Basalmembranmatrix Verkapselte Zellaggregation zur Untersuchung der Milzgewebebildung von Mäusen

Summary

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Aggregation und Verkapselung von Milzzellen in einer halbfesten Basalmembranmatrix. Basalmembranmatrix-Konstrukte können in dreidimensionalen Kulturen zur Untersuchung der Organoidentwicklung oder für In-vivo-Transplantations - und Geweberegenerationsstudien verwendet werden.

Abstract

Die Milz ist ein Immunorgan, das eine Schlüsselrolle bei der durch Blut übertragenen Immunantwort spielt. Der anatomische oder funktionelle Verlust dieses Gewebes erhöht die Anfälligkeit für schwere Blutinfektionen und Sepsis. Die Autotransplantation von Milzschnitten wurde klinisch eingesetzt, um verlorenes Gewebe zu ersetzen und die Immunfunktion wiederherzustellen. Der Mechanismus, der eine robuste und immunologisch funktionelle Milzgeweberegeneration antreibt, ist jedoch noch nicht vollständig geklärt. Hier wollen wir eine Methode zur Aggregation und Verkapselung von Milzzellen innerhalb einer halbfesten Matrix entwickeln, um die zellulären Anforderungen für die Bildung von Milzgewebe zu untersuchen. Verkapselte Zellkonstrukte mit Basalmembranmatrix sind sowohl für die In-vitro-Gewebekultur von dreidimensionalen Organoiden als auch für die Transplantation unter der Nierenkapsel geeignet, um die in vivo-Gewebebildung direkt zu beurteilen. Durch die Manipulation der Eingangszellen für die Aggregation und Verkapselung zeigen wir, dass aus Transplantaten gewonnene PDGFRβ⁺MAdCAM-1-neonatale Stromazellen für die Regeneration von Milzgewebe unter Tiertransplantationsmodellen benötigt werden.

Introduction

Ein traumatischer Milzriss und das Auftreten mehrerer Milzknötchen im Körper war einer der ersten Hinweise darauf, dass Milzgewebe eine Regenerationsfähigkeit besitzt ^1,2. Später wurden Milz-Autotransplantationen in die Klinik eingeführt, um Milzgewebe bei Patienten zu erhalten, die eine Notfall-Splenektomie^{benötigten 3}. Doch obwohl sie seit Jahrzehnten Teil der klinischen Praxis ist, ist nur sehr wenig darüber bekannt, wie sich die Milz regeneriert. Tiertransplantationsmodelle haben Einblicke in mehrere Parameter der Milzregeneration und der Immunfunktion gegeben ^4,5. Insbesondere experimentelle Modifikationen der Transplantatpräparationsmethode haben es ermöglicht, die Geweberegeneration auf zellulärer und molekularer Ebene genauer zu untersuchen.

Transplantationen mit ganzen Milzschnitten durchlaufen eine Phase der Massennekrose, bevor eine neue Milzstruktur wieder aufgebaut wird⁶. Die Anfangsphase der Transplantatnekrose deutet darauf hin, dass der Großteil des transplantierten Gewebes größtenteils aus roten und weißen Blutkörperchen besteht und für die Milzregeneration unnötig ist. Dies wurde experimentell untersucht, indem hämatopoetische Zellen aus Milztransplantaten vor der Transplantation unter die Nierenkapsel der Maus ausgeschlossen wurden. Hier wurde gezeigt, dass die Nicht-Leukozyten/Nicht-Erythrozyten-Fraktion der Milz, die Stroma- und Endothelzellen umfasst, ausreicht, um die De-novo-Gewebebildung zu induzieren⁷. Milzstromagewebe könnte zu einer Einzelzellsuspension weiterverarbeitet werden, was den Einsatz von Zellsortiertechnologien zur Manipulation der zellulären Transplantatzusammensetzung ermöglicht. Durch selektive Entfernung von Kandidatenzelltypen wurden zwei CD45-TER-119-Stromazellpopulationen identifiziert, die für die Transplantatentwicklung unerlässlich waren: eine endothelähnliche CD31⁺CD105⁺MAdCAM-1⁺-Zellpopulation und eine weiter gefasste PDGFRβ⁺-mesenchymale Zellpopulation⁸.

Der Aufbau von Transplantaten aus Milzzellen variiert in Bezug auf Stützmaterialien und Zellbeladungsprozesse. Tissue-Züchtungsmilz wurde zuvor durch Laden von Milzeinheiten auf ein Polyglykolsäure/Poly-L-Milchsäure-Polymergerüst ^5,9 hergestellt. Interessanterweise konnten sich Milzstromazellen, die in einen Kollagenschwamm absorbiert wurden, nicht transplantieren, während Stromazellen, die aggregiert und über eine Kollagenschicht geladen wurden, die Milzregeneration erleichterten⁸. Es wurde auch gezeigt, dass die Resuspension von Milzstromazellen innerhalb einer Matrigel-Matrix die Zellaggregation unter dreidimensionalen Kulturbedingungen induziert¹⁰. Diese Methode wurde jedoch nicht für den Einsatz in Transplantationsmodellen getestet. Das übergeordnete Ziel des aktuellen Protokolls besteht darin, Milzstromazellen direkt in der Basalmembranmatrix zwangsweise zu aggregieren und einzukapseln, die anschließend in ein dreidimensionales In-vitro-Gewebekultursystem überführt oder als Vehikel für Tiermodelltransplantationen verwendet werden können (Ergänzende Abbildung 1).

Protocol

Alle Tierversuche wurden nach Versuchsprotokollen durchgeführt, die von der Tierethikkommission der University of Queensland (UQBR/079/19) genehmigt wurden.

1. Gewebeentnahme und Stromazellvorbereitung

1. Einschläferung von 0,5-1,5 Tage alten männlichen und/oder weiblichen neugeborenen BALB/c-Spendermäusen durch Induktion von Unterkühlung, indem die Tiere in das Seidenpapier eingewickelt und für >10 Minuten unter zerstoßenes Eis gelegt werden.
   HINWEIS: Dieses Protokoll kann an verschiedene Mausstämme, Altersgruppen und die Anzahl der Tiere angepasst werden.
2. Bereiten Sie sterile chirurgische Instrumente vor.
3. Legen Sie die Maus in eine rechte Seitenlage. Tupfen Sie die Haut mit 80% Ethanol ab und machen Sie einen 1 cm langen Schnitt mit einer chirurgischen Irisschere, um die Peritonealwand freizulegen.
4. Machen Sie einen zweiten 0,5 cm langen Schnitt über der Milz und heben Sie das Gewebe mit einer feinen Pinzette vorsichtig an. Verwenden Sie eine chirurgische Schere, um die Blutgefäße zu schneiden und das Gewebe herauszuschneiden. Übertragen Sie das Gewebe in eine Petrischale mit eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Entfernen Sie das restliche Bindegewebe, das an der Milz haftet.
   HINWEIS: Ein Stereomikroskop kann feinmotorische Bewegungen unterstützen, die für die Manipulation chirurgischer Instrumente erforderlich sind.
5. Um ganze Gewebe zu dissoziieren, übertragen Sie neonatale Milz (Pools von 10 oder weniger) in den inneren Rand einer umgekehrten konischen 14-ml-Röhrchenkappe. Mechanisches Aufbrechen von Geweben mit einer Pressbewegung mit dem Kunststoff-hinteren Ende eines 1-ml-Spritzenkolbens.
6. Setzen Sie die Kappe fest über ein konisches 14-ml-Röhrchen mit 10 ml kaltem PBS. Drehen Sie das Röhrchen 5x um, um das gesamte zerbrochene Gewebe von der Kappe in das Röhrchen zu waschen.
7. Wiederholen Sie Schritt 1.6 für restliches Gewebe.
8. Lassen Sie das Röhrchen 1 Minute lang auf Eis, damit sich das Gewebe am Boden des Röhrchens absetzen kann.
9. Der Überstand (der hämatopoetische Zellen enthält) wird vorsichtig verworfen, indem die Lösung durch ein reversibles 70-μm-Zellsieb geleitet wird.
10. Die unlösliche Stromafraktion wird zurückgewonnen, indem das Sieb umgedreht und das Stromagewebe mit frisch zubereiteten 2 ml supplementiertem Dulbecco's Modified Eagle Medium (sDMEM) mit 1 mg/ml Kollagenase IV, 40 μg/ml DNase I und 2 % fötalem Kälberserum (FBS) zurück in das konische 14-ml-Röhrchen gewaschen wird.
    ACHTUNG: Kollagenase IV und Kollagenase D sind gefährliche Stoffe und müssen in einer Biosicherheitswerkbank mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung gehandhabt werden.
11. Zur Herstellung einer Einzelzellsuspension wird gepooltes Gewebe (bis zu 20) 10 min lang bei 37 °C mit konstanter Rotation enzymatisch verdaut.
12. Geben Sie 4 ml frisch zubereitetes sDMEM mit 1 mg/ml Kollagenase D, 40 μg/ml DNase I und 2 % FBS direkt in das Röhrchen mit Stromagewebe. Weitere 10 min bei 37 °C mit konstanter Rotation inkubieren.
13. Stoppen Sie die Verdauung, indem Sie 8 ml eiskaltes PBS hinzufügen. Die Zellen werden durch Zentrifugieren bei 200 x g für 5 min bei 4 °C gesammelt.
14. Der Überstand wird verworfen und die Zellen werden zweimal gewaschen, indem sie in 1 ml kaltem PBS resuspendiert und 5 Minuten lang bei 4 °C bei 200 x g zentrifugiert werden. Halten Sie die Zellen auf Eis.
    HINWEIS: Zellen können gezählt und auf eine gewünschte Konzentration eingestellt werden. Dies kann eine Optimierung für verschiedene Zellpopulationen erfordern. Mit diesem Protokoll werden in der Regel 0,5 x 10⁶- 1 x 10⁶ Stromazellen/Milz gewonnen, abhängig vom Alter der Spendermäuse. Zellen können in dieser Phase optional gefärbt und FACS sortiert werden, um die Zellzusammensetzung zu definieren.

2. Matrixverkapselung von Zellaggregaten

1. Sterile P200-Pipettenspitzen in einem -20 °C-Gefrierschrank vorkühlen.
2. Schneiden Sie flexible Laborfolie (z. B. Parafilm) in 1 cm x 2 cm große Stücke und sterilisieren Sie sie, indem Sie 10 Minuten lang 80 % Ethanol und anschließend 10 Minuten lang PBS eintauchen. Laborfilme können im Voraus vorbereitet und steril gelagert werden.
3. 0,5 x 10 6-2,5 x 10⁶ Zellen durch Zentrifugieren bei 200 x g für 5 min bei 4 °C vorbereiten. Saugen Sie den Überstand vorsichtig an, wobei etwa 20 μl des verbleibenden PBS-Volumens übrig bleiben. Halten Sie das Zellpellet auf Eis.
   HINWEIS: Das verbleibende PBS kann sanft abgesaugt werden, ohne das Zellpellet zu stören, um das Volumen zu bestätigen.
4. Aspirieren Sie 2 μl eiskalte Basalmembranmatrix mit einer P20-Pipette in eine vorgekühlte P200-Pipettenspitze.
   HINWEIS: Eine hochkonzentrierte Basalmembranmatrix (z. B. Corning Matrigel Matrix High Concentration) hilft bei der Bildung eines starken erstarrten Pfropfens.
5. Drehen Sie vorsichtig, um die Pipettenspitze auszuwerfen. Dehnen Sie einen vorsterilisierten Streifen der Laborfolie und legen Sie ihn über das Ende der Pipettenspitze, wobei Sie darauf achten, dass die Folie nicht durchstochen wird. Wickeln Sie die Spitze weiter in die Folie, um die Pipettenspitze zu versiegeln. Legen Sie die versiegelte Spitze vorsichtig direkt auf Eis und achten Sie darauf, dass die Folie nicht reißt.
6. Resuspendieren Sie das Zellpellet im verbleibenden PBS und schichten Sie die Lösung vorsichtig über die Basalmembranmatrix. Halte das Konstrukt auf Eis.
7. Bereiten Sie ein Zentrifugenröhrchen vor, indem Sie ein 1,2-ml-Clusterröhrchen in ein konisches 14-ml-Röhrchen legen.
8. Setzen Sie die Pipettenspitze in die geschachtelte Röhrchenkonfiguration ein und zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei 400 x g und 4 °C.
9. Positionieren Sie das konische 14-ml-Röhrchen in vertikaler Ausrichtung und inkubieren Sie es 15 Minuten lang bei 37 °C, damit sich die Basalmembranmatrix in der Pipettenspitze verfestigen kann.
   HINWEIS: Das konische 14-ml-Röhrchen kann auf Eis gelegt werden, bis es für die nachgeschaltete Anwendung benötigt wird.

3. Dreidimensionale Organoidkultur

1. Entfernen Sie vorsichtig die Laborfolie von der Pipettenspitze.
2. Führen Sie einen dünnen Edelstahldrahtkolben durch die größere Öffnung der Pipettenspitze ein.
3. Stoßen Sie den Matrixstopfen, bis er durch die Spitze gelöst wird, in eine Vertiefung einer unbehandelten 6-Well-Gewebekulturplatte aus, die 2 ml sDMEM enthält, ergänzt mit 10 % FBS, 1x Glutamax, 1x nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA), 10 μM Rock-Inhibitor, 10 U/ml Penicillin/Streptomycin und 50 μM β-Mercaptoethanol.
   HINWEIS: Das Gewebekulturgefäß und das entsprechende Medienvolumen können nach Bedarf eingestellt werden.
   ACHTUNG: NEAA, Penicillin/Streptomycin und β-Mercaptoethanol sind gefährliche Stoffe und müssen in einer Biosicherheitswerkbank mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung gehandhabt werden.
4. Kultivieren Sie Organoide 4-12 Wochen lang bei 37 °C, 5 % CO₂ und 95 % Luftfeuchtigkeit.
5. Ersetzen Sie alle 5 Tage die Hälfte des Mediums.
   HINWEIS: Wenn sich Organoide an der Gewebekulturplatte festsetzen, in eine frische Vertiefung übertragen.

4. Nierenkapseltransplantation

1. Bereiten Sie sterile chirurgische Instrumente vor.
2. Führen Sie eine subkapsuläre Nierentransplantation des Basalmembran-Matrix-Plugs durch:
   1. Betäuben Sie eine 8 Wochen alte weibliche BALB/c-Empfängermaus mit Isofluran gemäß den Richtlinien der institutionellen Tierethik.
      ACHTUNG: Isofluran ist ein gefährlicher Stoff. Abgase müssen abgespült werden, um das Eindringen in die Arbeitsumgebung zu verhindern.
   2. Legen Sie die Maus in eine rechte Seitenlage.
   3. Rasieren Sie die Haare von der Operationsstelle und desinfizieren Sie die Haut gemäß den institutionellen Richtlinien.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, die Operationsstelle dreimal in kreisenden Bewegungen mit einem abwechselnden Peeling auf Jod- oder Chlorhexidin- und Alkoholbasis zu desinfizieren.
   4. Machen Sie einen 2 cm langen Schnitt in der Haut senkrecht zur Wirbelsäule, um die Peritonealwand freizulegen.
      HINWEIS: Für den Hautschnitt kann eine feine chirurgische Schere oder eine Skalpellklinge verwendet werden. Benutzer sollten die Richtlinien für die Ethik institutioneller Tiere oder Standardarbeitsanweisungen befolgen.
   5. Machen Sie einen kleineren 0,5 cm langen Schnitt in der Peritonealwand über der Niere.
      HINWEIS: Der Schnitt sollte ungefähr der Nierenbreite entsprechen, um sicherzustellen, dass die Niere während der Transplantation außen bleibt.
   6. Äußere die Niere durch die Peritonealöffnung, indem Sie mit Daumen und Zeigefinger Druck nach unten ausüben. Eine Ringpinzette kann verwendet werden, um die Exteriorisation zu unterstützen. Stellen Sie sicher, dass die Niere während des gesamten Eingriffs feucht ist, indem Sie regelmäßig steriles PBS mit einem Wattestäbchen auftragen.
   7. Drücken Sie unter einem Stereomikroskop das perirenale Fett der Nierenkapsel mit einer gebogenen ultrafeinen Pinzette an einem Pol der Niere zusammen. Verwenden Sie ein zweites Paar gebogener ultrafeiner Pinzetten, um die Membran der Nierenkapsel vorsichtig in entgegengesetzter Richtung nach oben zu reißen, wodurch eine kleine Öffnung entsteht.
   8. Führen Sie den Stift einer Pinzette vorsichtig unter die Kapselmembran ein. Trennen Sie mit einer langsamen Schwungbewegung die Kapselmembran vom Nierenparenchym.
   9. Bereiten Sie den Basalmembran-Matrix-Stopfen für die Transplantation vor, indem Sie den Laborfilm von der Pipettenspitze entfernen.
   10. Heben Sie die Nierenkapsel mit einem Zinken der Pinzette an und führen Sie die Pipettenspitze durch die Öffnung und drücken Sie sie in Richtung des gegenüberliegenden Pols der Niere.
   11. Führen Sie einen Drahtkolben in die Pipettenspitze ein und drücken Sie den Matrizenstopfen aus, während Sie gleichzeitig die Pipettenspitze aus der Niere ziehen.
   12. Befeuchten Sie die Niere mit PBS und internalisieren Sie sie erneut.
   13. Verschließen Sie die Peritonealwand mit einer 5-0 Vicryl-Naht und verschließen Sie die Haut mit zwei Autoclips.
   14. Verabreichen Sie ein Analgetikum (Buprenorphin in einer Dosierung von 0,05-0,1 mg/kg subkutan oder gemäß den Richtlinien für die Ethik institutioneller Tiere).
       ACHTUNG: Buprenorphin ist ein gefährlicher Stoff und muss mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung gehandhabt werden.
3. Schalten Sie den Fluss von Isofluran aus, aber lassen Sie den Sauerstofffluss eingeschaltet, damit die Maus reinen Sauerstoff atmen kann, bis sie das Bewusstsein erlangt.
4. Bringen Sie die Maus in ihren Käfig zurück. Halten Sie das Tier während der Genesung warm, indem Sie den Käfig teilweise auf ein Heizkissen oder unter eine Wärmelampe legen, und überwachen Sie, bis sich die Maus vollständig von der Narkose erholt hat.
5. Überwachen Sie die postoperative Genesung in den ersten zwei Wochen oder gemäß den institutionellen Richtlinien.

Results

Die Zellaggregation ist wichtig, um den Kontakt und die Signalübertragung von Zelle zu Zelle zu fördern. Die Umhüllung von Zellaggregaten in der Basalmembranmatrix unterstützte sowohl 3-dimensionale Kulturen für die Bildung von In-vitro-Gewebeorganoiden als auch die mechanische Abgabe von Zellen in die Nierenkapsel für die Transplantattransplantation. Um diese Konstrukte zu etablieren, wurde die Basalmembranmatrix zunächst unter eiskalten Bedingungen in einem fluidischen Zustand gehalten. Die Zellaggregation wurde anschließend erreicht, indem eine konzentrierte Zellsuspension darüber geschichtet und die Zentrifugalkraft verwendet wurde, um die Zellen durch die Matrix mit hoher Dichte zu drücken. Eine Optimierung der Zentrifugationsgeschwindigkeit (200-2000 x g) war erforderlich, um eine Mittelschichtzellenpositionierung (Abbildung 1A) zu erreichen, die auch von der Zellzahl abhängig war. Höhere Zentrifugalkräfte (>500 x g) trieben die Zellen bis zur Spitze der Pipette (Abbildung 1B), und Vorsicht ist geboten bei kleineren Zellzahlen (d. h. <5 x 10⁵), die beim Entfernen der flexiblen Laborfolienabdeckung verloren gehen können. Umgekehrt können Zellen nicht ausreichend durch die Basalmembranmatrix wandern, wenn die G-Kräfte zu niedrig sind (≤200 x g) (Abbildung 1C). Die Zentrifugationsgeschwindigkeit für Zellnummern <1 x 10⁵ oder >2,5 x 10⁶ muss möglicherweise weiter optimiert werden. Nach der Zentrifugation wurden die Zellen in die Basalmembranmatrix gesetzt, indem das Konstrukt 15 Minuten lang bei 37 °C erwärmt wurde. Dieser Erstarrungsprozess ermöglichte es, den Matrix-"Stecker" mit einem dünnen Drahtkolben vollständig auszuwerfen (Abbildung 1D).

In-vitro-Organoidbildung der Milz
Basalmembran-Matrix-Pfropfen, die in ein geeignetes Gewebekulturgefäß ausgeworfen wurden, bildeten reproduzierbar 3-dimensionale organoidähnliche Strukturen, die unter Verwendung von Standard-Gewebekulturtechniken und -bedingungen (37 °C, 5 % CO₂, 95 % Luftfeuchtigkeit) aufrechterhalten werden ^konnten11. In Kultur löste sich das unterstützende Basalmembranmatrixsubstrat zwischen den Tagen 0 und 14 allmählich auf (Abbildung 2A, i-iii) und konnte am 21. Tag nicht mehr beobachtet werden, so dass eine intakte organoidartige kugelförmige Zellmasse (Abbildung 2A, vi) mit einem Durchmesser von etwa 545 μm (s.d. = 120 μm, n = 6)¹¹ zurückblieb. Diese Organoidstrukturen wurden in Kultur über 30 Tage hinaus unterstützt, nahmen aber im Laufe der Zeit nicht an Größe zu (Abbildung 2B). Milz-Organoide bestanden aus CD45-TER-119-Stroma^-, CD45-TER-119⁺-Erythrozyten- und CD45⁺TER-119-Lymphoidzellen (Abbildung 2C), jedoch war die Häufigkeit jeder Population über einzelne Organoide hinweg variabel (n = 4; Tabelle 1). Um die allgemeine Struktur von Milzorganoiden zu beurteilen, wurden 50 μm dicke Gewebekryoschnitte angefertigt und visualisiert. Organoide bestanden aus einer nicht-hohlen Struktur, wobei Zellen über den gesamten Durchmesser des Gewebes vorhanden waren (Abbildung 2D). Die Beurteilung von Organoidschnitten bei 7 μm Einzelzellschichtdicke zeigte, dass die Zellen in schnurartigen Strukturen ohne klare räumliche Orientierung angeordnet waren (Abbildung 2D), mit kernfreien Bereichen zwischen den Zellsträngen. Die CD45-Antikörperfärbung bestätigte das Vorhandensein von kernhaltigen hämatopoetischen Zellen, die periphere Regionen des Organoids dicht umschlossen (Abbildung 2E). Darüber hinaus wurden CD45⁺-Zellen mit ausgeprägter, spindelförmiger Morphologie in zentraleren Organoidregionen beobachtet. Eine allgemeine Abwesenheit von CD90.2 (T-Zell) und CD19 (B-Zell) Antikörperfärbung, aber eine positive CD11b-Färbung zeigte das spezifische Vorhandensein myeloischer Zellen (Abbildung 2F). Nicht-hämatopoetische CD105⁺- und CD31⁺-Endothelzellen wurden auch in mehreren Organoiden nachgewiesen¹¹.

In-vivo-Milztransplantation
Die Verkapselung von aggregierten Milzstromazellen in einer halbfesten Matrix erleichtert Tiertransplantationsstudien. Diese Technik wurde verwendet, um unfraktionierte oder CD45-TER-119-FACS-sortierte neonatale Milzstromazellpräparate in einen Basalmembran-Matrixpfropfen einzubetten, der als Vehikel für die Transplantation unter die Nierenkapsel der Maus diente. In Übereinstimmung mit ähnlichen Zellaggregationsprotokollen⁸ regenerierten Basalmembranmatrix-verkapselte Zellkonstrukte (MECCs) erfolgreich Milzgewebe in 4/5 unabhängigen Tiertransplantationen und bestätigten damit die Durchführbarkeit dieser Transplantatkonstruktionstechnik. Um den Nutzen von MECCs bei der Definition von Zelltypen zu testen, die für die Milzregeneration erforderlich sind, wurden ^{MECC-Transplantate} aus neonatalen Milzzellen konstruiert, die spezifisch von PDGFRβ⁺MAdCAM-1⁺- oder PDGFRβ⁺MAdCAM-1-Stromazellen (CD45-) erschöpft waren¹¹. Transplantate ohne PDGFRβ⁺MAdCAM-1⁺-Zellen behielten die Fähigkeit zur groben Geweberegeneration (4/4 Transplantate; Abbildung 3A) ¹¹. Drei von vier regenerierten Geweben wiesen eine normale Milzzellzusammensetzung und -struktur auf und zeigten zentrale Arteriolen, weiße Pulpafollikel, segregierte T- und B-Zellkompartimente, follikuläre dendritische Zellen, retikuläre Zellen der Marginalzone und marginale metallophile Makrophagen, Sinusoide der roten Pulpa, myeloische Zellen und Makrophagen (Abbildung 3B)¹¹. Im Gegensatz dazu konnten Transplantate, denen PDGFRβ⁺MAdCAM-1-Zellen fehlten, das Milzgewebe weitgehend nicht regenerieren (1/4 Transplantate)¹¹. Diese Daten unterstützen die Bedeutung von PDGFRβ⁺-Zellen für die Regeneration von Milzgewebe⁸ und zeigen einen spezifischen Bedarf an PDGFRβ⁺MAdCAM-1-Stromazellen auf.

Abbildung 1. Basalmembranmatrix-Verkapselung von aggregierten Milzstromazellen. Eine 200-μl-Pipettenspitze wird verwendet, um die Zellaggregation in einer Basalmembranmatrix zu erleichtern. Eine fluidische Matrixschicht wird zunächst durch Ansaugen von 2 μl eiskalter Basalmembranmatrix in eine vorgekühlte Pipettenspitze hergestellt. Eine Zellsuspension wird über der Matrixschicht abgeschieden und eine Zentrifugalkraft wird ausgeübt, um Zellen innerhalb der Basalmembranmatrix zu mobilisieren und zu aggregieren. (A) Die Einstellungen für die Zentrifugengeschwindigkeit sind optimiert, um Zellaggregate in der Mitte der Matrixschicht zu positionieren. (B) Eine zu hohe Zentrifugaldrehzahl führt zu Zellen, die sich am Ende der Pipette aggregieren. (C) Unzureichende Geschwindigkeit verhindert die Zellbewegung durch die Matrix. (D) Ein halbfester Matrixpfropfen wird nach einer Inkubation bei 37 °C für 15 Minuten aus der Pipettenspitze ausgeworfen. Pfeilspitzen zeigen die Platzierung von Zellaggregaten innerhalb der Matrix an. Maßstabsstab, 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2. In-vitro-Kultur von Basalmembranmatrix-verkapselten Milzaggregaten und der Bildung von 3-dimensionalen Organoidstrukturen. (A) Entwicklung von Milzorganoiden über einen Zeitraum von 35 Tagen. Die Panels (i-vi) entsprechen den Tagen 0, 7, 14, 21, 28 und 35 in der Kultur. Die Bilder wurden mit einem Nikon TS2 Invers-Phasenkontrast-Mikroskop aufgenommen. Maßstabsstab, 500 μm. (B) Durchmesser des Milzorganoids über längere Kulturzeiträume. Jede Linie steht für ein einzelnes Organoid. (C) Durchflusszytometrische Charakterisierung von stromalen (CD45-TER-119^-), lymphoiden (CD45⁺TER-119^-) und erythroiden (CD45-TER-119⁺) Zellpopulationen nach 53 Tagen in Kultur. Oberes Bild: Kontrollgewebe aus neonatalem Milzstroma. Unteres Bild: Milz-Organoid, Tag 52. (D) Organoide Gewebe-Bruttomorphologie bei 50 μm (obere Felder) und 7 μm (untere Felder) Schnittdicken nach 22 Tagen in Kultur. (E) Lokalisation und Morphologie von hämatopoetischen CD45⁺-Zellen nach 34 Tagen in Kultur. Der vergrößerte Bereich wird in den rechten Feldern angezeigt. Die Schnitte sind 7 μm. (F) Beurteilung von myeloischen (CD11b), T- (CD90.2) und B-Zellen (CD19) nach 34 Tagen in Kultur. Der vergrößerte Bereich ist im Einschub dargestellt. Die Schnitte sind 7 μm groß. Die Bilder wurden mit einem Nikon Eclipse Ti2-E Lebendzellmikroskop aufgenommen. Maßstabsleisten (D, E, F), 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3. Analyse des Basalmembran-Matrix-Transplantatgewebes. Die Transplantate wurden aus neonatalem Milzstroma konstruiert, das von PDGFRβ⁺MAdCAM-1+-Zellen (n = 4⁾ erschöpft war. Weitere Daten online verfügbar¹¹. (A) Makroskopisches Erscheinungsbild eines regenerierten Milztransplantats 4 Wochen nach der Transplantation unter der Nierenkapsel. Der umrandete gelbe Bereich zeigt regeneriertes Milzgewebe an. Das Bild wurde mit einem Leica M60 Stereomikroskop mit Snap-Zoom-Adapter und einem Apple iPhone 6S aufgenommen. Maßstabsbalken, 1000 μm. (B) Zusammengesetzte mehrfarbige Immunfluoreszenzbilder von 30 μm dickem Transplantatgewebe, das auf der koronalen Ebene kryogeschnitten wurde. Die Antikörperfärbung wurde mit indizierten Markern durchgeführt, um die Mikroarchitektur des Milzgewebes sichtbar zu machen. Die Bilder wurden mit einem Nikon Eclipse Ti2-E Lebendzellmikroskop aufgenommen. Umrandete Bereiche zeigen Bereiche mit höherer Vergrößerung. Maßstabsstab, 1000 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Organoid-Nr.	Stromazellen	Erythrozyten	Lymphozyten
1	62	7.7	31
2	22	24	55
3	3.6	0.1	96
4	10	76	12

Tabelle 1. Prozentsatz der Stroma-, Erythroid- und lymphoiden Zellpopulationen unter den einzelnen Milzorganoiden.

Ergänzende Abbildung 1. Schematische Übersicht über das Protokoll, die die wichtigsten Schritte bei der Generierung von in Matrix eingebetteten Zellkonstrukten für In-vitro - und In-vivo-Studien hervorhebt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Die Aggregation von neonatalen Milzzellen in einem halbfesten Medium stellt eine praktikable Methode zur Erzeugung von Milzkonstrukten dar. Ähnliche Protokolle auf Basis der Basalmembranmatrix wurden verwendet, um dreidimensionale Milzkulturen zu initiieren¹⁰. Hier zeigen wir, dass Milzkonstrukte sowohl für in vitro Organoid-Kultursysteme als auch für in vivo Transplantationsmodelle geeignet sind. Bemerkenswert ist, dass die Transplantation von in vitro kultivierten Milzorganoiden noch nicht getestet wurde, aber es wäre von Interesse, die Kapazität für die vollständige oder teilweise Regeneration von Milzgewebe zu bestimmen. Dieses Protokoll erbt auch Zellaggregationstechniken, die in früheren Milztransplantationsstudien beschrieben wurden⁸. Diese Studien umfassten das Laden von Zellaggregaten über ein Kollagenblatt, gefolgt von einer Transplantation unter der Nierenkapsel. Die Umhüllung von Zellaggregaten in der Basalmembranmatrix bietet einen deutlichen Vorteil in Bezug auf die Transplantatorientierung, bei der Variationen im Zusammenhang mit der Transplantation mit der Kollagenschicht nach unten gegenüber der Transplantation mit der Zellaggregatseite nach unten eliminiert werden.

Die Methodik zur Herstellung von Basalmembran-Matrix-Konstrukten ist relativ einfach. Die Verwendung einer hochkonzentrierten Basalmembranmatrix sorgt dafür, dass die Zellen zunächst in einem aggregierten Zustand gestützt werden, bevor sich die Matrix über mehrere Tage auflöst. Nach unserer Erfahrung kommt es nach sorgfältiger Schichtung (Schritt 2.6) und Zentrifugation (Schritt 2.8) einer PBS-suspendierten Zelllösung zu einer minimalen Vermischung und Verdünnung der Basalmembranmatrix. Die meisten Optimierungen konzentrieren sich auf die Positionierung des Zellpellets innerhalb des Matrixstopfens (Abbildung 1). Dies kann durch Testen verschiedener Variablen wie Zentrifugationsgeschwindigkeit, Zeit, Volumenzusammensetzung der Basalmembranmatrix, Volumen der PBS-suspendierten Zelllösung und Pipettenspitzengröße behoben werden. Auch die Zellzahl und die Eigenschaften (Größe, Dichte) können die Einstellungen beeinflussen, und jede Zellpräparation sollte individuell optimiert werden.

Es ist wichtig, einige Einschränkungen hervorzuheben. Basalmembranmatrix kann ein temperaturempfindliches Produkt sein, und es sollte darauf geachtet werden, schnell zu arbeiten, um Reagenzien kalt zu halten. Dies verhindert eine vorzeitige Matrixverfestigung und sorgt für eine ordnungsgemäße Verkapselung der Zellen. Während alle relevanten Materialien in einer kalten Umgebung gelagert, vorbereitet oder aufbewahrt werden, können manuelle Handhabungsschritte (z. B. Auswerfen der Pipettenspitze, Versiegeln mit flexibler Laborfolie [Schritt 2.5]) variabel externe Wärme vom Benutzer einbringen, die Matrixviskosität ändern und die Zellmigrationseigenschaften während der Zentrifugation beeinflussen. Die Reproduzierbarkeit innerhalb und zwischen den Experimenten kann daher schwierig sein, konsistent zu erreichen.

Die zweite Einschränkung ist die Anforderung an Benutzererfahrung und -kompetenz. Bestimmte manuelle Techniken erfordern möglicherweise eine erweiterte Schulung, um effizient und erfolgreich zu arbeiten. So kann das Versiegeln der Pipettenspitze mit Laborfolie (Schritt 2.5) zunächst zu geringen Erfolgsquoten führen, die sich aber mit der Übung zwangsläufig verbessern werden. Die Kompetenz mit tierischen mikrochirurgischen Techniken wird auch durch Wiederholung erworben. Bei Transplantationen ist Vorsicht geboten, insbesondere beim Einführen der Pipettenspitze unter die Nierenkapsel (Schritt 4.2.10), beim Einführen des Drahtkolbens zum Auswerfen des Stopfens (Schritt 4.2.11) und beim Herausziehen der Spitze aus der Niere. Es ist wichtig, dass der Stopfen sanft und gleichmäßig ausgeworfen wird, während gleichzeitig die Pipettenspitze zurückgezogen wird. Übermäßige Bewegung kann dazu führen, dass die Nierenkapsel perforiert oder das Parenchym beschädigt wird, was zu übermäßigen Blutungen führt.

Zusammenfassend wurde hier ein Verfahren zur Verkapselung von Zellen innerhalb einer halbfesten Matrix beschrieben, wobei der Schwerpunkt auf dem Verständnis der Milzgewebebildung liegt. Dieses System könnte gleichermaßen auf eine Vielzahl von Zelltypen angewendet werden, mit dem Potenzial für mehrere in vitro oder in vivo Downstream-Anwendungen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well Polypropylen 1,2 mL Cluster Tubes	Corning	CLS4401	Zum Einsetzen in ein konisches 14 ml Röhrchen
B-Mercaptoethanol	Gibco	21985023	Lager 55 mM, verwenden Sie bei 50 μM
Kollagenase D	Roche	11088858001
Kollagenase IV	Sigma-Aldrich	C5138	Aus Clostridium histolyticum
Desoxyribonuklease I (DNase I)	Sigma-Aldrich	D4513	Desoxyribonuklease I aus der Bauchspeicheldrüse des Rinders, Typ II-S, lyophilisiertes Pulver, Protein ≥ 80 %, ≥ 2.000 Einheiten/mg Protein
Dulbecco' s Modifizierter Adler" s Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796	4500 mg/L Glukose, L-Glutamin und Natriumbicarbonat, ohne Natriumpyruvat, flüssig. Steril gefiltert.
Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537	Ohne Calciumchlorid und Magnesiumchlorid, sterilfiltriert
Eclipse 200 μ l Pipettenspitzen	Labcon	1030-260-000	Bevel Point
Fetales Rinderserum (FBS)	Gibco	26140-079	Lot# 1382243
GlutaMAX	Gibco	35050061	Lager 100X, verwenden bei 1X
Matrigel	Corning	354263	Matrigel Matrix Basalmembran Hohe Konzentration, Los# 7330186
MEM Nicht-essentielle Aminosäuren	Gibco	11140076	Lager 100X, bei 1X
verwenden Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140122	Lager 10.000 Einheiten/ml Penicillin, 10.000 μg/ml Streptomycin
Reversibles Zellsieb	STEMCELL Technologies	27216	70 μ m
Ringpinzette	NAPOX	A-26	Ringgröße: 3 mm
Gesteinsinhibitor (Y-27632)	MedChemExpres	HY-10071
Thermofisher Heraeus Megafuge 40R Zentrifuge	Thermofisher		Beschleunigungs- und Verzögerungsgeschwindigkeiten wurden auf 8
Ultrafeinpinzetten	EMS	78340-51S	eingestelltModell 51S. Die antimagnetische/säurebeständige SA-Pinzette aus austenitischem Stahl mit niedrigem Kohlenstoffgehalt ist korrosionsbeständig. Blendfreies, satiniertes Finish.
Vicryl 5/0 Nahtmaterial Ligapak Rolle	Ethicon	J283G
Wiretrol II Langer Drahtkolben	Drummond	5-000-2002-L	Edelstahlkolben, 25 & 50 μ L/WRTL II, Lang
Wickelclip Applier	MikRon	427630
Wickelclips	MikRon	427631	9 mm