ50M57 männliche Fliegen als Versuchsfliegen verwendet; Erwachsene Männchen wurden 5 Tage lang in Isolationsröhren untergebracht. Homotypische Männchen (gleicher Genotyp, gleiche Haltungsbedingungen) wurden in die Aggressionsarena eingeführt und ihr Verhalten wurde 20 Minuten lang aufgezeichnet. Für jeden Genotyp wurde die Gesamtzahl der aggressiven Kämpfe in 20 Minuten gezählt. Es wurde festgestellt, dass die Anzahl der aggressiven Kämpfe während 20 Minuten bei den mutierten Männchen signifikant reduziert war als bei den Kontrollmännchen (Abbildung 1E). Diese verminderte Aggressivität bei Fmr1-Fliegen könnte auf ein vermindertes Interesse an sozialer Interaktion mit einer anderen Fliege zurückzuführen sein. Im Gegensatz dazu zeigen Gruppen-/sozial untergebrachte Fmr1-mutierte männliche Fliegen vergleichbare Aggressionsanfälle wie die von sozial untergebrachten w1118 Fliegen (Daten nicht gezeigt), was wahrscheinlich auf eine positive Rolle des sozialen Umfelds bei der Induktion von Sozialverhalten hinweist.

Assay für den sozialen Raum
Der Sozialraum-Assay wurde bei w1118 und ASD-Modellfliegen (Fmr1Δ113M/Fmr1Δ50M) durchgeführt. Für jede Fliege wurde die Entfernung zum nächsten Nachbarn berechnet und für jeden Genotyp wurden 10 biologische Replikate durchgeführt. Die mutierten Fliegen weisen signifikant höhere Nearest-Neighbor-Entfernungen auf als die Kontroll-Pendants (Abbildung 2D), was auf eine Präferenz für eine größere Distanzierung zu anderen Fliegen hindeutet.

Balz-Assay
Der Balztest von männlichen Fliegen mit nur einem Haus wurde durchgeführt, um das angeborene Balzverhalten von zwei separaten ASD-Modellfliegen zu quantifizieren. Zunächst wurde das Balzverhalten von Fmr1-transheterozygoten Fliegen mit dem von w1118 verglichen; Fmr1-Fliegen zeigten einen signifikant niedrigeren Balzindex sowie eine reduzierte Anzahl von Kopulationsversuchen (Abbildung 3E1). In einem zweiten Experiment wurde row, ein Drosophila-Ortholog des humanen POGZ-Gens (ein weit verbreitetes ASD-Risikogen20), durch Expression einer kurzhaarigen microRNA gegen row in Pilzkörperneuronen unter Verwendung der MB247-GAL4-Treiberlinie ausgeschaltet. Diese Reihen-Knockdown-ASD-Modellfliegen wurden auf Defekte im angeborenen Balzmuster getestet; Der Balzindex und die Anzahl der Kopulationsversuche wurden aus 15-minütigen Videos berechnet. Die Reihen-Knockdown-Fliegen zeigten einen signifikant reduzierten Balzindex sowie die Anzahl der Kopulationsversuche (Abbildung 3E2), was auf ihre fehlerhafte Kommunikation mit Weibchen hinweist.

Pflegeverhalten
Das Fellpflegeverhalten wird als Auslese für sich wiederholendes Verhalten in Drosophilaverwendet 16,42,43. Das Fellpflegeverhalten wurde bei Fmr1-transheterozygoten Fliegen quantifiziert und mit dem von w1118 verglichen. Die Latenzzeit bis zur ersten Fellpflege ist bei Fmr1-Fliegen signifikant verringert, während die mittlere Dauer des Fellpflegetrainings und der Fellindex bei Fmr1-Fliegen signifikant erhöht sind (Abbildung 4C), was auf ein verbessertes (oder sich wiederholendes) Fellverhalten bei ASD-Modellfliegen hinweist. Im Gegensatz dazu wurde festgestellt, dass die Gesamtzahl der Fellanfälle bei den mutierten Fliegen im Vergleich zu den Kontrollfliegen nicht signifikant verändert war.

Geruchsgewöhnungs-Assay
Es wurde festgestellt, dass die Gewöhnung bei einer großen Anzahl von autistischen Personen defekt ist und sie kann als Assay für dasselbe bei Drosophilaverwendet werden 23. Hier wurde die olfaktorische Gewöhnung im ASD-Modell getestet, indem die Reihe in olfaktorischen lokalen Interneuronen, die von LN1-GAL4 gesteuert werden, niedergeschlagen wurde. Ein aversiver Geruchsstoff, 20% Ethylbutyrat, wurde in diesen Experimenten verwendet, um bei diesen Fliegen eine Gewöhnung zu induzieren. Die Ergebnisse zeigen, dass sich Ruder-Knockdown-Fliegen nach einer 3-tägigen Exposition gegenüber Geruchsstoffen nicht gewöhnten (die letzten beiden Balken in der Grafik in Abbildung 5E zeigen keinen signifikanten Unterschied zwischen naiven und gewöhnten Fliegen) im Vergleich zu Wildtyp-Fliegen, die nach 3-tägiger Exposition gegenüber Ethylbutyrat eine typische Gewöhnung zeigten (exponierte Fliegen zeigen einen signifikanten Rückgang des Leistungsindex im Vergleich zu naiven Fliegen). Dies deutet darauf hin, dass sich Ruder-Knockdown-Fliegen nach 3-tägiger Exposition gegenüber Ethylbutyrat nicht gewöhnen und von dem abstoßenden Geruchsstoff abgestoßen werden, was beweist, dass diese ASD-Fliegen gewöhnungsdefizient sind.

figure-results-1
Abbildung 1: Aggressionsarena und repräsentative Verhaltensmuster. (A) Der Aufbau der Aggressionsarena in einer 24-Well-Platte mit einem perforierten Deckel für den Fliegeneintritt. Einschub: Abmessungen einer einzelnen Arena mit Fliegenfutter darin. (B) Fotografie eines Röhrchens mit einem Gehäuse, das eine einzelne, isolierte männliche Fliege enthält, und eines Fläschchens mit Gruppengehäuse, das männliche und weibliche Fliegen enthält, das ein soziales Umfeld rekapituliert. (C) Ein Aspirator für den auf Mundaspiration basierenden Transfer von Fliegen. Gegenstände, die für den Zusammenbau eines Fliegensaugers erforderlich sind, wobei die Seiten des Rohrs für den Fliegeneintritt (Fliegenende) und die Seite, die in den Mund eingeführt werden soll (Mundende) (C1), und ein zusammengebauter Fliegensauger (C2) angegeben sind. (D) Repräsentative aggressive Verhaltensmuster zwischen Männchen: Annäherung, Flügelbedrohung, Fechten, Halten, Ausfallschritt, Boxen und Gerangel. (E) Fmr1-mutierte männliche Fliegen zeigen im Vergleich zu Kontrollen ein reduziertes aggressives Verhalten gegenüber anderen Männchen. Boxplot zeigt die Anzahl der aggressiven Anfälle bei sozial isolierten Männchen von w1118 (Kontrolle) im Vergleich zu Fmr1 trans-heterozygoten Fliegen (Fmr1Δ113M/Fmr1Δ50M). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-2
Abbildung 2: Aufbau der Assay-Arena im Sozialraum. (A) Diagramm mit Abmessungen und Anordnung von Glasscheiben und Acryl-Abstandshaltern. (B) Die endgültige Anordnung der Arenakomponenten, bei der die Acryl-Abstandshalter zwischen den Glasstücken eingeklemmt sind und unten einen kleinen Spalt für den Fliegeneintritt lassen. Der dreieckige Raum, der zwischen Glasstückchen und Abstandshaltern entsteht, ist die SSA-Arena für die Fliegen, hier können sich Fliegen nur in zwei Dimensionen bewegen. (C) Foto des endgültigen SSA-Arena-Aufbaus mit Fliegen in der Kammer. Abkürzung: SSA = Social Space Array. (D) Fliegen des ASD-Modells (Fmr1 transheterozygot) zeigen im Sozialraum-Assay im Vergleich zu w1118 eine erhöhte Distanzierung voneinander. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Balzarena und repräsentative Verhaltensmuster. Diagramme, die (A) das Design und (B) die Anordnung der Scheiben in einer Balz-Assay-Arena zeigen. (C) Foto der Balzarena nach abschließender Absprache. (D) Repräsentative Bilder, die die Verhaltensmuster eines naiven Männchens bei der Balz gegenüber einem verpaarten Weibchen zeigen: Jagen, Orientierung, Flügelflackern, Lecken, Versuch der Kopulation und Kopulation. (E) Plots, die den Balzindex und die Anzahl der Kopulationsversuche in zwei ASD-Modellen zeigen: (E1) Fmr1-mutierte Fliegen zeigen eine signifikante Verringerung des Balzindex und des Kopulationsversuchs im Vergleich zur w 1118-Kontrolle. (E2) Row-Knockdown-Fliegen wurden als weiteres ASD-Modell verwendet, bei dem row-shRNA inPilz-Körper-y-Neuronen exprimiert wurde (MB247-GAL4); Eine signifikante Verringerung des Balzverhaltens wurde beim Row Knockdown beobachtet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Arena-Aufbau und repräsentative Verhaltensmuster des Pflegeverhaltens. (A) Die scheiben- oder radförmige Arena (gleiche Balzarena in Abbildung 3) ist auf einer LED-Platte mit einem Diffusor für eine gleichmäßige Beleuchtung von unten aufgebaut und das Video wurde von oben aufgenommen. Dies gewährleistet einen höheren Kontrast, der für die Identifizierung feiner Bewegungen der Gliedmaßen während der Fellpflege erforderlich ist. (B) Fotografien von Fellpflegeverhaltensmustern, die bei erwachsenen männlichen Fliegen beobachtet werden. T1 = 1erstes Beinpaar, T2 = 2. Beinpaar, T3 = drittes Beinpaar. Für die Fellpflege in B wird eine intuitive abgekürzte Nomenklatur verwendet: T1-Kopf = Kopf mit den ersten Beinen gerieben; T1-T1 = erstes Paar aneinander geriebenes Beinpaar und so weiter. Abkürzung: LED = Leuchtdiode. (C) Diagramme mit den Ergebnissen des Fellpflegeassays, die an Fmr1-transheterozygoten Fliegen durchgeführt und mit w1118 verglichen wurden. Fmr1-mutierte Fliegen zeigten im Vergleich zur Kontrolle eine signifikant reduzierte Latenzzeit für den ersten Putzanfall, was auf einen frühen Beginn der Fellpflege hinweist. Darüber hinaus waren die mittlere Dauer der Fellpflege und der Fellindex in Fmr1-Mutanten signifikant erhöht, was auf ein verstärktes repetitives Verhalten bei ASD-Modellfliegen hinweist. Im Gegensatz dazu war die Gesamtzahl der Putzkämpfe bei den mutierten Fliegen im Vergleich zur Kontrolle nicht signifikant verändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5: Induktions- und Assay-Aufbau für die olfaktorische Gewöhnung und repräsentatives Ergebnis nach dem Assay. (A) Komponenten des binären Odor-Choice-Assay-Aufbaus: (A1) das Y-Labyrinth, (A2) der Adapter, (A3) die Anordnung dieser beiden, (A4) ein Paar Sammelröhrchen zur Befestigung an der Oberseite der Y-Labyrinth-Arme, (A5), die Glasflasche und die Glasröhrchen zur Aufbewahrung der Odorierlösung oder des Wassers, durch das Luft sprudelt, bevor sie in das Y-Labyrinth gelangt. (B) Einrichtung einer Fliegenfutterflasche zur Induktion der Geruchsgewöhnung; Das Cartoon-Diagramm (B1) zeigt, wie das odormittelhaltige Mikrofugenrohr an einem Kupferdraht in der Mitte der Flasche aufgehängt wird; (B2) Zum Schluss wird die Öffnung der Flasche mit Baumwolle abgedeckt und mit braunen Papierumschlägen verschlossen. (C) Foto der Gesamtanordnung des Y-Labyrinth-Setups. (D) Fotos, die die Verteilung der Fliegen in den Sammelkammern nach Beendigung eines Versuchs zeigen. (D1) Naive Fliegen (nur geruchloses Paraffin ausgesetzt, Kontrolle) zeigen eine Abstoßung gegenüber dem aversiven Geruchsstoff (20% Ethylbutyrat, das in dieser Studie zur Induktion der Gewöhnung verwendet wurde) und wählen den Arm des Y-Labyrinths, der mit normaler Luft gefüllt ist, während (D2) exponierte (habituierte) Fliegen sich gleichmäßig in beiden Armen verteilen. Abkürzung: ID = Innendurchmesser. (E) Die Ergebnisse des Geruchsgewöhnungstests von Ruder-Knockdown-Fliegen zeigten einen Gewöhnungsdefekt. Wildtyp-Fliegen (Kanton S) zeigten nach 3-tägiger Exposition gegenüber Ethylbutyrat eine signifikante Verringerung des Leistungsindex im Vergleich zu naiven Fliegen, was auf eine Gewöhnung hindeutet. Wenn Nachkommen von LN1-GAL4 x row-shRNA-Fliegen 3 Tage lang exponiert wurden, unterschied sich der Leistungsindex nicht signifikant von dem naiver Fliegen; Dies zeigt, dass sich diese Reihen-Knockdown-Fliegen nach 3-tägiger Exposition gegenüber dem Geruchsstoff nicht gewöhnten und ein menschliches ASD-ähnliches Symptom rekapitulierten. Abkürzungen: ASD = Autismus-Spektrum-Störung; shRNA = kurze Haarnadel-RNA. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Drosophila wird aufgrund eines hohen Grades an Konservierung von Gensequenzen zwischen Fliegen- und menschlichen Krankheitsgenen als guter Modellorganismus für die Erforschung humaner neurologischer Erkrankungen verwendet9. Zahlreiche robuste Verhaltensparadigmen machen es zu einem attraktiven Modell für die Untersuchung von Phänotypen, die sich in Mutanten manifestieren, die menschliche Krankheiten rekapitulieren. Da Hunderte von Genen an der Autismus-Spektrum-Störung (ASS) beteiligt sind, gibt es in keinem Modellorganismus ein gemeinsames ASD-Modell. Daher müssen die Forscher für jede Mutante zunächst ASD-ähnliche Phänotypen in der Fliege etablieren. In diesem Artikel haben wir versucht, den Prozess zu rationalisieren, indem wir die gemeinsame Verwendung von fünf Fliegenverhaltensparadigmen für eine solche Bewertung vorgeschlagen haben. Diese Paradigmen werden bei Fliegen eingesetzt, um die wichtigsten und häufig auftretenden Verhaltensdefizite von menschlichen ASD-Patienten zu bewerten: soziale und kommunikative Defizite, Verstärkung von sich wiederholenden Verhaltensweisen und ein Gewöhnungsdefekt. Wenn eine Mutation des Fliegengens Defekte in allen oder den meisten dieser fünf Paradigmen aufweist, könnte dies ein starker Hinweis auf ein ASD-ähnliches Szenario sein.

Die meisten der hier beschriebenen Verhaltensparadigmen wurden in der bisherigen Literatur mehrfach zur Lösung verschiedener Forschungsfragen verwendet. Es ist nicht ungewöhnlich, Unterschiede in den Techniken zwischen verschiedenen Studien zu finden. Die Optimierungen in den Techniken wurden vorgenommen, um dem Forschungsbedarf und den Anforderungen der zu lösenden spezifischen Fragestellung gerecht zu werden. Zum Beispiel kann im Balztest sowohl das angeborene als auch das erlernte Balzverhalten gegenüber einer Testerfliege quantifiziert werden, die ein unreifes Männchen65, ein jungfräuliches Weibchen66,67, ein vorverpaartes Weibchen 68,69,70, ein durch Erfrieren getötetes jungfräuliches Weibchen65 oder sogar ein enthauptetes Weibchen 19 sein kann. In der in dieser Arbeit beschriebenen Methode wurden vorverpaarte Wildtyp-Weibchen als Tester verwendet, um das Balzmuster einer männlichen ASD-Modellfliege zu überprüfen. Dieexuale Empfänglichkeit eines präpaarten Weibchens ist relativ geringer als die einer jungfräulichen Fliege71. Infolgedessen sind die Anzahl der männlichen Balzkämpfe und ihre Dauer eher für ein verpaartes Weibchen als für eine Jungfrau bestimmt; In ähnlicher Weise ist auch die Latenzzeit bis zur Kopulation länger als bei jungfräulichen Tester-Weibchen, in diesem Fall führt eine frühe Kopulation zu einem reduzierten Balzindex, was den Spielraum für einen effektiven Vergleich zwischen den Genotypen verringert. Daher bietet die Verwendung von vorverpaarten Weibchen als Tester eine bessere vergleichende Analyse des Balzverhaltens einer ASD-Fliege im Vergleich zu einer Wildtyp-Fliege. Auf der anderen Seite kann die Verwendung von jungfräulichen Weibchen zusätzliche Informationen liefern, die bei der Verwendung von verpaarten Weibchen maskiert werden können. Die Verwendung von verpaarten Weibchen kann auch das Balzverhalten der Männchen beeinflussen und verändern. Zusammenfassend wird vorgeschlagen, dass die Forscher ihre experimentelle Strategie und ihr Detail je nach Notwendigkeit des jeweiligen Experiments wählen.

Man muss hier vorsichtig sein, bevor man die Technik bei einem oder allen Fliegen-Homologen von ASD-Genen anwendet. All diese Verhaltensparadigmen werden von einer spezifischen und kleinen Anzahl von Neuronen reguliert. Die Expression eines bestimmten Gens muss zuerst etabliert werden, bevor man zu einem bestimmten Verhaltensparadigma übergeht. Wenn zum Beispiel das Fliegen-Homolog eines ASD-assoziierten Gens nicht in Pilzkörperneuronen oder glutamatergen Neuronen exprimiert wird, dann kann das Balz- und Pflegeverhalten in seiner Mutante nicht beeinflusst werden.

Ein weiterer Punkt, auf den Forscher achten müssen, ist, dass das Fehlen eines Defekts nicht immer bedeutet, dass die Mutation keine Rolle spielt. Zum Beispiel ist in den Grooming-Verhaltensexperimenten mit Fmr1-Mutanten die Gesamtanzahl der Grooming-Anfälle bei Mutanten nicht signifikant niedriger als bei Kontrollen, während andere Parameter wie der Grooming-Index usw. einen Defekt im Grooming-Verhalten zeigen. Dies könnte durch die Verlängerung jedes Grooming-Drills in Fmr1-Mutanten erklärt werden, was zu einer geringen Anzahl der Gesamt-Fights führt, obwohl die Gesamt-Fight-Dauer viel höher ist. Dies unterstreicht die Notwendigkeit der Quantifizierung mehrerer Parameter für jedes Verhaltensmuster. Darüber hinaus muss daran erinnert werden, dass der Begriff ASS ein breites Spektrum von Krankheiten umfasst, die durch Variationen in einem der Hunderte von Genen verursacht werden, was zu heterogenen Phänotypen mit unterschiedlicher Penetranz bei den betroffenen Personen führt. Zum Beispiel wird ein Gewöhnungsdefizit bei einigen Patienten beobachtet, aber nicht bei allen. Das Gleiche wäre in Fliegenmodellen der Krankheit zu erwarten.

Für die Analyse des aggressiven Verhaltens wurden in dieser Studie verschiedene Arten von aggressiven Parametern berücksichtigt: Ausfallschritt, Flügelbedrohung, Raufen usw. (Abbildung 1)30. Jeder Kampf muss identifiziert und gezählt werden, entweder als einzelner Kampftyp oder als Gesamtanzahl der Kämpfe. Es ist wichtig, sich zunächst mit den Aggressionsmustern männlicher Fliegen vertraut zu machen, die in59,72 beschrieben und in Abbildung 1 dargestellt sind. Bei der Zählung der Anzahl der aggressiven Kämpfe müssen der Start- und Endpunkt eines einzelnen Aggressionsereignisses klar identifiziert werden. Mehrere Arten von Aggressionsmustern können innerhalb eines einzigen Kampfes gezeigt werden, gefolgt vom Ende des Kampfes. Ein Aggressionskampf gilt als beendet, wenn eine Fliege entweder für 2 Sekunden aufhört, aggressives Verhalten oder Bewegung zu zeigen, oder den Kampf stoppt und anfängt, wegzulaufen.

Die meisten dieser Verhaltensparadigmen haben mehrere Variationen und Fortschritte, die von mehreren Labors beschrieben werden. Jede der spezifischen Modifikationen wurde entwickelt, um den Anforderungen eines bestimmten Zwecks gerecht zu werden. In ähnlicher Weise haben automatisierte und algorithmusbasierte Quantifizierungs- oder Analysetechniken diese Techniken von der Gefahr manueller Fehler befreit. In diesem Artikel wurden die grundlegendsten Techniken mit dem geringsten Materialbedarf demonstriert, in der Hoffnung, dass diese Techniken von der größtmöglichen Anzahl von Forschern leicht übernommen und verwendet werden können.

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Wir danken Mani Ramaswami (NCBS, Bangalore) und Baskar Bakthavachalu (IIT Mandi) für das Setup des Gewöhnungs- und Geruchsauswahl-Assays, Pavan Agrawal (MAHE) für seine wertvollen Vorschläge zum Aggressions-Assay, Amitava Majumdar (NCCS, Pune) für das Teilen seines Prototyps der Balz-Assay-Kammer und der Fmr1-Mutantenfliegenschnüre und Gaurav Das (NCCS, Pune) für die Bereitstellung der MB247-GAL4-Linie. Wir danken dem Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC, Indiana, USA), dem National Institute of Genetics (NIG, Kyoto, Japan), der Banaras Hindu University (BHU, Varanasi, Indien) und dem National Center for Biological Science (NCBS, Bangalore, Indien) für die Drosophila-Linien . Die Arbeit im Labor wurde durch Zuschüsse von SERB-DST (ECR/2017/002963) an AD, ein DBT Ramalingaswami-Stipendium für AD (BT/RLF/Re-entry/11/2016) und institutionelle Unterstützung vom IIT Kharagpur, Indien, unterstützt. SD und SM erhalten Ph.D.-Stipendien vom CSIR-Senior Research Fellowship; PM erhält ein Ph.D.-Stipendium von MHRD, Indien.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Aggression arena:
aus transparentem12 cm x 8 cm x 2 cm. Durchmesser einer einzelnen Vertiefung = 18 cm. Sigma-aldrich #Z707791; Tiefe = 1 cm
Transparente Kunststoff-/AcrylplatteAlternativ: ein perforierter Deckel einer Zellkulturplatte
Social Space Assay:
Bindeklammern19 mm
Glasscheiben und Acrylplatten in kundenspezifischen GrößenDicke = 5 mm
Balztest:
Mutter und Schraube mit Gewinde
Plexiglasplatten in kundenspezifischen Formeni) Deckel: Eine maßgefertigte runde transparente Plexiglasscheibe (2-3 mm Dicke, 70 mm Durchmesser) mit einem Ladeloch im Randbereich und einem weiteren Schraubenloch in der Mitte (Durchmesser jeweils ~ 3 mm); ii) Eine zweite transparente, dickere Plexiglasscheibe (3-4 mm Dicke, 70 mm Durchmesser) mit 6-8 Perforationen mit einem Durchmesser von 15 mm, gleich weit von der Mitte entfernt; iii) Basis: Wie der Deckel, nur ohne Ladeloch
Grooming-Assay:
10– 15 Watt an der Decke montierbares LED-Panel
Gewöhnungs- und Y-Labyrinth-Assay
Kletterkammernx2, Borosilikatglas
Adapter zum Verbinden des Y-Labyrinths mit dem EinlauffläschchenPlexiglas, Sonderanfertigung, Messungen in Abbildung 5A
Clear ReagenzflaschenBorosil #1500017
StopfenBorosil #1761021
GlasfläschchenAD= 25 mm x Höhe= 85 mm; Borosilikatglas
Geruchsstoff (Ethylbutyrat)Merck #E15701
Paraffinwachs (flüssig) lightSRL #18211
RollenklemmenPolymed #14098
SilikonschläucheAD = 0,6 cm, ID = 0,3 cm; Rollenklemmen zur Durchflussregelung
VakuumpumpeHana #HN-648 (Alle Aquarienpumpen mit Durchflussrichtung Y-Labyrinth
BorosilikatglasY-förmige
Glasröhre (Borosilikatglas)Sonderanfertigung, Messungen in Abbildung 5A
Gemeinsame Artikel:
Jede Software für die Videowiedergabe (z. B. VLC Media Player)https://www.videolan.org/vlc/
Computer für die Videodatenanalyse
FliegenflaschenOD= 60 mm x Höhe= 140 mm; Glas/Polypropylen
FliegenfläschchenOD= 25 mm x Höhe= 85 mm; Borosilikatglas
Graph-Pad Prisma-Softwarehttps://www.graphpad.com/scientific-software/prism/www.graphpad.com/scientific-software/prism/ ImageJ-Software
https://imagej.net/downloads
Timer
Videokamera mit Videoaufzeichnung, EinrichtungCamcorders oder einer Handykamera funktioniert
Für Fliegensauger:
CottonSaugfähig, autoklavierte
ParafilmSigma-aldrich #P7793
Pipettenspitzen200 & Mikro; L oder 1000 µ L, wählen Sie je nach Außendurchmesser des Silikonschlauchs
Silikon-/Gummischlauchs= 30-50 cm. Die Tube sollte geruchlos sein
Zusammensetzung des Fliegenfutters:
Zutaten (Menge für 1 l Futter)
Agar (8 g)SRL # 19661 (CAS : 9002-18-0)
Speisestärke (80 g)Organisches, lokal beschafftes
D-Glucose (20 g)SRL # 51758 (CAS: 50-99-7)
Propionsäure (4 g)SRL # 43883 (CAS: 79-09-4)
Saccharose (40 g)SRL # 90701 (CAS: 57-50-1)
Tego (Methyl para hydroxybenzoat) (1,25 g)SRL # 60905 (CAS: 5026-62-0)
Hefepulver (10 g)HIMEDIA # RM027
Fliegenschnüre, die in den Experimenten in dieser Studie verwendet wurden:
Wildtyp (Kanton S oder CS)BDSC # 64349
w1118BDSC # 3605
w[1118]; fmr1[Δ 50M]/TM6B, Tb[+]BDSC # 6930
w[*]; fmr1[Δ 113M]/TM6B, Tb[1]BDSC # 67403
MB247-GAL4 (Gaurav Das, NCCS Pune, Indien)BDSC # 50742
LN1-GAL4NP1227, NP-Konsortium, Japan
row-shRNABDSC # 25971
Standard 24-Well-Platte Polystyrol Diffuses, glasbedecktes LED-Panel für die Gaswäsche des Länge des

Referenzen

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