Methodenartikel

Hochdurchsatz-Bioprinting-Verfahren zur Modellierung der Gefäßpermeabilität in Standard-Sechs-Well-Platten mit Größen- und Musterflexibilität

DOI:

10.3791/66676

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16. August 2024

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1Department of Convergence Biosystems Engineering, College of Agriculture and Life Sciences (CALS), Chonnam National University, 2Interdisciplinary Program in IT-Bio Convergence System, Chonnam National University, 3Advanced Bio and Healthcare Materials Research Division, Korea Institute of Materials Science (KIMS), 4Advanced Materials Engineering, Korea National University of Science and Technology (UST)

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir stellen ein Protokoll für die Hochdurchsatzproduktion von Gefäßkanälen mit flexiblen Größen und gewünschten Mustern auf einer Standard-Sechs-Well-Platte unter Verwendung der 3D-Bioprinting-Technologie vor, die als Gefäße auf einer Platte (VOP) bezeichnet wird. Diese Plattform hat das Potenzial, die Entwicklung von Therapeutika für die mit einem kompromittierten Endothel verbundenen Erkrankungen voranzutreiben.

Zusammenfassung

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Die Gefäßpermeabilität ist ein Schlüsselfaktor bei der Entwicklung von Therapien für Erkrankungen, die mit einer Beeinträchtigung des Endothels verbunden sind, wie z. B. endotheliale Dysfunktion in den Herzkranzgefäßen und eine beeinträchtigte Funktion der Blut-Hirn-Schranke. Bestehende Herstellungstechniken replizieren die geometrische Variation der Gefäßnetzwerke im menschlichen Körper, die das Fortschreiten der Krankheit wesentlich beeinflusst, nicht ausreichend. Darüber hinaus beinhalten diese Techniken oft mehrstufige Herstellungsverfahren, die die für pharmakologische Tests erforderliche Hochdurchsatzproduktion behindern. In diesem Artikel wird ein Bioprinting-Protokoll für die Erstellung mehrerer Gefäßgewebe mit gewünschten Mustern und Größen direkt auf Standard-Sechs-Well-Platten vorgestellt, wodurch bestehende Auflösungs- und Produktivitätsherausforderungen in der Bioprinting-Technologie überwunden werden. Es wurde ein vereinfachter Herstellungsansatz etabliert, um sechs hohle, perfundierte Kanäle innerhalb eines Hydrogels zu konstruieren, die anschließend mit menschlichen Endothelzellen der Nabelschnurvene ausgekleidet wurden, um ein funktionsfähiges und reifes Endothel zu bilden. Die computergesteuerte Natur des 3D-Biodrucks gewährleistet eine hohe Reproduzierbarkeit und erfordert weniger manuelle Fertigungsschritte als herkömmliche Methoden. Dies unterstreicht das Potenzial von VOP als effiziente Hochdurchsatzplattform für die Modellierung der Gefäßpermeabilität und die Weiterentwicklung der Wirkstoffforschung.

Einleitung

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Das Gefäßnetz im gesamten menschlichen Körper fungiert als entscheidende Transportbarriere, indem es den Austausch von Molekülen und Zellen zwischen dem Blut und dem umgebenden Gewebe dynamisch reguliert. Diese Regulation ist essentiell, um Gewebeödeme zu verhindern und einen selektiven Nährstoff- und Zellaustausch zu ermöglichen und so den Gewebestoffwechsel und die Homöostase zu unterstützen1. Eine veränderte endotheliale Permeabilität, ein Faktor bei vielen Gesundheitszuständen, beeinflusst sowohl den Schweregrad der Erkrankung als auch die Wirksamkeit der Behandlung2. Das vaskuläre Endothel wirkt als selektive Barriere und erleichtert den Transfer zwischen Gefäßen, Geweben und Organen. Diese Regulation umfasst mehrere Mechanismen, wie z. B. die grundlegende Filterung von gelösten Stoffen und kleinen Molekülen, die absichtliche Störung der Gefäßbarriere und den Einfluss von Molekülen wie Prostaglandinen und Wachstumsfaktoren auf die Permeabilitätsniveaus3.

Zu den Schlüsselfaktoren bei dieser Regulation gehören Endothelzellverbindungen, die Migration von Leukozyten und die Funktionalität der Blut-Hirn-Schranke4. Aufgrund seiner Komplexität variiert der Prozess in verschiedenen Umgebungen, wobei verschiedene Blutgefäßtypen beteiligt sind und unterschiedliche anatomische Wege verwendet werden. Das Verständnis der biologischen Grundlagen der Gefäßpermeabilität ist entscheidend für die Entwicklung therapeutischer Ansätze zur Behandlung von Erkrankungen, die mit abnormaler Gefäßpermeabilität verbunden sind. Die Aufrechterhaltung der Gefäßpermeabilität ist entscheidend für die Gesundheit des Gefäßsystems und des umgebenden Gewebes. Folglich führt eine Beeinträchtigung dieser Funktion zu einer endothelialen Dysfunktion, einem Zustand, in dem das Endothel seine normale Funktionalität verliert.

Die endotheliale Dysfunktion ist ein Vorläufer mehrerer weit verbreiteter menschlicher Krankheiten, darunter Bluthochdruck, koronare Herzkrankheit, Diabetes und Krebs 5,6,7. Dieser Zustand kann sich auf verschiedene Weise äußern, einschließlich einer verminderten Vasodilatation, einer erhöhten Gefäßpermeabilität und einer Tendenz zu einem entzündungsfördernden Zustand. Dieser pathologische Zustand ist das früheste Stadium mehrerer kritischer kardiovaskulärer Probleme, wie z. B. koronare Herzkrankheit, Schlaganfall und periphere arterielle Verschlusskrankheit8, die nach wie vor die Haupttodesursachen in den Vereinigten Staaten sind1. Die endotheliale Dysfunktion wirkt sich sowohl auf die kardiovaskuläre Gesundheit als auch auf die Blut-Hirn-Schranke (BHS) aus und spielt eine wichtige Rolle beim Fortschreiten verschiedener neurologischer Erkrankungen. Eine Dysfunktion kann die BHS-Durchlässigkeit erhöhen, wodurch Toxine, Krankheitserreger und Immunzellen in das zentrale Nervensystem eindringen können und zu neurologischen Störungen wie Schlaganfall, Alzheimer, Multipler Sklerose und Gehirninfektionen beitragen9.

Die endotheliale Dysfunktion bei Diabetes ist gekennzeichnet durch die beeinträchtigte Fähigkeit des Endothels, den Gefäßtonus zu regulieren und gefäßerweiternde Mediatoren wie Stickstoffmonoxid zu produzieren, was zu einer beeinträchtigten Vasodilatation führt10. Dieser Zustand wird durch Hyperglykämie-induzierte Signalwege wie die Aktivierung der Proteinkinase C und oxidativen Stress verschlimmert und trägt wesentlich zum Fortschreiten der diabetischen Gefäßerkrankung bei11. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass ein entzündliches Milieu die Adhäsion von Tumorzellen an mikrovaskuläre Endothelzellen des Gehirns erhöht, während ein undichtes Endothel ein wichtiger Faktor für die Metastasierung von Krebs ist12,13. Es wurde festgestellt, dass die Geometrie der Blutgefäße einen direkten Einfluss auf die Metastasierung von Hirntumoren hat. Tumorzellen heften sich bevorzugt an Bereiche mit größerer Blutgefäßkrümmung7. Dieser Befund unterstreicht die Bedeutung der Gefäßgeometrie bei der Metastasierung von Krebs. Noch wichtiger ist, dass bei Erkrankungen wie Fibrose und Krebs eine gestörte Endothelbarrierefunktion nicht nur eine Rolle bei der Krankheitsentwicklung spielt, sondern auch die Wirksamkeit der Behandlung behindert, indem sie eine angemessene Arzneimittelabgabe behindert14. Die Erforschung der Gefäßpermeabilität ist von entscheidender Bedeutung, um die Behandlung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen voranzutreiben und Einblicke in die Behandlung anderer Krankheiten zu gewinnen, die eine beeinträchtigte Gefäßfunktion beinhalten.

Angesichts der entscheidenden Rolle der Gefäßpermeabilität für Gesundheit und Krankheit haben sich umfangreiche Forschungsarbeiten darauf konzentriert, die selektive Natur der Endothelbarriere für die therapeutische Entwicklung unter Verwendung von Tiermodellen neben traditionellen 2D- und 3D-In-vitro-Testplattformen zu untersuchen. Tiermodelle haben jedoch aufgrund artspezifischer Unterschiede und ethischer Fragen sowie hoher Kosten Einschränkungen15,16. So gab Pfizer im Jahr 2004 an, dass es in den letzten 10 Jahren über 2 Milliarden US-Dollar für die Entwicklung von Medikamenten ausgegeben hatte, die in Tiermodellen vielversprechende Wirkungen zeigten, aber schließlich in fortgeschrittenen Testphasen am Menschen scheiterten17. Darüber hinaus ahmen herkömmliche 2D-Modelle die dreidimensionale (3D) Architektur und die komplexe geometrische Struktur von Gefäßkanälen nicht genau nach.

Mit den Fortschritten in der Biofabrikationstechnologie wurden umfangreiche Anstrengungen unternommen, um Gefäßkanäle herzustellen und gleichzeitig die 3D-Architektur zu rekapitulieren. Mikroskalige Gefäßkanäle können in mikrofluidischen Chips unter Verwendung von Softlithographie effektiv hergestellt werden, was einen Vorteil der Echtzeitanalyse bietet18,19. Alternative Methoden, wie z. B. das Gießen von Hydrogelen oder das Umwickeln von Zellfolien um eine Form oder einen Dorn, können verwendet werden, um freistehende röhrenförmige Strukturen mit dem gewünschten Durchmesser20,21 herzustellen. Diese Methoden haben jedoch Einschränkungen; Zum Beispiel sind mikrofluidische Chips auf Mikrokanalkonfigurationen beschränkt, und das Hydrogelgießen um eine Form herum repliziert nicht effektiv mehrere Geometrien.

Mit dem Aufkommen der 3D-Bioprinting-Technologie22 ist die Replikation komplexer Geometrien durch präzises Abscheiden verschiedener Hydrogelmaterialien auf Basis extrazellulärer Matrix (ECM) möglich geworden23,24. Einige Bioprinting-Verfahren, wie z. B. solche mit konzentrisch angeordneten Düsen, z. B. koaxial und triaxial25,26, können keine gegabelten Röhren erzeugen; Komplexe Strukturen können jedoch mit Opfermusterungsmethoden erreicht werden27. Keines dieser Bioprinting-Verfahren konnte nachweislich eine In-vitro-Modellierung mit hohem Durchsatz ermöglichen – eine entscheidende Voraussetzung für die pharmakologische Forschung in der Arzneimittelforschung. Hier stellen wir eine Methode zur effizienten Herstellung endothelialisierter Gefäßkanäle mit effizienter Kontrolle über die Dimensionen vor.

Wir etablierten einen unkomplizierten Ansatz unter Verwendung kommerziell erhältlicher Sechs-Well-Platten, kombiniert mit einer Opferstrukturierungsmethode, bei der ein Bioprinter Gefäßkanäle in den gewünschten Größen und Mustern innerhalb eines EZM-Hydrogels herstellt. Humane Nabelschnurvenendothelzellen (HUVECs) wurden ausgesät, um diese Kanäle zu endothelialisieren und die Funktionalität des Endothels durch einen Permeabilitätsassay zu bewerten. Dieses Design ermöglicht eine pumpenlose Perfusion, indem auf beiden Seiten des Kanals Medienreservoirs geschaffen werden, und verwendet eine schwerkraftgetriebene Strömung mit Hilfe einer häufig verwendeten 2D-Wippe, um die dynamische Kultur nachzuahmen. Dieser Ansatz macht Schlauchpumpen überflüssig und erleichtert die Skalierbarkeit dieser Plattform für Anwendungen mit hohem Durchsatz. Die computergesteuerte Natur der 3D-Bioprinting-Technologie rationalisiert auch den Herstellungsprozess und verringert so die Wahrscheinlichkeit von Fehlern während der Herstellung. Das VOP-Modell ist ein vielversprechendes Werkzeug für pharmakologische Tests in der Wirkstoffforschung.

Protokoll

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1. Generierung des G-Codes für den Bioprinter

  1. Um den Druckpfad zu generieren und zu visualisieren, besuchen Sie ein Online-G-Code-Simulationstool (z. B. NCviewer).
  2. Klicken Sie auf das Symbol Neue Datei auf der Benutzeroberfläche, um eine neue G-Code-Datei zu erstellen.
  3. Generieren Sie einen Druckpfad, indem Sie die G-Code-Befehle für den Opferkanal und die Siliziumkammer manuell schreiben. Verwenden Sie die Abmessungen einer Standardplatte mit sechs Vertiefungen als Referenz für die Erstellung der Geometrie.
    HINWEIS: Der hier verwendete G-Code basiert auf dem CNC-Code (Computer Numerical Control). Die Funktionen der einzelnen Befehle sind in der ergänzenden Tabelle S1 aufgeführt. Das Sechs-Well-Plattenformat wurde aufgrund seiner Kompatibilität mit kommerziellen Mikroplatten-Readern und Mikroskopie-Setups und seiner Fähigkeit, ausreichende Medienvolumina zur Unterstützung der Endothelreifung aufzunehmen, wodurch der Bedarf an häufigen Medienwechseln minimiert wird. Dieses Herstellungsprotokoll kann auch für die Verwendung mit anderen Standard-Well-Platten angepasst werden.
  4. Sobald der G-Code abgeschlossen ist, klicken Sie auf der Benutzeroberfläche auf das Symbol Datei speichern , um die Datei mit der Erweiterung .nc herunterzuladen.
    HINWEIS: Jeder andere verfügbare G-Code-Generierungsalgorithmus kann verwendet werden, um die Druckpfade zu generieren. Die Geometrie des Gefäßkanals kann in diesem G-Code manipuliert werden.

2. Vorbereitung von Opfer- und Silikonkammertinten

HINWEIS: Die Quellen für alle Materialien, die in diesem Protokoll verwendet werden, sind in der Materialtabelle aufgeführt.

  1. Kombinieren Sie zwei Arten von Silikonpolymeren, SE1700 und Polydimethylsiloxan (PDMS), in einem Verhältnis von 10:2. Fügen Sie das Härtungsmittel jedes Polymers in einem Verhältnis von 10:1 hinzu, Polymer zu Härter.
  2. Verwenden Sie einen Planetenmischer, um das Polymergemisch bei 2.000 U/min gründlich zu mischen und zu entgasen.
  3. Übertragen Sie das gemischte Silikonpolymer mit einem Spatel in eine 10-ml-Einwegspritze. Zentrifugieren Sie die geladene Spritze bei 400 × g für 3 min bei 5 °C, um eine gleichmäßige Konsistenz zu gewährleisten und Blasenbildung während des Drucks zu vermeiden.
    HINWEIS: Die Kammertinte sollte innerhalb von 2 Stunden nach der Zugabe der Härter verwendet werden, um eine optimale Druckqualität zu gewährleisten. Lagern Sie die Spritze bei 5 °C, während Sie den Druck vorbereiten. Dieser Prozess trägt dazu bei, die Aushärtung der Tinte zu verlangsamen, wodurch sich sonst die Druckparameter verändern können.
  4. Pluronic F-127 (PF127) wird gewogen, um eine 40%ige (w/v) Stammlösung von PF127 in destilliertem Wasser herzustellen.
  5. Mischen Sie die PF127-Lösung in einem Planetenmischer für 3 min bei 400 × g , um eine Homogenität zu erreichen. Die homogenisierte Mischung wird bei 4 °C gehalten, um PF127 vollständig aufzulösen.
  6. Bereiten Sie eine Thrombin-Stammlösung von 1.000 Einheiten/ml in Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) vor.
    HINWEIS: Lagern Sie Thrombin-Stammlösung in 100 μl Aliquoten, um wiederholte Gefrier-Auftau-Zyklen zu vermeiden. Die Aliquote sollten nicht länger als 6 Monate bei -20 °C gelagert werden.
  7. Bereiten Sie vor dem Drucken Opfertinte vor, indem Sie Thrombin in einer Verdünnung von 1:10 mit PF127 auf eine endgültige Arbeitskonzentration von 36 % (w/v) für PF127 und 100 Einheiten/ml für Thrombin mischen. Zur Herstellung von 1 ml Opfertinte mischen Sie 100 μl Thrombin-Stammlösung mit 900 μl PF127-Stammlösung.
    HINWEIS: Bei der Vorbereitung der Opfertinte für den Druck einer einzelnen Platte ist ein Gesamtvolumen von 1 ml mehr als ausreichend.

3. Herstellungsprozess

  1. Bevor Sie mit dem Herstellungsprozess beginnen, behandeln Sie eine Sechs-Well-Platte 1 Minute lang mit Sauerstoffplasma (O2) mit einer Stärke von 100 Watt.
  2. Befolgen Sie das in Abschnitt 2 beschriebene Verfahren, um sowohl die Opfer- als auch die Silikontinte vorzubereiten, und stellen Sie sicher, dass die Tinten frei von Blasen und homogen gemischt sind, um einen konsistenten Druck zu gewährleisten. Legen Sie die Tinten vorsichtig in den Druckkopf des Biodruckers ein. Stellen Sie die Temperatur des Kopfes des Biodruckers auf 37 °C für die Opfertinte und 5 °C für die Silikontinte ein.
  3. Befestigen Sie eine konische Düse mit 22 G Doppelschraubgewinde an der Silikonspritze. Für die Opfertinte wählen Sie die Düsengröße entsprechend dem gewünschten Kanaldurchmesser.
    HINWEIS: Hier haben wir drei Düsengrößen demonstriert: 18 G, 20 G und 22 G. Optimale Druckparameter, einschließlich Druckdruck und Druckkopfgeschwindigkeit, sind in Tabelle 1 aufgeführt.
  4. Laden Sie den gewünschten G-Code und drücken Sie die Servo-Bereitschaftsfunktion auf der Softwareoberfläche des Biodruckers für 3 Sekunden. Positionieren Sie die Platte auf dem Tisch am Startpunkt des G-Codes und klicken Sie auf Start , um den Druckvorgang zu starten.
    HINWEIS: In der Regel dauert die Herstellung einer Platte mit sechs Kammern ca. 1 h und 10 min. Schritt 3.4, der das Laden und Ausführen des G-Codes umfasst, kann je nach verwendetem Bioprinter variieren. Stellen Sie sicher, dass während der Verwendung des Biodruckers sterile Bedingungen eingehalten werden, um eine Kontamination zu vermeiden.
  5. Setzen Sie einen Deckel über die Platte und stellen Sie die Platte für 72 Stunden in einen befeuchteten CO2 -Inkubator bei 37 °C um, um die Silikonkammern auszuhärten.
    HINWEIS: Obwohl die Aushärtung des Silikons im Inkubator langsamer erfolgen kann, darf die Platte nicht in einen trockenen Ofen gestellt werden.

4. Hydrogel-Vorbereitung und Kanaleinbettung

  1. Bereiten Sie ein konisches 50-ml-Röhrchen mit 20 ml 1x PBS vor. 0,01 g Lithiumphenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinat (LAP) werden in das konische Röhrchen gegeben, um eine 0,05%ige (w/v) LAP-Lösung herzustellen. Strudeln Sie es, bis sich das Pulver vollständig aufgelöst hat.
    HINWEIS: Wickeln Sie das konische Rohr in Folie ein, um Lichteinwirkung zu vermeiden. Die LAP-Stammlösung bei 4 °C lagern.
  2. Fügen Sie 3 g Gelatinemethacrylat (GelMA) und 0,2 g Fibrinogen zu 20 ml LAP-Lösung hinzu, um eine Endkonzentration von 15 % GelMA und 1 % Fibrinogen (als GelFib bezeichnet) zu erreichen. Geben Sie die Mischung in ein 37 °C heißes Wasserbad und mischen Sie sie regelmäßig, bis sich die Lösung vollständig aufgelöst hat.
  3. Nach der Herstellung, wie in Abschnitt 3 beschrieben, fügen Sie 300 μl vorgewärmtes GelFib in jede Hydrogelkammer hinzu, um das Opfermuster einzubetten. Vernetzen Sie das GelMA schnell mit ultraviolettem (UV) Licht bei einer Wellenlänge von 405 nm und einer Intensität von 85 mW/cm2 für 120 s. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle anderen Vertiefungen.
    HINWEIS: Fibrinogen vernetzt sich schnell bei Kontakt mit dem Thrombin enthaltenden Opfermuster. Wir empfehlen, Hydrogel hinzuzufügen und die UV-Vernetzung einzeln für jede Vertiefung durchzuführen, um eine unerwünschte Gelierung von GelMA bei Raumtemperatur zu vermeiden. Darüber hinaus sollten sterile Bedingungen eingehalten werden, um eine Kontamination während des UV-Härtungsprozesses zu vermeiden.
  4. Geben Sie 1 ml DPBS auf jede Seite des Gefäßkanals in jeder Vertiefung und halten Sie die Platte 15 Minuten lang bei 4 °C, um das PF127 zu verflüssigen.
  5. Nach 15 Minuten saugen Sie das DPBS ab und wiederholen Sie Schritt 4.5 3x, um PF127 vollständig zu waschen.
  6. Bevor Sie Zellen in die Kanäle einführen, perfundieren Sie DMEM F12 mit 1% Matrigel für 30 Minuten durch die Kanäle, um die Zelladhäsion zu verbessern.

5. HUVEC-Kultur

  1. Endothelzellwachstumsmedium (EKGM) in einem 37 °C warmen Wasserbad für 30 min vorwärmen.
  2. Nehmen Sie in der Zwischenzeit ein Fläschchen mit kryokonservierten HUVECs aus dem Stickstofftank, lösen Sie vorsichtig die Kappe des Fläschchens und ziehen Sie sie dann wieder fest, um Stickstoff aus den Gewinden freizusetzen. Tauen Sie die Zellen sofort auf, indem Sie das Fläschchen 2 Minuten lang in ein 37 °C heißes Wasserbad tauchen, wobei Sie darauf achten, dass eine kleine Menge Eis im Fläschchen verbleibt. Spülen Sie das Fläschchen mit 70 % Ethanol aus, um eine Kontamination zu vermeiden.
    HINWEIS: Tragen Sie eine Schutzbrille, wenn Sie Zellen aus dem Stickstofftank entnehmen. Die Kappe des Fläschchens muss während dieses Vorgangs über dem Wasserspiegel gehalten werden.
  3. Bereiten Sie einen konischen 15-ml-Schlauch mit 5 ml vorgewärmtem EKGM vor. Übertragen Sie die aufgetauten Zellen vorsichtig mit einer Mikropipette aus dem Fläschchen in das konische Röhrchen. Um sicherzustellen, dass keine Zellen zurückbleiben, geben Sie 1 ml frisches, vorgewärmtes Medium in das Kryofläschchen, spülen Sie das Innere aus und geben Sie alle verbleibenden Zellen in das konische Röhrchen.
  4. Das konische Röhrchen wird 3 Minuten lang bei 200 × g zentrifugiert, um ein Zellpellet zu erhalten. Der Überstand wird verworfen, die Zellen in 10 ml frischem Medium resuspendiert, die Zellen in einen T75-Kolben überführt und der Kolben in einen 37 °C befeuchteten CO2 -Inkubator gestellt.
    HINWEIS: Dieser Schritt ist wichtig, um das im Gefriermedium im Kryoröhrchen vorhandene Dimethylsulfoxid durch Zentrifugation zu entfernen.
  5. Frischen Sie das Medium jeden zweiten Tag auf, bis die Zellen eine Konfluenz von 80-90 % erreicht haben.

6. Endothelisierung der Kanäle

  1. ECGM, DPBS, Trypsin-neutralisierende Lösung und Trypsinethylendiamintetraessigsäure (TE) in einem 37 °C warmen Wasserbad für 30 min vorwärmen.
  2. Bei 90 % Konfluenz spülen Sie die Zellen in einem T75-Kolben mit 10 ml DPBS, geben Sie 1 ml 0,25 % TE in den Kolben und inkubieren Sie ihn 3 Minuten lang.
  3. Klopfen Sie vorsichtig auf die Seiten des Kolbens und fügen Sie 5 ml Trypsin-Neutralisationslösung hinzu, um den TE zu neutralisieren. Übertragen Sie die Zellen in ein konisches 15-ml-Röhrchen. Verwenden Sie 5 ml frisches EKGM, um die verbleibenden Zellen zu sammeln und in den konischen Schlauch zu geben.
  4. Zentrifugieren Sie das konische Röhrchen bei 250 × g für 3 Minuten, um das Küvettenpellet aufzufangen.
  5. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml frischem EKGM. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und wiederholen Sie Schritt 6.4, um ein Zellpellet zu erhalten. Resuspendieren Sie 3 Millionen Zellen in 90 μl frischem EKGM.
  6. Bevor Sie die Zellsuspension in den Kanal einführen, saugen Sie den Kanal kurz im Vakuum, um das Lumen zu reinigen.
    HINWEIS: Vermeiden Sie ein längeres Ansaugen des Kanals, um seine Integrität nicht zu beschädigen.
  7. Befüllen Sie den Kanal vorsichtig mit einer Zellsuspension bei einer Aussaatdichte von 0,5 Millionen Zellen pro Well. Verwenden Sie eine Mikropipette, um ~15 μl dieser Suspension hinzuzufügen, um den Kanal zu füllen.
    HINWEIS: Die Aussaatdichte kann je nach Größe des Kanals variieren. Diese Dichte ist für einen Kanal optimiert, der mit einer 20-G-Düse und einem Innendurchmesser von ca. 900 μm gedruckt wird.
  8. Legen Sie die Platte für 2 Stunden flach in den Inkubator. Drehen Sie anschließend die Platte um 180° um und halten Sie sie für die folgenden 2 Stunden in einer flachen Position.
  9. Waschen Sie den Kanal nach 4 Stunden mit DPBS, um nicht anhaftende und abgestorbene Zellen zu entfernen. Geben Sie 2 ml frisches ECGM in jede Vertiefung (1 mL auf jede Seite des Kanals). Starten Sie die dynamische Kultur an einer Wippe bei einem Neigungswinkel von 10° und 5 U/min, indem Sie die Platte mit den Kanälen parallel zur Schaukelrichtung auf der Wippe positionieren. Frischen Sie das Wachstumsmedium jeden zweiten Tag auf.
    HINWEIS: Die dynamische Kultur verbessert den Medienaustausch zwischen den Reservoiren und Kanälen und hilft den Zellen, sich über Nacht zu vermehren.

7. Beurteilung der Endothelreifung

  1. EKGM und DPBS in einem 37 °C warmen Wasserbad für 30 min und das Reagenz des Cell Counting Kit-8 (CCK8) bei Raumtemperatur vorwärmen.
  2. Stellen Sie eine Arbeitslösung aus CCK8 her, indem Sie 100 μl CCK8-Reagenz mit 1 ml frischem ECGM für jede Vertiefung mischen. Bereiten Sie bei der Arbeit mit einer Platte/einem 6-Kanal 600 μl CCK8-Reagenz vor, indem Sie es mit 6 ml frischem EKGM kombinieren.
  3. Entfernen Sie das Wachstumsmedium durch Saugen und spülen Sie die Kanäle mit DPBS aus. Geben Sie 1 ml CCK8-Arbeitslösung in jede Vertiefung und lassen Sie die Platte 30 Minuten lang flach im Inkubator bleiben. Starten Sie anschließend die dynamische Kultur auf einer Wippe, wie in Schritt 6.9 beschrieben, und setzen Sie diesen Vorgang für die nächsten 3 Stunden fort.
  4. Entfernen Sie nach 3 Stunden den Inhalt aus jeder Vertiefung, indem Sie die Platte zur Seite kippen, und geben Sie ihn auf eine neue Platte mit sechs Vertiefungen. Spülen Sie die Kanäle mit DPBS aus und fügen Sie frisches Medium hinzu.
    HINWEIS: Decken Sie die Platte bis zur Absorptionsmessung mit Alufolie ab. Halten Sie ein konsistentes Reagenzienvolumen über alle Vertiefungen aufrecht, um einheitliche Messwerte zu gewährleisten. Vermeiden Sie beim Pipettieren sorgfältig das Einbringen von Luftblasen, die die Genauigkeit der optischen Dichtemessungen beeinträchtigen können.
  5. Nachdem Sie die Platte 15 s lang vorsichtig geschüttelt haben, um eine gleichmäßige Mischung der Farben zu gewährleisten, verwenden Sie einen Mikroplatten-Reader, um die Absorption bei 450 nm zu messen.
  6. Wiederholen Sie diesen Vorgang in vordefinierten Zeitintervallen. Berechnen Sie die mittlere optische Dichte für jeden Zeitpunkt und zeichnen Sie eine Wachstumskurve in einer Grafiksoftware. Diese Kurve zeigt die relative Reifung des Endothels im Laufe der Zeit.

8. Permeabilitätstest

  1. Entferne das Medium aus einer Vertiefung von Interesse.
    HINWEIS: Für den Permeabilitätstest wird empfohlen, jede Vertiefung separat zu bearbeiten, um zu verhindern, dass andere Kanäle austrocknen, was ihre Gefäßpermeabilität verändern könnte.
  2. Bereiten Sie 6 ml 0,1 mg/ml-Lösung von FITC-konjugiertem Dextran vor, indem Sie 70 kDa FITC-Dextran in DPBS auflösen.
    HINWEIS: Bereiten Sie eine 20 mg/ml-Stammlösung von FITC-Dextran vor, indem Sie 100 mg FITC-Dextran in 5 ml DPBS auflösen. Nachdem Sie die Lösung vorsichtig vortexiert haben, aliquotieren Sie 500 μl in 1,5-ml-Röhrchen, um wiederholte Gefrier-Tau-Zyklen zu vermeiden. Diese Aliquots können maximal 6 Monate bei -20 °C gelagert werden. Vor der Durchführung des Assays verdünnen Sie die Stammlösung auf eine Arbeitskonzentration von 0,1 mg/ml.
  3. Positionieren Sie die Platte fest auf dem Mikroskoptisch und stellen Sie die Vergrößerung des Objektivs im Phasenkontrastmodus ein, um eine klare Sichtbarkeit der Kanalwand im interessierenden Bereich zusammen mit dem in der Nähe befindlichen Gel innerhalb des Sichtfelds zu gewährleisten.
    HINWEIS: Versuchen Sie für eine effektive Bewertung der Permeabilität, den Bereich des Gels zu maximieren, der den interessierenden Bereich im Sichtfeld umgibt. Dieser Aspekt ist der Schlüssel für eine genaue Überwachung des Dextrantransports.
  4. Nachdem Sie auf den gewünschten Bereich fokussiert haben, wechseln Sie vom Phasenkontrast in den Fluoreszenzmodus. Fügen Sie auf der Registerkarte Bildaufnahme FITC in den Weitfeldkanal ein, und nehmen Sie vor der Zugabe von Dextranlösung ein Bild auf, um die Hintergrundfluoreszenzintensität zu berechnen. Geben Sie dann 1 ml FITC-Dextran-Arbeitslösung auf eine Seite des Kanals und lassen Sie die Lösung zur anderen Seite des Bohrlochs fließen, angetrieben durch die hydrostatische Druckdifferenz.
  5. Erfassen Sie Bilder in vorgegebenen Zeitintervallen – häufiger für Kanäle mit hoher Permeabilität und seltener für solche mit geringerer Permeabilität.

9. Messung der Fluoreszenzintensität in ImageJ

  1. Messen Sie in der ImageJ-Bildanalysesoftware die Intensität zum Anfangszeitpunkt (It1), die durchschnittliche Intensität, die zu einem späteren Zeitpunkt (It2) beobachtet wurde, und die Intensität aufgrund von Hintergrundrauschen (Ib), wie unten beschrieben. Verwenden Sie Gleichung (1), um den Permeabilitätskoeffizienten (Pd) zu berechnen. T1 und T2 beziehen sich auf den Anfangs- und den späteren Zeitpunkt der Bildaufnahme.
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    1. Starten Sie ImageJ und öffnen Sie das Bild, das zum ursprünglichen Zeitpunkt aufgenommen wurde.
    2. Stellen Sie den Maßstab in ImageJ ein. Navigieren Sie zu Analysieren | Festlegen der Skalierung. Geben Sie den bekannten Maßstab und die Maßeinheit ein.
    3. Wählen Sie das Rechteckwerkzeug aus und zeichnen Sie ein Rechteck über den Bereich des Gels, in dem die Fluoreszenzintensitätsmessung erforderlich ist.
    4. Navigieren Sie zu Analysieren | Legen Sie Messungen fest und stellen Sie sicher, dass der mittlere Grauwert aktiviert ist.
      HINWEIS: Mit dieser Option wird die durchschnittliche Intensität innerhalb des ausgewählten Bereichs gemessen. Andere Parameter können je nach Bedarf für die jeweilige Analyse ausgewählt werden.
    5. Wenn der Bereich noch ausgewählt ist, navigieren Sie zu Analysieren | Messen Sie oder drücken Sie einfach M. Warten Sie, bis sich ein Ergebnisfenster öffnet, in dem die mittlere Fluoreszenzintensität und alle anderen ausgewählten Parameter angezeigt werden.
    6. Führen Sie drei Messungen durch und berechnen Sie den durchschnittlichen Wert der Fluoreszenzintensität in einer Tabelle.
    7. Dieses Verfahren wird für die Bilder wiederholt, die zum folgenden Zeitpunkt t2 aufgenommen wurden, sowie für die Bilder, die vor der Zugabe der Dextranlösung zur Berechnung der Fluoreszenzintensität zu einem späteren Zeitpunkt aufgenommen wurden, um die Hintergrundfluoreszenz zu bestimmen.

Ergebnisse

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Die VOP-Plattform, die sich durch Flexibilität in Größe und Muster auszeichnet, wurde mit einem Mehrkopf-Bioprinting-System hergestellt. Sowohl hohle als auch perfusionsfähige Kanäle wurden mit HUVECs besiedelt, um die Endothelisierung zu erleichtern, und anschließend mit einem Permeabilitätsassay bewertet (Abbildung 1A). Um die Multiskalen-Fertigungsfähigkeit dieser Methode zu demonstrieren, haben wir drei verschiedene Konfigurationen gedruckt: gerade, gegabelt und gewunden (Abbildung 1B). Durch einen unkomplizierten Herstellungsansatz können sechs hohle, perfundierte Gefäßkanäle, die in eine Hydrogelmatrix eingebettet sind, in einer Standard-Sechs-Well-Platte hergestellt werden. Diese Kanäle können dann mit HUVECs endothelisiert werden (Abbildung 2A). Die Zellen heften sich schnell an und vermehren sich, um die luminale Oberfläche des Gefäßkanals zu bedecken (Abbildung 2B). Zellen, die sowohl an der unteren als auch an der oberen luminalen Oberfläche haften, weisen eine gleichmäßige Verteilung innerhalb des Lumens auf (Ergänzende Abbildung S1).

Die Platte wurde für 3 Tage in einen befeuchteten Inkubator gelegt, um die Silikontinte aushärten zu lassen und gleichzeitig sicherzustellen, dass das Opfermuster frei von Austrocknung blieb (Abbildung 3A). Um die Strömung durch diese Kanäle zu bewerten, wurden grüne Mikrokügelchen eingeführt, die zeigen, dass die Kanäle effektiv perfundierbar sind (Ergänzendes Video S1). Der Durchmesser der Kanäle wurde von 558 ± 38 μm auf 1094 ± 45 μm variiert, indem die Düsengröße während des Opfermodelldrucks von 22 G auf 18 G geändert wurde. Zusätzlich wurde die geometrische Konfiguration der Kanäle durch Modifikation des G-Codes des Biodruckers manipuliert (Supplemental File 1), um das Drucken von gewundenen und gegabelten Mustern zu ermöglichen (Abbildung 3B).

Die Vernetzungsdauer mit UV wurde auf 120 s optimiert, was eine effektive Zellproliferation unterstützt (Ergänzende Abbildung S2). Diese Vernetzungsdauer führte zu einer physiologisch relevanteren Umgebung, die die Proliferation von Endothelzellen fördert, wahrscheinlich aufgrund der ausgewogenen mechanischen Eigenschaften und Porosität des Hydrogels, was eine bessere Zelladhäsion und anschließende Proliferation ermöglicht. HUVECs vermehrten sich effektiv auf der luminalen Oberfläche und zeigten am Tag 5 nach der Aussaat eine kopfsteinpflasterartige Morphologie. Die Reifung des Endothels wurde mit einem CCK8-Assay bewertet, der an den Tagen 1, 3 und 5 durchgeführt wurde (Abbildung 4A, B). Die Reifung des Endothels wurde durch Immunfärbung für CD31 5 Tage nach der Zellaussaat verifiziert, die die Lokalisation von CD31 an den Tight Junctions zeigte (Abbildung 4D).

Um die Barrierefunktion des Endothels zu bewerten, perfundierten wir am 5. Tag der Reifung eine 70 kDa Dextranlösung durch die Kanäle. Zum Vergleich wurde ein Kontrollkanal ohne Endothel (blank) gewählt. Der endothelialisierte Kanal zeigte im Laufe der Zeit minimale Veränderungen der Fluoreszenz innerhalb der perivaskulären Gelregion, was darauf hindeutet, dass das Endothel seine Barrierefunktion effektiv beibehielt. Die nackten Kanäle zeigten jedoch eine Zunahme der Fluoreszenz in der perivaskulären Gelregion, was auf eine höhere Permeabilität aufgrund des Fehlens von Endothel hinweist (Abbildung 4C und Abbildung 4E).

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Abbildung 1: Präparation von gedruckten Gefäßkanälen und deren Konfigurationen. (A) Schematische Darstellung der Herstellung, Endothelisierung und Permeabilitätsuntersuchung von gedruckten Gefäßkanälen. (B) Schematische Darstellung der drei Konfigurationen, die in diesem Verfahren demonstriert werden: gerade, gegabelt und gewunden. Abkürzung: VOPs = Gefäße auf einer Platte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Zeitleiste für die Herstellung des Drucks des Opfermusters und der Siliziumkammer sowie der Endothelisierung des Gefäßkanals. (A) Die Abbildung stellt eine einzelne Vertiefung der Vertiefungsplatte dar und AA' bezieht sich auf die Ansicht entlang der Querschnittsebene. (B) Repräsentative Bilder der Schritte des Herstellungsprozesses. Maßstabsstäbe = 5 mm (B1), 200 μm (B2-4). Abkürzungen: GelFib = 15 % Gelatinemethacrylat und 1 % Fibrinogen in 0,05 % w/v Lithiumphenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinat-Lösung; HUVECs = Endothelzellen der menschlichen Nabelschnurvene. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Gefäße auf einer Platte. (A) Bruttobild von Gefäßen auf einer Platte nach dem Drucken des Opfermusters und der Silikonkammer. (B) Demonstration der Multiskalenherstellung von Gefäßkanälen mit einer Vielzahl von Konfigurationen und Größen, die mit grünen Mikrokügelchen durchblutet sind. Maßstabsbalken = 200 μm (gerade Kanäle), 1.000 μm (gewellte und gegabelte Kanäle). Abkürzungen: ID = Innendurchmesser. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Gefäßkanäle und ihre endotheliale Reifung und Permeabilität. (A) Fluoreszenzmikroskopische Bilder von Gefäßkanälen an den Tagen 1, 3 und 5 nach der Aussaat mit grün fluoreszierenden Protein-markierten HUVECs, die die Proliferation und die Kopfsteinpflastermorphologie von HUVECs an Tag 5 zeigen. (B) Die Endothelreifung wurde mit einem CCK-8-Assay an den Tagen 1, 3 und 5 nach der Zellaussaat bewertet. (C) Permeabilitätsassay von endothelialisierten (Endothel +) und nackten (Endothel -) Gefäßkanälen. (D) Repräsentative Bilder der CD31-Färbung veranschaulichen die Lokalisation von CD31 an Tight Junctions am Tag 5. (E) Quantifizierung der Diffusionspermeabilität. Maßstabsleisten = 200 μm (A, C, D). Abkürzungen: HUVECs = Endothelzellen der menschlichen Nabelvene; GFP = grün fluoreszierendes Protein; GFP HUVECs = GFP-getaggte HUVECs; CCK-8 = Zellzählkit 8; DAPI = 4'6-Diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

DruckerschwärzeParameter drucken
Düsen-ManometerTemperatur (°C)Luftdruck (kPa)Kopfgeschwindigkeit (mm/min)
Opfer-Tinte183740-48200
20
22
Silikon-Tinte225100

Tabelle 1: Druckparameter für die Opfer- und Silikontinten.

Ergänzende Datei 1: G-Code-Skript mit den Befehlen für den 3D-Druck des Opfermusters und der Silikonkammer in einer Sechs-Well-Platte. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S1: Repräsentative Bilder der unteren und oberen luminalen Oberfläche nach dem Zell-Seeding, die die Bindung von GFP-HUVEC sowohl in der unteren als auch in der oberen Brennebene zeigen. Maßstabsleisten = 200 μm. Abkürzungen: UU' = obere Brennebene; LL' = untere Brennebene. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S2: GFP-HUVEC-Proliferation unter unterschiedlichen Vernetzungsdauern mit UV (405 nm). Maßstabsleisten = 200 μm. Abkürzungen: HUVECs = Endothelzellen der menschlichen Nabelvene; GFP = grün fluoreszierendes Protein; GFP HUVECs = GFP-getaggte HUVECs. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzendes Video S1: Perfusion mit grünen Mikrokügelchen, die die effektive Perfusion durch die geraden, gewundenen und gegabelten Kanäle zeigen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle S1: Funktionen von G-Code- und M-Code-Befehlen. HINWEIS: Im G-Code geben X, Y und Z die Koordinaten für die Bewegung entlang der X-Achse, der Y-Achse bzw. der Z-Achse an. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Unter Ausnutzung der Präzision, Automatisierung und computergesteuerten Natur der 3D-Bioprinting-Technologie haben wir eine optimierte Methode zur Herstellung von Gefäßkanälen in Standard-Sechs-Well-Platten entwickelt, die aufgrund ihrer Kompatibilität mit kommerziellen Mikroplatten-Readern und Mikroskop-Bildgebungseinrichtungen ausgewählt wurden. Das Design der Platte kann Kanäle mit mehreren Größen und ein ausreichendes Medienvolumen für das Wachstum größerer Kanäle aufnehmen, während die erforderliche Häufigkeit von Medienwechseln verringert wird. Zukünftige Anpassungen dieses Designs könnten an andere kommerziell erhältliche Standard-Well-Platten angepasst werden, wodurch der experimentelle Durchsatz erhöht und der Materialverbrauch verringert wird.

Mikrofluidische Plattformen verwenden aufgrund seiner Ungiftigkeit, Gasdurchlässigkeit und hohen Transparenz häufig ein Silikonpolymer namens PDMS28. Die geringe Formtreue von PDMS schränkt jedoch die Verwendung im Mikroextrusions-basierten Bioprinting für die Chipherstellung mit hoher Formtreue ein. SE170029, ein weiteres Silikonpolymer, bietet eine höhere Präzision beim Bau von Kammern für die Gewebeherstellung, aber seine hohe Viskosität erfordert größere Düsen und einen hohen pneumatischen Druck. Wir haben eine Mischung aus SE1700 und PDMS formuliert, die mit kleineren Düsen verwendet werden kann und so die Fertigung in engen Bereichen mit hoher Präzision und Formtreue ermöglicht. Andere Arten von Polymeren, wie z. B. Polycaprolacton (PCL) oder Polyethylenvinylacetat (PEVA), können aufgrund ihrer hohen Formtreue ebenfalls für den Kammerdruck verwendet werden30.

Entscheidend ist auch die optische Transparenz von GelMA31. Im Gegensatz zu anderen EZM-basierten Hydrogelen - wie z. B. Kollagen, das nach der Vernetzung undurchsichtig wird - behält GelMA die Transparenz bei und ermöglicht so eine zelluläre Echtzeitanalyse innerhalb der Kanäle, selbst wenn die Kanalgröße zunimmt. Dieser Aspekt bietet einen großen Vorteil gegenüber Methoden, die dünne Schnitte für die Beobachtung erfordern, wenn die Größe des Konstrukts erhöht wird32. Die biologische Abbaubarkeit von GelMA erleichtert den Ersatz des EZM-Gerüsts durch neues, funktionelles Gewebe, wenn es sich auflöst, und bietet dadurch den notwendigen Raum für das Wachstum von neu gebildetem funktionellem Gewebe33,34. Darüber hinaus eignet es sich aufgrund seiner nachweislich geringen Zytotoxizität hervorragend für Tissue-Engineering-Anwendungen35,36. Die hervorragenden mechanischen Eigenschaften von GelMA machen es zu einem guten Kandidaten für Anwendungen im Bereich der vaskulären Gewebezüchtung37. Seine Wirksamkeit bei der Erleichterung der Endothelisierung von Gefäßkanälen mit HUVECs ist gut dokumentiert38.

Die in dieser Studie für die Endothelisierung verwendeten Zellen, HUVECs, weisen eine hohe Isolationserfolgsrate auf und sind ein außergewöhnliches Modell für die Untersuchung einer Vielzahl von Herz-Kreislauf- und Stoffwechselerkrankungen39. Dieser Ansatz kann jedoch auf verschiedene Arten von Endothelzellen zugeschnitten werden, einschließlich solcher, die aus Arterien oder direkt von Patienten stammen. Diese Anpassungsfähigkeit ermöglicht die Erstellung patientenspezifischer Gefäßgewebemodelle, die die Bewertung des individuellen Ansprechens auf bestimmte Medikamente erleichtern.

Dieses Protokoll enthält einige wichtige Schritte, die die Leser im Hinterkopf behalten sollten. Erstens ist die Plasmabehandlung entscheidend, um die Oberflächeneigenschaften der Platte zu modifizieren, insbesondere um die Hydrophilie zu verbessern, da die meisten kommerziellen Well-Platten hydrophob sind. Durch die Plasmabehandlung werden polare funktionelle Gruppen auf die Oberfläche eingebracht, wodurch die Bindungsfähigkeit mit der Siliziumkammer und dem Hydrogel verbessert wird. Zweitens ist die Temperaturkontrolle von entscheidender Bedeutung, da sich die Opfertinte bei niedrigeren Temperaturen verflüssigt und die Silikontinte niedrigere Temperaturen benötigt, um eine vorzeitige Aushärtung zu verhindern, die die Extrusion der Tinte durch die Düse behindern kann. Drittens ist die gründliche Entfernung aller Spuren von PF127 von entscheidender Bedeutung, da jedes verbleibende PF127 die zellulären Prozesse nachteilig beeinflussen kann, z. B. durch Beeinträchtigung der Zelladhäsion40. Viertens können die Zellen, wenn sie während der Zellkultur auf eine Konfluenz von mehr als 90 % anwachsen, aufgrund der Konkurrenz um Platz und Nährstoffe Stress erleben. Dieser Stress kann zu einem veränderten Zellverhalten, einer verminderten Zelllebensfähigkeit und Veränderungen der zellulären Mikroumgebung führen. Um die Zellgesundheit und die richtige Proliferation zu erhalten, wird empfohlen, Kulturen unter 90 % Konfluenz zu halten. Fünftens ist es wichtig, die Platte vor und nach der Inversion flach im Inkubator zu halten, um eine gleichmäßige Zelladhäsion im Kanal und letztendlich eine gleichmäßige Endothelisierung zu erreichen. Schließlich ist die Aufrechterhaltung einer konsistenten Belichtungszeit, der Anregungslaserintensität und des Mikroskopfokus bei der Bildaufnahme von entscheidender Bedeutung, da Schwankungen dieser Parameter die Intensität des Emissionssignals verändern und somit möglicherweise die Genauigkeit der Ergebnisse beeinträchtigen können.

Unser Ansatz ermöglicht die Erstellung von Kanälen in mehreren Konfigurationen, wie z. B. die hier gezeigten geraden, gegabelten und gewundenen Muster. Diese Anpassungsfähigkeit ist für die Replikation der verschiedenen Gefäßnetzwerkgeometrien im menschlichen Körper unerlässlich und übertrifft die Fähigkeiten traditioneller Methoden, wie z. B. das Hydrogelgießen um eine Form oder die konzentrischen, düsenbasierten Bioprinting-Techniken, die für röhrenartige Strukturen verwendet werden 30,41,42. Eine Einschränkung dieser Methode besteht jedoch darin, dass sie die Rundheit der Kanäle nicht gewährleistet, da das Opfermuster auf einer ebenen Fläche ausgelegt ist.

Der Vorteil der Konstruktion von Kanälen in mehreren Größen ist der Schlüssel zur Überwindung der Einschränkungen von mikrofluidischen Plattformen, die oft auf Mikrokanäle beschränkt sind. Diese Einschränkung kann bei herkömmlichen biochemischen Assays ein Nachteil sein. Um beispielsweise ausreichend Material für Standard-Proteinexpressionsassays wie Western Blot zu erhalten, müssen die Ergebnisse mehrerer mikrofluidischer Geräte kombiniert werden. Darüber hinaus muss das Hydrogel bei der Bildung von Hohlkanälen eine ausreichende Steifigkeit beibehalten, um den Nadelentfernungsprozess zu überstehen. Unser Ansatz verwendet ein thermoreversibles Opfermaterial, das flüssig wird, wenn die Temperatur gesenkt wird, wodurch dieser Prozess erleichtert wird, ohne die Integrität des Gels zu beschädigen. Darüber hinaus können auch andere thermoreversible Geliermaterialien, wie z. B.Gelatine 43, als Opfermaterialien in diesem Verfahren verwendet werden.

Dieser Ansatz ermöglicht eine einfache Anpassung von Gewebestrukturen auf der Platte und stellt damit ein vielversprechendes Werkzeug für pharmakologische Tests in der Wirkstoffforschung dar. Diese Methode kann das Screening von Medikamenten erleichtern, indem sie ihre Auswirkungen auf die Gefäßpermeabilität bewertet - ein Schlüsselfaktor bei der Entwicklung von Therapien für Krankheiten, die mit vaskulärer Dysfunktion einhergehen. Unser Modell kann verwendet werden, um die Gefäßpermeabilität unter bestimmten Bedingungen, wie z. B. Entzündungen, zu untersuchen und Strategien zur Gefäßnormalisierung zu entwickeln, die für die Behandlung verschiedener Krankheiten mit abnormaler Gefäßpermeabilität relevant ist44, um das Verständnis dieses Prozesses zu verbessern und potenzielle klinische Anwendungenzu entwickeln 45.

Um die Gefäßpermeabilität zu beurteilen, perfundierten wir 70 kDa Dextran durch den Gefäßkanal. Typischerweise dient ein gesundes vaskuläres Endothel als wirksame Barriere gegen Dextranmoleküle dieses Molekulargewichts46. Bei Vorliegen einer Entzündung kommt es jedoch zu einer Störung der Tight Junctions, wodurch diese Moleküle durchdringen können, wodurch die Gefäßpermeabilität erhöhtwird 30. Darüber hinaus wird fluoreszenzmarkiertes Dextran verwendet, um die Verteilung von Arzneimitteln in manipulierten Geweben zu bewerten47. Obwohl die bidirektionale Strömung und die begrenzte Steuerung der Überlaufdynamik innerhalb des Kanals die Einschränkungen dieses Modells darstellen, gehen wir davon aus, dass Endbenutzer in der Lage sein werden, das System an ihre Anforderungen anzupassen, indem sie kundenspezifische Wippen verwenden, um die Strömungsdynamik innerhalb der Kanäle zu steuern. Diese Anpassung kann die Implementierung einer pumpenlosen unidirektionalen Strömung48 umfassen.

In Zukunft könnte diese Herstellungsmethode hochskaliert werden, um komplexe Gewebe zu konstruieren. Durch die präzise Positionierung anderer Zelltypen in der Nähe von Gefäßkanälen konnten perfusierbare, vaskularisierte Gewebe erzeugt werden, wodurch eine große Herausforderung beim Bioprinting von volumetrischen Geweben überwunden wurde. Wir glauben auch, dass diese Methode für die Simulation anderer Arten von hohlen, durchlässigen Geweben wie Lymphgefäßen und Darm mit hohem Durchsatz für eine Vielzahl von biomedizinischen Anwendungen angepasst werden könnte.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Research Foundation of Korea (NRF) unterstützt, die von der koreanischen Regierung (Ministerium für Wissenschaft und IKT, MSIT) finanziert wurden [Nr. NRF-2019R1C1C1009606; Nr. 2020R1A5A8018367; und Nr. RS-2024-00423107]. Diese Forschung wurde durch das Bio- und Medizintechnik-Entwicklungsprogramm der NRF unterstützt, das vom MSIT [Nr. NRF-2022M3A9E4017151 und Nr. NRF-2022M3A9E4082654]. Diese Arbeit wurde durch das Technology Innovation Program [Nr. 20015148] und das Alchemist Project [Nr. 20012378] unterstützt, das vom Ministerium für Handel, Industrie und Energie (MOTIE, Korea) finanziert wurde. Diese Arbeit wurde auch vom Korea Institute of Planning and Evaluation for Technology in Food, Agriculture and Forestry (IPET) durch das Agriculture and Food Convergence Technologies Program for Research Manpower Development unterstützt, das vom Ministerium für Landwirtschaft, Ernährung und ländliche Angelegenheiten (MAFRA) finanziert wurde [Nr. RS-2024-00397026].

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
10 mL Serologische PipetteSPLSPL 91010
10 mL Spritze Shinchang Medical
15 mL konisches RöhrchenSPL50015
3D-Biodrucker T& R Biofab3DX-Drucker 6-Well-Platte
 SPL37206
Biologische SicherheitswerkbänkeCHC LABPCHC-777A2-04, 
Inverse HellfeldmikroskopeLeicaDMi1
Zellzählkit (CCK8)GlpBioGK10001
Zellzählkit (CCK8)GlpBioGK10001
Zellkulturflasche 75TSPL70075
Corning Matrigel Wachstumsfaktor reduziert (GFR) Basalmembranmatrix, LDEV-frei, 10 mLCorning354230
Destilliertes Wasser
DMEM/F12Gibco11320033
DMSO, ZellkulturqualitätSigma aldrichD2438
Dow-Corning, PDMS-Sylgard 184a KitDOWDC-184
DOWSIL SE 1700 Klar W/C 1,1 KG Kit DOW2924404
D-PBS - 1xWelgeneLB001-01
Endothelial Cell Growth Medium MV 2 (Ready to use)PromocellC-22022
Eppendorf Micro pipette(1000,200,100,20,10)eppendorf
Ethyl Alcohol 99,9%DuksanD5
ExcelMicrosoft
Fibrinogen aus RinderplasmaSigma AldrichF8630-1G
FITC Dextran 70 kDaSigma Aldrich46945-100MG-F
Fluoreszierende Kügelchen (1,0 μ m, grün)Sigma AldrichL1030-1ML
GelMA-Pulver (Gelatinemethacrylat) 50 g3D Materialien 20JT29
Gibco, Einfriermedium für Wiederherstellungszellkulturen, 50 mLGibco
HUVECs (humane Endothelzellen der Umbillalvene)Promocell
ImageJ SoftwareNIH
InkubatorThermo SCIENTIFICForma STERI-CYCLE i160 CO2 Inkubator
Invitrogen, Lebend-/Totlebensfähigkeits-/Zytotoxizitätskit (für Säugetierzellen)Thermo FisherL3224
Lithiumphenyl (2,4,6-trimethylbenzoyl) phosphatpulver Tokoyo Chemical Industry CO.85073-19-4 
Marienfeld Superior, ZählkammerdeckelMarienfeld Superior
Marienfeld Superior, Hämozytometer, ZellzählkammerMarienfeld SuperiorHSU-0650030
MikrozentrifugeeppendorfCentrifuge 5920 R
NCViewer.com
StickstofftankWORTHINGTON INDUSTRIESLS750
Omnicure UV LaserEXCELITASSERIES 1500
Parafilm MamcorPM-996
Penicillin-Streptomycin Lösung (100x)GenDEPOTCA005-010
PlanetenmischerTHINKY CORPORATION, japanARE-310
PlasmabehandlungsmaschineFEMTO SCIENCECUTE-1MPR
Pluronic F-127Sigma aldrichP2443-250G
Vorgefertigter Puffer, (P2007-1) 10x PBSBiosesangPR4007-100-00
Reagenzien-AufbewahrungsschrankZIO FILTER TECHSC2-30F-1306D1-BC
Echtzeit Live Cell Imaging MikroskopCarl ZEISS
KühlschrankSAMSUNGRT50K6035SL
ROCKER 2D digitalIKA4003000
Schaufel-SpatelCacheBySL-SCO7001-EA
Sigma, Trypsin-EDTA Solition, 0,25%Sigma aldrichT4049-100ML
Natriumdodecylsulfat (SDS)Thermo Fisher scientific151-21-3
Spritzenzylinder SpitzenkappeFISNAR3051806
Tally-ZählerControl Company  C23-147-050
Konische Düse (18 G)MushashiTPND-18G-U
Konische Düse (22 G)MushashiTPND-22G-U
Konische Düse 20 GMusashiTPND-20G-U
Thrombin aus RinderplasmaSigma AldrichT7326-1KU
Timer, 4-KanalETLSL. Tim3005
Trypan Blue Lösung 0,4%Gibco15250061
Trypsin NeutralisationslösungPromocellC-41120
UG 24 mL UG SalbenglasYamayuNr. 3-53
UG 58 mL UG SalbenglasYamayuNr. 3-55
WasserbadDAIHAN ScientificWB-11
KraftmaschineSartoriusBCE2241-1SKR

Referenzen

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3D BioprintingVascular Tissue ModelsEndothelial CellsHydrogel ChannelsPerfusable VesselsImmunostaining CD31Blood Vessel Modeling

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