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Mastzellen in der Mikroumgebung des hepatozellulären Karzinoms bieten günstige Prognose: Eine retrospektive Studie mit der Bildanalysesoftware QuPath

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DOI:

10.3791/66743

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12. April 2024

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1Laboratory of Translational Cancer Genomics, Biomedical Center, Faculty of Medicine in Pilsen, Charles University, 2Laboratory of Cancer Treatment and Tissue Regeneration, Biomedical Center, Faculty of Medicine in Pilsen, Charles University, 3Department of Pathology, Third Faculty of Medicine, Charles University, 4Department of Surgery and Biomedical Center, Faculty of Medicine in Pilsen, Charles University, 5Sikl's Institute of Pathology, Faculty of Medicine and Teaching Hospital in Pilsen, Charles University, 6Bioptická Laboratoř s.r.o., 7Department of Cancer Epidemiology, German Cancer Research Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das Vorhandensein von Mastzellen im Innenrand und im Peritumorbereich des hepatozellulären Karzinoms nach der Resektion verleiht eine günstige Prognose. Diese Studie bestätigt die Bildanalysesoftware QuPath als vielversprechende Plattform, die den Bedarf an Reproduzierbarkeit, Konsistenz und Genauigkeit in der digitalen Pathologie erfüllen könnte.

Zusammenfassung

Die Erkenntnisse, die durch den in-situ-Nachweis von Immunzellen im hepatozellulären Karzinom (HCC) gewonnen werden, könnten Aufschluss über die Ergebnisse der Patienten geben. Studien, die die Expression und Lokalisierung von Immunzellen in Tumorgeweben untersuchen, sind mit mehreren Herausforderungen verbunden, darunter ein Mangel an präziser Annotation für Tumorregionen und eine zufällige Auswahl mikroskopischer Sichtfelder. QuPath ist eine benutzerfreundliche Open-Source-Software, die den wachsenden Bedarf an digitaler Pathologie bei der Analyse von Ganzbildbildern (WSI) decken kann.

Die Infiltration von HCC und angrenzenden Geweben durch CD1a+ unreife dendritische Zellen (iDCs), CD117+ Mastzellen und NKp46+ natürliche Killerzellen (NKs) wurde immunhistochemisch in repräsentativen Proben von 67 Patienten mit HCC untersucht, die sich einer kurativen Resektion unterzogen hatten. Die Flächenfraktion (AF) von positiv gefärbten Zellen wurde in WSIs automatisch mit QuPath im Bereich des Tumorzentrums (TC), des inneren Randes (IM), des äußeren Randes (OM) und des Peritumors (PT) bestimmt. Die prognostische Bedeutung von Immunzellen wurde für die Zeit bis zum Rezidiv (TTR), das krankheitsfreie Überleben (DFS) und das Gesamtüberleben (OS) untersucht.

Der AF von Mastzellen war signifikant größer als der von NKs, und der AF von iDCs war signifikant niedriger im Vergleich zu NKs in jeder interessierenden Region. Hohe AFs von Mastzellen im IM- und PT-Bereich waren mit einem längeren DFS assoziiert. Darüber hinaus war ein hoher Vorhofflimmern von Mastzellen im IM mit einem längeren OS assoziiert.

Die computergestützte Analyse mit dieser Software ist ein geeignetes Werkzeug, um prognostische Informationen für tumorinfiltrierende Immunzellen (iDCs, Mastzellen und NKs) in verschiedenen Regionen des HCC nach der Resektion zu erhalten. Mastzellen zeigten den größten AF in allen Regionen von Interesse (ROIs). Mastzellen in der Peritumorregion und im IM zeigten eine positive prognostische Signifikanz.

Einleitung

Es wurde nachgewiesen, dass die räumliche Organisation und Häufigkeit von tumorinfiltrierenden Immunzellen das Überleben bei verschiedenen Krebsarten beeinflusst, einschließlich des hepatozellulären Karzinoms (HCC) 1,2,3,4. Die prognostische Bedeutung von tumorinfiltrierenden Lymphozyten bei Krebserkrankungen wurde erstmals an Hämatoxylin- und Eosin (H&E)-gefärbten Schnittengezeigt 5,6. Dann zeigte eine Pionierstudie von Galon et al. unter Verwendung der Immunhistochemie (IHC) Assoziationen zwischen den Dichten von CD3+- und CD8+-T-Zellen in Darmkrebsgewebe mit der Prognose4.

IHC ist ein Goldstandard für die Visualisierung, Quantifizierung und Kartierung von Immunzellen im Tumorgewebe für eine weitere Assoziation mit klinischen Ergebnissen7. IHC bietet mehrere Vorteile, wie z. B. niedrige Kosten, weit verbreitete Verfügbarkeit und Kompatibilität mit formalinfixiertem, paraffineingebettetem (FFPE) Gewebe8. Die genaue Beurteilung von IHC-gefärbten Immunzellen ist jedoch eine große Herausforderung. Die traditionelle Bewertung in ausgewählten mikroskopischen Sichtfeldern ist zeitaufwändig und reicht nicht mehr aus, um die qualitativ hochwertige, reproduzierbare und objektive Analyse zu gewährleisten, die für die Auswahl der Biomarkerkandidaten und eine zuverlässige klinische Korrelation unerlässlich ist9. Scans ganzer Objektträger können als ganzes Bild oder nach Unterstichprobe bewertet werden10.

Die computergestützte quantitative Bewertung der Häufigkeit von Immunzellen in Gewebeproben kann praktische, genaue, zuverlässige und klinisch relevante Daten gewährleisten11. QuPath ist eine kostenlose Open-Source-Software, die die digitale Bildanalyse von IHC-gefärbten Objektträgern ermöglicht und die Menge der aus einzelnen Proben gewonnenen Informationen maximiert12.

Da unreife dendritische Zellen (iDCs), natürliche Killerzellen (NK) und Mastzellen an der Anti-Tumor-Immunantwort beteiligt sind und gezeigt wurde, dass sie mit den Ergebnissen der Patienten korrelieren 13,14,15, stellen wir hier ein Schritt-für-Schritt-Protokoll vor, um ihre räumliche Verteilung im FFPE-HCC-Gewebe zu beurteilen und ihre prognostische Wirkung zu untersuchen. CD1a wird hauptsächlich auf der Membran unreifer dendritischer Zellen exprimiert, deren Dichte bei einer Vielzahl von humanen Tumoren mit klinischen Ergebnissen in Verbindung gebracht wurde16,17. Mastzellen können eine Protumor- oder Antitumorrolle innerhalb der Tumormikroumgebung (TME) spielen18. Sie können die Angiogenese unterstützen und die Metastasierung erleichtern19. Umgekehrt wurde berichtet, dass Mastzellen die Apoptose von Tumorzellen durch die Produktion von IL-420 vermitteln können. Die Anti-CD117-Färbung wird häufig verwendet, um Mastzellen im Tumorgewebe sichtbar zu machen und zu quantifizieren21. Es wird angenommen, dass NK-Zellen zur Überwachung und Kontrolle von HCCbeitragen 22, indem sie Krebszellen abtöten23. Die Expression von NKp46 durch NK ist ein entscheidender Parameter für ihre Anti-Tumor-Aktivität24. NKp46+ NK-Zellen korrelierten jedoch positiv mit dem Tumordurchmesser bei HCC-Patienten25. Trotzdem ist wenig über ihren Zusammenhang mit dem Überleben der Patienten bekannt.

Unser Ziel war es, die Häufigkeit von CD1a+ iDCs, CD117+ Mastzellen und NKp46+ NK-Zellen in verschiedenen Regionen des HCC quantitativ zu bewerten und ihre prognostische Bedeutung hervorzuheben. In die aktuelle retrospektive Studie wurden insgesamt 70 konsekutive Patienten mit pathologisch bestätigtem HCC im Stadium I-IV eingeschlossen, die gemäß den BCLC-Richtlinien für eine Resektion in Frage kamen und sich zwischen 1997 und 2019 am Universitätsklinikum Pilsen einer Leberresektion mit kurativer Absicht unterzogen haben. Die pathologischen Berichte der Patienten wurden überprüft. Keiner der in diese Studie eingeschlossenen Patienten hatte Fernmetastasen und hatte vor der Operation eine neoadjuvante Therapie wie Chemotherapie oder Strahlentherapie erhalten. Insgesamt wurden 3 Patienten mit histologischen Proben von schlechter Qualität ausgeschlossen und die restlichen 67 Patienten in die Studie eingeschlossen (Tabelle 1).

Protokoll

Dieses Protokoll war Teil einer Studie, die in Übereinstimmung mit den ethischen Standards durchgeführt wurde, die in der Erklärung von Helsinki (Fassung von 2013) festgelegt sind. sie wurde von der Ethikkommission der Medizinischen Fakultät und des Universitätskrankenhauses in Pilsen genehmigt (118/2021, 11. März 2021). Abbildung 1 zeigt eine Zusammenfassung der eingesetzten Methoden.

1. Auswahl von FFPE-Gewebeblöcken

  1. Rufen Sie FFPE-Block-Identifikatoren aus Patientenakten mit Hilfe von behandelnden Ärzten oder Pathologen ab.
  2. Fordern Sie die FFPE-Blöcke beim lokalen Pathologiearchiv an.
  3. Für jeden Patienten wählen Sie 2-3 FFPE-Blöcke aus, die lebensfähiges Tumorgewebe enthalten, vorzugsweise mit dem umgebenden Peritumorbereich und der Nicht-Tumorleber.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, für diese Auswahl die Meinung eines Pathologen einzuholen. Die histologische Beurteilung der Nicht-Tumorleber wurde zusammen mit anamnestischen, klinischen und Labordaten verwendet, um die zugrunde liegende Ätiologie des HCC zu bestimmen.

2. Entparaffinisierung und Rehydrierung von FFPE-Gewebe

  1. Schneiden Sie aus jedem der FFPE-Gewebeblöcke auf einem Mikrotom ein oder zwei Gewebeschnitte von 4 μm Stärke.
    HINWEIS: Die Dicke der Profile kann zwischen 3 μm und 5 μm liegen, ohne dass es zu merklichen Fleckeneinflüssen kommt. Eine Dicke von 4 μm ist jedoch der Standard.
  2. Legen Sie die Abschnitte in ein Wasserbad (42°C), um Falten zu entfernen.
  3. Montieren Sie die Objektträger, indem Sie sie aufnehmen und auf einen positiv geladenen mikroskopischen Objektträger aus Glas legen. Anschließend die Objektträger 24 h lang bei Raumtemperatur (AT) trocknen lassen.
  4. Stellen Sie die Objektträger für 1 h in ein Thermostat (56 °C).
  5. Verwenden Sie einen Autostainer, um die Abschnitte in Entwachslösung-1 (30 s bei 72 °C), Entwachslösung-2 (10 s bei 72 °C), Entwachslösung-3 (10 s bei AT), Ethanol 96%-1 (10 s), Ethanol 96 %-2 (10 s) und Ethanol 96 %-3 (10 s) zu entparaffinieren.
  6. Verwenden Sie einen Autostainer, um die Abschnitte in Waschlösung-1 (10 s, AT), Waschlösung-2 (10 s, AT) und Waschlösung-3 (5 min, AT) zu rehydrieren.

3. IHC in einem vollautomatischen Färbegerät durchführen

HINWEIS: Die IHC wird gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Die Schritte werden im Folgenden kurz erläutert.

  1. Methode der Antigen-Rückgewinnung
    1. Antigen mit dem hitzeinduzierten Epitop-Retrieval (ER)-Verfahren in einer ER-Lösung mit hohem pH-Wert (z. B. Tris-EDTA) abrufen: ER-Lösung-1 (10 s, AT), ER-Lösung-2 (10 s, AT), ER-Lösung-3 (20 min bei 100 °C), ER-Lösung-4 (12 min, AT).
    2. Spülen Sie den Objektträger 3x (je 30 s) und 1x (3 min) in einer Waschlösung.
    3. Blockieren Sie die endogene Peroxidase mit der Peroxid-Blocklösung für 5 min bei AT.
    4. 3x (je 30 s) in einer Waschlösung spülen.
    5. Blockieren Sie die unspezifische Bindung von Antikörpern mit einem Proteinblock für NKp46 nur für 30 min. bei AT.
  2. Bindung an Primärantikörper: Mit Primärantikörpern 15 min bei AT inkubieren, dann 3x (je 30 s) mit einer Waschlösung spülen.
  3. Führen Sie für die Bindung an sekundäre Antikörper die unten beschriebenen Schritte aus.
    1. Inkubieren Sie mit Meerrettichperoxidase-konjugierten Sekundärantikörpern für 8 min bei AT.
    2. 2x (je 2 min) mit einer Waschlösung und 1x mit entionisiertem Wasser spülen.
    3. Visualisieren Sie die Reaktion, indem Sie die Objektträger mit Diaminobenzidin (DAB)-Lösung spülen und dann 10 Minuten lang bei AT mit der DAB-Lösung inkubieren.
    4. 3x (30 s) mit entionisiertem Wasser spülen.
    5. Die Partien mit Mayer's Hämatoxylin gegenfärben.
    6. Spülen Sie 1x (30 s) mit entionisiertem Wasser, 1x (30 s) mit Waschlösung und 1x (30 s) mit deionisiertem Wasser.
    7. Verwenden Sie einen vollautomatischen Objektträgerfärbeer, um die Schnitte in Ethanol 70 % (2 min), Ethanol 80 % (2 min), Ethanol 96 %-1 (3 min), Ethanol 96 %-2 (3 min), Ethanol 100 % (3 min), Xylol-1 (4 min), Xylol-2 (4 min) und Xylol-3 (4 min) zu dehydrieren.
    8. Verwenden Sie einen vollautomatischen Glasabdeckschalter, um die Abschnitte auf den Dias in ein Montagemedium zu montieren.
      HINWEIS: Es wurden durchgehend negative und positive (Mandeln) Gewebekontrollproben verwendet.

4. Abrufen von Scans ganzer Objektträger

  1. Scannen Sie die gefärbten Objektträger mit dem 20-fach-Objektiv und der mittleren bis hohen Fokussierungsdichte auf einem Objektträgerscanner.

5. IHC-Analyse mit der Software

  1. Erstellen Sie ein Projekt für die IHC-Bilder in der Software.
    1. Laden Sie QuPath-0.4.3 (oder höher) herunter und öffnen Sie es.exe
    2. Erstellen Sie einen neuen Ordner mit einem passenden Namen.
    3. Klicken Sie auf die Schaltfläche Projekt erstellen in der oberen linken Ecke der Software und wählen Sie den neu erstellten Ordner aus.
    4. Ziehen Sie gescannte Bilder in das Softwarefenster. Wenn automatisch ein neues Fenster angezeigt wird, wählen Sie "Bildtyp > H-DAB festlegen " und klicken Sie auf "Importieren " (Abbildung 2).
    5. Beobachten Sie die Liste der Bilder im linken Fenster des Menüs; Doppelklicken Sie, um das Bild zu öffnen.
    6. Wählen Sie aus dem Hauptmenü oben Datei, um die Bilder als Projekt zu speichern .
      HINWEIS: Die Software kann mit einer Vielzahl von Bildformaten umgehen, einschließlich vieler ganzer Folienformate. Das TIFF-Format wird jedoch bevorzugt, um den Verlust von Rohdaten und zugehörigen Metadaten zu verhindern.
  2. Beschriften von Interessenbereichen
    1. Wählen Sie das Pinselwerkzeug oder das Zauberstabwerkzeug aus dem Hauptmenü oben aus, um den Tumorbereich zu kommentieren. Befolgen Sie für diskontinuierliche Regionen des Tumors die Schritte 5.2.1.1-5.2.1.3.
      1. Kommentieren Sie sie separat.
      2. Halten Sie die Strg-Taste gedrückt, während Sie alle Tumorregionen auswählen
      3. Klicken Sie mit der rechten Maustaste, und wählen Sie Mehrere bearbeiten > Auswahl zusammenführen.
    2. Stellen Sie sicher, dass die Tumorannotation ausgewählt ist (die Ränder haben eine gelbe Farbe).
    3. Klicken Sie im Hauptmenü auf Automatisieren und wählen Sie Skript-Editor anzeigen.
    4. Kopieren Sie das Skript, das in der Zusatzdatei 1 oder unter https://petebankhead.github.io/qupath/scripts/2018/08/08/three-regions.htmls verfügbar ist, fügen Sie es in den Skript-Editor ein und klicken Sie dann auf Ausführen. Die ROIs: Tumorzentrum (TC), Innenrand (IM), Außenrand (OM) und Peritumorbereich (PT) werden automatisch erstellt und beschriftet.
    5. Um eine alternative Möglichkeit zum Erstellen von Interessenbereichen zu erhalten, führen Sie die Schritte 5.2.5.1 bis 5.2.5.5 aus.
      1. Wählen Sie das Polylinien-Werkzeug aus dem Hauptmenü oben aus, um einen Rahmen zu zeichnen, der die bösartigen Zellnester und das angrenzende Nicht-Tumorgewebe trennt.
      2. Wählen Sie den resultierenden Rahmen aus. Wählen Sie im Hauptmenü oben Objekte > Beschriftung > Expand-Anmerkungen > 500 μm für den Erweiterungsradius > Flach für den Linienabschluss. Aktivieren Sie "Innenraum entfernen " und aktivieren Sie "Auf übergeordnetes Element beschränken ".
      3. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die resultierende Anmerkung, Einzelne > teilen bearbeiten. Zwei separate Anmerkungen werden automatisch als 500 μm breite Bereiche auf jeder Seite des Randes erweitert.
      4. Benennen Sie die mit Anmerkungen versehenen Bereiche entsprechend für IM und OM, indem Sie mit der rechten Maustaste auf die Anmerkung in der Liste auf der linken Seite klicken, Eigenschaften festlegen auswählen und den Namen eingeben.
      5. Das TC stellt das verbleibende Tumorareal dar. Erweitern Sie den 500 μm breiten PT-Bereich neben dem OM mit dem gleichen Verfahren.
        HINWEIS: Kommentierte Objektträger und QuPath AF-Erkennungen wurden von einem erfahrenen Histopathologen überprüft.
  3. Optimierung der Pixelklassifizierung
    1. Wählen Sie das Rechteck-Werkzeug aus dem Hauptmenü aus. Kommentieren Sie dann einen Bereich, der alle zu unterscheidenden Pixeltypen enthält (z. B. Hämatoxylin, DAB und Hintergrund).
    2. Wählen Sie im Hauptmenü die Option Analysieren > Vorverarbeitung > Färben Vektor schätzen.
    3. Wenn das Fenster Visual Stain Editor automatisch geöffnet wird, wählen Sie Auto > OK und legen Sie H-DAB geschätzt als Namen für den Fleckenvektor fest.
    4. Für eine alternative Methode befolgen Sie die Schritte 5.3.4.1-5.3.4.3.
      1. Wählen Sie das Rechteck-Werkzeug aus dem Hauptmenü und kommentieren Sie einen kleinen Bereich eines typischen Zellkerns, der mit Hämatoxylin gefärbt wurde.
      2. Wählen Sie Bild aus dem linken Menü und doppelklicken Sie auf Fleck 1 > Ja.
      3. Wählen Sie das Rechteck-Werkzeug aus dem Hauptmenü aus und kommentieren Sie einen kleinen Bereich positiver Färbung mit DAB. Wählen Sie Bild aus dem linken Menü und doppelklicken Sie auf Fleck 2 > Ja.
  4. Bewertung des Flächenanteils positiver Immunzellen mit der Option Pixelklassifizierung .
    1. Klicken Sie im Hauptmenü auf > Pixel-Klassifizierung klassifizieren > auf Schwellenwert erstellen.
    2. Wählen Sie "Hoch" für die Auflösung > Kanal: DAB->Vorfilter: Gaußscher > Sigma: 0,5 > (Abbildung 3) Schwellenwert: (0,2 bis 0,3) > über dem Schwellenwert: positiv > unterhalb des Schwellenwerts: negativ.
    3. Wählen Sie für den Bereich die Option Beliebige Annotation aus, geben Sie einen Namen für den Klassifikator ein, > > Measure speichern > OK. Die DAB-positiven Zellen werden rot gefärbt (Abbildung 4).
    4. Kopieren Sie die Ergebnisse aus dem Menü auf der linken Seite in eine Tabelle.
    5. Oder öffnen Sie Messen im oberen Hauptmenü, wählen Sie Anmerkungsmessungen anzeigen > In Zwischenablage kopieren und fügen Sie die Ergebnisse in eine Tabelle ein.
    6. Um das Bild zu schließen, klicken Sie mit der rechten Maustaste > Multi View > Viewer schließen.
      HINWEIS: Vor der Quantifizierung wurden alle Artefakte eliminiert. Der Schwellenwert wurde für jeden Fall mit einer schwachen spezifischen positiven Färbung angepasst. Die Richtigkeit der Annotationen und der Pixelklassifizierung wurde zunächst überprüft und dann von einem leitenden Histopathologen überprüft. Alle Analysen wurden blind durchgeführt. Weitere Informationen zur Analyse der IHC mit Hilfe der Software finden Sie unter https://forum.image.sc/tag/QP.

6. Statistische Methoden und Datenanalyse

  1. Die Endpunkte der Studie waren die Zeit bis zum Rezidiv (TTR), das krankheitsfreie Überleben (DFS) und das Gesamtüberleben (OS). Patienten ohne Rückfall oder Tod wurden bei der letzten Nachuntersuchung zensiert.
    HINWEIS: Stetige nicht normalverteilte Daten werden als Median (min-max) ausgedrückt. Die Anteile werden als Rohdaten (Prozentsätze) ausgedrückt. Flächenfraktionen von Immunzellen in verschiedenen Regionen des Interesses (ROIs) wurden mit Friedman ANOVA verglichen, gefolgt von Wilcoxon Matched Pairs Test mit Bonferroni-Korrektur. Aufgrund der nichtparametrischen Verteilung der meisten Variablen wurde die Spearman-Korrelation verwendet, um die Assoziationen zwischen Paaren ordinaler oder quantitativer Variablen zu bewerten. Um den prognostischen Wert einzelner Prädiktoren für Endpunkte zu bestimmen, wurde eine univariable gefolgt von einer multivariablen Cox-Regressionsanalyse durchgeführt. Es wurden Hazard Ratios (HR) berechnet. Die HR zeigte das relative Risiko für die kombinierte mittlere hohe Gruppe im Vergleich zu 1 für die niedrige Gruppe. Alle Überlebensschätzungen wurden nach der Kaplan-Meier-Methode berechnet und zwischen den Gruppen mit dem Log-Rank-Test verglichen. Für die statistischen Analysen wurde GraphPad Prism 9.0 (GraphPad Software LLC) verwendet. Ein 2-seitiger p-Wert < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Ergebnisse

Die Demographie und die klinischen Merkmale der Patienten sind in Tabelle 1 dargestellt. Das mediane Alter der Patienten betrug 69 Jahre, und die meisten waren Männer (77,6%). Hinsichtlich der Ätiologie des HCC war die chronische nicht-virale Hepatitis mit einer Prävalenz der nicht-alkoholischen Steatohepatitis (NASH) (23,9%) die häufigste Hintergrunderkrankung. Nur 15 Patienten (22,4 %) hatten eine Zirrhose als Hintergrunderkrankung. Die Mehrheit der Patienten (68,7 %) hatte TNM im Stadium I. Detailliertere klinische und pathologische Befunde wurden in unserer zuvor veröffentlichten Arbeitbeschrieben 2,26.

Ergebnisse
Bei der letzten Nachuntersuchung wurde bei 29 (41,8 %) Patienten ein Tumorrezidiv beobachtet, von denen 89,7 % ein Lokalrezidiv aufwiesen und 38 (56,7 %) Patienten starben. 5 Jahre nach der Operation betrug der Anteil des DFS 33,2%, der Anteil des OS 49,4% und der Anteil des rezidivfreien (RFP) 48,7% (Tabelle 2).

Verteilung von Immunzellen in verschiedenen Regionen von Interesse
Das CD117-Protein wurde überwiegend in der zytoplasmatischen Membran abgerundeter Zellen gefunden (Abbildung 5A). Im TC und IM waren sie meist im Stroma und im perivaskulären Raum lokalisiert. Im OM- und PT-Bereich wurden die CD117+ Zellen in der Tumorkapsel und im perivaskulären Raum beobachtet.

Das NKp46-Protein wurde hauptsächlich in der zytoplasmatischen Membran abgerundeter Zellen gefunden, die in sinusförmigen Räumen im TC und IM vorhanden waren, sowie mit dem Stroma assoziiert (Abbildung 5B). Im OM- und PT-Bereich wurden NKp46+-Zellen in Kapseln um Tumornester und im Stroma von Pfortadern beobachtet.

Das CD1a-Protein wurde im TC und IM gefunden, hauptsächlich in der zytoplasmatischen Membran abgerundeter Zellen (verstreut oder in Aggregaten) im Stroma, innerhalb und entlang der Grenzen sinusförmiger Räume (Abbildung 5C). Im PT-Bereich wurde CD1a+ DC innerhalb und entlang der Grenzen der Sinusoide und innerhalb des Gallenepithels in den Pfortaderbahnen beobachtet.

Das Vorhofflimmern von Mastzellen war signifikant größer als das Vorhofflimmern von NKp46+-Zellen (p < 0,001) (Abbildung 6). CD1a+ iDCs zeigten in jedem ROI den niedrigsten VHF im Vergleich zu Mastzellen und NK-Zellen (p < 0,001) (Abbildung 6). Das Vorhofflimmern von CD117+- und NKp46+-Zellen in TC oder IM war signifikant kleiner als die im PT-Bereich und OM (p < 0,001) (Abbildung 6). Bei CD1a+-Zellen unterschied sich das Vorhofflimmern nicht signifikant zwischen den Regionen.

Signifikante Assoziationen für einzelne Immunzellen zwischen allen ROIs sind in Tabelle 3 dargestellt. Abbildung 7 zeigt die Heatmap für signifikante Assoziationen zwischen verschiedenen Immunzellen in verschiedenen Regionen. Das Vorhofflimmern von CD117 + Mastzellen in TC korrelierte signifikant mit dem Vorhofflimmern von CD1a in TC und IM.

Prognostischer Wert klinischer und pathologischer Variablen
Unter den klinischen und pathologischen Variablen war nur ein jüngeres Alter mit einem höheren Rezidivrisiko assoziiert (HR = 0,96, KI: 0,93-0,99, p = 0,007), während keine Variable mit DFS und OS assoziiert war (Tabelle 4).

Prognostische Werte infiltrierender Immunzellen
Ein hoher VHF von CD117+-Mastzellen im IM war mit längerem DFS (HR = 0,48, KI: 0,241 - 0,935, p = 0,031) und OS (HR = 0,34, KI: 0,167 - 0,703, p = 0,004) assoziiert (Abbildung 8, Tabelle 5). Darüber hinaus war ein hohes VHF von CD117+-Mastzellen im PT-Bereich mit einem längeren DFS assoziiert (HR = 0,48, KI: 0,247 - 0,945, p = 0,034) (Abbildung 8, Tabelle 5). Im Gegensatz dazu waren die Vorhofflimmern von iDC- und NK-Zellen mit keinem der Ergebnisse assoziiert. CD117+-Mastzellen am inneren Rand behielten nach Anpassung an das TNM-Stadium signifikante Assoziationen mit DFS (HR = 0,46, KI: 0,23-0,91, p = 0,027) und OS (HR = 0,33, KI: 0,16-0,68, p = 0,003) bei (Tabelle 6). Bei den Mastzellen im PT-Bereich blieb die Assoziation mit dem DFS ebenfalls signifikant (HR = 0,47, KI: 0,24-0,93, p = 0,029) (Tabelle 6).

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Abbildung 1: Repräsentatives Schema für die Methoden. Schematische Darstellung des Arbeitsablaufs zur Identifizierung der prognostischen Rolle von Mastzellen, dendritischen Zellen und natürlichen Killerzellen bei HCC. Abkürzungen: FFPE, formalinfixiert, paraffineingebettet; H&E, Hämatoxylin und Eosin; ROIs, interessante Regionen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Screenshot des Software-Fensters. Ein beschreibender Screenshot, der den Schritt des Importierens von Bildern in ein Projekt in der Software zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Screenshot der Option des Flächenbruchs. Ein Screenshot aus der Software, der die ausgewählten Parameter zeigt, um den Flächenanteil der positiven Färbung zu quantifizieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Screenshot der Option der Pixelklassifizierung. Screenshot aus der Software, der die DAB-positiven Zellen vor und nach der Pixelklassifizierung zeigt. Die bräunliche DAB-Färbung wurde nach der Pixelklassifizierung in rote Farbe umgewandelt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5: Repräsentative Immunfärbung von Zellen des angeborenen Immunsystems bei HCC-Patienten. Repräsentative Immunfärbung von (A) CD117+, (B) NKp46+ und (C) CD1a+ Zellen in TC (400x) und TIM (200x) von HCC. Abkürzungen: HCC, hepatozelluläres Karzinom; TC, Tumorzentrum; TIM, tumorinvasiver Rand, mit innerem Rand (IM) und äußerem Rand (OM). Die gestrichelte Linie stellt eine Grenze zwischen dem Tumor und dem Nicht-Tumorgewebe dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 6: Statistik, die den Flächenanteil der angeborenen Immunzellen bei HCC-Patienten beschreibt. Statistik für den Flächenanteil von CD1a+ dendritischen Zellen, CD117+ Mastzellen und NKp46+ NK-Zellen) in den TC-, IM-, OM- und PT-Bereichen des HCC. Schwarze Linien sind Mediane. Für den Vergleich wurde der Wilcoxon-Matching-Pairs-Test mit Bonferroni-Korrektur verwendet. Abkürzungen: HCC, hepatozelluläres Karzinom; TC, Tumorzentrum; IM, innerer Rand; OM, äußerer Rand; PT, Peritumorbereich. : p <0,001 Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 7: Heatmap mit signifikanten Korrelationen zwischen Flächenfraktionen von Mastzellen, DCs und NKs in verschiedenen Regionen von Interesse. Heatmap signifikanter Korrelationen zwischen Flächenanteilen von CD117+-Mastzellen, CD1a+ DCs und NKp46+NKs in TC, IM, OM und PT (Spearman ρ, p < 0.05). Abkürzungen: TC, Tumorzentrum; IM, innerer Rand; OM, äußerer Rand; PT, Peritumorbereich; DC, dendritische Zellen; NK, natürliche Killerzellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 8: Kaplan-Meier-DFS- und OS-Kurven für tumorinfiltrierende Mastzellen bei HCC-Patienten. Kaplan-Meier-Analyse von DFS und OS nach niedrigem vs. hohem VHF von tumorinfiltrierenden Mastzellen am inneren Rand (A, C) und PT (B) des HCC. Abkürzungen: HCC, hepatozelluläres Karzinom; DFS, krankheitsfreies Überleben; IM, innerinvasiv; PT, Peritumorbereich. Die Abbildung wurde mit Genehmigung von Ali et al.26 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Klinischer Hintergrund der eingeschlossenen Patienten mit hepatozellulärem Karzinom. Klinischer Hintergrund der eingeschlossenen Fälle von hepatozellulärem Karzinom. Abkürzungen: NAFLD, nichtalkoholische Fettlebererkrankung. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Geschätzte Wahrscheinlichkeit von Ergebnissen in der Kaplan-Meier-Analyse. Die geschätzte Wahrscheinlichkeit von RFP, DFS und OS in der Kaplan-Meier-Analyse. Abkürzungen: RFP, recurrence-free ratio; DFS, krankheitsfreies Überleben; OS, Gesamtüberleben. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 3: Korrelation zwischen dem Flächenanteil von tumorinfiltrierenden Mastzellen, dendritischen Zellen und natürlichen Killerzellen in verschiedenen ROIs. Spearman-Korrelation (ρ) zwischen dem Flächenanteil von tumorinfiltrierenden Mastzellen, dendritischen Zellen und natürlichen Killerzellen in verschiedenen ROIs, p < 0,038. Abkürzungen: TC, Tumorzentrum; IM, innerer Rand; OM, äußerer Rand; PT, Peritumorbereich; ROIs, interessante Regionen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 4: Univariable Analyse klinischer und pathologischer Variablen, die mit der Zeit bis zum Rezidiv (TTR), dem krankheitsfreien Überleben (DFS) und dem Gesamtüberleben (OS) assoziiert sind. Nein", weibliches Geschlecht oder "A" waren die Referenzkategorien für dichotome Variablen. Fettgedruckte Werte weisen auf eine statistische Signifikanz bei p < 0,05 hin. Abkürzungen: HR, Hazard Ratio; CI, Konfidenzintervall; TTR, Zeit bis zum Wiederauftreten; DFS, krankheitsfreies Überleben. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 5: Univariable Analyse der Assoziation des Flächenanteils von CD117+-Mastzellen, CD1a+denderitischen Zellen und NKp46+natürlichen Killerzellen mit TTR, DFS und OS pro individueller interessierender Region unter Verwendung der Cox-Regression (67 HCC-Patienten). Der Flächenanteil der Immunzellen pro Flächenabschnitt (mm2) wurde in Perzentile umgerechnet und dann in niedrig (0-25 Perzentil) und hoch (25-100 Perzentil) kategorisiert. Die Hazard Ratios zeigen das relative Risiko im Vergleich zu 1 für das niedrige Vorhofflimmern. Fettgedruckte Werte weisen auf eine statistische Signifikanz bei p < 0,05 hin. Abkürzungen: AF, Flächenanteil; DFS, krankheitsfreies Überleben; OS, Gesamtüberleben; HR, Hazard Ratio. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 6: Der Flächenanteil von CD117+-Mastzellen pro individuellem ROI, der mit dem krankheitsfreien Überleben und dem Gesamtüberleben assoziiert ist (multivariable Analyse). Multivariable Analyse der Assoziation der Flächenfraktion von CD117+-Mastzellen mit DFS und OS im IM- und PT-Bereich mittels Cox-Regression (67 HCC-Patienten). Der Flächenanteil der Immunzellen pro Flächenabschnitt (mm2) wurde in Perzentile umgerechnet und dann in niedrig (0-24 Perzentil) und hoch (25-100 Perzentil) kategorisiert. Die Hazard Ratios zeigen das relative Risiko im Vergleich zu 1 für das niedrige Vorhofflimmern. Fettgedruckte Werte weisen auf eine statistische Signifikanz bei p > 0,05 hin. Abkürzungen: AF, Flächenanteil; DFS, krankheitsfreies Überleben; OS, Gesamtüberleben; HR, Hazard Ratio. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzende Datei 1: Skript zur Erstellung des ROI. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Durch die Überwachung der in situ Immunorganisation bei TME kann der Bereich der Immunonkologie neue krebsprognostische und prädiktive Biomarker hinzufügen. Unsere zuvor veröffentlichte Arbeit zur Rolle adaptiver Immunzellen in der TME von HCC zeigte positive prognostische Assoziationen von CD3+ und CD8+ T-Zellen sowie CD20+ B-Zellen in ausgewählten ROIs bis zum Zeitpunkt des Rezidivs2. Hier wurde die Bildanalysesoftware QuPath verwendet, um die Häufigkeit von CD1a+ iDCs, CD117+ Mastzellen und NKp46+ NK-Zellen in mehreren verschiedenen Regionen des HCC zu beurteilen und ihre prognostische Bedeutung zu bewerten. Aufgrund der unregelmäßigen Formen einiger angeborener Immunzellen kann ihre Quantifizierung ungenau sein. Aus diesem Grund war die Bewertung des Flächenanteils immunpositiver Zellen die optimale Option. Von den drei Zelltypen zeigten nur CD117+-Mastzellen einen signifikanten prognostischen Einfluss: Ein höheres Vorhofflimmern von Mastzellen im IM- und PT-Bereich war mit einem längeren Überleben verbunden.

Mastzellen waren bei allen ROIs am häufigsten, und die Assoziation ihres Vorhofflimmerns im Peritumorbereich und am inneren Rand mit einem besseren Überleben spiegelt die Anti-Tumor-Rolle von Mastzellen wider. Mastzellen können durch tumorzellfreigesetzte Chemolockstoffe wie SCF oder CCL1518 in die TME gelockt werden. Mastzellen können die Anti-Tumor-Reaktion beeinflussen, indem sie Tumorzellen direkt zytotoxisch behandeln27 oder indem sie entzündungsfördernde Zytokine sezernieren, die das Tumorwachstum hemmen können18. Eine erhöhte Mastzelldichte schützte vor dem Wiederauftreten von Prostatakrebs28, Magenkrebs27 und HCC nach Lebertransplantation29. Eine umfassende Untersuchung, bestehend aus einer größeren Kohorte von 245 HCC-Patienten, fand eine positive Korrelation zwischen einer signifikanteren Mastzellinfiltration in Tumorproben und einem längeren Überleben nach Tumorresektion30. Rohr-Udilova et al. berichteten über ähnliche Ergebnisse von höheren Dichten von Mastzellen im umgebenden HCC-Gewebe; Allerdings war nur die intratumorale Mastzelldichte mit einer niedrigeren Rezidivrate assoziiert29.

In dieser Studie übten Mastzellen nur in der IM- und PT-Leber eine Anti-Tumor-Wirkung aus. Die TME verschiedener Tumoren ist hinsichtlich der räumlichen Verteilung der Immunzellen heterogen31. Die prognostische Bedeutung von Immunzellen bei TME hängt auch entscheidend mit ihrer räumlichen Verteilung zusammen32,33. Es wurden verschiedene Ansätze zur Annotation des tumorinvasiven Randes vorgeschlagen, darunter ein ganzer Rand mit unterschiedlichen Breiten 4,34,35, Innen- und Außenrand, wiederum mit unterschiedlichen Breiten36,37, mit oder ohne PT 2,7. Wir folgten der reproduzierbaren, standardisierten Methodik der International Immunooncology Biomarkers Working Group, um den invasiven Rand als eine 1 mm Region zu definieren, die auf der Grenze zentriert ist, die die malignen Zellnester vom Wirtsgewebe trennt und den zentralen Tumor als verbleibenden Tumorbereich darstellt38. Da die frühere Studie signifikante Unterschiede in den Ergebnissen des inneren und äußeren invasiven Randes2 aufzeigte, wurden diese Regionen (jeweils 500 μm Breite) separat analysiert. Das räumliche Immunprofiling des Peritumorbereichs hat seine ausgeprägte prädiktive Bedeutung39,40, weshalb auch das PT-Areal einbezogen wurde.

Die Analyse von TC, Tumorrand und PT-Leber wurde in WSIs durchgeführt, im Gegensatz zur Möglichkeit, ausgewählte Sichtfelder in den jeweiligen Regionen zu evaluieren. Die Bildgebung ganzer Objektträger ist eine potenziell reichhaltige Datenquelle41. Da wir keine Subsampling durchgeführt haben, wurde der "wahre Erwartungswert" auf zeiteffiziente Weise ermittelt10. Darüber hinaus war dieses System sinnvoll, da nur 1 oder 2 Folien pro Block analysiert wurden, was es uns ermöglichte, den Bias der Patch-Auswahl42 zu vermeiden. Der langsame Arbeitsablauf stellte uns in der vorherigen Studie vor eine Herausforderung, als die Stereologie zur Quantifizierung von Immunzellen angewendet wurde2.

IHC ermöglicht die direkte Lokalisierung der Mastzellexpression von CD1a+, NKp46+NK und CD117+ im Lebergewebe, die Quantifizierung ihrer Verteilungen und damit die Unterklassifizierung der Kohorte. Die IHC-Analyse gibt dieser Studie wichtige Vorteile gegenüber biochemischen Assays in solubilisiertem Gewebe, die zu falsch negativen Ergebnissen führen können, wenn nur wenige Biomarker-positive Zellen vorhanden sind43 und die regionale Reaktion von Immunzellen auf histopathologische Merkmale nicht widerspiegeln44. Die IHC ist auch der Analyse in H&E-gefärbten Schnitten vorzuziehen. Studien zu Darmkrebs und kleinzelligem Lungenkrebs zeigten, dass die Beurteilung von H&E-gefärbten Schnitten robuste, quantitative Tumor-Immun-Biomarker liefern könnte 45,46,47; Es gibt jedoch nach wie vor Einschränkungen, um das tatsächliche Vorhandensein bestimmter Subtypen widerzuspiegeln.

Eine hohe Qualität der Gewebeschnitte und der IHC-Färbung ist Voraussetzung für eine genaue Beurteilung. Hoher Hintergrund, Kantenartefakte und spezifische, aber unerwünschte Färbungen (z. B. Färbung von Endothelzellen der sinusförmigen Leberräume mit Anti-CD4-Antikörpern) können alle Ergebnisse verfälschen. Ein CD56-Antikörper war in der aktuellen Studie die erste Wahl zum Nachweis natürlicher Killerzellen, wurde aber aufgrund der Expression von CD56 in unreifen Gallengängen durch den NKp46-Antikörper ersetzt. Die Auswahl des am besten geeigneten Markers in Bezug auf Spezifität, robustes Färbemuster und Stabilität in FFPE-Blöcken stellt ein weiteres zu berücksichtigendes Thema dar. Zum Beispiel wurde CD117 anstelle von Tryptase gewählt, weil die Tryptase-Expression stark herunterreguliert sein kann, außerdem sind Zellen, die CD117 nicht exprimieren, keine Mastzellen48.

QuPath bietet die Möglichkeit, die Grenzen des ROI von außen zu glätten und Artefakte, große Gefäße, nekrotisches Gewebe, unspezifische Färbungen, Hintergründe und Aggregationen von Erythrozyten zu entfernen, die nicht Teil des ROI sein sollten. Der Bediener muss den ROI auswählen und die "Alt"-Taste drücken, während er diese Artefakte kommentiert. Unspezifische Färbungen wurden in dieser Studie als Artefakte vor der Quantifizierung eliminiert, so dass sie die Ergebnisse nicht beeinflussten. Im Falle einer systematisch niedrigen spezifischen Färbung oder eines hohen Hintergrunds sollte das Protokoll überprüft werden, um mögliche Verzerrungen zu vermeiden. Der Schwellenwert wurde für jeden Fall mit einer schwachen spezifischen positiven Färbung angepasst. Vor jedem routinemäßigen Einsatz sollte das Protokoll optimiert werden. Alle Analysen sollten blind durchgeführt werden, und im Idealfall verdient die Genauigkeit der Schwellenwertbestimmung eine Gegenprüfung.

QuPath ist eine benutzerfreundliche, intuitive, erweiterbare Open-Source-Lösung für die digitale Pathologie und die Analyse ganzer Objektträger9, die zuvor für die Bildanalyse bei HCC49 und verschiedenen Krebsartengetestet wurde 50,51. Die einfache Bedienung der Software für WSIs und die Möglichkeiten zur Annotation von Regionen von Interesse (z.B. tumorale oder peritumorale Areale) sind die Hauptvorteile.

Die Anwendung vorhandener, modifizierter oder de novo erstellter Skripte kann die Analyse erheblich beschleunigen. Es wurde das Skript zur Erstellung von Annotationen für ROIs angewendet, das eine schnelle und genaue regionale Segmentierung anstelle einer manuellen Abgrenzung ermöglichte. Das Skript ist nicht festgelegt und kann für Regionen mit unzureichenden Gewebegrenzen problemlos auf Ränder von weniger als 500 μm angepasst werden. Die Breite des IM-, OM- oder PT-Bereichs kann über den Skripteditor Automate > Show angepasst werden, > die Linie 30 Double Expand Margin Microns = 500 μm an die verfügbare Breite > Run angepasst wird. ROIs können auch hinzugefügt oder entfernt werden. In der Regel sind die Arbeitsabläufe in der Software nicht festgelegt, und der Bediener ist frei, sie zu entwickeln und zu modifizieren.

Eine Vielzahl verfügbarer Software-Tools für die pathologische Bildanalyse, darunter CellProfiler, ImageJ, Fiji, Microscopy Image Browser und andere, sind ab sofort verfügbar. QuPath zeichnet sich jedoch durch eine Reihe von Vorteilen aus, wie z. B. die Open-Source-Architektur, die benutzerfreundliche Oberfläche, die Möglichkeit zur Anpassung von Algorithmen und die Integration fortschrittlicher Tools für maschinelles Lernen. Diese Funktionen machen diese Bildanalysesoftware zu einer robusten Wahl für die nuancierte Analyse von Krebsgeweben im Bereich der digitalen Pathologie.

QuPath zeigte im Vergleich zu den kommerziellen Softwares HALO (IndicaLab) und QuantCenter (3DHistech) die geringste Variabilität für den Nachweis der Ki67-Expression bei Brustkrebs52. Die Software verfügt auch über das Potenzial, angewiesen zu werden, ein Skript für alle Projektbilder in einer reproduzierbaren Batch-Verarbeitung auszuführen.

QuPath ermöglichte es uns, quantitative kontinuierliche Daten anstelle von ordinalen (semiquantitativen) Daten zu erstellen. Ordinale Daten, die durch visuelles Scoring gewonnen werden, sind aufgrund der Subjektivität bei der Interpretation, der Variabilität zwischen den Beobachtern und der schlechten Reproduzierbarkeit mit Problemen behaftet53. Die Schnelligkeit der aktuellen Analyse wurde durch die Tatsache verbessert, dass Personen ohne umfangreichen histopathologischen Hintergrund und Programmierkenntnisse automatische Analysen durchführen können, sofern die Genauigkeit der Annotationen von einem Pathologen überprüft wurde. Eine Studie an Kopf-Hals-Tumoren zeigte die Eignung von QuPath für eine schnelle und reproduzierbare Beurteilung des prognostischen Wertes von CD57+-Tumor-infiltrierenden Lymphozyten50. Die Studie zeigte auch eine substanzielle Übereinstimmung zwischen menschlichen Beobachtern und QuPath. Eine hohe Übereinstimmung zwischen manueller Beobachtung und Beurteilung mit QuPath zeigte sich auch bei Mundkrebs54 und Brustkrebs55. In der oben genannten Arbeit wurde die IHC-Quantifizierung von 5 klinischen Brustkrebs-Biomarkern mit QuPath und 2 kommerziellen Softwareprodukten (Definiens Tissue Studio und inForm) mit einer manuellen Bewertung durch einen Pathologen verglichen. Während dieser Studie zeigte QuPath durchweg die beste Leistung sowie die geringste Zeit für die Einrichtung und Anwendung, was sich als hervorragende zukünftige Alternative zu visueller Überwachung und kommerzieller Software erwies. Selbst im Vergleich zu ImageJ, der bekanntesten Open-Source-Software für die biomedizinische Bildanalyse, zeichnet sich QuPath durch den Umgang mit großformatigen WSIsaus 56.

Es gibt ein offenes Online-Forum für QuPath, in dem Benutzer ihre Fragen zu Methoden der digitalen Pathologie stellen und eine aktive und engagierte Community präsentieren, um die Entwicklung von Werkzeugen für die Bildanalyse (https://forum.image.sc/tag/qupath) zu unterstützen.

Die in dieser Studie verwendete Kohorte war einzigartig und nicht repräsentativ für die Allgemeinbevölkerung mit HCC, da sie nur Patienten umfasste, die für eine Leberresektion in Frage kamen. Im Allgemeinen kommt eine Minderheit der Patienten mit HCC (20 %-30 %) für eine Leberresektionin Frage 57. Dies könnte auch ein Grund dafür sein, dass weniger Patienten eine bestätigte Zirrhose hatten, da Patienten mit dieser Ätiologie des HCC wahrscheinlich höhere Child-Pugh-Werte aufwiesen und nicht als resezierbar galten. Die Kohorte war auch eher klein, und die meisten Patienten hatten ein frühes TNM-Stadium der Krankheit. Daher ist eine Extrapolation der Ergebnisse auf andere Populationen mit Vorsicht zu genießen.

In der aktuellen Studie wurde die Häufigkeit von angeborenen Immunzellen in der HCC-Mikroumgebung durch die Bewertung ihres Vorhofflimmerns abgeschätzt, da sich eine genaue Zählung von unregelmäßig geformten Immunzellen wie dendritischen Zellen als schwierig erweisen kann. Auf der anderen Seite korreliert der Flächenanteil von Immunzellen in der Regel stark mit deren Dichte58. Die Immunperoxidase-Markierung liefert Daten für die Lokalisierung des Antigens, den Flächenanteil oder die Dichte der Zellen, die es exprimieren, aber die Intensität der Färbung hängt nicht linear mit der Menge des Antigens zusammen. Daher sollte IHC nicht verwendet werden, um das Expressionsniveau eines bestimmten Proteins quantitativ zu beurteilen. Die Genauigkeit der Methode hängt auch von der Gleichmäßigkeit der Schnittdicke, der Bildqualität und der gewählten Auflösung für die Pixelklassifizierung ab. Alle Ergebnisse der Bildanalyse sollten validiert und mit Vorsicht behandelt werden. Da ein einzelner Marker die Komplexität von Immunzellen nicht vollständig erfassen kann, sind mehr IHC-Marker und Multiplex-Färbung erforderlich, um ein zuverlässiges Bild der Immun-TME von HCC zu erhalten. Die Verwendung von nur einem einzigen IHC-Marker für die Phänotypisierung von Immunzellen stellt eine Annäherung dar, und die Ergebnisse sollten mit Vorsicht interpretiert werden.

Die Verwendung der QuPath-Bildanalysesoftware zur Bewertung von IHC-gefärbten Objektträgern ermöglichte es uns, die Verteilung und den Flächenanteil von lokalen iDCs, Mastzellen und NKs in Tumoren und Peritumoren von HCC-Patienten zu beurteilen und dann ihre Beziehungen zur Prognose zu analysieren. Die Häufigkeit von Mastzellen am inneren Rand und in der Peritumorleber von HCC ist mit einem längeren DFS und OS verbunden, was die Anti-Tumor-Wirkung dieser angeborenen Immunzellen unterstreicht. Der analytische Workflow von QuPath ist benutzerfreundlich, schnell und einfach zu bedienen, mit hilfreichen Standardeinstellungen und einfachem Datenexport. Diese Software wurde als vielversprechende Plattform für die digitale Bildanalyse empfohlen, die die Anforderungen an Reproduzierbarkeit, Konsistenz und Genauigkeit in der digitalen Pathologie erfüllen könnte.

Offenlegungen

Es gibt keine finanziellen Interessenkonflikte, die offengelegt werden müssen.

Danksagungen

Wir danken für die Beiträge von Mgr. Ondřej Šebesta (Vinicna Microscopy Core Facility, Fakultät für Naturwissenschaften, Karls-Universität) für das Scannen ganzer Objektträger und das Projekt "e-Infrastruktura CZ" (e-INFRA LM2018140), das uns die Rechenressourcen für diese Studie zur Verfügung gestellt hat. Die Techniker Jana Dosoudilova und Jan Javurek sind für ihre hervorragende technische Unterstützung bekannt. Diese Forschung wurde durch das Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union, Stipendium Nr. 856620, und das Gesundheitsministerium der Tschechischen Republik, Stipendium AZV NU21-03-00506, und durch das Cooperatio-Programm (Chirurgische Disziplinen) finanziert. Die Vinicna Microscopy Core Facility wird vom großen RI-Projekt Czech-BioImaging LM2023050 mitfinanziert.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Anti-CD1aLeica BiosystemsPA0235Identifier - unreife dendritische Zellen; RTU, Protokoll F, ER2/20 min
Anti-CD117Leica Biosystems  PA0007Identifikator - Mastzellen; RTU, Protokoll F, ER2/20 min
BOND Plus ObjektträgerLeica Biosystems, DeutschlandS21.2113.A
BOND RXmLeica Biosystems49.1501Vollautomatischer IHC Färbeer   
Bond-AspirationssondenLeica BiosystemsCS9100
Bond  Entwachsung  LösungLeica BiosystemsAR9222
Bond  Polymer Refine Detection KitLeica BiosystemsDS9800
BondTM Epitop-Entnahme 2Leica BiosystemsAR9640
BondTM Primäres Antikörper-VerdünnungsmittelLeica BiosystemsAR9352
BondTM Waschlösung 10X KonzentratLeica BiosystemsAR9590
Technische Daten: Intel(R) Core(TM) i5-10500 CPU @ 3.10GHz    3,10 GHz Installierter RAM: 128 GIntelEin 64-Bit-Betriebssystem mit Windows 7. Jeder Computer mit Java-basiertem Betriebssystem und Excel verfügbar
DeckgläserLeica Biosystems, Deutschland14071135636
CV-PassepartoutLeica Biosystems, Deutschland14046430011
CV5030 Vollautomatischer GlaseindeckerLeica Biosystems149CVTS5025
Trockenschrank UN30Memmert GmbH UN30
GraphPad Prism 9.0GraphPad Software LLC Version 12
Humaner NKp46/NCR1 Antikörper, monoklonaler Maus-IgG2B-Klon # 195314R& D Systems, Inc., Vereinigte StaatenMAB1850Identifikator - natürliche Killerzellen; Verdünnung 1:150, Protokoll F + BLOK, ER2/20 min
Leica HI1210 - WasserbadLeica Biosystems14041521466
Protein BlockAgilent Dako, USAX0909
QuPath 0.3.2 oder höhere Versionen  Version (QuPath v.0.3.2) 
RM2235 RotationsmikrotomLeica Biosystems149AUTO00C1
ST5020 Multistainer Objektträger-FärbegerätLeica BiosystemsDEV-ST5010-CV5030
StatisticaStatSoft Inc.Version 7
Zeiss Axio Scan.Z1ScienceServices GmbH, Deutschland430038-9000-000 Dia-Scanner 
Reinigungsset für

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Mastzellen in der Mikroumgebung des hepatozellulären Karzinoms bieten günstige Prognose: Eine retrospektive Studie mit der Bildanalysesoftware QuPath
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