Entwicklung einer bio-hybriden Mosquito-Stinger-basierten Rasterkraftmikroskopie-Sonde

Zusammenfassung

Quantitative und kontrollierte Untersuchungen des Stichverhaltens von Insekten sind entscheidend, um wirksame Strategien zur Bekämpfung vektorübertragener Krankheiten zu entwickeln. In diesem Zusammenhang wird ein Verfahren zur Herstellung einer biohybriden Rasterkraftmikroskopie (AFM)-Sonde vorgestellt.

Zusammenfassung

Mücken, die aufgrund ihrer Fähigkeit, Krankheiten zu übertragen, als die tödlichsten Tiere für den Menschen berüchtigt sind, stellen eine ständige Herausforderung für die öffentliche Gesundheit dar. Die derzeit angewandte primäre Präventionsstrategie sind chemische Repellentien, die sich oft als unwirksam erweisen, da Mücken schnell Resistenzen entwickeln. Daher ist die Erfindung neuer Präventionsmethoden von entscheidender Bedeutung. Eine solche Entwicklung hängt von einem gründlichen Verständnis des Stechverhaltens von Mücken ab, was einen Versuchsaufbau erfordert, der tatsächliche Stichszenarien mit kontrollierbaren Testparametern und quantitativen Messungen genau nachbildet. Um diese Lücke zu schließen, wurde eine biohybride Rasterkraftmikroskopie-Sonde (AFM) entwickelt, deren Spitze ein biologischer Stachel - genauer gesagt ein Mückenlabrum - ist. Diese Bio-Hybrid-Sonde, die mit Standard-AFM-Systemen kompatibel ist, ermöglicht eine nahezu authentische Simulation des Penetrationsverhaltens von Mücken. Diese Methode stellt einen Fortschritt in der quantitativen Erforschung von Stichmechanismen dar und führt möglicherweise zur Schaffung wirksamer Barrieren gegen vektorübertragene Krankheiten (VBDs) und eröffnet neue Wege im Kampf gegen durch Stechmücken übertragene Krankheiten.

Einleitung

Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) berichtete, dass vektorübertragene Krankheiten (VBDs) über 17 % aller Infektionskrankheiten ausmachen, die weltweit mehr als 7.00.000 Todesfälle pro Jahr verursachen. Als tödlichstes Tier der Welt verbreiten Mücken beispielsweise zahlreiche Krankheitserreger wie Dengue, Malaria und Zika durch blutsaugende Gliederfüßer, was jedes Jahr zu 700 Millionen Infektionen führt¹. Die Erforschung der Entwicklung wirksamer Maßnahmen zur Vorbeugung von VBDs ist von entscheidender Bedeutung, einschließlich der Nachahmung des Penetrationsverhaltens von Mücken, um ihre Stichmechanismen zu untersuchen, und der Untersuchung potenzieller Barrieren, um ihre Wirksamkeit bei der Verhinderung des Eindringens zu beweisen. Eine zentrale Herausforderung besteht darin, geeignete Ansätze für die Durchführung solcher Untersuchungen zu entwickeln. In der Literatur wurden Anstrengungen unternommen, einschließlich der Entwicklung von mikroskaligen Nadeln, die der Geometrie eines Mückenstichs ähneln; Viele der Materialien, die zur Herstellung dieser Mikronadeln verwendet werden (d. h. viskoelastische Materialien², Silikon (Si), Glas, Keramik³ usw.), haben jedoch andere mechanische Eigenschaften als das biologische Material des Rüssels der Mücke. Die technischen Materialien können spröde und anfällig für Bruch und Knicken^{sein 3,4}, während der Rüssel der Mücke einem Bruch oder Knicken besser standhalten^{kann 4}. Der Vorteil einer Bio-Hybrid-Sonde, die das Labrum einer Mücke anstelle von technischen Materialien verwendet, besteht darin, dass sie den Piercing-Mechanismus von Mücken genauer darstellen kann. Außerdem müssen spezielle Werkzeuge in Mikronadeln integriert werden, um quantitative Studien durchzuführen, wie z. B. die genaue Messung von Kraft⁵, die mit kundenspezifischen Setups mit speziell entwickelten Mikronadeln nicht leicht zu erreichen ist.

Der auf der Rasterkraftmikroskopie (AFM) basierende Ansatz ist insofern vielversprechend, als er mit einem Cantilever-Ansatz mit einer ultrafeinen Spitze arbeitet, die sorgfältig in der Nähe der Oberfläche einer Probe positioniert wird. Die Spitze kann entweder über eine Oberfläche scannen oder in eine Oberfläche gedrückt werden, wobei sie aufgrund ihrer Wechselwirkungen mit einer Probe⁶ unterschiedliche Anziehungs- oder Abstoßungskräfte erfährt. Diese Wechselwirkungen führen zur Ablenkung des Auslegers, die durch die Reflexion eines Laserstrahls von der Oberseite des Auslegers auf einen Photodetektor⁶ verfolgt wird. Die außergewöhnliche Empfindlichkeit des Systems gegenüber Bewegungen ermöglicht es dem AFM, eine Vielzahl von Messungen durchzuführen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf morphologische Kartierungen mit Pikometergenauigkeit, Kraftmessungen von Pikonewton bis Mikronewton und umfassende multiphysikalische Untersuchungen⁷. Zum Beispiel können AFM-Eindrücke durchgeführt werden, um die Reaktion auf die aufgebrachte Kraft einer Probe genau zu beurteilen und auch um die Härte, Elastizität und andere mechanische Eigenschaften einer Probe zu messen, indem sie mit geeigneten analytischen Modellen^{gekoppelt werden 8}. Die Sonde des Rasterfelds besteht am häufigsten aus Silizium (Si) oder Siliziumnitrid (Si₃N₄)⁸ mit einer Länge von 20 bis 300 μm⁹ und einem Spitzenradius in der Größenordnung von mehreren bis zehn Nanometern¹⁰. Der Spitzenradius im Nanometerbereich kann ideal für Anwendungen wie hochauflösende Bildgebung sein. Es besitzt jedoch nicht die Eigenschaften biologischer Stacheln für Studien, die versuchen, das Penetrationsverhalten in Bezug auf Steifigkeit, Radius, Form und Streckungsverhältnis nachzuahmen. Zum Beispiel ist die Mikronadelstruktur einer Mücke der Faszikel, der ein Seitenverhältnis von ~60¹¹ (Länge ~1,5 mm bis 2 mm; Durchmesser ~30 μm)¹² hat. Während man davon ausgehen kann, dass eine herkömmliche AFM-Sonde einem biologischen Stachel wie einem Labrum ähnelt, spiegeln ihre unterschiedlichen Materialeigenschaften und Abmessungen nicht die reale Situation während eines Bisses wider.

Um quantitative Untersuchungen des Penetrationsverhaltens zu ermöglichen, das biologische Bisse von Insekten oder anderen Tieren mit Stacheln nachahmt, wird hier ein Verfahren zur Herstellung von bio-hybriden AFM-Auslegern mit einem biologischen Stachel als Spitze entwickelt. Als Fallstudie wurde erfolgreich ein AFM-Ausleger demonstriert, an dem die Spitze eines Mückenlabrums befestigt war. Unter Berücksichtigung vorhandener Informationen aus der Literatur über die typischen Einstichkräfte, mit denen eine Mücke die Haut eines Opfers durchdringt^12,13, kann dieser biohybride AFM-Cantilever möglicherweise eine nahezu reale Nachahmung von Mückenstichen unter einem regulären AFM ermöglichen. Das Protokoll der Nutzung mikrobiologischer Stacheln zur Herstellung von biohybriden AFM-Auslegern kann auch auf die Entwicklung anderer scharfer stachelbasierter biohybrider AFM-Ausleger für quantitative Untersuchungen einer Vielzahl von Beißmechanismen angewendet werden.

Terminologien
Ein Schema eines Rüssels und seiner interessierenden Komponenten ist in Abbildung 1 dargestellt, und ihre Definitionen sind: (1) Rüssel: ein Körperteil aus dem Mund einer Mücke, der es der Mücke ermöglicht, sich selbst zu ernähren, mit einer Kern-Schale-Struktur, die aus dem Faszikel (Kern) und dem Labium (Schale) besteht, (2) Labium: die dunkle und stumpfe äußere Hülle eines Rüssels², (3) Faszikel: eine Gruppe schlanker Nadeln, die sich im Inneren des Labiums befinden, darunter zwei Oberkiefer, zwei Mandibeln, ein Hypopharynx und ein Labrum², (4) Hypopharynx: verantwortlich für die Sekretion von Speichel in den Blutkreislauf des Wirts², (5) Maxillae: gezacktes Element, das den Ernährungsmechanismus unterstützt², (5) Mandibeln: ähnlich wie der Oberkiefer helfen sie der Mücke beim Fressmechanismus und haben eine scharfe Spitze², (6) Labrum: das Hauptglied für das Eindringen in die Haut des Opfers, das viel größer ist als der Oberkiefer, der Mandibeln und der Hypopharynx. Es verfügt auch über sensorische Strukturen, die es ihm ermöglichen, Blutgefäße und interne Kanäle unter der Haut zu finden², (7) Manipulator: eine Anordnung mit drei Freiheitsgraden und einer Genauigkeit im Mikrometerbereich für die Positionierung, die eine Bewegung in XYZ-Richtung ermöglicht, (8) Klemmbaugruppe: eine maßgeschneiderte 2-teilige Klemme, die am Manipulator montiert wird und zum Klemmen des spitzenlosen AFM-Auslegers während des Experiments verwendet wird.

Protokoll

Bei der für dieses Protokoll verwendeten Mückenart handelt es sich um ein nicht infiziertes adultes Weibchen von Aedes aegypti (A. aegypti), das eingefroren und in einem Gefrierschrank bei -20 °C gelagert wurde. Die Spezies wurde vom NIH/NIAID Filariasis Research Reagent Resource Center für den Vertrieb über BEI Resources, NIAID, NIH, zur Verfügung gestellt: Uninfected Aedes aegypti, Strain Black Eye Liverpool (Frozen), NR-48920. Die für die Studie verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Präparieren des Labiums vom Rüssel

1. Legen Sie mit einer Pinzette eine tote Mücke auf einen Objektträger unter dem Mikroskop und stellen Sie sicher, dass sich am Ende des Rüssels eine spitz zulaufende Spitze befindet (Abbildung 2A).
2. Während Sie die Mücke auf dem Objektträger halten, legen Sie eine Skalpellklinge vorsichtig über das Labium in der Nähe des Mückenkopfes (Abbildung 2B).
3. Fahren Sie mit einem Schnitt über die gesamte obere Hälfte des Labiums fort (ein Schnitt von ca. 80 μm) mit einer geringen Eindringtiefe durch die Dicke des Labiums. Achten Sie darauf, einen leichten Druck auf die Klinge auszuüben, um nur das Labium, aber nicht den darunter liegenden Faszikel zu schneiden.
4. Halten Sie mit einer Pinzette den Kopf der Mücke fest und kneifen Sie mit einer weiteren Präzisionspinzette das Schamlippen leicht an einer beliebigen Stelle zwischen der spitz zulaufenden Spitze und der Stelle des Schnitts zusammen (Abbildung 2B).
   1. Ziehen Sie mit der Pinzette, die das Labium hält, in Richtung der spitz zulaufenden Spitze (Abbildung 2C). Ziehe weiter an der Pinzette, bis sich das Labium gelöst hat und vollständig aus dem Faszikel entfernt wurde.
5. Legen Sie die Mücke unter das Mikroskop und überprüfen Sie, ob die Spitze des Labrums vorhanden ist. Dies ist an einer sich verjüngenden Spitze am Faszikel zu erkennen (Abbildung 2D).

2. Trennung der Spitze des Labrums von den anderen Faszikelgliedern

1. Klemmen und schließen Sie die Spitzen einer Präzisionspinzette und platzieren Sie die Spitze der Pinzette direkt neben dem Labrum in der Nähe der Spitze.
2. Üben Sie mit der Pinzettenspitze eine sanfte Kraft auf das Labrum in Richtung senkrecht zur Länge des Faszikels aus (Abbildung 3A).
3. Schieben Sie das Labrum weiter über den Objektträger, bis die Trennung des Labrums von den anderen Faszikelgliedern erreicht ist.
4. Untersuchen Sie die Probe unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass eine korrekte Trennung zwischen dem Labrum und anderen Faszikelmitgliedern erreicht wurde (Abbildung 3, links). Wenn die Trennung nicht erfolgreich ist, fahren Sie mit Schritt 2.1 fort.

3. Schneiden der Spitze des Labrums

1. Während sich das Labrum noch auf dem Objektträger befindet, platzieren Sie eine Skalpellklinge in einem Abstand von ca. ~200 μm von der Spitze des Labrums über das Labrum (Abbildung 4A). Üben Sie vorsichtig ausreichend Druck aus und schneiden Sie die Spitze des Labrums vollständig durch. Während die Labrumspitze idealerweise so kurz wie möglich sein sollte, ist ~200 μm das Beste, was der derzeitige Ansatz bewältigen kann.
2. Messen Sie die Länge des geschnittenen Labrums, um sicherzustellen, dass sie nicht länger als 300 μm ist (Abbildung 4B), mit einer digitalen Messsoftware. In diesem Protokoll wurde ImageJ^{verwendet 14}.

4. Greifen Sie die Spitze des Labrums

1. Lokalisieren und isolieren Sie mit einer Präzisionspinzette die Spitze des Labrums auf dem Objektträger. Entsorge alle verbleibenden Teile auf dem Objektträger außer der Spitze des Labrums.
2. Mit der gleichen Präzisionspinzette kneifen Sie das Labrum langsam und leicht zusammen, so dass das abgeschnittene Ende frei und frei von der Pinzette ist. Stellen Sie außerdem sicher, dass die Ausrichtung des Labrums parallel zur Richtung der Pinzettenlänge ist und das abgeschnittene Ende des Labrums vom Pinzettenkörper weg zeigt.
3. Sobald die Probe fest eingeklemmt ist, entfernen Sie die Klemmkraft, die die Pinzettenspitzen zusammenhält. Die Spitze des Labrums klebt an einer der Spitzen der Pinzette.
4. Untersuchen Sie unter dem Mikroskop die Spitzen der Pinzette und stellen Sie sicher, dass die Spitze des Labrums auf einer der Pinzettenspitzen vorhanden ist (Abbildung 5). Wenn sich die Spitze des Labrums nicht auf der Pinzette befindet, fahren Sie mit Schritt 4.2 fort, und wenn sich die Spitze des Labrums nicht auf der Pinzette oder auf dem Objektträger befindet, fahren Sie mit Schritt 1 fort.

5. Auftragen von Epoxidharz auf den spitzenlosen Ausleger

1. Geben Sie einen Tropfen (~0,05 ml) Epoxidharz auf den Rand eines neuen Objektträgers, indem Sie den Klebstoff direkt aus der Originalflasche/dem Originalbehälter tropfengießen. Legen Sie den epoxidhaltigen Objektträger unter die Sondenstation und fokussieren Sie darauf.
2. Montieren Sie den spitzenlosen AFM-Ausleger an der Klemmbaugruppe, indem Sie die Basis (d. h. das größere Ende) sichern, sodass das Auslegerende frei und im Raum schwebend bleibt. Stellen Sie sicher, dass die Unterseite des AFM-Auslegers nach unten zeigt.
3. Montieren Sie den Manipulator auf der Sondenstation.
4. Heben Sie die Z-Achse des Manipulators in eine Position an, in der sich der spitzenlose Ausleger einige Millimeter über dem epoxidhaltigen Glasschieber befindet.
5. Bewegen Sie den Manipulator manuell so, dass der spitzenlose Ausleger in der Feldansicht der Kamera auf der Taststation sichtbar ist.
6. Bewegen Sie den AFM-Ausleger mit dem Manipulator in X- und Y-Richtung, bis die Spitze des Auslegers direkt über dem Epoxidharz am Rand des Objektträgers aufliegt.
7. Wenden Sie den Manipulator wieder an und senken Sie den kipplosen Ausleger langsam in Z-Richtung über den Rand des Glasschiebers ab.
8. Wenn der Ausleger abgesenkt wird und sich dem Glasschieber nähert, senken Sie den Ausleger sehr langsam ab, bis er zum ersten Mal das Epoxidharz berührt. Senken Sie den Ausleger nicht weiter ab.
9. Schalten Sie den Manipulator vorsichtig ein, um den Ausleger langsam in X- oder Y-Richtung zu bewegen, und entfernen Sie den Ausleger aus dem Epoxidbecken, indem Sie den Ausleger kontinuierlich in die gewählte Richtung bewegen, bis der Ausleger vollständig vom Epoxidharz auf dem Glasträger getrennt ist. Der spitzenlose Ausleger sollte an seiner Spitze eine Miniaturblase aus Epoxidharz haben, die unter der Sondenstation sichtbar ist.
10. Heben Sie den Ausleger mit dem Manipulator in Z-Richtung an.

6. Verkleben der Spitze des Labrums mit dem spitzenlosen Ausleger

1. Drehen Sie den Manipulator um 90 Grad um die Längsachse des Auslegers und legen Sie den Manipulator auf die Seite der Sondenstation. In dieser Konfiguration verlaufen die Dicken entlang der Länge des AFM-Auslegers in vertikaler Richtung.
2. Positionieren Sie die Präzisionspinzette, die die Spitze des Labrums enthält, so unter der Kamera der Sondenstation, dass die gesamte Länge der Labrumspitze auf dem Computermonitor sichtbar ist.
3. Positionieren Sie die Manipulatorbaugruppe, die die Klemme und den spitzenlosen Ausleger hält, so unter der Kamera der Sondenstation, dass die gesamte Länge des spitzenlosen Auslegers auf dem Computermonitor sichtbar ist.
4. Fokussieren Sie das Mikroskop der Sondenstation auf die Spitze des Labrums und den spitzenlosen Ausleger.
5. Richten Sie den Ausleger senkrecht zur Spitze des Labrums aus, indem Sie den Manipulator vorsichtig und manuell drehen (Abbildung 6A).
6. Bewegen Sie den spitzenlosen Ausleger unter Ausnutzung der Freiheitsgrade des Manipulators langsam in XY-Richtung, so dass der Kleber auf dem Ausleger das abgeschnittene Ende der Labrumspitze berührt (Abbildung 6B).
7. Härten Sie das Epoxidharz aus und verfestigen Sie die Schnittstelle zwischen dem Cantilever- und dem Mückenlabrum.
8. Sobald das Epoxidharz ausgehärtet ist, rasten Sie den Manipulator vorsichtig in XY-Richtung ein und bewegen Sie den Ausleger von der Pinzette weg, um sicherzustellen, dass die Spitze des Labrums jetzt auf dem spitzenlosen Auslegerbalken steht (Abbildung 6C).

Ergebnisse

Rasterelektronenmikroskopische (REM) Bilder der hergestellten Bio-Hybrid-AFM-Sonde sind in Abbildung 7 zu sehen. Das Ende des Labrums wurde erfolgreich mit dem kipplosen Auslegerbalken verklebt. Aufgrund der natürlichen Krümmung der Mückenstiche und der manuellen Bedienung des vorgestellten Protokolls ist es äußerst schwierig, einen Ausleger mit einer Stingerspitze zu erhalten, die perfekt senkrecht zum Ausleger steht. Der außermittige Winkel zwischen dem Stinger und einer imaginären Mittell...

Diskussion

Schritt 1 des Protokolls dient dazu, die biologische Probe von dem unerwünschten Labium zu reinigen. Um dies zu erreichen, wird ein Schnitt am Labium gemacht, nicht aber am Faszikel, der direkt unter dem Labium aufliegt (Abbildung 1). Da Faszikel und Labium an ihrer Grenzfläche nicht miteinander verbunden sind (d.h. das Labium kann frei entlang des Faszikels gleiten und wird nur durch seine Befestigung am Mückenkopf an Ort und Stelle gehalten), soll der durchgeführte Schnitt einen Teil des L...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
5-SA-SE Gerade konische Pinzette	Excelta	N/A	Zum Manipulieren/Präparieren des Rüssels.
C-4D Sondenstation	Everbeing Int' l Corp	N/A	Wird für die AFM-Montage verwendet.
Spitzenmodus	NanoAndMore USA	TL-NCH	AFM Ausleger für die Montage des Labrums. Die Spezifikationen sind hier dargestellt: Shape: Beam Force Constant: 42 N/m (10 - 130 N/m) Resonance Frequency: 330 kHz (204 - 497 kHz) Länge: 125 &Mikro; m (115 - 135 µ m) Breite: 30 µ m (22,5 - 37,5 & Mikro; m) Dicke: 4 µ m ( 3 - 5 µ m)
UV Expoxy	Let's resin	ALR00146	Für die Stinger-Befestigung.

Ausleger im