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Methodenartikel

Erforschung alternativer Perfusionslösungen unter Verwendung von polymerisierten hämoglobinbasierten Sauerstoffträgern der nächsten Generation in einem Modell der ex vivo Lungenperfusion von Ratten

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DOI:

10.3791/66702

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14. Juni 2024

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1COPPER Laboratory, Department of Surgery, The Ohio State University Wexner Medical Center, 2Division of Cardiac Surgery, Department of Surgery, The Ohio State University Wexner Medical Center, 3William G. Lowrie Department of Chemical and Biomolecular Engineering, College of Engineering, The Ohio State University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir die Anwendung eines polymerisierten humanen Hämoglobin (PolyhHb)-basierten Sauerstoffträgers als Perfusat und das Protokoll, in dem diese Perfusionslösung in einem Modell der ex vivo Lungenperfusion von Ratten getestet werden kann.

Zusammenfassung

Eine Lungentransplantation wird durch den Mangel an geeigneten Spendern erschwert. Früher wurden Spender, die als marginal oder unzureichend galten, verworfen. Neue und aufregende Technologien, wie z. B. die Ex-vivo-Lungenperfusion (EVLP), bieten Lungentransplantationsanbietern jedoch eine erweiterte Bewertung für Allotransplantate von marginalen Spendern. Diese dynamische Bewertungsplattform hat zu einer Zunahme der Lungentransplantationen geführt und es den Anbietern ermöglicht, Spender zu verwenden, die zuvor verworfen wurden, wodurch der Spenderpool erweitert wurde. Derzeitige Perfusionstechniken verwenden zelluläre oder azelluläre Perfusate, und beide haben unterschiedliche Vor- und Nachteile. Die Zusammensetzung der Perfusion ist entscheidend für die Aufrechterhaltung eines homöostatischen Milieus, eine angemessene metabolische Unterstützung, die Verringerung von Entzündungen und Zelltod und letztendlich die Verbesserung der Organfunktion. Perfusionslösungen müssen eine ausreichende Proteinkonzentration enthalten, um einen angemessenen onkotischen Druck aufrechtzuerhalten. Derzeitige Perfusionslösungen führen jedoch häufig zu einer Flüssigkeitsextravasation durch das Lungenendothel, was zu unbeabsichtigten Lungenödemen und -schäden führt. Daher ist es notwendig, neuartige Perfusionslösungen zu entwickeln, die übermäßige Schäden verhindern und gleichzeitig eine ordnungsgemäße zelluläre Homöostase aufrechterhalten. Hier beschreiben wir die Anwendung eines polymerisierten humanen Hämoglobin (PolyhHb)-basierten Sauerstoffträgers als Perfusat und das Protokoll, in dem diese Perfusionslösung in einem Modell der EVLP der Ratte getestet werden kann. Das Ziel dieser Studie ist es, der Lungentransplantationsgemeinschaft wichtige Informationen für die Konzeption und Entwicklung neuartiger Perfusionslösungen sowie die richtigen Protokolle zur Verfügung zu stellen, um sie in klinisch relevanten translationalen Transplantationsmodellen zu testen.

Einleitung

Wie jeder Bereich der soliden Organtransplantation leidet auch die Lungentransplantation unter einem Mangel an Spenderorganen. Um den Spenderpool zu vergrößern, wurde viel geforscht, um das Potenzial von Allotransplantaten zu untersuchen, die einst als ungeeignet für eine Transplantation galten, d.h. Spender mit erweiterter Kriterien, d.h. Spender mit erweiterten Kriterien (ECD). Diese Allotransplantate können aus einer Reihe von Gründen als ECD angesehen werden, darunter fragwürdige Qualität, schlechte Funktion, Infektionen, Traumata, verlängerte warme oder kalte ischämische Zeiten und fortgeschrittenes Alter 1,2. In bestimmten Fällen, in denen diese Lungen für eine sofortige Transplantationgeeignet sind 3, ist es oft sowohl für Anbieter als auch für Empfänger von Vorteil, diese Lungen für eine zusätzliche Zeit zu bewerten, um ihre Eignung für eine Transplantation zu bestimmen. Die Ex-vivo-Lungenperfusion (EVLP) ist eine solche Technologie, die eine erweiterte Beurteilung potenzieller Lungentransplantate in einem geschlossenen Kreislauf außerhalb des Spendersermöglicht 2,4,5,6,7 und dem Transplantatgeber die Möglichkeit gibt, die Eignung für die Transplantation zu bestimmen. Die EVLP hat gezeigt, dass sie in der Lage ist, Spenderorgane angemessen zu beurteilen 8,9,10,11, die Auswirkungen der ischämischen Reperfusionsverletzung (IRI)12,13 zu verringern und den Spenderpool zu vergrößern 14,15, wodurch die Lungentransplantation für alle leichter zugänglich wird.

Im Allgemeinen handelt es sich bei einem EVLP-System um ein geschlossenes System mit einem Beatmungskreislauf (erreicht durch Anschluss eines Beatmungsgeräts an die Luftröhre, um Luft in das System einzuführen) und einem Gefäßkreislauf (erreicht durch Verbindung des linken Vorhofs (LA) mit der Lungenarterie (PA) mit einem Schlauch)7. Der Gefäßkreislauf ist mit Perfusat ausgestattet, das durch die Schläuche fließt, um der Lunge lebenswichtige Nährstoffe und Sauerstoff zuzuführen und gleichzeitig die kalte ischämische Zeit (CIT) zu begrenzen5,8,16,17. Diese Lösung ist entweder blutbasiert (d. h. durch Zugabe von gepackten roten Blutkörperchen (PRBCs)16,17 oder azellulär (d. h. keine PRBCs)4,5. Die Verwendung von PRBCs hat jedoch einige bemerkenswerte Nachteile. Bei der Verwendung von PRBCs von Spendern, die an einem Trauma oder hirntoten Spendern (BDD) gestorben sind, enthalten diese Flüssigkeiten oft große Mengen an entzündlichen Zytokinen, die die Zellschädigung während der EVLP sowie den Spiegel von zellfreiem Hämoglobin (Hb), Häm, Eisen und Zellfragmenten erhöhen können, was den Zellen zusätzlichen Schaden zufügt18,19. Da es sich bei diesen Spendern häufig um Multiorganspender handelt, könnte die Entnahme von PRBCs vor der Entnahme zu einer Abnahme des Blutvolumens beim Spender und in der Folge zu einer Zunahme der Ischämie bei allen Organen führen. Bei der Verwendung von PRBCs aus einer anderen Quelle könnten Anbieter mit Blutengpässen konfrontiert werden, da dies an und für sich ein knappes Material ist20,21. Schließlich sind PRBCs unabhängig von ihrer Quelle anfällig für eine mechanische Lyse im EVLP-Schaltkreis, wodurch Hb und andere Komponenten freigesetzt werden, die zur Zellschädigung beitragen.

Daher kann es aus vielen Gründen vorteilhaft sein, einen künstlichen Ersatz für rote Blutkörperchen, d. h. hämoglobinbasierte Sauerstoffträger (HBOCs), als Perfusatergänzung zu verwenden. Ein besonders vielversprechendes HBOC ist polymerisiertes humanes Hämoglobin (PolyhHb). PolyhHb wird aus Hb synthetisiert, das aus abgelaufenen PRBCs gereinigt wurde, die als ungeeignet für eine sofortige Transfusion eingestuft wurden22. Sie haben sich als brauchbare Blutersatzstoffe bei hämorrhagischem Schock23 und Transplantation24 erwiesen und können in großen Mengen hergestellt werden22. Die großflächige Einführung von PolyhHb war jedoch aufgrund unvorhergesehener Komplikationen wie Vasokonstriktion, steigendem Blutdruck und Herzstillstand nicht erfolgreich23,25. Die Gründe für diese Befunde waren wahrscheinlich auf das Vorhandensein von zellfreien Hb- oder niedermolekularen Hb-Polymeren (< 500 kDa) in der PolyhHb-Lösung zurückzuführen, da sie eine Neigung zur Extravasation in den Geweberaum haben, was zu einer verminderten Verfügbarkeit von Stickstoffmonoxid, einer nachfolgenden Vasokonstriktion, systemischer Hypertonie und schließlich zu oxidativen Gewebeschäden führte26,27. Um diese Probleme zu verbessern, hat das Palmer Laboratory an der Entwicklung eines PolyhHb der nächsten Generation gearbeitet, das minimale Spezies mit niedrigem MW und zellfreies Hb enthält, das verbesserte biophysikalische Eigenschaften und In-vivo-Reaktionen gezeigt hat 22,28,29,30. Mehrere Transfusionsstudien an Tieren haben gezeigt, dass, wenn niedermolekulare Hb-Polymere aus dem HBOC eliminiert werden, Vasokonstriktion, systemische Hypertonie und oxidative Schäden gemildert werden können 28,29,31,32,33,34,35. Dies macht dieses PolyhHb der nächsten Generation zu einem vielversprechenden Perfusatkandidaten.

Hier beschreiben wir die Anwendung eines PolyhHb der nächsten Generation, das in einem Perfusat verwendet werden soll, und das Protokoll, mit dem diese Perfusionslösung in einem Modell der EVLP von Ratten getestet werden kann. Das Ziel dieser Studie ist es, der Lungentransplantationsgemeinschaft wichtige Informationen für die Gestaltung und Entwicklung neuartiger Perfusionslösungen zur Verfügung zu stellen und Protokolle bereitzustellen, um sie in klinisch relevanten translationalen Transplantationsmodellen zu testen.

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Protokoll

Sprague-Dawley-Ratten (300 g Körpergewicht) wurden kommerziell gewonnen und unter pathogenfreien Bedingungen in der Tiereinrichtung des Wexner Medical Center der Ohio State University untergebracht. Alle Verfahren wurden gemäß dem Leitfaden für die humane Pflege und Verwendung von Labortieren des NIH und des National Research Council und mit Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee der Ohio State University (IACUC-Protokoll 2023A00000071) human durchgeführt.

1. PolyhHb-Synthese und -Reinigung

HINWEIS: Die Herstellung und Synthese des PolyhHb-Materials, das für die folgenden EVLP-Experimente verwendet wurde, wurde ursprünglich von Cuddington et al. im Jahr 2020veröffentlicht 22. Bitte beziehen Sie sich auf diese Arbeit für detaillierte Schemata und Analysen der PolyhHb-Synthese. Im Folgenden finden Sie eine Zusammenfassung der Synthese und Reinigung von PolyhHb im Pilotmaßstab und seiner anschließenden Herstellung als Perfusat.

  1. Erythrozytenwäsche, Lyse und Hb-Reinigung
    1. Beschaffen Sie 18 Einheiten abgelaufener humaner PRBCs und gießen Sie sie in ein 20-Liter-Filtergefäß, verdünnen Sie sie mit 0,9 Gew.-% Kochsalzlösung auf einen endgültigen Hämatokrit von 22 % (Abbildung 1B, C).
    2. Führen Sie sechs Systemvolumenaustausche (Diazyklen) an einem 0,65 μm modifizierten Polyethylensulfon (mPES)-Tangentialflussfiltrationsmodul (TFF) mit 0,9 Gew.-% Kochsalzlösung auf der Erythrozytenlösung durch. HINWEIS: Der Zweck dieses Waschschritts besteht darin, beschädigte Erythrozyten, Membranfragmente und andere extrazelluläre Materialien vor der Hämolyse zu entfernen (Abbildung 1B, C).
    3. Die RBC-Lösung wird mit 10 l Phosphatpuffer (PB, 3,75 mM, pH 7,4) 1 h lang bei 4 °C unter ständigem Rühren lysiert.
    4. Entfernen Sie die lysierten Membranfragmente und andere Aggregate, indem Sie die Lösung über ein 500-kDa-TFF-Modul filtrieren und das Permeat im 30-l-Batch-Reaktorbehälter auffangen (Abbildung 1A-C).
    5. Sobald sich 480 g Hb im Reaktor befinden, fügen Sie eine Salzladung hinzu, um PB in phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) umzuwandeln.
    6. Rezirkulieren Sie das Hb durch einen mit Stickstoff gespeisten Gaskontaktor und halten Sie einen Stickstoffkopfraum im Reaktor aufrecht, um das Protein über Nacht sauerstoffarm zu machen. Auf 14 °C abkühlen lassen, um die Bildung von Methämoglobin (metHb) zu begrenzen.
  2. Hb-Polymerisation
    1. Die Hb-Lösung wird auf physiologische Temperatur (37 °C) erhitzt, während die Lösung in einer Gasschützschleife umgewälzt wird.
      HINWEIS: Ziel ist es, das Protein auf einen pO2 zwischen 0 und 10 mmHg zu desoxygenieren, um sicherzustellen, dass sich der größte Teil des Hb im angespannten quartären Zustand befindet (Abbildung 1A).
    2. Fügen Sie bei Bedarf 1 g Natriumdithionit hinzu, um eine wirksame Sauerstoffentgiftung zu gewährleisten.
    3. Unter Beibehaltung des Rezirkulationskreislaufs und Entgasung der Hb-Lösung wird ein molares Verhältnis von Glutaraldehyd (GA) zu Hb von 30:1 zugegeben, verdünnt in 3 l sauerstoffarmem PBS (pH 7,4).
    4. Die Lösung über 3 Stunden in den Reaktorbehälter geben, mit einer zusätzlichen Stunde Reaktionszeit.
    5. Die Vernetzungsreaktion wird mit einem molaren Verhältnis von Natriumcyanoborohydrid zu GA von 7:1 abgeschreckt, verdünnt in 3 l PBS (pH 7,4). Für mehr als 10 min in den Reaktor geben.
    6. Reaktor über Nacht bei 14 °C kühlen.
  3. PolyhHb-Aufreinigung
    1. Pumpen Sie den Reaktorinhalt in ein 10-l-Filtrationsgefäß und beginnen Sie mit der Zirkulation durch ein 0,2-μm-TFF-Modul aus Polyethylensulfon (PES) (Stufe 1). In diesem Schritt werden große Zuschlagstoffe und unerwünschte Verunreinigungen entfernt.
    2. Geben Sie das Permeat in ein sekundäres 10-Liter-Filtrationsgefäß, das über ein 500 kDa Polysulfon (PS) TFF-Modul (Stufe 2) zirkuliert, sobald es voll ist. Fahren Sie fort, bis der Reaktor entleert ist (Abbildung 1B,D).
    3. Sobald der Reaktor in den Reinigungskreislauf entleert ist, beginnen Sie mit dem Austausch von Hilfsstoffen in Stufe 1 mit einer modifizierten Ringer-Laktatlösung (pH 7,4). Nach jedem vollständigen Volumenaustausch ist die Proteinkonzentration im Permeat der Stufe 1 mittels UV-sichtbarer Spektroskopie zu messen.
    4. Wenn das Permeat der Stufe 1 eine Konzentration von weniger als 1 mg Hb/ml aufweist, überführen Sie die modifizierte Ringer-Lösung in die Stufe 2. Jeder Stillstand in Stufe 1 ist eine Verschwendung und sollte ordnungsgemäß entsorgt werden. Stellen Sie insgesamt sicher, dass in beiden Phasen 12 vollständige Volumenaustausche der modifizierten Ringer-Lösung durchgeführt werden.
    5. Nach Abschluss der Diazyklen ist der Gehalt der Stufe 2 auf mindestens 10 g/dl über dem 500 kDa TFF-Modul zu konzentrieren.
    6. Verpacken Sie die konzentrierte Lösung in konische 50-ml-Röhrchen und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei -80 °C.

2. Perfusat-Formulierung

  1. Bereiten Sie das Perfusat auf ein Endvolumen von 165 ml vor. PolyhHb auf eine Endkonzentration von 3,7 g/dl mit William's E Medium verdünnen.
  2. Humanserumalbumin (HSA) bis zu einer Endkonzentration von 3 Gew.-% HSA zugeben. Fügen Sie 1 ml Heparin zur endgültigen Lösung hinzu.

3. Einrichtung eines Ex-vivo-Lungenperfusionskreislaufs

  1. Geben Sie PolyhHb-Perfusat in den EVLP-Kreislaufbehälter und schalten Sie das Warmwasserbad auf 37 °C ein. Stellen Sie sicher, dass das Perfusat im Kreislauf zirkuliert, indem Sie die Rollenpumpen einschalten.
  2. Schließen Sie das Sauerstoffentsauerungsgas (d. h. 6 % O2, 8 % CO2, 84 % N2) an den Hohlfaseroxygenator an, um das Perfusat sauerstofffrei zu machen. Dies geschieht, um die Fähigkeit der Lunge zu beurteilen, das Perfusat mit Sauerstoff zu versorgen.
  3. Öffnen Sie die Datenerfassungssoftware auf einem Computer in der Nähe. Stellen Sie sicher, dass der Lungenarteriendruck, der Differenzdruck der Luftröhre, der Differenzdruck der Atemströmung, das Lungengewicht und die Pumpendrehzahl sowohl an den Kreislauf als auch an die Datenwandlerbox angeschlossen sind.
  4. Stellen Sie sicher, dass im gesamten System keine Lecks vorhanden sind, indem Sie alle Rohrverbindungen sorgfältig untersuchen und dass warmes Wasser im gesamten System zirkuliert (Abbildung 2). Drücken Sie in der Datenerfassungssoftware auf Ausführen , um sicherzustellen, dass alle Druckmessumformer funktionieren. Sobald das System ordnungsgemäß funktioniert, schalten Sie die Rollenpumpen aus.

4. Beschaffung eines Spender-Ratten-Lungenblocks

  1. Richten Sie den Operationstisch ein und ordnen Sie die Instrumente an (Abbildung 3). Autoklavieren Sie alle Instrumente 30 Minuten lang bei 121 °C.
  2. Bereiten Sie 1200 U/kg Heparin, ein Ketamin/Xylazin-Gemisch für die Anästhesie (60 mg/kg Ketamin und 5 mg/kg), sowie 5-10 cm lange Seidennähte (3-0 oder 4-0) vor.
  3. Injizieren Sie der Ratte intraperitoneal Ketamin/Xylazin-Lösung. Warten Sie 5-10 Minuten, bis sich die Anästhesieebene entwickelt hat. Um ein angemessenes Maß an Anästhesie zu gewährleisten, kneifen Sie die Ratte, um eine Reaktion auszulösen. Wenn es keine Reaktion gibt, wurde das richtige Anästhesieniveau erreicht.
  4. Rasieren Sie den Bauch der Ratte und legen Sie die Ratte in Rückenlage auf das Operationsbrett. Reinigen Sie den Bauch mit Povidon-Jod und 70% Ethanol. Tragen Sie eine Augensalbe unter die Augen der Ratte auf, um Trockenheit zu verhindern.
  5. Bringen Sie die Ratte auf die Operationsplatte und befestigen Sie die Ratte (Abbildung 4A). Schalten Sie die Datenerfassungssoftware ein und beginnen Sie mit der Aufnahme. Schalten Sie das Beatmungsgerät bei 4 ml/kg ein und stellen Sie sicher, dass der positive Exspirationsdruck (PEEP) etwa 2 cm/H2O beträgt.
    HINWEIS: Diese Grundeinstellungen sind experimentspezifisch. Es liegt an allen Forschern, die besten Beatmungsstrategien für einzelne Experimente zu bestimmen.
  6. Sobald die richtige Anästhesietiefe erreicht ist, führen Sie mit einer Schere eine Mittellinien-Laparotomie vom Xiphoid-Prozess bis zur Schambeinsymphyse durch. Als nächstes führen Sie eine medial-laterale viszerale Rotation durch und visualisieren Sie die infrahepatische untere Hohlvene mit einem stumpfen Instrument (IVC)36,37,38 (Abbildung 4B). Injizieren Sie Heparin mit einer 20G-Nadel in die IVC (Abbildung 4C).
  7. Richten Sie die Aufmerksamkeit auf den Hals und schneiden Sie die Haut von der sternalen Kerbe bis knapp unter den Winkel des Unterkiefers mit einer Schere. Beginnen Sie als Nächstes mit der Präparation in Richtung Luftröhre (Abbildung 5A).
  8. Präparieren Sie im Nacken stumpf die notwendigen Gurtmuskeln, um die Luftröhre freizulegen (Abbildung 5B). Machen Sie mit einer Schere einen Querschnitt an der vorderen Luftröhre zwischen den Knorpelringen, die groß genug für den Endotrachealtubus (ET) sind (mehrere Millimeter), aber schneiden Sie nicht durch den hinteren Teil der Luftröhre. Legen Sie eine 5-0 Seidennaht um die Luftröhre (Abbildung 5C).
  9. Führen Sie den Endotrachealtubus ein und befestigen Sie ihn mit der bereits erwähnten 5-0-Seidennaht (Abbildung 5D). Schließen Sie den ET-Schlauch an das Beatmungsgerät an und sorgen Sie für eine korrekte Anhebung des Brustkorbs.
  10. Führen Sie eine mediane Sternotomie durch und dringen Sie mit einer Schere wieder in die Brusthöhle ein. Platzieren Sie Brustwandretraktoren, um Herz und Lunge freizulegen (Abbildung 6A). Vermeiden Sie jede versehentliche Manipulation der Lunge, da sie unglaublich brüchig ist.
  11. Entfernen Sie den Thymus aus dem vorderen Mediastinum durch eine Kombination aus scharfer (Schere) und stumpfer Dissektion. Achten Sie darauf, keine großen Gefäße oder Lungen zu beschädigen.
  12. Identifizieren Sie die Lungenarterie (PA; Abbildung 6B) und legen Sie eine 5-0-Seidennaht darum, um die Kanülierung vorzubereiten (Abbildung 6C). Aufgrund der mikroskopischen Anatomie der großen Gefäße der Ratte ist es oft einfacher, die Naht gleichzeitig um die PA und die Aorta zu legen.
  13. Machen Sie mit einer Schere (Abbildung 6D-E) einen 2-3 mm großen Schnitt in der rechtsventrikulären Ausflussspur (RVOT), um die arterielle Kanüle in der PA zu platzieren und sie mit der einen Schritt zuvor beschriebenen 5-0-Naht zu fixieren (Abbildung 6F).
  14. Machen Sie einen 5-mm-Schnitt im linken Ventrikel (LV) sowie eine infrahepatische IVC mit einer Schere, um die Ratte einzuschläfern. Verbinden Sie die Lungenkonservierungsflüssigkeit schnell mit der arteriellen Kanüle, um die Lunge mit etwa 20 ml zu spülen (Abbildung 7A-B). Stellen Sie sicher, dass die Lungenkonservierungsflüssigkeit entlüftet wird, bevor Sie sie an die arterielle Kanüle anschließen, da Luftembolien die Lunge sehr schädigen.
  15. Verbinden Sie die arterielle Kanüle mit dem EVLP-Kreislauf. Schalten Sie die Rollenpumpe ein und lassen Sie eine kleine Menge Perfusat durch die Lunge und aus dem linken Ventrikel in die Brusthöhle fließen. Sobald das Perfusat aus dem linken Vorhof zu fließen beginnt, schalten Sie die Rollenpumpe aus (Abbildung 7C). Während das Perfusat fließen kann, stellen Sie sicher, dass der PA-Druck nicht ansteigt - was auf eine Verstopfung oder falsche Platzierung hinweisen würde.
  16. Legen Sie eine kleine Pinzette in die LV und dehnen Sie vorsichtig den Mitralklappenanulus, wodurch die Kanüle des linken Vorhofs (LA) eingeführt werden kann (Abbildung 8A). Legen Sie eine 5-0 Seidenkrawatte um das Herz und binden Sie sie locker zusammen (Abbildung 8B).
  17. Führen Sie die LA-Kanüle in das LV ein und schieben Sie die LA-Kanüle vor, bis sie im Vorhof zu sehen ist. Beenden Sie die Sicherung des LA mit der vorgebundenen 5-0-Naht (Abbildung 8C).
  18. Identifizieren Sie die Speiseröhre und klemmen Sie sie mit einem Blutstillungsmittel so nah wie möglich an das Zwerchfell. Schneiden Sie die Speiseröhre unterhalb des Hämostaten ab, um sicherzustellen, dass kein Austritt in die Brusthöhle erfolgt (Abbildung 9A).
  19. Schneiden Sie mit einer Schere alle Bänderansätze, die den Herz-Lungen-Block mit den umgebenden Strukturen verbinden, mit der Wirbelsäule ab (Abbildung 9B). Sobald der Herz-Lungen-Block frei beweglich ist, präparieren Sie die Luftröhre vom Hals aus und schneiden Sie schließlich die Luftröhre oberhalb des ET-Schlauchs mit einer Schere, um den Herz-Lungen-Block zu befreien (Abbildung 9C).
  20. Verschieben Sie den Herz-Lungen-Block in den Thoraxmantel innerhalb des EVLP-Kreislaufs und befestigen Sie die LA-Kanüle an den EVLP-Kreislauf (Abbildung 9D). Schalten Sie die Rollenpumpe ein und schließen Sie den Beatmungsmonitor an.
  21. Überprüfen Sie die Blasenfalle, um sicherzustellen, dass keine Luftembolien in das System eingebracht werden.
  22. Ändern Sie die Beatmungs- und Perfusionseinstellungen während der ersten 15 Minuten langsam auf die gewünschten experimentellen Werte 36,37,38. Erhöhen Sie außerdem während dieser anfänglichen Anlaufphase die Perfusionsflussrate auf die gewünschte Rate und/oder den gewünschten Druck.
  23. Zu den für den Versuch festgelegten Zeitpunkten sind die Perfusatgaswerte sowie Lungenfunktionstests zu überprüfen.

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Ergebnisse

Die Validierung unseres PolyhHb-basierten Perfusats und darüber hinaus die Stabilität dieses Perfusats über mehrere Stunden ist in Abbildung 10 dargestellt. Während der ersten 1 h zeigten alle getesteten Perfusate (PolyhHb, Control (Williams Media + 5% HSA), RBC-basiert) eine leichte Abnahme von LApO 2 (PostpO 2). Das Erythrozyten-basierte Perfusat zeigte jedoch nach 1 h eine signifikante Abnahme im Vergleich zu PolyhHb (p < 0,05). Bei Tests in den nächsten Stunden w...

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Diskussion

Die Entwicklung und Erprobung von Perfusionslösungen ist ein neuartiges Unterfangen, das viele Menschen auf der ganzen Welt in Angriff nehmen. Traditionell bieten Standardperfusate die Möglichkeit, die ischämische Zeit auszusetzen und die damit verbundenen Verletzungen mit Ischämie sowie Reperfusion zu mildern18. Die nächste Weiterentwicklung von EVLP besteht jedoch darin, die derzeitige Perfusattechnologie zu verbessern und Reparatur- und Rekonditionierungstherap...

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Offenlegungen

Für das in dieser Arbeit vorgestellte Material sind A.F.P., A.G. und C.C. Erfinder der US-Patentanmeldung PCT/US2022/041743. A.F.P., C.C., B.A.W. und S.M.B. sind Erfinder der US-Patentanmeldung PCT/US2023/017765.

Danksagungen

Diese Forschung wurde großzügig unterstützt von der Jewel and Frank Benson Family Endowment und der Jewel and Frank Benson Research Professorship. B.A.W. wird teilweise von den National Institutes of Health (NIH) Grant R01HL143000 unterstützt. A.F.P. wird durch NIH-Zuschüsse R01HL126945, R01EB021926, R01HL131720 und R01HL138116 sowie durch Zuschüsse des US Army Medical Research and Materiel Command W81XWH1810059 unterstützt. S.M.B. wird von der NIH R01 DK123475 unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
10 cc Insulinspritze 29 G x 1/2" NadelB-D309301
30 L Glas Batch BioreaktorAce Glass
30g NadelMed NadelnBD-305106
Baytril (Enrofloxacin) Antibakterielle TablettenElancoNA
Calciumchlorid-Dihydrat (CaCl2.2H2O)Sigma Aldrich10035-04-8Für modifizierte Ringer's Laktat
CFBA Trägerfrequenz-Brückenverstärker Typ 672Harvard Apparatus731747
Connect Kit D150Cole-Parmer VK 73-3763
Dumont #5 PinzettenFine Science Werkzeuge11252-50
Dumont Medical #5/45 Pinzette - Abgewinkelt 45°;Fine Science Tools11253-25
Ecoline Star Edition 003, E100 WarmwasserbereiterLaudaLCK 1879
Abgelaufene humane leukoreduzierte, verpackte ErythrozyteneinheitenWexner Medical Center
Canadian Blood Services
Zen-Bio Inc
Fiberoxygenator D150Hugo Sachs ElektronikPY2 73-3762
PinzetteFine Science Werkzeuge11027-12
Glutaraldehyd (C5H8O2 70 Gew.-%)Sigma Aldrich111-30-8 (G7776)
Halsted-Mosquito HämostatRoboz SurgicalRS-7112
Heparin 30.000 Einheiten pro 30 mlAPP Pharmazeutika
Humanserum Albumin (HSA)OctaPharma PlasmaPerfusat-Additiv
IL2 Schlauchset für PerfusatHarvard Apparat733842
IPL-2 Basic LungenperfusionssystemHarvard Apparat
Ketamin 500 mg pro 5 mlJHP Pharmaceuticals
Kanüle linker VorhofHarvard Apparat 730712
Liqui-Cel EXF Serie G420 Membranschütz3MG420Gasschütz
kaliumarme Dextran-Glukoselösung (Perfadex)XVIVO-Lösung, die die Lunge spült
Masterflex Platinum Coated Tubing (Größe: 73,17,16,24)Cole-Palmer
N-Acetyl-L-Cystein (NALC, C5H9NO3S)Sigma Aldrich616-91-1 (A7250)Für modifizierte Ringer-Laktat-Nalgengefäße
( 10L, 20L)NalgeneFiltrationsgefäße
Schlauchpumpe  Ismatec  ISM 827B
PES, 0,65 & Mikro m TFF-ModulRepligenN02-E65U-07-N
PhysioSuiteKent Scientific CorporationPS-MSTAT-RT
Polyethersulfon (PES), 0,2 & Mikro; m TFF-ModulRepligenN02-S20U-05-N
Polysulfon (PS), 500 kDa TFF-ModulRepligenN02-P500-05-N
Kaliumchlorid (KCl)Fisher Scientific7447-40-7Für PBS
PowerLab 8/35  ADInstruments730045
PulmonalarterienkanüleHarvard Apparatus730710
Pumpenkopfschlauch (Größe: 73,17,16,24)PharMed BPT
Puralube  AugensalbeDechraNA
SchereFine Science Werkzeuge14090-11
SCP Servoregler für Perfusion Typ 704Harvard Gerät732806
Kleintierbeatmungsgerät Modell 683Harvard Gerät55-000
Natriumchlorid (NaCl)Fisher Scientific7647-14-5 (S271-10)Für PBS und Kochsalzlösung
Natriumcyanoborohydrid (NaCNBH3)Sigma Aldrich25895-60-7
Natriumdithionit (Na2S2O4)Sigma Aldrich7775-14-6
Natriumhydroxid (NaOH)Fisher Scientific1310-73-2Für modifiziertes Ringer-Laktat
Natriumlactat (NaC3H5O3)Sigma Aldrich867-56-1Für modifiziertes Ringer-Laktat
Natriumphosphat zweibasisch (Na2HPO4)Fisher Scientific7558-79-4Für PBS
Natriumphosphat monobasisch (NaH2PO4)Fisher Scientific7558-80-7Für PBS
SomnoSuite Anästhesiesystem für KleintiereKent Scientific CorporationSS-MVG-Modul
Sprague-Dawley RattenEnvigo
TAM-A Wandler Verstärker Modul Typ 705/1Harvard Apparat73-0065
TAM-D Wandler Verstärker Typ 705/2Harvard Apparat  73-1793
TCM Zeitregelmodul Typ 686Harvard Apparat731750
TrachealkanüleHarvard Apparat733557
Schlauchset für FeuchtkammerHarvard Apparatur& 73V83157
SchlauchkassetteCole-ParmerIS 0649
Pinzette #5 DumostarKent Scientific Corporation  INS500085-A
Pinzette #5 Edelstahl, gebogenKent Scientific CorporationIND500232
Pinzette #7 TitanKent Scientific Corporation 
Tygon E-3603 Schlauch 2,4 mm IDHarvard Apparat721017Perfusatleitung in die Lunge
Tygon E-3603 Schlauch 3,2 mm IDHarvard Apparat 721019Perfusatleitung aus der Lunge
Vannas-Tübingen FederschereFine Science Tools15008-08
VCM Beatmungsgerät Steuermodul Typ 681Harvard Apparat731741
William's E MediaGibco, ThermoFisher ScientificA12176-01Perfusatzusatz
Xylazin 100 mg pro 1 mlAkorn
INS600187

Referenzen

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