Erforschung alternativer Perfusionslösungen unter Verwendung von polymerisierten hämoglobinbasierten Sauerstoffträgern der nächsten Generation in einem Modell der ex vivo Lungenperfusion von Ratten

Summary

Hier beschreiben wir die Anwendung eines polymerisierten humanen Hämoglobin (PolyhHb)-basierten Sauerstoffträgers als Perfusat und das Protokoll, in dem diese Perfusionslösung in einem Modell der ex vivo Lungenperfusion von Ratten getestet werden kann.

Abstract

Eine Lungentransplantation wird durch den Mangel an geeigneten Spendern erschwert. Früher wurden Spender, die als marginal oder unzureichend galten, verworfen. Neue und aufregende Technologien, wie z. B. die Ex-vivo-Lungenperfusion (EVLP), bieten Lungentransplantationsanbietern jedoch eine erweiterte Bewertung für Allotransplantate von marginalen Spendern. Diese dynamische Bewertungsplattform hat zu einer Zunahme der Lungentransplantationen geführt und es den Anbietern ermöglicht, Spender zu verwenden, die zuvor verworfen wurden, wodurch der Spenderpool erweitert wurde. Derzeitige Perfusionstechniken verwenden zelluläre oder azelluläre Perfusate, und beide haben unterschiedliche Vor- und Nachteile. Die Zusammensetzung der Perfusion ist entscheidend für die Aufrechterhaltung eines homöostatischen Milieus, eine angemessene metabolische Unterstützung, die Verringerung von Entzündungen und Zelltod und letztendlich die Verbesserung der Organfunktion. Perfusionslösungen müssen eine ausreichende Proteinkonzentration enthalten, um einen angemessenen onkotischen Druck aufrechtzuerhalten. Derzeitige Perfusionslösungen führen jedoch häufig zu einer Flüssigkeitsextravasation durch das Lungenendothel, was zu unbeabsichtigten Lungenödemen und -schäden führt. Daher ist es notwendig, neuartige Perfusionslösungen zu entwickeln, die übermäßige Schäden verhindern und gleichzeitig eine ordnungsgemäße zelluläre Homöostase aufrechterhalten. Hier beschreiben wir die Anwendung eines polymerisierten humanen Hämoglobin (PolyhHb)-basierten Sauerstoffträgers als Perfusat und das Protokoll, in dem diese Perfusionslösung in einem Modell der EVLP der Ratte getestet werden kann. Das Ziel dieser Studie ist es, der Lungentransplantationsgemeinschaft wichtige Informationen für die Konzeption und Entwicklung neuartiger Perfusionslösungen sowie die richtigen Protokolle zur Verfügung zu stellen, um sie in klinisch relevanten translationalen Transplantationsmodellen zu testen.

Introduction

Wie jeder Bereich der soliden Organtransplantation leidet auch die Lungentransplantation unter einem Mangel an Spenderorganen. Um den Spenderpool zu vergrößern, wurde viel geforscht, um das Potenzial von Allotransplantaten zu untersuchen, die einst als ungeeignet für eine Transplantation galten, d.h. Spender mit erweiterter Kriterien, d.h. Spender mit erweiterten Kriterien (ECD). Diese Allotransplantate können aus einer Reihe von Gründen als ECD angesehen werden, darunter fragwürdige Qualität, schlechte Funktion, Infektionen, Traumata, verlängerte warme oder kalte ischämische Zeiten und fortgeschrittenes Alter ^1,2. In bestimmten Fällen, in denen diese Lungen für eine sofortige Transplantation^{geeignet sind 3}, ist es oft sowohl für Anbieter als auch für Empfänger von Vorteil, diese Lungen für eine zusätzliche Zeit zu bewerten, um ihre Eignung für eine Transplantation zu bestimmen. Die Ex-vivo-Lungenperfusion (EVLP) ist eine solche Technologie, die eine erweiterte Beurteilung potenzieller Lungentransplantate in einem geschlossenen Kreislauf außerhalb des Spenders^ermöglicht 2,4,5,6,7 und dem Transplantatgeber die Möglichkeit gibt, die Eignung für die Transplantation zu bestimmen. Die EVLP hat gezeigt, dass sie in der Lage ist, Spenderorgane angemessen zu beurteilen 8,9,10,11, die Auswirkungen der ischämischen Reperfusionsverletzung (IRI)^12,13 zu verringern und den Spenderpool ^{zu vergrößern 14,15}, wodurch die Lungentransplantation für alle leichter zugänglich wird.

Im Allgemeinen handelt es sich bei einem EVLP-System um ein geschlossenes System mit einem Beatmungskreislauf (erreicht durch Anschluss eines Beatmungsgeräts an die Luftröhre, um Luft in das System einzuführen) und einem Gefäßkreislauf (erreicht durch Verbindung des linken Vorhofs (LA) mit der Lungenarterie (PA) mit einem Schlauch)⁷. Der Gefäßkreislauf ist mit Perfusat ausgestattet, das durch die Schläuche fließt, um der Lunge lebenswichtige Nährstoffe und Sauerstoff zuzuführen und gleichzeitig die kalte ischämische Zeit (CIT) zu begrenzen5,8,16,17. Diese Lösung ist entweder blutbasiert (d. h. durch Zugabe von gepackten roten Blutkörperchen (PRBCs)^16,17 oder azellulär (d. h. keine PRBCs)^4,5. Die Verwendung von PRBCs hat jedoch einige bemerkenswerte Nachteile. Bei der Verwendung von PRBCs von Spendern, die an einem Trauma oder hirntoten Spendern (BDD) gestorben sind, enthalten diese Flüssigkeiten oft große Mengen an entzündlichen Zytokinen, die die Zellschädigung während der EVLP sowie den Spiegel von zellfreiem Hämoglobin (Hb), Häm, Eisen und Zellfragmenten erhöhen können, was den Zellen zusätzlichen Schaden zufügt^18,19. Da es sich bei diesen Spendern häufig um Multiorganspender handelt, könnte die Entnahme von PRBCs vor der Entnahme zu einer Abnahme des Blutvolumens beim Spender und in der Folge zu einer Zunahme der Ischämie bei allen Organen führen. Bei der Verwendung von PRBCs aus einer anderen Quelle könnten Anbieter mit Blutengpässen konfrontiert werden, da dies an und für sich ein knappes Material ist^20,21. Schließlich sind PRBCs unabhängig von ihrer Quelle anfällig für eine mechanische Lyse im EVLP-Schaltkreis, wodurch Hb und andere Komponenten freigesetzt werden, die zur Zellschädigung beitragen.

Daher kann es aus vielen Gründen vorteilhaft sein, einen künstlichen Ersatz für rote Blutkörperchen, d. h. hämoglobinbasierte Sauerstoffträger (HBOCs), als Perfusatergänzung zu verwenden. Ein besonders vielversprechendes HBOC ist polymerisiertes humanes Hämoglobin (PolyhHb). PolyhHb wird aus Hb synthetisiert, das aus abgelaufenen PRBCs gereinigt wurde, die als ungeeignet für eine sofortige Transfusion eingestuft wurden²². Sie haben sich als brauchbare Blutersatzstoffe bei hämorrhagischem Schock²³ und Transplantation²⁴ erwiesen und können in großen Mengen hergestellt werden²². Die großflächige Einführung von PolyhHb war jedoch aufgrund unvorhergesehener Komplikationen wie Vasokonstriktion, steigendem Blutdruck und Herzstillstand nicht erfolgreich^23,25. Die Gründe für diese Befunde waren wahrscheinlich auf das Vorhandensein von zellfreien Hb- oder niedermolekularen Hb-Polymeren (< 500 kDa) in der PolyhHb-Lösung zurückzuführen, da sie eine Neigung zur Extravasation in den Geweberaum haben, was zu einer verminderten Verfügbarkeit von Stickstoffmonoxid, einer nachfolgenden Vasokonstriktion, systemischer Hypertonie und schließlich zu oxidativen Gewebeschäden führte^26,27. Um diese Probleme zu verbessern, hat das Palmer Laboratory an der Entwicklung eines PolyhHb der nächsten Generation gearbeitet, das minimale Spezies mit niedrigem MW und zellfreies Hb enthält, das verbesserte biophysikalische Eigenschaften und In-vivo-Reaktionen gezeigt hat 22,28,29,30. Mehrere Transfusionsstudien an Tieren haben gezeigt, dass, wenn niedermolekulare Hb-Polymere aus dem HBOC eliminiert werden, Vasokonstriktion, systemische Hypertonie und oxidative Schäden gemildert werden können 28,29,31,32,33,34,35. Dies macht dieses PolyhHb der nächsten Generation zu einem vielversprechenden Perfusatkandidaten.

Hier beschreiben wir die Anwendung eines PolyhHb der nächsten Generation, das in einem Perfusat verwendet werden soll, und das Protokoll, mit dem diese Perfusionslösung in einem Modell der EVLP von Ratten getestet werden kann. Das Ziel dieser Studie ist es, der Lungentransplantationsgemeinschaft wichtige Informationen für die Gestaltung und Entwicklung neuartiger Perfusionslösungen zur Verfügung zu stellen und Protokolle bereitzustellen, um sie in klinisch relevanten translationalen Transplantationsmodellen zu testen.

Protocol

Sprague-Dawley-Ratten (300 g Körpergewicht) wurden kommerziell gewonnen und unter pathogenfreien Bedingungen in der Tiereinrichtung des Wexner Medical Center der Ohio State University untergebracht. Alle Verfahren wurden gemäß dem Leitfaden für die humane Pflege und Verwendung von Labortieren des NIH und des National Research Council und mit Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee der Ohio State University (IACUC-Protokoll 2023A00000071) human durchgeführt.

1. PolyhHb-Synthese und -Reinigung

HINWEIS: Die Herstellung und Synthese des PolyhHb-Materials, das für die folgenden EVLP-Experimente verwendet wurde, wurde ursprünglich von Cuddington et al. im Jahr 2020^{veröffentlicht 22}. Bitte beziehen Sie sich auf diese Arbeit für detaillierte Schemata und Analysen der PolyhHb-Synthese. Im Folgenden finden Sie eine Zusammenfassung der Synthese und Reinigung von PolyhHb im Pilotmaßstab und seiner anschließenden Herstellung als Perfusat.

1. Erythrozytenwäsche, Lyse und Hb-Reinigung
   1. Beschaffen Sie 18 Einheiten abgelaufener humaner PRBCs und gießen Sie sie in ein 20-Liter-Filtergefäß, verdünnen Sie sie mit 0,9 Gew.-% Kochsalzlösung auf einen endgültigen Hämatokrit von 22 % (Abbildung 1B, C).
   2. Führen Sie sechs Systemvolumenaustausche (Diazyklen) an einem 0,65 μm modifizierten Polyethylensulfon (mPES)-Tangentialflussfiltrationsmodul (TFF) mit 0,9 Gew.-% Kochsalzlösung auf der Erythrozytenlösung durch. HINWEIS: Der Zweck dieses Waschschritts besteht darin, beschädigte Erythrozyten, Membranfragmente und andere extrazelluläre Materialien vor der Hämolyse zu entfernen (Abbildung 1B, C).
   3. Die RBC-Lösung wird mit 10 l Phosphatpuffer (PB, 3,75 mM, pH 7,4) 1 h lang bei 4 °C unter ständigem Rühren lysiert.
   4. Entfernen Sie die lysierten Membranfragmente und andere Aggregate, indem Sie die Lösung über ein 500-kDa-TFF-Modul filtrieren und das Permeat im 30-l-Batch-Reaktorbehälter auffangen (Abbildung 1A-C).
   5. Sobald sich 480 g Hb im Reaktor befinden, fügen Sie eine Salzladung hinzu, um PB in phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) umzuwandeln.
   6. Rezirkulieren Sie das Hb durch einen mit Stickstoff gespeisten Gaskontaktor und halten Sie einen Stickstoffkopfraum im Reaktor aufrecht, um das Protein über Nacht sauerstoffarm zu machen. Auf 14 °C abkühlen lassen, um die Bildung von Methämoglobin (metHb) zu begrenzen.
2. Hb-Polymerisation
   1. Die Hb-Lösung wird auf physiologische Temperatur (37 °C) erhitzt, während die Lösung in einer Gasschützschleife umgewälzt wird.
      HINWEIS: Ziel ist es, das Protein auf einen pO₂ zwischen 0 und 10 mmHg zu desoxygenieren, um sicherzustellen, dass sich der größte Teil des Hb im angespannten quartären Zustand befindet (Abbildung 1A).
   2. Fügen Sie bei Bedarf 1 g Natriumdithionit hinzu, um eine wirksame Sauerstoffentgiftung zu gewährleisten.
   3. Unter Beibehaltung des Rezirkulationskreislaufs und Entgasung der Hb-Lösung wird ein molares Verhältnis von Glutaraldehyd (GA) zu Hb von 30:1 zugegeben, verdünnt in 3 l sauerstoffarmem PBS (pH 7,4).
   4. Die Lösung über 3 Stunden in den Reaktorbehälter geben, mit einer zusätzlichen Stunde Reaktionszeit.
   5. Die Vernetzungsreaktion wird mit einem molaren Verhältnis von Natriumcyanoborohydrid zu GA von 7:1 abgeschreckt, verdünnt in 3 l PBS (pH 7,4). Für mehr als 10 min in den Reaktor geben.
   6. Reaktor über Nacht bei 14 °C kühlen.
3. PolyhHb-Aufreinigung
   1. Pumpen Sie den Reaktorinhalt in ein 10-l-Filtrationsgefäß und beginnen Sie mit der Zirkulation durch ein 0,2-μm-TFF-Modul aus Polyethylensulfon (PES) (Stufe 1). In diesem Schritt werden große Zuschlagstoffe und unerwünschte Verunreinigungen entfernt.
   2. Geben Sie das Permeat in ein sekundäres 10-Liter-Filtrationsgefäß, das über ein 500 kDa Polysulfon (PS) TFF-Modul (Stufe 2) zirkuliert, sobald es voll ist. Fahren Sie fort, bis der Reaktor entleert ist (Abbildung 1B,D).
   3. Sobald der Reaktor in den Reinigungskreislauf entleert ist, beginnen Sie mit dem Austausch von Hilfsstoffen in Stufe 1 mit einer modifizierten Ringer-Laktatlösung (pH 7,4). Nach jedem vollständigen Volumenaustausch ist die Proteinkonzentration im Permeat der Stufe 1 mittels UV-sichtbarer Spektroskopie zu messen.
   4. Wenn das Permeat der Stufe 1 eine Konzentration von weniger als 1 mg Hb/ml aufweist, überführen Sie die modifizierte Ringer-Lösung in die Stufe 2. Jeder Stillstand in Stufe 1 ist eine Verschwendung und sollte ordnungsgemäß entsorgt werden. Stellen Sie insgesamt sicher, dass in beiden Phasen 12 vollständige Volumenaustausche der modifizierten Ringer-Lösung durchgeführt werden.
   5. Nach Abschluss der Diazyklen ist der Gehalt der Stufe 2 auf mindestens 10 g/dl über dem 500 kDa TFF-Modul zu konzentrieren.
   6. Verpacken Sie die konzentrierte Lösung in konische 50-ml-Röhrchen und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei -80 °C.

2. Perfusat-Formulierung

1. Bereiten Sie das Perfusat auf ein Endvolumen von 165 ml vor. PolyhHb auf eine Endkonzentration von 3,7 g/dl mit William's E Medium verdünnen.
2. Humanserumalbumin (HSA) bis zu einer Endkonzentration von 3 Gew.-% HSA zugeben. Fügen Sie 1 ml Heparin zur endgültigen Lösung hinzu.

3. Einrichtung eines Ex-vivo-Lungenperfusionskreislaufs

1. Geben Sie PolyhHb-Perfusat in den EVLP-Kreislaufbehälter und schalten Sie das Warmwasserbad auf 37 °C ein. Stellen Sie sicher, dass das Perfusat im Kreislauf zirkuliert, indem Sie die Rollenpumpen einschalten.
2. Schließen Sie das Sauerstoffentsauerungsgas (d. h. 6 % O₂, 8 % CO₂, 84 % N₂) an den Hohlfaseroxygenator an, um das Perfusat sauerstofffrei zu machen. Dies geschieht, um die Fähigkeit der Lunge zu beurteilen, das Perfusat mit Sauerstoff zu versorgen.
3. Öffnen Sie die Datenerfassungssoftware auf einem Computer in der Nähe. Stellen Sie sicher, dass der Lungenarteriendruck, der Differenzdruck der Luftröhre, der Differenzdruck der Atemströmung, das Lungengewicht und die Pumpendrehzahl sowohl an den Kreislauf als auch an die Datenwandlerbox angeschlossen sind.
4. Stellen Sie sicher, dass im gesamten System keine Lecks vorhanden sind, indem Sie alle Rohrverbindungen sorgfältig untersuchen und dass warmes Wasser im gesamten System zirkuliert (Abbildung 2). Drücken Sie in der Datenerfassungssoftware auf Ausführen , um sicherzustellen, dass alle Druckmessumformer funktionieren. Sobald das System ordnungsgemäß funktioniert, schalten Sie die Rollenpumpen aus.

4. Beschaffung eines Spender-Ratten-Lungenblocks

1. Richten Sie den Operationstisch ein und ordnen Sie die Instrumente an (Abbildung 3). Autoklavieren Sie alle Instrumente 30 Minuten lang bei 121 °C.
2. Bereiten Sie 1200 U/kg Heparin, ein Ketamin/Xylazin-Gemisch für die Anästhesie (60 mg/kg Ketamin und 5 mg/kg), sowie 5-10 cm lange Seidennähte (3-0 oder 4-0) vor.
3. Injizieren Sie der Ratte intraperitoneal Ketamin/Xylazin-Lösung. Warten Sie 5-10 Minuten, bis sich die Anästhesieebene entwickelt hat. Um ein angemessenes Maß an Anästhesie zu gewährleisten, kneifen Sie die Ratte, um eine Reaktion auszulösen. Wenn es keine Reaktion gibt, wurde das richtige Anästhesieniveau erreicht.
4. Rasieren Sie den Bauch der Ratte und legen Sie die Ratte in Rückenlage auf das Operationsbrett. Reinigen Sie den Bauch mit Povidon-Jod und 70% Ethanol. Tragen Sie eine Augensalbe unter die Augen der Ratte auf, um Trockenheit zu verhindern.
5. Bringen Sie die Ratte auf die Operationsplatte und befestigen Sie die Ratte (Abbildung 4A). Schalten Sie die Datenerfassungssoftware ein und beginnen Sie mit der Aufnahme. Schalten Sie das Beatmungsgerät bei 4 ml/kg ein und stellen Sie sicher, dass der positive Exspirationsdruck (PEEP) etwa 2 cm/H₂O beträgt.
   HINWEIS: Diese Grundeinstellungen sind experimentspezifisch. Es liegt an allen Forschern, die besten Beatmungsstrategien für einzelne Experimente zu bestimmen.
6. Sobald die richtige Anästhesietiefe erreicht ist, führen Sie mit einer Schere eine Mittellinien-Laparotomie vom Xiphoid-Prozess bis zur Schambeinsymphyse durch. Als nächstes führen Sie eine medial-laterale viszerale Rotation durch und visualisieren Sie die infrahepatische untere Hohlvene mit einem stumpfen Instrument (IVC)36,37,38 (Abbildung 4B). Injizieren Sie Heparin mit einer 20G-Nadel in die IVC (Abbildung 4C).
7. Richten Sie die Aufmerksamkeit auf den Hals und schneiden Sie die Haut von der sternalen Kerbe bis knapp unter den Winkel des Unterkiefers mit einer Schere. Beginnen Sie als Nächstes mit der Präparation in Richtung Luftröhre (Abbildung 5A).
8. Präparieren Sie im Nacken stumpf die notwendigen Gurtmuskeln, um die Luftröhre freizulegen (Abbildung 5B). Machen Sie mit einer Schere einen Querschnitt an der vorderen Luftröhre zwischen den Knorpelringen, die groß genug für den Endotrachealtubus (ET) sind (mehrere Millimeter), aber schneiden Sie nicht durch den hinteren Teil der Luftröhre. Legen Sie eine 5-0 Seidennaht um die Luftröhre (Abbildung 5C).
9. Führen Sie den Endotrachealtubus ein und befestigen Sie ihn mit der bereits erwähnten 5-0-Seidennaht (Abbildung 5D). Schließen Sie den ET-Schlauch an das Beatmungsgerät an und sorgen Sie für eine korrekte Anhebung des Brustkorbs.
10. Führen Sie eine mediane Sternotomie durch und dringen Sie mit einer Schere wieder in die Brusthöhle ein. Platzieren Sie Brustwandretraktoren, um Herz und Lunge freizulegen (Abbildung 6A). Vermeiden Sie jede versehentliche Manipulation der Lunge, da sie unglaublich brüchig ist.
11. Entfernen Sie den Thymus aus dem vorderen Mediastinum durch eine Kombination aus scharfer (Schere) und stumpfer Dissektion. Achten Sie darauf, keine großen Gefäße oder Lungen zu beschädigen.
12. Identifizieren Sie die Lungenarterie (PA; Abbildung 6B) und legen Sie eine 5-0-Seidennaht darum, um die Kanülierung vorzubereiten (Abbildung 6C). Aufgrund der mikroskopischen Anatomie der großen Gefäße der Ratte ist es oft einfacher, die Naht gleichzeitig um die PA und die Aorta zu legen.
13. Machen Sie mit einer Schere (Abbildung 6D-E) einen 2-3 mm großen Schnitt in der rechtsventrikulären Ausflussspur (RVOT), um die arterielle Kanüle in der PA zu platzieren und sie mit der einen Schritt zuvor beschriebenen 5-0-Naht zu fixieren (Abbildung 6F).
14. Machen Sie einen 5-mm-Schnitt im linken Ventrikel (LV) sowie eine infrahepatische IVC mit einer Schere, um die Ratte einzuschläfern. Verbinden Sie die Lungenkonservierungsflüssigkeit schnell mit der arteriellen Kanüle, um die Lunge mit etwa 20 ml zu spülen (Abbildung 7A-B). Stellen Sie sicher, dass die Lungenkonservierungsflüssigkeit entlüftet wird, bevor Sie sie an die arterielle Kanüle anschließen, da Luftembolien die Lunge sehr schädigen.
15. Verbinden Sie die arterielle Kanüle mit dem EVLP-Kreislauf. Schalten Sie die Rollenpumpe ein und lassen Sie eine kleine Menge Perfusat durch die Lunge und aus dem linken Ventrikel in die Brusthöhle fließen. Sobald das Perfusat aus dem linken Vorhof zu fließen beginnt, schalten Sie die Rollenpumpe aus (Abbildung 7C). Während das Perfusat fließen kann, stellen Sie sicher, dass der PA-Druck nicht ansteigt - was auf eine Verstopfung oder falsche Platzierung hinweisen würde.
16. Legen Sie eine kleine Pinzette in die LV und dehnen Sie vorsichtig den Mitralklappenanulus, wodurch die Kanüle des linken Vorhofs (LA) eingeführt werden kann (Abbildung 8A). Legen Sie eine 5-0 Seidenkrawatte um das Herz und binden Sie sie locker zusammen (Abbildung 8B).
17. Führen Sie die LA-Kanüle in das LV ein und schieben Sie die LA-Kanüle vor, bis sie im Vorhof zu sehen ist. Beenden Sie die Sicherung des LA mit der vorgebundenen 5-0-Naht (Abbildung 8C).
18. Identifizieren Sie die Speiseröhre und klemmen Sie sie mit einem Blutstillungsmittel so nah wie möglich an das Zwerchfell. Schneiden Sie die Speiseröhre unterhalb des Hämostaten ab, um sicherzustellen, dass kein Austritt in die Brusthöhle erfolgt (Abbildung 9A).
19. Schneiden Sie mit einer Schere alle Bänderansätze, die den Herz-Lungen-Block mit den umgebenden Strukturen verbinden, mit der Wirbelsäule ab (Abbildung 9B). Sobald der Herz-Lungen-Block frei beweglich ist, präparieren Sie die Luftröhre vom Hals aus und schneiden Sie schließlich die Luftröhre oberhalb des ET-Schlauchs mit einer Schere, um den Herz-Lungen-Block zu befreien (Abbildung 9C).
20. Verschieben Sie den Herz-Lungen-Block in den Thoraxmantel innerhalb des EVLP-Kreislaufs und befestigen Sie die LA-Kanüle an den EVLP-Kreislauf (Abbildung 9D). Schalten Sie die Rollenpumpe ein und schließen Sie den Beatmungsmonitor an.
21. Überprüfen Sie die Blasenfalle, um sicherzustellen, dass keine Luftembolien in das System eingebracht werden.
22. Ändern Sie die Beatmungs- und Perfusionseinstellungen während der ersten 15 Minuten langsam auf die gewünschten experimentellen Werte 36,37,38. Erhöhen Sie außerdem während dieser anfänglichen Anlaufphase die Perfusionsflussrate auf die gewünschte Rate und/oder den gewünschten Druck.
23. Zu den für den Versuch festgelegten Zeitpunkten sind die Perfusatgaswerte sowie Lungenfunktionstests zu überprüfen.

Results

Die Validierung unseres PolyhHb-basierten Perfusats und darüber hinaus die Stabilität dieses Perfusats über mehrere Stunden ist in Abbildung 10 dargestellt. Während der ersten 1 h zeigten alle getesteten Perfusate (PolyhHb, Control (Williams Media + 5% HSA), RBC-basiert) eine leichte Abnahme von LA_{pO 2} (Post_{pO 2}). Das Erythrozyten-basierte Perfusat zeigte jedoch nach 1 h eine signifikante Abnahme im Vergleich zu PolyhHb (p < 0,05). Bei Tests in den nächsten Stunden wiesen sowohl PolyhHb- als auch Kontrollperfusate stabile LA_{pO 2 auf,} während PolyhHb einen nicht signifikanten Trend (p > 0,05) eines höheren_{pO 2} aufwies (Abbildung 10A). Delta_{pO 2}, d.h. die Änderung des LA_{pO 2} gegenüber PA_{pO 2}, nahm in der Erythrozytenperfusatgruppe nach 1 h erneut signifikant ab (p < 0,05), während sie in der PolyhHb- und Kontrollperfusat stabil blieb, mit einem nicht signifikanten Trend (p > 0,05) eines höheren_{pO 2} in der PolyhHb-Gruppe (Abbildung 10B). LA pCO₂ war im Erythrozytenperfusat und im Kontrollperfusat im Vergleich zum PolyhHb-Perfusat nach der ersten Stunde signifikant niedriger (p < 0,05), und dies galt auch für die nächsten Stunden beim Vergleich von PolyhHb und Kontrollperfusat (Abbildung 10C). Schließlich war delta pCO 2 (d.h. die Änderung des LA_pCO2 von PA pCO2) im Erythrozytenperfusat nach 1 h signifikant erhöht (p < 0,05) und blieb nach mehreren Stunden sowohl im PolyhHb- als auch im Kontrollperfusat stabil (Abbildung 10D).

Die über die Erfassungssoftware gesammelten physiologischen Echtzeitdaten der Lunge liefern ergänzende Informationen zu den Perfusatgaswerten (Abbildung 11). Der pulmonale Gefäßwiderstand (PVR) zeigte erneut, dass das Erythrozytenperfusat in der ersten Stunde signifikant anstieg (p < 0,05). Über die verbleibenden Stunden wiesen sowohl das PolyhHb- als auch das Kontrollperfusat einen stabilen und niedrigen PVR auf (Abbildung 11A). Die Veränderung des Lungengewichts nahm auch im Erythrozytenperfusat in der ersten Stunde signifikant zu (p < 0,05) und nahm sowohl im PolyhHb- als auch im Kontrollperfusat in den verbleibenden Stunden zu, wobei das Gewicht im PolyhHb-Perfusat etwas höher war (Abbildung 11B). Schließlich nahm die Compliance in der Erythrozytenperfusatgruppe innerhalb der ersten Stunde signifikant ab (p < 0,05), während es eine nicht signifikante Abnahme zwischen PolyhHb und Kontrollperfusat gab (p > 0,05), wobei PolyhHb nach 4 h die höchste Compliance aufwies (Abbildung 11C).

In Bezug auf den technischen Erfolg und/oder Misserfolg (Abbildung 12) sind mehrere Dinge wichtig, auf die hingewiesen werden sollte. In Abbildung 12A sehen wir das Versagen des Allotransplantats aufgrund einer Nekrose des rechten Oberlappens aufgrund eines möglichen Gerinnsels im Lungengefäßsystem. In Abbildung 12B sehen wir auch schwere Gewebeödeme im rechten Lappen, die zum Scheitern des Experiments führen. Abbildung 12C-E zeigt die korrekte Konservierung und das Aussehen des Gewebes unter den jeweiligen Versuchsbedingungen. In Abbildung 12F schließlich sehen wir eine ideale Gewebekonservierung nach dem Spülen mit einer Lungenkonservierungslösung.

Abbildung 1: Synthese und Aufreinigung von PolyhHb im Pilotmaßstab. (A) Bioreaktor für die Polymerisation. (B) Die Tangentialflussfiltration (TFF) wird in einem Kühlschrank mit 4 °C eingerichtet. (C) Nahaufnahme des parallelen TFF-Aufbaus für die Waschung der roten Blutkörperchen (RBC) und die Reinigung von Hämoglobin (Hb). (D) Nahaufnahme des zweistufigen TFF-Systems der Serie für die PolyhHb-Aufreinigung. Die Behälter für die Stufen eins und zwei befinden sich jeweils links und rechts der Filter. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Überblick über den Ex-vivo-Lungenperfusionskreislauf (EVLP). (A) Schematische Zeichnung des EVLP-Kreislaufs. (B) In-vivo-Platzierung einer Pulmonalarterienkanüle und einer linken Vorhofkanüle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Chirurgische Instrumente, die für die ex vivo Lungenperfusion verwendet werden. (A) Seidennaht. (B) Pinzette mit feiner Spitze (mittlere Länge). (C) Pinzette mit feiner Spitze (lange Länge). (D) Gebogene Pinzette mit feiner Spitze. (E) Mayo-Schere. (F) Trachealkanüle. (G) Kanüle der Lungenarterie (PA). (H) Kanüle für den linken Vorhof (LA). I) Aufrolleinrichtungen für den Brustkorb. (J) Federschere. (K) DeBakey-Zange. (L) Hämostat. (M) Kleine Schere. (N) Kleine gebogene Pinzette mit feiner Spitze. (O) Adson-Tonabnehmer. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Chirurgische Positionierung und Freilegung der Vena cava inferior (IVC). (A) Positionierung der Ratte für die Lungenbeschaffung. (B) Freilegung der infrahepatischen IVC. (C) Kanülierung der IVC und Injektion von Heparin mit einer 27G-Nadel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Kanülierung der Luftröhre mit dem Endotrachealtubus (ET). (A) Beginnen Sie mit dem Schneiden der Haut im Halsbereich. (B) Präparieren Sie die Gurtmuskulatur und das Bindegewebe, um die Luftröhre freizulegen. (C) Einen Querschnitt an der vorderen Luftröhre zwischen den Knorpelringen vornehmen, der groß genug für die ET-Sonde ist. (D) Führen Sie den ET-Schlauch in die Luftröhre ein und befestigen Sie ihn mit einer Seidennaht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Platzierung der Lungenarterienkanüle. (A) Freilegung der Brusthöhle zur Visualisierung von Herz und Lunge. (B) Identifizierung der PA und Isolierung der PA. (C) Platzieren der Naht um PA. (D) Schneiden eines kleinen Lochs in den Ausflusstrakt des rechten Ventrikels (RVOT) für die PA-Kanüle. (E) Richtige Platzierung der PA-Kanüle in der PA. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 7: Spülen der Lunge mit Konservierungslösung. (A) Verbinden der Spülkanüle mit der Kanüle der Lungenarterie (PA). (B) Klare Flüssigkeit sollte aus dem linken Vorhof (LA) austreten. (C) Verbinden der PA-Kanüle mit dem ex vivo-Lungenperfusionskreislauf , um einen ordnungsgemäßen Fluss und eine ordnungsgemäße Platzierung der PA-Kanüle zu gewährleisten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 8: Platzieren der linken Vorhofkanüle (LA). (A). Sanftes Erweitern des Mitralklappenanulums mit einer Pinzette. (B) Lockeres Platzieren einer Seidennaht um den linken Ventrikel (LV). Platzieren der LA-Kanüle im linken Vorhof. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 9: Extraktion des Herz-Lungen-Blocks. (A) Ligatur des Ösophagus unterhalb des Hämostaten. (B) Durch das Präparieren wird der Herz-Lungen-Block von der Wirbelsäule befreit. (C) Präparieren der Luftröhre. (D) Ordnungsgemäße Anschlüsse und Platzierung der ex vivo Lungenperfusionskanüle (EVLP). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 10. Perfusieren Sie den Gasgehalt im Laufe der Zeit. (A) Post pO₂, d.h. linksatrialer (LA)_{pO 2}, über eine 4-stündige Perfusion. (B) Delta_{pO 2}, d.h. die Veränderung des LA_{pO 2} aus der Lungenarterie (PA)_{pO 2} über eine 4 h Perfusion. (C) Nach pCO₂, d. h. LA_{pO 2}, über eine Perfusion von 4 h. (D) Delta pCO₂, d. h. die Änderung des LA_{pO 2} von PA_{pO 2} über eine 4 h lange Perfusion. Blau steht für PolyhHb-Perfusat, Schwarz für Kontrollperfusat (Standard-William-Medien) und Rot für Erythrozyten-basiertes Perfusat. N=6 pro Gruppe. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung an. Die Signifikanz wurde mit einem Student's T-Test getestet und wird mit einem *, p < 0,05 angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 11. Physiologische Daten der Lunge in Echtzeit. (A) Pulmonaler Gefäßwiderstand (PVR) über 4 h Reperfusion. (B) Veränderung (gekennzeichnet durch Δ) des Lungengewichts im Laufe der Zeit. (C) Compliance über 4 h Reperfusion. Blau steht für PolyhHb-Perfusat, Schwarz für Kontrollperfusat (Standard-William-Medien) und Rot für Erythrozyten-basiertes Perfusat. N=6 pro Gruppe. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung an. Die Signifikanz wurde mit einem Student's T-Test getestet und wird mit einem *, p < 0,05 angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 12: Repräsentative technische Ergebnisse. (A) Versagen des Transplantats aufgrund eines Infarkts des rechten Oberlappens. (B) Versagen des Transplantats aufgrund eines schweren Ödems im rechten Lappen. (C) Erfolgreiche Kanulation und Perfusion des Lungenallotransplantats mit Erythrozytenperfusat. (D) Erfolgreiche Kanulation und Perfusion des Lungenallotransplantats mit PolyhHb-Perfusat. (E) Erfolgreiche Kanulation und Perfusion des Lungenallotransplantats mit Standardperfusat. (F) Ideale Gewebekonservierung nach dem Spülen mit Lungenkonservierungslösung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Die Entwicklung und Erprobung von Perfusionslösungen ist ein neuartiges Unterfangen, das viele Menschen auf der ganzen Welt in Angriff nehmen. Traditionell bieten Standardperfusate die Möglichkeit, die ischämische Zeit auszusetzen und die damit verbundenen Verletzungen mit Ischämie sowie Reperfusion zu mildern¹⁸. Die nächste Weiterentwicklung von EVLP besteht jedoch darin, die derzeitige Perfusattechnologie zu verbessern und Reparatur- und Rekonditionierungstherapien zu integrieren 39,40,41,42,43.

Das in dieser Arbeit beschriebene PolyhHb ist zwischen 500 kDa und 0,2 μm eingeklammert, um zu verhindern, dass das Material aus dem Kreislauf in die Lunge extravasiert, was eine Vasokonstriktion und einen erhöhten PA-Druck verhindert³⁰. Es ist von entscheidender Bedeutung, dass während der Polymerisationsschritte dieser Synthese der Partialdruck des Sauerstoffs (_pO2) auf dem für das gewünschte sauerstoffaffinen PolyhHb-Produkt angemessenen Wert gehalten wird. Dies schließt alle während der Reaktion zugesetzten Lösungen (d. h. Vernetzer, Quenchlösung usw.) ein, die ein mit dem Bioreaktor übereinstimmendes pO2 aufweisen (d. h. mit Stickstoff entgast, sauerstoffangereichert usw.). Ein großer Vorteil dieses Syntheseverfahrens besteht darin, dass das Endprodukt über modifizierbare Sauerstoffgleichgewichte verfügt, um verschiedene Anwendungen mit unterschiedlichem Sauerstoffbedarf zu ermöglichen (z. B. PolyhHb mit niedriger Sauerstoffaffinität für die Transfusionsmedizin, mäßige Sauerstoffaffinität für die Lungenperfusion oder hohe Sauerstoffaffinität für eine gezielte Sauerstoffabgabe). Es ist auch wichtig, sicherzustellen, dass der Bioreaktor über einen Heizmechanismus verfügt, der nicht zu einer übermäßigen Erwärmung der Kontaktpunkte führt, was zur Bildung beschädigter Proteine führt. Wir fanden heraus, dass eine Kupferspirale im gesamten Behälter eine gleichmäßigere und weniger schädliche Heizung/Kühlung bewirkte als ein isolierter Heizmantel an der Außenseite des Behälters (Abbildung 1A).

Obwohl die Entwicklung eines EVLP-Rattenmodells nicht neu ist^37,38, haben wir einige Bereiche festgestellt, die zu verbesserten Ergebnissen führen können. Erstens ist es notwendig, bei der Opferung kleine Schnitte in der IVC zu machen, um sicherzustellen, dass keine zusätzliche Luft durch den Kreislauf in die Lunge gelangen könnte. Beim Spülen des Lungentransplantats mit der Lungenkonservierungslösung zeigt eine gleichmäßige blassweiße Farbe der Lunge dem Mikrochirurgen an, dass es einen technischen Erfolg für den Beschaffungsprozess gibt. Befindet sich innerhalb des Parenchyms noch eine rosafarbene Lunge, ist es manchmal ratsam, die PA-Kanüle so einzustellen, dass die gesamte Lunge gleichmäßig durchblutet wird. Während die PA-Kanüle oft der einfachere Teil des Eingriffs ist, ist das Einführen der LA-Kanüle etwas schwieriger. Es ist immer notwendig, den Mitralklappenring zu erweitern, damit die LA-Kanüle den LA erreicht. Dies muss jedoch mit äußerster Vorsicht erfolgen, da es leicht ist, den Ventrikel oder die Vorhöfe zu perforieren. Sobald sich die Spitze der Kanüle in den Vorhöfen befindet, kann sie beim Befestigen der Naht um den Ventrikel oft verlegt werden. Oft ist es notwendig, den Tischwinkel (horizontaler) einzustellen oder ein Stück Gaze an der Unterseite der Kanüle zu platzieren, damit sie an Ort und Stelle bleibt.

Begrenzungen
Dieses Modell weist einige Einschränkungen auf. Es ist zwar hilfreich, die Wirksamkeit von Perfusaten und ihre Fähigkeit, potenzielle Allotransplantate zu verbessern, zu bewerten, aber dies ist kein Transplantationsmodell, das uns in vivo Ergebnisse unterschiedlicher Perfusate und Technologien liefern könnte. Obwohl PolyhHb eine aufregende neue Perfusattechnologie ist, müssen ihre Verwendung, Wirksamkeit und potenziellen Einschränkungen in zusätzlichen präklinischen und klinischen Perfusionsexperimenten weiter untermauert werden, bevor eine breite Einführung dieser Technologie in Betracht gezogen werden kann.

Schlüsse
Hier demonstrierten wir die Anwendung eines PolyhHb-Perfusats der nächsten Generation und das Protokoll, mit dem diese Perfusionslösung in einem Modell der EVLP von Ratten getestet werden kann. Mit dem Fortschritt der Perfusattechnologie wird es von Vorteil sein, die Möglichkeiten der Verwendung von PolyhHb als potenziellen Ersatz für herkömmliche Perfusate zu untersuchen³⁰. Frühere Generationen von PolyhHb haben aufgrund ihrer Zusammensetzung zu nachteiligen Nebenwirkungen geführt; Durch Verbesserungen der Synthese ist jedoch ein Polymer entstanden, das weniger wahrscheinlich extravasiert, zu Ödemen führt und somit Zellschäden verursacht³⁰. Mit PolyhHb ist es möglich, EVLP ohne Erythrozyten durchzuführen und gleichzeitig den metabolischen Bedarf von Lungentransplantaten zu decken. Dies wird zweifellos eine bessere Funktion des Allotransplantats ex vivo ermöglichen. Eine weitere Validierung von PolyhHb sowohl im präklinischen als auch im klinischen Umfeld ist jedoch erforderlich. Wir hoffen, dass dieses Protokoll der Lungentransplantationsgemeinschaft wichtige Informationen für die Gestaltung und Entwicklung neuartiger Perfusionslösungen sowie die richtigen Protokolle liefert, um sie in klinisch relevanten, translationalen Transplantationsmodellen zu testen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cc Insulinspritze 29 G x 1/2" Nadel	B-D	309301
30 L Glas Batch Bioreaktor	Ace Glass
30g Nadel	Med Nadeln	BD-305106
Baytril (Enrofloxacin) Antibakterielle Tabletten	Elanco	NA
Calciumchlorid-Dihydrat (CaCl2.2H2O)	Sigma Aldrich	10035-04-8	Für modifizierte Ringer's Laktat
CFBA Trägerfrequenz-Brückenverstärker Typ 672	Harvard Apparatus	731747
Connect Kit D150	Cole-Parmer	VK 73-3763
Dumont #5 Pinzetten	Fine Science Werkzeuge	11252-50
Dumont Medical #5/45 Pinzette - Abgewinkelt 45°;	Fine Science Tools	11253-25
Ecoline Star Edition 003, E100 Warmwasserbereiter	Lauda	LCK 1879
Abgelaufene humane leukoreduzierte, verpackte Erythrozyteneinheiten	Wexner Medical Center Canadian Blood Services Zen-Bio Inc
Fiberoxygenator D150	Hugo Sachs Elektronik	PY2 73-3762
Pinzette	Fine Science Werkzeuge	11027-12
Glutaraldehyd (C5H8O2 70 Gew.-%)	Sigma Aldrich	111-30-8 (G7776)
Halsted-Mosquito Hämostat	Roboz Surgical	RS-7112
Heparin 30.000 Einheiten pro 30 ml	APP Pharmazeutika
Humanserum Albumin (HSA)	OctaPharma Plasma		Perfusat-Additiv
IL2 Schlauchset für Perfusat	Harvard Apparat	733842
IPL-2 Basic Lungenperfusionssystem	Harvard Apparat
Ketamin 500 mg pro 5 ml	JHP Pharmaceuticals
Kanüle linker Vorhof	Harvard Apparat 730712
Liqui-Cel EXF Serie G420 Membranschütz	3M	G420	Gasschütz
kaliumarme Dextran-Glukoselösung (Perfadex)	XVIVO-Lösung		, die die Lunge spült
Masterflex Platinum Coated Tubing (Größe: 73,17,16,24)	Cole-Palmer
N-Acetyl-L-Cystein (NALC, C5H9NO3S)	Sigma Aldrich	616-91-1 (A7250)	Für modifizierte Ringer-Laktat-Nalgengefäße
( 10L, 20L)	Nalgene		Filtrationsgefäße
Schlauchpumpe	Ismatec	ISM 827B
PES, 0,65 & Mikro m TFF-Modul	Repligen	N02-E65U-07-N
PhysioSuite	Kent Scientific Corporation	PS-MSTAT-RT
Polyethersulfon (PES), 0,2 & Mikro; m TFF-Modul	Repligen	N02-S20U-05-N
Polysulfon (PS), 500 kDa TFF-Modul	Repligen	N02-P500-05-N
Kaliumchlorid (KCl)	Fisher Scientific	7447-40-7	Für PBS
PowerLab 8/35	ADInstruments	730045
Pulmonalarterienkanüle	Harvard Apparatus	730710
Pumpenkopfschlauch (Größe: 73,17,16,24)	PharMed BPT
Puralube  Augensalbe	Dechra	NA
Schere	Fine Science Werkzeuge	14090-11
SCP Servoregler für Perfusion Typ 704	Harvard Gerät	732806
Kleintierbeatmungsgerät Modell 683	Harvard Gerät	55-000
Natriumchlorid (NaCl)	Fisher Scientific	7647-14-5 (S271-10)	Für PBS und Kochsalzlösung
Natriumcyanoborohydrid (NaCNBH3)	Sigma Aldrich	25895-60-7
Natriumdithionit (Na2S2O4)	Sigma Aldrich	7775-14-6
Natriumhydroxid (NaOH)	Fisher Scientific	1310-73-2	Für modifiziertes Ringer-Laktat
Natriumlactat (NaC3H5O3)	Sigma Aldrich	867-56-1	Für modifiziertes Ringer-Laktat
Natriumphosphat zweibasisch (Na2HPO4)	Fisher Scientific	7558-79-4	Für PBS
Natriumphosphat monobasisch (NaH2PO4)	Fisher Scientific	7558-80-7	Für PBS
SomnoSuite Anästhesiesystem für Kleintiere	Kent Scientific Corporation	SS-MVG-Modul
Sprague-Dawley Ratten	Envigo
TAM-A Wandler Verstärker Modul Typ 705/1	Harvard Apparat	73-0065
TAM-D Wandler Verstärker Typ 705/2	Harvard Apparat	73-1793
TCM Zeitregelmodul Typ 686	Harvard Apparat	731750
Trachealkanüle	Harvard Apparat	733557
Schlauchset für Feuchtkammer	Harvard Apparatur	& 73V83157
Schlauchkassette	Cole-Parmer	IS 0649
Pinzette #5 Dumostar	Kent Scientific Corporation	INS500085-A
Pinzette #5 Edelstahl, gebogen	Kent Scientific Corporation	IND500232
Pinzette #7 Titan	Kent Scientific Corporation
Tygon E-3603 Schlauch 2,4 mm ID	Harvard Apparat	721017	Perfusatleitung in die Lunge
Tygon E-3603 Schlauch 3,2 mm ID	Harvard Apparat 721019		Perfusatleitung aus der Lunge
Vannas-Tübingen Federschere	Fine Science Tools	15008-08
VCM Beatmungsgerät Steuermodul Typ 681	Harvard Apparat	731741
William's E Media	Gibco, ThermoFisher Scientific	A12176-01	Perfusatzusatz
Xylazin 100 mg pro 1 ml	Akorn