Entwicklung einer bio-hybriden Mosquito-Stinger-basierten Rasterkraftmikroskopie-Sonde

Summary

Quantitative und kontrollierte Untersuchungen des Stichverhaltens von Insekten sind entscheidend, um wirksame Strategien zur Bekämpfung vektorübertragener Krankheiten zu entwickeln. In diesem Zusammenhang wird ein Verfahren zur Herstellung einer biohybriden Rasterkraftmikroskopie (AFM)-Sonde vorgestellt.

Abstract

Mücken, die aufgrund ihrer Fähigkeit, Krankheiten zu übertragen, als die tödlichsten Tiere für den Menschen berüchtigt sind, stellen eine ständige Herausforderung für die öffentliche Gesundheit dar. Die derzeit angewandte primäre Präventionsstrategie sind chemische Repellentien, die sich oft als unwirksam erweisen, da Mücken schnell Resistenzen entwickeln. Daher ist die Erfindung neuer Präventionsmethoden von entscheidender Bedeutung. Eine solche Entwicklung hängt von einem gründlichen Verständnis des Stechverhaltens von Mücken ab, was einen Versuchsaufbau erfordert, der tatsächliche Stichszenarien mit kontrollierbaren Testparametern und quantitativen Messungen genau nachbildet. Um diese Lücke zu schließen, wurde eine biohybride Rasterkraftmikroskopie-Sonde (AFM) entwickelt, deren Spitze ein biologischer Stachel - genauer gesagt ein Mückenlabrum - ist. Diese Bio-Hybrid-Sonde, die mit Standard-AFM-Systemen kompatibel ist, ermöglicht eine nahezu authentische Simulation des Penetrationsverhaltens von Mücken. Diese Methode stellt einen Fortschritt in der quantitativen Erforschung von Stichmechanismen dar und führt möglicherweise zur Schaffung wirksamer Barrieren gegen vektorübertragene Krankheiten (VBDs) und eröffnet neue Wege im Kampf gegen durch Stechmücken übertragene Krankheiten.

Introduction

Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) berichtete, dass vektorübertragene Krankheiten (VBDs) über 17 % aller Infektionskrankheiten ausmachen, die weltweit mehr als 7.00.000 Todesfälle pro Jahr verursachen. Als tödlichstes Tier der Welt verbreiten Mücken beispielsweise zahlreiche Krankheitserreger wie Dengue, Malaria und Zika durch blutsaugende Gliederfüßer, was jedes Jahr zu 700 Millionen Infektionen führt¹. Die Erforschung der Entwicklung wirksamer Maßnahmen zur Vorbeugung von VBDs ist von entscheidender Bedeutung, einschließlich der Nachahmung des Penetrationsverhaltens von Mücken, um ihre Stichmechanismen zu untersuchen, und der Untersuchung potenzieller Barrieren, um ihre Wirksamkeit bei der Verhinderung des Eindringens zu beweisen. Eine zentrale Herausforderung besteht darin, geeignete Ansätze für die Durchführung solcher Untersuchungen zu entwickeln. In der Literatur wurden Anstrengungen unternommen, einschließlich der Entwicklung von mikroskaligen Nadeln, die der Geometrie eines Mückenstichs ähneln; Viele der Materialien, die zur Herstellung dieser Mikronadeln verwendet werden (d. h. viskoelastische Materialien², Silikon (Si), Glas, Keramik³ usw.), haben jedoch andere mechanische Eigenschaften als das biologische Material des Rüssels der Mücke. Die technischen Materialien können spröde und anfällig für Bruch und Knicken^{sein 3,4}, während der Rüssel der Mücke einem Bruch oder Knicken besser standhalten^{kann 4}. Der Vorteil einer Bio-Hybrid-Sonde, die das Labrum einer Mücke anstelle von technischen Materialien verwendet, besteht darin, dass sie den Piercing-Mechanismus von Mücken genauer darstellen kann. Außerdem müssen spezielle Werkzeuge in Mikronadeln integriert werden, um quantitative Studien durchzuführen, wie z. B. die genaue Messung von Kraft⁵, die mit kundenspezifischen Setups mit speziell entwickelten Mikronadeln nicht leicht zu erreichen ist.

Der auf der Rasterkraftmikroskopie (AFM) basierende Ansatz ist insofern vielversprechend, als er mit einem Cantilever-Ansatz mit einer ultrafeinen Spitze arbeitet, die sorgfältig in der Nähe der Oberfläche einer Probe positioniert wird. Die Spitze kann entweder über eine Oberfläche scannen oder in eine Oberfläche gedrückt werden, wobei sie aufgrund ihrer Wechselwirkungen mit einer Probe⁶ unterschiedliche Anziehungs- oder Abstoßungskräfte erfährt. Diese Wechselwirkungen führen zur Ablenkung des Auslegers, die durch die Reflexion eines Laserstrahls von der Oberseite des Auslegers auf einen Photodetektor⁶ verfolgt wird. Die außergewöhnliche Empfindlichkeit des Systems gegenüber Bewegungen ermöglicht es dem AFM, eine Vielzahl von Messungen durchzuführen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf morphologische Kartierungen mit Pikometergenauigkeit, Kraftmessungen von Pikonewton bis Mikronewton und umfassende multiphysikalische Untersuchungen⁷. Zum Beispiel können AFM-Eindrücke durchgeführt werden, um die Reaktion auf die aufgebrachte Kraft einer Probe genau zu beurteilen und auch um die Härte, Elastizität und andere mechanische Eigenschaften einer Probe zu messen, indem sie mit geeigneten analytischen Modellen^{gekoppelt werden 8}. Die Sonde des Rasterfelds besteht am häufigsten aus Silizium (Si) oder Siliziumnitrid (Si₃N₄)⁸ mit einer Länge von 20 bis 300 μm⁹ und einem Spitzenradius in der Größenordnung von mehreren bis zehn Nanometern¹⁰. Der Spitzenradius im Nanometerbereich kann ideal für Anwendungen wie hochauflösende Bildgebung sein. Es besitzt jedoch nicht die Eigenschaften biologischer Stacheln für Studien, die versuchen, das Penetrationsverhalten in Bezug auf Steifigkeit, Radius, Form und Streckungsverhältnis nachzuahmen. Zum Beispiel ist die Mikronadelstruktur einer Mücke der Faszikel, der ein Seitenverhältnis von ~60¹¹ (Länge ~1,5 mm bis 2 mm; Durchmesser ~30 μm)¹² hat. Während man davon ausgehen kann, dass eine herkömmliche AFM-Sonde einem biologischen Stachel wie einem Labrum ähnelt, spiegeln ihre unterschiedlichen Materialeigenschaften und Abmessungen nicht die reale Situation während eines Bisses wider.

Um quantitative Untersuchungen des Penetrationsverhaltens zu ermöglichen, das biologische Bisse von Insekten oder anderen Tieren mit Stacheln nachahmt, wird hier ein Verfahren zur Herstellung von bio-hybriden AFM-Auslegern mit einem biologischen Stachel als Spitze entwickelt. Als Fallstudie wurde erfolgreich ein AFM-Ausleger demonstriert, an dem die Spitze eines Mückenlabrums befestigt war. Unter Berücksichtigung vorhandener Informationen aus der Literatur über die typischen Einstichkräfte, mit denen eine Mücke die Haut eines Opfers durchdringt^12,13, kann dieser biohybride AFM-Cantilever möglicherweise eine nahezu reale Nachahmung von Mückenstichen unter einem regulären AFM ermöglichen. Das Protokoll der Nutzung mikrobiologischer Stacheln zur Herstellung von biohybriden AFM-Auslegern kann auch auf die Entwicklung anderer scharfer stachelbasierter biohybrider AFM-Ausleger für quantitative Untersuchungen einer Vielzahl von Beißmechanismen angewendet werden.

Terminologien
Ein Schema eines Rüssels und seiner interessierenden Komponenten ist in Abbildung 1 dargestellt, und ihre Definitionen sind: (1) Rüssel: ein Körperteil aus dem Mund einer Mücke, der es der Mücke ermöglicht, sich selbst zu ernähren, mit einer Kern-Schale-Struktur, die aus dem Faszikel (Kern) und dem Labium (Schale) besteht, (2) Labium: die dunkle und stumpfe äußere Hülle eines Rüssels², (3) Faszikel: eine Gruppe schlanker Nadeln, die sich im Inneren des Labiums befinden, darunter zwei Oberkiefer, zwei Mandibeln, ein Hypopharynx und ein Labrum², (4) Hypopharynx: verantwortlich für die Sekretion von Speichel in den Blutkreislauf des Wirts², (5) Maxillae: gezacktes Element, das den Ernährungsmechanismus unterstützt², (5) Mandibeln: ähnlich wie der Oberkiefer helfen sie der Mücke beim Fressmechanismus und haben eine scharfe Spitze², (6) Labrum: das Hauptglied für das Eindringen in die Haut des Opfers, das viel größer ist als der Oberkiefer, der Mandibeln und der Hypopharynx. Es verfügt auch über sensorische Strukturen, die es ihm ermöglichen, Blutgefäße und interne Kanäle unter der Haut zu finden², (7) Manipulator: eine Anordnung mit drei Freiheitsgraden und einer Genauigkeit im Mikrometerbereich für die Positionierung, die eine Bewegung in XYZ-Richtung ermöglicht, (8) Klemmbaugruppe: eine maßgeschneiderte 2-teilige Klemme, die am Manipulator montiert wird und zum Klemmen des spitzenlosen AFM-Auslegers während des Experiments verwendet wird.

Protocol

Bei der für dieses Protokoll verwendeten Mückenart handelt es sich um ein nicht infiziertes adultes Weibchen von Aedes aegypti (A. aegypti), das eingefroren und in einem Gefrierschrank bei -20 °C gelagert wurde. Die Spezies wurde vom NIH/NIAID Filariasis Research Reagent Resource Center für den Vertrieb über BEI Resources, NIAID, NIH, zur Verfügung gestellt: Uninfected Aedes aegypti, Strain Black Eye Liverpool (Frozen), NR-48920. Die für die Studie verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Präparieren des Labiums vom Rüssel

1. Legen Sie mit einer Pinzette eine tote Mücke auf einen Objektträger unter dem Mikroskop und stellen Sie sicher, dass sich am Ende des Rüssels eine spitz zulaufende Spitze befindet (Abbildung 2A).
2. Während Sie die Mücke auf dem Objektträger halten, legen Sie eine Skalpellklinge vorsichtig über das Labium in der Nähe des Mückenkopfes (Abbildung 2B).
3. Fahren Sie mit einem Schnitt über die gesamte obere Hälfte des Labiums fort (ein Schnitt von ca. 80 μm) mit einer geringen Eindringtiefe durch die Dicke des Labiums. Achten Sie darauf, einen leichten Druck auf die Klinge auszuüben, um nur das Labium, aber nicht den darunter liegenden Faszikel zu schneiden.
4. Halten Sie mit einer Pinzette den Kopf der Mücke fest und kneifen Sie mit einer weiteren Präzisionspinzette das Schamlippen leicht an einer beliebigen Stelle zwischen der spitz zulaufenden Spitze und der Stelle des Schnitts zusammen (Abbildung 2B).
   1. Ziehen Sie mit der Pinzette, die das Labium hält, in Richtung der spitz zulaufenden Spitze (Abbildung 2C). Ziehe weiter an der Pinzette, bis sich das Labium gelöst hat und vollständig aus dem Faszikel entfernt wurde.
5. Legen Sie die Mücke unter das Mikroskop und überprüfen Sie, ob die Spitze des Labrums vorhanden ist. Dies ist an einer sich verjüngenden Spitze am Faszikel zu erkennen (Abbildung 2D).

2. Trennung der Spitze des Labrums von den anderen Faszikelgliedern

1. Klemmen und schließen Sie die Spitzen einer Präzisionspinzette und platzieren Sie die Spitze der Pinzette direkt neben dem Labrum in der Nähe der Spitze.
2. Üben Sie mit der Pinzettenspitze eine sanfte Kraft auf das Labrum in Richtung senkrecht zur Länge des Faszikels aus (Abbildung 3A).
3. Schieben Sie das Labrum weiter über den Objektträger, bis die Trennung des Labrums von den anderen Faszikelgliedern erreicht ist.
4. Untersuchen Sie die Probe unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass eine korrekte Trennung zwischen dem Labrum und anderen Faszikelmitgliedern erreicht wurde (Abbildung 3, links). Wenn die Trennung nicht erfolgreich ist, fahren Sie mit Schritt 2.1 fort.

3. Schneiden der Spitze des Labrums

1. Während sich das Labrum noch auf dem Objektträger befindet, platzieren Sie eine Skalpellklinge in einem Abstand von ca. ~200 μm von der Spitze des Labrums über das Labrum (Abbildung 4A). Üben Sie vorsichtig ausreichend Druck aus und schneiden Sie die Spitze des Labrums vollständig durch. Während die Labrumspitze idealerweise so kurz wie möglich sein sollte, ist ~200 μm das Beste, was der derzeitige Ansatz bewältigen kann.
2. Messen Sie die Länge des geschnittenen Labrums, um sicherzustellen, dass sie nicht länger als 300 μm ist (Abbildung 4B), mit einer digitalen Messsoftware. In diesem Protokoll wurde ImageJ^{verwendet 14}.

4. Greifen Sie die Spitze des Labrums

1. Lokalisieren und isolieren Sie mit einer Präzisionspinzette die Spitze des Labrums auf dem Objektträger. Entsorge alle verbleibenden Teile auf dem Objektträger außer der Spitze des Labrums.
2. Mit der gleichen Präzisionspinzette kneifen Sie das Labrum langsam und leicht zusammen, so dass das abgeschnittene Ende frei und frei von der Pinzette ist. Stellen Sie außerdem sicher, dass die Ausrichtung des Labrums parallel zur Richtung der Pinzettenlänge ist und das abgeschnittene Ende des Labrums vom Pinzettenkörper weg zeigt.
3. Sobald die Probe fest eingeklemmt ist, entfernen Sie die Klemmkraft, die die Pinzettenspitzen zusammenhält. Die Spitze des Labrums klebt an einer der Spitzen der Pinzette.
4. Untersuchen Sie unter dem Mikroskop die Spitzen der Pinzette und stellen Sie sicher, dass die Spitze des Labrums auf einer der Pinzettenspitzen vorhanden ist (Abbildung 5). Wenn sich die Spitze des Labrums nicht auf der Pinzette befindet, fahren Sie mit Schritt 4.2 fort, und wenn sich die Spitze des Labrums nicht auf der Pinzette oder auf dem Objektträger befindet, fahren Sie mit Schritt 1 fort.

5. Auftragen von Epoxidharz auf den spitzenlosen Ausleger

1. Geben Sie einen Tropfen (~0,05 ml) Epoxidharz auf den Rand eines neuen Objektträgers, indem Sie den Klebstoff direkt aus der Originalflasche/dem Originalbehälter tropfengießen. Legen Sie den epoxidhaltigen Objektträger unter die Sondenstation und fokussieren Sie darauf.
2. Montieren Sie den spitzenlosen AFM-Ausleger an der Klemmbaugruppe, indem Sie die Basis (d. h. das größere Ende) sichern, sodass das Auslegerende frei und im Raum schwebend bleibt. Stellen Sie sicher, dass die Unterseite des AFM-Auslegers nach unten zeigt.
3. Montieren Sie den Manipulator auf der Sondenstation.
4. Heben Sie die Z-Achse des Manipulators in eine Position an, in der sich der spitzenlose Ausleger einige Millimeter über dem epoxidhaltigen Glasschieber befindet.
5. Bewegen Sie den Manipulator manuell so, dass der spitzenlose Ausleger in der Feldansicht der Kamera auf der Taststation sichtbar ist.
6. Bewegen Sie den AFM-Ausleger mit dem Manipulator in X- und Y-Richtung, bis die Spitze des Auslegers direkt über dem Epoxidharz am Rand des Objektträgers aufliegt.
7. Wenden Sie den Manipulator wieder an und senken Sie den kipplosen Ausleger langsam in Z-Richtung über den Rand des Glasschiebers ab.
8. Wenn der Ausleger abgesenkt wird und sich dem Glasschieber nähert, senken Sie den Ausleger sehr langsam ab, bis er zum ersten Mal das Epoxidharz berührt. Senken Sie den Ausleger nicht weiter ab.
9. Schalten Sie den Manipulator vorsichtig ein, um den Ausleger langsam in X- oder Y-Richtung zu bewegen, und entfernen Sie den Ausleger aus dem Epoxidbecken, indem Sie den Ausleger kontinuierlich in die gewählte Richtung bewegen, bis der Ausleger vollständig vom Epoxidharz auf dem Glasträger getrennt ist. Der spitzenlose Ausleger sollte an seiner Spitze eine Miniaturblase aus Epoxidharz haben, die unter der Sondenstation sichtbar ist.
10. Heben Sie den Ausleger mit dem Manipulator in Z-Richtung an.

6. Verkleben der Spitze des Labrums mit dem spitzenlosen Ausleger

1. Drehen Sie den Manipulator um 90 Grad um die Längsachse des Auslegers und legen Sie den Manipulator auf die Seite der Sondenstation. In dieser Konfiguration verlaufen die Dicken entlang der Länge des AFM-Auslegers in vertikaler Richtung.
2. Positionieren Sie die Präzisionspinzette, die die Spitze des Labrums enthält, so unter der Kamera der Sondenstation, dass die gesamte Länge der Labrumspitze auf dem Computermonitor sichtbar ist.
3. Positionieren Sie die Manipulatorbaugruppe, die die Klemme und den spitzenlosen Ausleger hält, so unter der Kamera der Sondenstation, dass die gesamte Länge des spitzenlosen Auslegers auf dem Computermonitor sichtbar ist.
4. Fokussieren Sie das Mikroskop der Sondenstation auf die Spitze des Labrums und den spitzenlosen Ausleger.
5. Richten Sie den Ausleger senkrecht zur Spitze des Labrums aus, indem Sie den Manipulator vorsichtig und manuell drehen (Abbildung 6A).
6. Bewegen Sie den spitzenlosen Ausleger unter Ausnutzung der Freiheitsgrade des Manipulators langsam in XY-Richtung, so dass der Kleber auf dem Ausleger das abgeschnittene Ende der Labrumspitze berührt (Abbildung 6B).
7. Härten Sie das Epoxidharz aus und verfestigen Sie die Schnittstelle zwischen dem Cantilever- und dem Mückenlabrum.
8. Sobald das Epoxidharz ausgehärtet ist, rasten Sie den Manipulator vorsichtig in XY-Richtung ein und bewegen Sie den Ausleger von der Pinzette weg, um sicherzustellen, dass die Spitze des Labrums jetzt auf dem spitzenlosen Auslegerbalken steht (Abbildung 6C).

Results

Rasterelektronenmikroskopische (REM) Bilder der hergestellten Bio-Hybrid-AFM-Sonde sind in Abbildung 7 zu sehen. Das Ende des Labrums wurde erfolgreich mit dem kipplosen Auslegerbalken verklebt. Aufgrund der natürlichen Krümmung der Mückenstiche und der manuellen Bedienung des vorgestellten Protokolls ist es äußerst schwierig, einen Ausleger mit einer Stingerspitze zu erhalten, die perfekt senkrecht zum Ausleger steht. Der außermittige Winkel zwischen dem Stinger und einer imaginären Mittellinie senkrecht zum Ausleger beträgt normalerweise ~10 Grad. Obwohl es ein häufiges Problem bei der Montage einer Sonde an einem AFM-Ausleger¹⁵ zu sein scheint, muss die unbeabsichtigte Neigung bei der Durchführung einer Kraft-/Spannungsanalyse berücksichtigt werden. Für zukünftige Studien wäre es interessant, sich auf die Verbesserung des Herstellungsprotokolls zu konzentrieren und Studien mit der Bio-Hybrid-Sonde durchzuführen. Dies ist der erste Versuch, eine biohybride AFM-Sonde mit dem Stachel eines Insekts herzustellen.

Abbildung 1: Schematische Darstellung des Rüssels einer Mücke. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Entfernung des Labiums eines Mückenrüssels. (A) Eine Mücke mit vollem Rüssel, die das Vorhandensein einer intakten, spitz zulaufenden Spitze zeigt. (B) Die Position des Labium-Schnitts und der Pinzettenplatzierung auf dem Labium während des Labium-Entnahmeprozesses. (C) Die Richtung des Ziehens der Pinzette während der Entfernung des Labiums. (D) Der letzte präparierte Faszikel mit einer intakten Spitze nach der Labiumentfernung, wobei die konische Labrumspitze noch vorhanden und intakt ist. Maßstabsstäbe: 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Trennung des Labrums von unerwünschten Faszikelgliedern. (A) Lokalisation der Pinzettenplatzierung und Richtung des Pinzettendrückens als Technik zur Trennung der Rüsselfaszikelglieder. (B) Rüssel nach einer Manipulation, um das Labrum von anderen Faszikelmitgliedern zu trennen. Maßstabsstäbe: 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Isolierung der gewünschten Labrumspitze für die Montage am AFM-Ausleger. (A) Die Position des Labrumschnitts für die Entfernung der Labrumspitze. Maßstab: 200 μm. (B) Die Spitze des Labrums misst nach dem Abschneiden aus dem Körper des Labrums eine Länge von etwa 200-300 μm. Maßstabsleiste: 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Montieren der Labrumspitze an einer Pinzette vor dem Klebevorgang. Die Labrumspitze klebte an einer der Pinzettenspitzen, wobei das ungeschnittene Ende des Labrums frei war und vom Pinzettenkörper weg zeigte. Maßstabsleiste: 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Ablauf für die Montage der Labrumspitze am spitzenlosen Ausleger. (A) Ausrichten des spitzenlosen Auslegers in einer senkrechten Position zum Labrum. (B) Verschmelzen des spitzenlosen Auslegers mit dem Labrum und Aushärten des Epoxidklebstoffs, der zur Verfestigung der Verbindung zwischen den beiden Komponenten verwendet wird. (C) Die endgültig ausgehärtete Bio-Hybrid-AFM-Sonde, ohne dass das Labrum durch die Pinzette gestützt wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 7: REM-Bilder der biohybriden AFM-Sonde. (A) Eine Gesamtansicht der Spitze des Labrums und des spitzenlosen Cantilevers. Maßstabsbalken: 200 μm. (B) Eine vergrößerte Ansicht der Labrumspitze. Maßstabsleiste: 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Schritt 1 des Protokolls dient dazu, die biologische Probe von dem unerwünschten Labium zu reinigen. Um dies zu erreichen, wird ein Schnitt am Labium gemacht, nicht aber am Faszikel, der direkt unter dem Labium aufliegt (Abbildung 1). Da Faszikel und Labium an ihrer Grenzfläche nicht miteinander verbunden sind (d.h. das Labium kann frei entlang des Faszikels gleiten und wird nur durch seine Befestigung am Mückenkopf an Ort und Stelle gehalten), soll der durchgeführte Schnitt einen Teil des Labiums vom Kopf der Mücke trennen und so das Entfernen der äußeren Hülle erleichtern. Wenn das Labium aus der Probe gezogen wird, sollte der Techniker einen leichten Widerstand spüren, der dadurch verursacht wird, dass die untere Hälfte des Labiums noch an der Mücke haftet. Es wird erwartet, dass sich diese Widerstandskraft relativ leicht löst, da der Schnitt die Rissausbreitung des biologischen Materials fördert, wodurch das unbeschnittene Segment des Labiums reißt und das gesamte Labium während der Zugwirkung vom Faszikel abrutscht. Wenn ein unzureichender Schnitt gemacht wird, kann der Techniker beim Ziehen einen übermäßigen Widerstand verspüren und wird aufgefordert, einen weiteren Schnitt zu versuchen, bevor er mit dem Protokoll fortfährt.

Es ist wichtig, in Schritt 1 und Schritt 4 ein sanftes Auge und Geduld zu üben, wenn das Labrum durch Kneifen mit einer Pinzette manipuliert wird. Obwohl das Labrum relativ widerstandsfähig ist, kann es dennoch beschädigt werden, wenn es mit der Pinzette zu aggressiv zusammengedrückt wird. Der Techniker wird angeleitet, das Labium/Labrum leicht einzuklemmen, was bedeutet, dass er die minimale Kraft ausüben sollte, die auf die Pinzette erforderlich ist, um das Labium/Labrum zu halten. Die Bewertung des Vorhandenseins einer Schädigung kann am Ende von Schritt 1 und Schritt 4 durchgeführt werden, wenn die Probe unter dem Mikroskop untersucht wird. Es wird empfohlen, den Rüssel auf Anomalien entlang seiner Länge zu untersuchen (z. B. Dellen, Risse, Trennungen in Segmenten). Wenn der Verdacht besteht, dass eine Probe an der Spitze des Labrums beschädigt ist, verwerfen Sie sie und starten Sie das Protokoll neu.

Wichtige Prozessschritte des Protokolls, wie Schritt 3 und Schritt 6, erfordern besondere Sorgfalt. Um Schritt 3 durchzuführen, muss die Spitze des Labrums manuell mit einem Skalpell abgeschnitten werden. Wenn Sie zu kurz schneiden, wird der Rest des Experiments exponentiell schwieriger, da er zu klein sein kann, um ihn zu manipulieren. Im Gegenteil, wenn die Spitze länger als 300 μm ist, wird sie aufgrund des übermäßigen senkrechten Versatzes, der zwischen der Labrumspitze und dem AFM-Ausleger eingeführt wird, zu lang, um am AFM-Ausleger montiert zu werden. Dieser Versatz wird durch Unvollkommenheiten im Einbettungsprozess und/oder eine Krümmung verursacht, die in der Probe vorhanden sein können, die beide bei größeren Labrumlängen problematisch werden. Außerdem sind Kragarme mit sehr langen Spitzen auch unter dem AFM sehr schwer zu verwenden. Bei Schritt 3 ist es wichtig zu beachten, dass bei diesem Verfahren wahrscheinlich alle Faszikelstilette (Labrum, Oberkiefer, Mandibeln und Hypopharynx) geschnitten werden. Das Labrum kann aufgrund der manuellen Trennung, die in Schritt 2 durchgeführt wurde, leicht lokalisiert und von den restlichen Stiletts in Schritt 4 isoliert werden. Auch wenn es in Schritt 6 nahezu unmöglich ist, sicherzustellen, dass die Spitze unter einem optischen Mikroskop völlig normal zum Ausleger ist, ist es dennoch notwendig, den Neigungswinkel zu minimieren, um unerwünschte Belastungsbedingungen bei der zukünftigen Verwendung zu vermeiden.

Wichtig ist auch die Wahl des richtigen Epoxidharzes für die Befestigung des Stachels am AFM-Ausleger. Es wurden verschiedene langsam aushärtende Zweikomponenten-Epoxide getestet, die sich später als nicht ideal erwiesen, da jede kleine Vibration des Laborbodens während des Aushärtungsprozesses zum Scheitern des Versuchs führen kann. So wurde schließlich ein UV-härtendes Epoxidharz eingesetzt. Bei dem verwendeten Klebstoff handelt es sich um ein niedrigviskoses, schnell aushärtendes Epoxidharz, das innerhalb von 5 s nach UV-Einwirkung aushärten kann. Beim Erstarren wird der Kleber sehr steif und hat eine ausgezeichnete Festigkeit, wodurch sich die hergestellte Labrum-Cantilever-Sonde wie ein einzelner Körper verhält und an der Stelle der Adhäsion nicht versagt oder sich verformt. Diese Option bot genügend Zeit vor dem Aushärten, um das Setup in der richtigen Position für die Befestigung des Stinger am AFM-Cantilever (Schritt 6.3) zu konfigurieren und gleichzeitig alle Probleme im Zusammenhang mit Umgebungsvibrationen aufgrund seines Aushärtungsverhaltens auf Befehl zu beseitigen.

Die verbleibende wichtige Ausrüstung in diesem Protokoll ist die Sondenstation, die scharfe Pinzette und der Ausleger. Die verwendete Sondenstation ist mit einem 5-fach-Objektiv ausgestattet, das an der Kamera montiert ist. Es ist jedoch nicht zwingend erforderlich, genau dieses Sondenstationsmodell für dieses Protokoll zu verwenden. Bei der Auswahl der Sondenstation steht nur die klare und einfache Sichtbarkeit des AFM-Auslegers und des Labrums im Vordergrund. Die verwendete scharfe Pinzette hatte eine Spitzengröße von 0,5 mm x 0,1 mm. Es ist zwingend erforderlich, eine Pinzette mit dieser oder einer ähnlichen Spitzenabmessung zu verwenden, da die Verwendung einer Pinzette mit geringerer Feinheit zu Schwierigkeiten bei der Manipulation des Labrums führen kann. Der in diesem Protokoll verwendete Cantilever stammt aus einer kommerziellen Quelle (siehe Materialtabelle). Dieses Cantilever-Modell wurde aufgrund seiner hohen Steifigkeit ausgewählt, da eine große Kraft auf die Spitze der Mückensonde übertragen werden muss, um die reale Hautpenetration nachzuahmen. Im Allgemeinen darf ein AFM-Cantilever bei allen Stinger-basierten Sonden nicht zu weich sein, da ein Mangel an Steifigkeit zu einer Biegung des Cantilever während der AFM-Prüfung führt, was wiederum zu einer mangelnden Druckentwicklung an der Spitze der Stachelsonde führt. Dies führt dazu, dass die Sonde den Stichprozess ungenau nachahmt, so dass hochsteife spitzenlose AFM-Ausleger eine Voraussetzung für dieses Protokoll sind.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass es einzigartige Vorteile hat, eine stachelbasierte Bio-Hybrid-AFM-Sonde für quantitative mechanische Penetrations-/Stichstudien zu verwenden, verglichen mit anderen Methoden, bei denen lebende^{Mücken und} menschliche Freiwillige 4,11,12 ähnliche Studien durchführen müssen. Die ultrahohe Sensorauflösung des Rasterfelds ermöglicht Messungen mit beispielloser Genauigkeit, und die Bio-Hybrid-Sonde ermöglicht eine nahezu realistische Emulation tatsächlicher Beißszenarien, die eine statistisch signifikante Anzahl von Messungen umfasst, ohne dass menschliche Freiwillige erforderlich sind ^4,11,12. Darüber hinaus sind die Materialien, die zur Herstellung von technischen Mikronadeln verwendet werden, typischerweise anfällig für Brüche oder Knicke ^3,4, was für den Rüssel der Mücke nicht repräsentativ ist. Die Verwendung der Mückenteile selbst ähnelt besser dem echten Stichszenario. Dieses Protokoll kann potenziell weiterentwickelt und für die Hochdurchsatzproduktion automatisiert werden. Schließlich könnte das entwickelte Protokoll möglicherweise zur Herstellung anderer biohybrider AFM-Sonden unter Verwendung von Stacheln verschiedener Tiere für quantitative Studien verschiedener Beiß-/Penetrationsverhaltensweisen verwendet werden.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-SA-SE Gerade konische Pinzette	Excelta	N/A	Zum Manipulieren/Präparieren des Rüssels.
C-4D Sondenstation	Everbeing Int' l Corp	N/A	Wird für die AFM-Montage verwendet.
Spitzenmodus	NanoAndMore USA	TL-NCH	AFM Ausleger für die Montage des Labrums. Die Spezifikationen sind hier dargestellt: Shape: Beam Force Constant: 42 N/m (10 - 130 N/m) Resonance Frequency: 330 kHz (204 - 497 kHz) Länge: 125 &Mikro; m (115 - 135 µ m) Breite: 30 µ m (22,5 - 37,5 & Mikro; m) Dicke: 4 µ m ( 3 - 5 µ m)
UV Expoxy	Let's resin	ALR00146	Für die Stinger-Befestigung.