Isolierung von Zellkernen aus humanem intermuskulärem Fettgewebe und nachgeschaltete Einzelkern-RNA-Sequenzierung

Summary

Die Biologie des intermuskulären Fettgewebes (IMAT) ist aufgrund der begrenzten Zugänglichkeit von menschlichem Gewebe weitgehend unerforscht. Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll für die Zellkernisolierung und die Bibliotheksvorbereitung von gefrorenen humanen IMAT für die Einzelkern-RNA-Sequenzierung, um die zelluläre Zusammensetzung dieses einzigartigen Fettdepots zu identifizieren.

Abstract

Intermuskuläres Fettgewebe (IMAT) ist ein relativ wenig untersuchtes Fettdepot, das sich zwischen Muskelfasern befindet. Der IMAT-Gehalt steigt mit dem Alter und dem BMI und wird mit Stoffwechsel- und Muskeldegenerativen Erkrankungen in Verbindung gebracht. Das Verständnis der biologischen Eigenschaften von IMAT und seines Zusammenspiels mit den umgebenden Muskelfasern fehlt jedoch erheblich. In den letzten Jahren haben uns die Einzelzell- und Zellkern-RNA-Sequenzierung zelltypspezifische Atlanten verschiedener menschlicher Gewebe geliefert. Die zelluläre Zusammensetzung der humanen IMAT ist jedoch aufgrund der inhärenten Herausforderungen ihrer Zugänglichkeit aus der Biopsieentnahme beim Menschen weitgehend unerforscht. Neben der begrenzten Menge an entnommenem Gewebe ist die Verarbeitung der menschlichen IMAT aufgrund ihrer Nähe zu Skelettmuskelgewebe und Faszien kompliziert. Die lipidbeladene Natur der Adipozyten macht sie mit der Einzelzellisolierung unvereinbar. Daher ist die Einzelkern-RNA-Sequenzierung optimal für die Erlangung hochdimensionaler Transkriptomik mit Einzelzellauflösung und bietet das Potenzial, die Biologie dieses Depots aufzudecken, einschließlich der genauen zellulären Zusammensetzung von IMAT. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Zellkernisolierung und die Bibliotheksvorbereitung von gefrorenen humanen IMAT für die Einzelkern-RNA-Sequenzierung vor. Dieses Protokoll ermöglicht die Profilierung von Tausenden von Zellkernen unter Verwendung eines tröpfchenbasierten Ansatzes und bietet so die Möglichkeit, seltene und wenig häufige Zelltypen zu erkennen.

Introduction

Intermuskuläres Fettgewebe (IMAT) ist ein ektopisches Fettdepot, das sich zwischen und um die Muskelfasern befindet¹. Wie in einer kürzlich erschienenen Übersichtsarbeit von Goodpaster et al. ausführlich beschrieben, kann IMAT mittels hochauflösender Computertomographie (CT) und Magnetresonanztomographie (MRT) nachgewiesen werden (Abbildung 1A,B) und befindet sich um und in Muskelfasern im gesamten Körper¹. Die Menge der IMAT variiert stark zwischen den Individuen und wird durch BMI, Alter, Geschlecht, Rasse und Bewegungsmangel beeinflusst ^2,3,4. Darüber hinaus wird die IMAT-Ablagerung häufig bei pathologischen Zuständen beobachtet, die mit Muskeldegeneration verbunden sind⁵, und zahlreiche Studien haben eine erhöhte IMAT-Masse bei Personen mit Fettleibigkeit, Typ-2-Diabetes, metabolischem Syndrom und Insulinresistenz dokumentiert 6,7,8,9. Nichtsdestotrotz stehen die zellulären und biologischen Eigenschaften von IMAT erst am Anfang der Entschlüsselung. Die eingeschränkte Zugänglichkeit und die Variation der IMAT-Lokalisationen und des IMAT-Gehalts im gesamten Körper haben die Entnahme von Proben aus diesem einzigartigen Fettdepot² erschwert. Darüber hinaus können die Proben bei der Entnahme leicht mit der Skelettmuskulatur (SM) "kontaminiert" werden, was die Trennung zwischen dem biologischen Beitrag der verschiedenen Gewebe schwer zu entschlüsseln macht (Abbildung 1C). Zu diesem Zweck dient die Einzelkern-RNA-Sequenzierung (snRNA-seq), die in den letzten zehn Jahren stark an Aufmerksamkeit gewonnen hat, als ideale Methode, um die Trennung von IMAT- und SM-abgeleiteten Genexpressionsmustern mit Einzelzellauflösung zu ermöglichen. Darüber hinaus ist die Isolierung von Zellkernen besonders nützlich für Fettgewebe, da es sich um große lipidbeladene Adipozyten handelt, die nicht in Einzelzellsuspension dissoziiert werden können, ohne die Integrität der Zellen zu beeinträchtigen. Schließlich birgt diese Technologie das Potenzial, neuartige Marker für IMAT-spezifische Adipozyten zu entdecken und die Zusammensetzung und das Vorhandensein verschiedener Vorläuferzellpopulationen aufzudecken sowie die Variation der Zellzusammensetzung unter pathologischen und normalen Bedingungen zu untersuchen.

Abbildung 1: Bilder von IMAT. Repräsentatives Magnetresonanzbild (MRT) der IMAT von (A) einer schlanken Frau mittleren Alters und (B) einem Mann mittleren Alters mit Adipositas. Rot: subkutanes Fettgewebe, gelb: intermuskuläres Fettgewebe, grün: Skelettmuskulatur, blau: Knochen. Bild mit freundlicher Genehmigung von Heather Cornnell, AdventHealth Translational Research Institute. (C) Frische Gewebeprobe mit IMAT (eingezehrt durch eine gestrichelte schwarze Linie). Bild mit freundlicher Genehmigung von Meghan Hopf, AdventHealth Translational Research Institute und Bryan Bergman, University of Colorado. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Goodpaster et ^al.1 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Aus der Viehwirtschaft wurde eine Reihe von Studien veröffentlicht, die die Marmorierung von Fleisch (insbesondere IMAT) bei Schweinen, Hühnern und Rindern mit Einzelzell- (sc) und snRNA-seq¹⁰ untersuchen. Diese Studien haben mehrere Subpopulationen von Adipozyten und Marker potenzieller Vorläuferzellen von IMAT^{identifiziert} 11,12,13; ob sich diese zellulären Zusammensetzungen auf die humane IMAT übertragen lassen, ist jedoch nicht bekannt. Unseres Wissens hat nur eine Studie die zelluläre Heterogenität von menschlichen Muskeln mit Fettinfiltration untersucht, die von männlichen Patienten mit Hüftarthrose unter Verwendung von snRNA-seq¹⁴ gewonnen wurden. Die Forscher berichteten über eine kleine Adipozytenpopulation und mehrere fibro-adipogene Vorläuferpopulationen (FAP) innerhalb der großen Population von Myonuklei¹⁴. Unsere Studie ist die erste, die eine Methode entwickelt, um IMAT, das manuell aus menschlichen Muskeln seziert wurde, mittels snRNA-seq direkt auf die zelluläre Zusammensetzung zu untersuchen.

Wichtig ist, dass die Protokolle für snRNA-seq für das untersuchte Gewebe angepasst werden müssen, da die Menge des verfügbaren Gewebes und die physikalischen Eigenschaften des spezifischen Gewebes die optimalen Verarbeitungsschritte bestimmen. Die Gewebeausbeute für IMAT ist in der Regel gering und überschreitet oft nicht 50 mg, selbst wenn ultraschallgesteuerte Biopsien durchgeführt werden. Daher ist die richtige Verarbeitung dieses knappen Gewebes unerlässlich. Wir glauben, dass dieses Protokoll als wertvolle Ressource für Forscher dienen wird, die die IMAT beim Menschen untersuchen.

Protocol

Die für dieses Protokoll verwendete Stichprobe war Teil der Study of Muscle, Mobility, and Aging (SOMMA)^15, die vom Institutional Review Board der Western IRB-Copernicus Group (WCG) genehmigt wurde und in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki durchgeführt wurde. Die Teilnehmer gaben eine schriftliche Einverständniserklärung für ihre Teilnahme an der Studie ab.

HINWEIS : Dieses Protokoll wurde von einem früheren Protokoll adaptiert, bei dem 100 mg subkutanes Fettgewebe des menschlichen Abdomens auf einer Nanowell-basierten Plattform¹⁶ verwendet wurden. Das aktuelle Protokoll ist für 50 mg humane IMAT und Bibliotheksvorbereitung unter Verwendung einer tröpfchenbasierten Plattform optimiert. Eine weitere Optimierung dieses Protokolls für die Zellkernisolierung aus nicht-humanen IMAT oder anderen Fettdepots könnte erforderlich sein.

1. Herstellung von Puffern und Reagenzien (Tabelle 1 und Tabelle 2)

HINWEIS: Bereiten Sie die Puffer am Tag des Versuchs frisch vor und verwenden Sie sie nicht wieder.

1. Eine Zentrifuge auf 4 °C vorkühlen.
2. Bereiten Sie den Homogenisierungspuffer und das Kernisolationsmedium vor.
   1. Besorgen Sie sich zwei Eimer Eis und kühlen Sie 2 x 15 mL konische Röhrchen vor.
   2. Mischen Sie alle Reagenzien für den Homogenisierungspuffer (HB) in einem konischen 15-ml-Röhrchen in der in Tabelle 1 aufgeführten Reihenfolge. Bleiben Sie auf Eis. Durch Vortexen mischen.
   3. Mischen Sie alle Reagenzien für das Kernisolationsmedium (NIM) in einem konischen 15-ml-Röhrchen in der geordneten Liste in Tabelle 2. Bleiben Sie auf Eis. Durch Vortexen mischen.
   4. Bereiten Sie 10% Triton-X vor, indem Sie 100 μl Triton X-100 auf 900 μl nukleasefreies Wasser hinzufügen. Vortex, um das richtige Mischen zu gewährleisten. Bei Raumtemperatur (RT) aufbewahren.

Reagenz	Volumen (μL)		Endkonzentration (mM)
	1x	2x
1 M MgCl2	10	20	5
1 M Tris-Puffer, pH 8,0	20	40	10
2 M KCl	25	50	25
1,5 M Saccharose (-4°C)	334	668	250
1 mM DVB-T	2	4	0,001 (~1 μM)
100x Protease-Hemmer	20	40	1x
Superasin 20 U/μL	40	80	0,4 U/μL
Nukleasefreies Wasser	1549	3098	-
Gesamtvolumen	2000	4000	-

Tabelle 1: Homogenisierungspuffer (HB). Bleiben Sie auf Eis. Durch Vortexen mischen.

Reagenz	Volumen (μL)		Endkonzentration (mM)
	1x	2x
EDTA	0.4	0.8	0.1
Ribolock-RNAse-Inhibitor (40U/μL)	40	80	0,8 U/μL
1% BSA-PBS (-/-)	1959.6	3919.2	-
Gesamtvolumen	2000	4000	-

Tabelle 2: Kernisolationsmedium (NIM). Bleiben Sie auf Eis. Durch Vortexen mischen.

2. Pulverisierung von gefrorenem Gewebe (Abbildung 2A)

1. Richten Sie den Arbeitsplatz für die Homogenisierung ein.
   1. Füllen Sie den Kanister mit flüssigem Stickstoff (LN₂).
      ACHTUNG: Tragen Sie bei der Arbeit mit LN₂ immer eine Schutzbrille und Kryohandschuhe.
   2. Besorge dir 2x Mörser, 1x Stößel, 1x Mikroschaufelspatel, 1x Glasspachtel und 1x Edelstahlstößel für den automatischen Douncer.
   3. Richten Sie den automatischen Douncer ein.
   4. Füllen Sie ein Becherglas mit Eis und kühlen Sie das Glas vor.
2. Füllen Sie die 2 Mörser (mit Stößel und Spatel) mit LN₂ , um die Instrumente abzukühlen. Lassen Sie den LN₂ verdampfen und wiederholen Sie den Vorgang.
3. Während die Instrumente abkühlen, geben Sie 1 mL HB in den Glasdounce.
4. Füllen Sie beide Mörser ein letztes Mal mit LN₂ und gießen Sie die 50 mg IMAT-Probe in einen der Mörser.
5. Pulverisieren Sie den IMAT mit dem Stößel, indem Sie ihn vorsichtig auf das Stück Taschentuch drücken, um es in kleine Stücke zu brechen. Stellen Sie sicher, dass alle Teile pulverisiert sind.
6. Der LN₂ verdampft langsam, während das Gewebe pulverisiert wird. Wenn das Gewebe ordnungsgemäß pulverisiert ist und noch 1/4 - 1/2 Mörser LN₂ übrig ist, kippen Sie den Mörser in Richtung der Lippe des Mörsers, um das pulverisierte Gewebe an der Lippe zu sammeln. Lassen Sie den LN₂ vollständig verdampfen.
7. Unmittelbar nachdem das letzte LN₂ verdampft ist, wird das pulverisierte Gewebe in den Glasdounce mit 1 ml HB geschöpft.

3. Homogenisierung von pulverisiertem Gewebe

1. Homogenisieren Sie das pulverisierte Gewebe mit dem automatischen Douncer. Bringen Sie das Glas auf dem Edelstahlstößel für 10 Hübe in Vorwärtsrichtung auf und ab, gefolgt von 10 Hüben in umgekehrter Richtung.
2. Stellen Sie sicher, dass die Lösung nach der Homogenisierung trüb ist und keine sichtbaren Gewebestücke enthält. Oft wird eine hellrosa Farbe aufgrund der Kontamination mit Muskelgewebe erwartet.
3. Übertragen Sie das Homogenat in ein vorgekühltes 1,7-ml-Röhrchen mit geringer Bindung auf Eis.
4. Verwenden Sie 400 μl HB, um den Dounce zu spülen, um sicherzustellen, dass das gesamte Material übertragen wird, und geben Sie es in das Röhrchen.
   HINWEIS: Es können zwei Proben gleichzeitig verarbeitet werden. Verdoppeln Sie dazu die Menge an HB und NIM. Pulverisieren und homogenisieren Sie eine Gewebeprobe und unmittelbar danach pulverisieren und homogenisieren Sie die zweite Gewebeprobe, um die Isolations- und Reinigungsschritte parallel durchführen zu können.

4. Isolierung und Reinigung von Zellkernen (Abbildung 2B)

1. 14 μl Triton-X (10 %) zum Homogenat hinzufügen, um eine Konzentration von 0,1 % zu erhalten.
2. Halten Sie die Tube 10-15 Minuten lang auf Eis und im Dunkeln, während Sie alle 3 Minuten vortexen.
3. Befeuchten Sie ein 100 μm und ein 40 μm Zellsieb (pro Probe) mit jeweils 100 μl RT DPBS in einem konischen 50 mL Röhrchen.
4. Filtrieren Sie das Homogenat durch das 100 μm Zellsieb.
5. Spülen Sie das 1,7 mL Röhrchen mit 400 μl HB und filtrieren Sie es durch das 100 μm Zellsieb.
6. Filtrieren Sie anschließend die Lösung durch das 40 μm Zellsieb.
7. Übertragen Sie die gleiche Menge Lösung in zwei vorgekühlte 1,7 mL Low-Bind-Röhrchen, was ~900 μl in jedem Röhrchen entspricht.
8. Die Röhrchen 10 min bei 2700 x g bei 4 °C zentrifugieren. Nach der Zentrifugation sollte ein kleines Pellet sichtbar sein.
9. Entfernen und verwerfen Sie die oberste Lipidschicht und den verbleibenden Überstand, wobei ~50 μl Lösung aus dem ersten Röhrchen übrig bleiben.
10. Wiederholen Sie den Vorgang für die zweite Tube.
11. Resuspendieren Sie das Pellet im ersten Röhrchen gründlich, indem Sie es 20x vorsichtig auf und ab pipettieren und in ein neues 1,7-ml-Röhrchen mit geringer Bindung umfüllen. Vermeiden Sie die Bildung von Blasen.
12. Wiederholen Sie diesen Vorgang für das zweite Röhrchen und übertragen Sie die resuspendierte Lösung in dasselbe Röhrchen.
13. 500 μl NIM zugeben und durch Pipettieren mischen.
14. Das Röhrchen mit einer Waage bei 1000 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren.
15. Entfernen Sie den Überstand, lassen Sie ~50 μl übrig und pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, bis das Pellet wieder suspendiert ist. Optional können Sie das resuspendierte Pellet in ein neues, sauberes Röhrchen umfüllen, wenn etwas Lipidrest an der Seite des Röhrchens verbleibt.
16. 200 μl NIM zugeben und durch Pipettieren mischen.

5. Färbung und Zählung von Zellkernen (Abbildung 2C und Abbildung 3)

HINWEIS : Um die Zählung zu erleichtern, richten Sie ein Protokoll zur "Kernzählung" auf einem automatisierten Zellzähler ein, da die Anpassung des Hellfelds und der DAPI-Kanäle die Zählung stark beeinflussen kann. Passen Sie die Kanäle so an, dass nur Kerne und keine Trümmer erfasst werden. Stellen Sie sicher, dass der Hellfeldkanal nur "Objekte" markiert, die auch einen DAPI-Fleck aufweisen.

1. Fügen Sie 1 Tropfen der Färbelösung für lebende Zellen hinzu und lassen Sie sie 15 Minuten lang im Dunkeln auf Eis.
2. Die Lösung durch ein 30 μm Zellsieb filtrieren.
3. Mischen Sie die Zellkernlösung durch Pipettieren und geben Sie 10 μl der Lösung in einen Objektträger der Zellzählkammer.
4. Zählen Sie die Zellkerne mit einem automatisierten Zellzähler.
   HINWEIS: Die optimale Konzentration beträgt 1000 Kerne/μL, was 1,0 x 10⁶/ml entspricht.
   1. Stellen Sie sicher, dass keine Klumpen von Kernen vorhanden sind, da dies den Chip zur Erzeugung von Einzelkerntröpfchen verstopfen könnte (Abbildung 3).
   2. Wenn die Kernkonzentration nicht hoch genug ist, schleudern Sie die Lösung bei 1000 x g für 10 min bei 4 °C herunter, um ein Pellet zu erhalten, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie sie in einem kleineren Volumen.
   3. Wenn der Schmutzgrad in der Lösung hoch ist, resuspendieren Sie die Kernlösung in einem größeren Volumen NIM (d. h. 1 mL) und filtrieren Sie erneut durch ein 30-μm-Zellsieb. Dann bei 1000 x g für 10 min bei 4 °C herunterschleudern und in einem angemessenen Volumen im Verhältnis zur Kernkonzentration resuspendieren.
5. Nachdem Sie die Kernkonzentration erhalten haben, fahren Sie direkt mit dem ersten Schritt der Bibliotheksvorbereitung fort.

Abbildung 3: Färbung von isolierten Zellkernen. Bild vom Zellzähler von Zellkernen, die mit NucBlue/DAPI gefärbt wurden (linkes Bild) und das entsprechende Hellfeldbild (rechtes Bild). Das Vorhandensein geringer Mengen an Schmutz ist im Hellfeldbild offensichtlich. Der hier verwendete automatische Zellenzähler verfügt nicht über eine Option zum Einschließen von Maßstabsleisten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

6. Parameter für die Bibliotheksvorbereitung und -sequenzierung

1. Es wird auf ein gründliches Protokoll für die Bibliotheksvorbereitung unter Verwendung des tröpfchenbasierten Einzelkernansatzes verwiesen, das auf der Webseite¹⁷ des Anbieters verfügbar ist.
   1. Streben Sie eine angestrebte Zellkernrückgewinnung von 10.000 an. Bei Proben mit einem hohen Gehalt an Trümmern oder zerbrechlichen Kernen wird jedoch eine geringere Anzahl der gewonnenen Kerne erwartet.
   2. Die Proben werden nach Schritt 2.3 bis zu 72 h bei 4 °C gelagert. im Protokoll zur Bibliotheksvorbereitung, um die parallele Verarbeitung mehrerer Proben zu kombinieren. Verarbeiten Sie dazu zwei Proben bis Schritt 2.3 an zwei aufeinanderfolgenden Tagen und verarbeiten Sie am dritten Tag die 4 Proben zusammen aus Schritt 3 und weiter im Protokoll zur Bibliotheksvorbereitung.
2. Sequenzierungsparameter: Sequenzierung auf einer Sequenzierungsplattform mit dem Ziel von 50.000 Paired-End-Reads pro Kern.
   HINWEIS: Die in diesem Protokoll präsentierten Daten wurden auf der NovaSeq 6000-Plattform sequenziert, mit dem Ziel, 50.000 Paired-End-Reads pro Kern zu erreichen.

Abbildung 2: Protokoll-Workflow. Schematische Darstellung des Arbeitsablaufs in (A) Schritten 2 und 3, (B) Schritt 4 und (C) Schritt 5 des Protokolls. Die Figur ist mit BioRender.com entstanden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

7. Datenverarbeitung und -analyse

HINWEIS : In diesem Protokoll werden einige der empfohlenen Software- und R-Pakete, die zur Verarbeitung der resultierenden Sequenzierungsdaten verwendet werden, kurz vorgestellt, wobei der Schwerpunkt auf den Schritten nach der anfänglichen Vorverarbeitung liegt (Tabelle 3). Diese Studie enthält allgemeine Metriken zur Qualitätskontrolle (QC) und ein Beispiel für eine einheitliche Mannigfaltigkeitsapproximation und -projektion (UMAP) in Abbildung 4. Eine detaillierte Beschreibung der bioinformatischen Analyse würde jedoch den Rahmen dieses Protokolls sprengen. Daher können sich die Leser auf die kürzlich erschienene Übersichtsarbeit zu Best Practices für die Einzelzellanalyse von Heumos et ^al.18 beziehen.

1. Vorverarbeitung von Sequenzierungsdaten
   1. Ordnen Sie die einzelnen Kernlesevorgänge dem humanen Referenzgenom GRCh38 zu.
   2. Beziehen Sie die Intron-Lesevorgänge in die Zählung ein.
2. Führen Sie die Qualitätskontrolle und Filterung der Daten mit dem Seurat R-Paket ¹⁹ durch.
   1. Berechnen Sie einen Zellkomplexitätswert, indem Sie die log(10)-Anzahl der nachgewiesenen Gene durch die log(10)-Anzahl der erkannten Lesevorgänge dividieren.
   2. Stellen Sie die wichtigsten QC-Metriken mithilfe eines Histogramms oder Violin-Diagramms dar, einschließlich der Anzahl der pro Zellkern nachgewiesenen Gene, des prozentualen Anteils der mitochondrialen Lesevorgänge und der Zellkomplexitätsbewertung.
   3. Filtern Sie Zellkerne mit weniger als 200 oder mehr als 10.000 Genen pro Zellkern, mehr als 10 % mitochondrialen Lesevorgängen und einem Komplexitätswert von unter 0,8 heraus.
3. Normalisieren Sie Daten und führen Sie eine Dimensionalitätsreduzierung durch.
   1. Verwenden Sie die SCTransform-Funktion von Seurat, um die Daten anhand von 2000 variablen Features zu normalisieren.
   2. Cluster-Daten mit den folgenden Funktionen aus dem Seurat R-Paket: RunPCA, FindNeighbors, FindClusters und RunUMAP.
   3. Plotten Sie eine UMAP, um das Clustering der Daten zu visualisieren.
4. Filtern Sie vorhergesagte Dubletten mit dem DoubletFinder R-Paket ²⁰ heraus und gruppieren Sie die Daten neu.
5. Annotation von Clustern unter Verwendung bekannter Genmarker der Zelltypen, von denen erwartet wird, dass sie im Gewebe vorhanden sind (überwachter Ansatz) oder basierend auf den Top 5 unterschiedlich exprimierten Genen zwischen den Clustern (unüberwachter Ansatz).
6. Verwenden Sie decontX²¹, um den Grad der Kontamination von Ambient-RNA zu bestimmen und die Genexpressionsmatrix für Ambient-RNA anzupassen.
   1. Fügen Sie die rohe Genmatrix als Hintergrund hinzu.
7. Speichern Sie das Seurat-Objekt für die zukünftige Erkundung der Daten.
   HINWEIS: Der Code für die QC- und Clustering-Analyse ist in der Zusatzdatei 1 verfügbar.

Software/R-Pakete, die im Datenworkflow verwendet werden	Alternative Software/Pakete	Verarbeitungsschritt
CellRanger	STARsolo, kallisto	Trimmen, Ausrichten, Mapping
Seurat	SingleCellExperiment, Cellranger	QC, Analyse und Datenexploration
DoubletFinder	scds, scdblFinder, Scrublet	Dublett-Erkennung
DecontX	SoupX, CellBender	Anpassung der Umgebungs-RNA

Tabelle 3: Software/Tools für den Daten-Workflow.

Results

Dieser Arbeitsablauf wurde entwickelt, um die Verarbeitung von gefrorenen humanen IMAT-Proben zu steuern, um Genexpressionsprofile mit Einzelkernauflösung zu erhalten und so die Identifizierung von Zelltypen zu ermöglichen. Hier wird eine repräsentative IMAT-Stichprobe eines Teilnehmers der SOMMA-Studie vorgestellt.

Der erste Schritt jeder Analyse von snRNA-seq-Daten besteht darin, die Qualität der Daten zu bewerten, um Zellkerne von schlechter Qualität zu identifizieren, die möglicherweise aus dem Datensatz entfernt werden sollten. Wichtig ist, dass die Filterschritte und Schwellenwerte für die spezifische Art der Probe und des Datensatzes bestimmt werden, die Sie zur Hand haben, da die häufig ausgewerteten Metriken je nach Gewebe und Zelltyp unterschiedlich sein können^22,23. Abbildung 4A zeigt einige der wichtigsten Metriken, die zur Bewertung der Qualität der generierten snRNA-seq-Daten verwendet werden. Die Anzahl der pro Zellkern nachgewiesenen Gene hängt von der Sequenzierungstiefe und dem Zelltyp ab, wird jedoch bei Zellkernen guter Qualität auf über 200 geschätzt^18,23. Es wurde festgestellt, dass die mit diesem Protokoll generierten Daten mit einem Median von 1134 Genen pro Zellkern von insgesamt 4662 Kernen im erwarteten Bereich liegen.

Der Prozentsatz der mitochondrialen Reads wird bewertet, da ein hoher Grad an mitochondrialer Kontamination durch beschädigte Zellkerne oder Umgebungs-RNA entstehen kann, die an die Zellkerne andocken, was auf Zellkerne von schlechter Qualität hinweist. In dem hier vorgestellten Datensatz wurde ein medianer mitochondrialer Leseprozentsatz von 2,65 gefunden, was deutlich unter der in der Literatur üblichen Schwelle von 5 % bis 20 % liegt 24,25,26. Der Prozentsatz der ribosomalen Reads unterscheidet sich je nach Zelltyp und Gewebe. Da jedoch große Anteile ribosomaler Gene das Clustering der Daten beeinflussen können, wird empfohlen, den ribosomalen Leseprozentsatz zu überprüfen und möglicherweise ribosomale Gene oder Zellkerne mit einem hohen Anteil an ribosomalen Genen aus dem Datensatz zu entfernen, bevor das Clustering erfolgt. Die mit diesem Protokoll generierten Daten zeigten ein niedriges Niveau an ribosomalen Reads mit einem Median von 2,46 % und einem Maximum von 16,5 %, weshalb wir nicht auf der Grundlage dieser Metrik gefiltert haben. Zuletzt wurde ein Zellkomplexitätswert berechnet, der sich aus der log(10)-Anzahl der nachgewiesenen Gene dividiert durch die log(10)-Anzahl der erkannten Reads zusammensetzt. Es wird erwartet, dass die Zellkerne von guter Qualität über 0,8 liegen, und in der in dieser Studie verwendeten Probe wurde ein Median von 0,92 erhalten. Basierend auf diesen QC-Metriken kann entschieden werden, welche Kerne aus dem Datensatz herausgefiltert werden sollen. Für die Analyse haben wir uns entschieden, Zellkerne mit weniger als 200 oder mehr als 10.000 Genen pro Zellkern, mehr als 10 % mitochondrialen Lesevorgängen und einem Komplexitätswert von unter 0,8 herauszufiltern.

Nach dem ersten Schritt der Qualitätsbewertung und Filterung kann ein UMAP generiert werden, um die Clusterbildung der Kerne zu visualisieren. Das Clustering wurde auf der Grundlage der 2000 variabelsten Gene unter Verwendung der SCT-Transformation durchgeführt. Die ersten Clustering-Schritte können verwendet werden, um zu überprüfen, ob eines der QC-Merkmale zusammengeclustert ist, z. B. Kerne mit hohen mitochondrialen Reads. Darüber hinaus sind Clustering-Informationen für einige Dublett-Erkennungsmethoden erforderlich, einschließlich DoubletFinder²⁰, das in diesem Protokoll verwendet wurde. DoubletFinder wurde mit einer erwarteten Multilotrate von 4,8 % verwendet, wie von den Anbietern der tröpfchenbasierten Plattform vorgeschlagen. Nach der Dublettenentfernung wurde der Grad der RNA-Kontamination in der Umgebung abgeschätzt, was besonders häufig bei Einzelkernpräparationen der Fall ist, da RNA bei der Zelllyse aus dem Zytoplasma freigesetzt und in die Gel-Beads-in-Emulsion (GEMs) abgegeben und in den folgenden Bibliotheksvorbereitungsschritten amplifiziert wird. Daher wurden mehrere Instrumente entwickelt, um das inhärente Problem der RNA-Kontamination in der Umgebung zu beheben (siehe Tabelle 3). Wir haben das R-Paket decontX²¹ verwendet, in dem die rohe Hintergrundmatrix (einschließlich nur leerer Tröpfchen) verwendet wird^, um die Genexpressionsmatrix anzupassen und so die reale Genexpressionssignatur zu verbessern.

Die Clusterbildung und die Fähigkeit, niedrig vorkommende Zelltypen zu erkennen, hängen von der Anzahl der Zellkerne ab. In dieser Studie wurden alle erwarteten Hauptzelltypen in IMAT (Abbildung 4B) von insgesamt 3817 Zellkernen nach QC-Filterung, Dublettenentfernung und Umgebungs-RNA-Anpassung nachgewiesen. Dazu gehörten Stammzellen, fibro-adipogene Vorläuferzellen (FAPs) und reife Adipozyten sowie Perizyten, glatte Muskelzellen, Immunzellen, Muskelvorläuferzellen und Myonuklei aus der Kontamination von Skelettmuskelzellen.

Insgesamt haben wir gezeigt, dass dieses Protokoll hochauflösende Einzelkerndaten liefert, die den Nachweis der Zelltyp-Annotation ermöglichen, die für die Entschlüsselung der Biologie und der zellulären Ursprünge von IMAT wichtig ist.

Abbildung 4: Qualitätsbewertung, Clustering und Zelltyp-Annotation von Sequenzierungsdaten. (A) Violindiagramme der wesentlichen Metriken für die Bewertung der Proben- und Sequenzierungsleistung, einschließlich der Anzahl der pro Zellkern nachgewiesenen Gene, des Prozentsatzes der mitochondrialen Reads, des Prozentsatzes der ribosomalen Reads und der Zellkomplexität, gemessen als log(10) Anzahl der nachgewiesenen Gene dividiert durch die log(10) Anzahl der nachgewiesenen Reads. Die Medianwerte für jede Metrik werden in geschlossenen Feldern angegeben. Gesamtzahl der Kerne: 4662. (B) UMAP, das die Clusterbildung einzelner Zellkerne und das entsprechende DotPlot zeigt, das die relative Genexpression von Zelltyp-Markergenen für jeden Cluster nach der Filterung zeigt. Anzahl der Kerne: 3817. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Datei 1: Der Code für die QC- und Clustering-Analyse. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Die Arbeit mit IMAT ist mit mehreren Herausforderungen verbunden. Neben der eingeschränkten Zugänglichkeit ist die Ausbeute an Probenmaterial oft sehr gering, und eine "Kontamination" der Skelettmuskulatur ist fast unmöglich zu vermeiden. Um die beste Probenqualität zu erhalten, sollte man beim Einführen der Biopsienadel in die Muskelfaszie eindringen (um sicherzustellen, dass kein subkutanes Fettgewebe entnommen wird) und so viel Muskelgewebe wie möglich entfernen, indem man die Probe unmittelbar nach der Entnahme unter einem Mikroskop präpariert, gefolgt von einer anschließenden Verarbeitung für Histologie, Schnappfrosten usw. Dies ist die erste Methode, bei der IMAT-Proben verwendet werden, die prospektiv aus der Skelettmuskulatur entnommen und präpariert wurden. Im Vergleich dazu wurden frühere snRNA-seq-Daten bei IMAT durch Zellkernisolierungen einer Mischung von Skelettmuskelbiopsien mit bekannter Fettinfiltration und nicht durch die IMAT allein durchgeführt.

IMAT ist von Natur aus dichter als subkutanes Fettgewebe, so dass eine ordnungsgemäße Pulverisierung des Gewebes während der Kernisolierung unerlässlich ist, um Kerne aus der Gewebestruktur freizusetzen. Eine unsachgemäße Pulverisierung kann zu einer geringeren Kernausbeute führen, was bei einer begrenzten Gewebemenge ungünstig ist. Darüber hinaus ist die Berechnung der korrekten Anzahl von Kernen in der vorbereiteten Kernlösung ein kritischer Schritt, um sicherzustellen, dass genügend (aber nicht zu viele) Kerne für die GEM-Erzeugung auf den Chip geladen werden können. Zu viele Kerne oder das Vorhandensein von großen Kernclustern oder Ablagerungen können zu einer Verstopfung führen, die sich auf die endgültige cDNA-Konzentration und letztendlich auf die Sequenzierungsleistung auswirkt. Die Umgehung von Kernverklumpungen und Ablagerungen bei der Einzelkernpräparation ist schwierig und wird von der Qualität der Probe beeinflusst. Die Verklumpung von Zellkernen und/oder das Vorhandensein von Ablagerungen kann reduziert werden, indem dem 30-μm-Zellsieb ein zusätzlicher Filterschritt beigefügt wird.

Es ist wichtig, Proben schnell zu verarbeiten, um das Risiko eines RNA-Abbaus zu verringern. Das Halten von Lösungen auf Eis oder gekühlt während aller möglichen Schritte der Zellkernisolierung sowie die Zugabe einer ausreichenden Menge an RNAse-Inhibitoren können den Abbau minimieren. Aufgrund der Bedeutung der Verarbeitungszeit für jede Probe empfehlen wir, maximal zwei Proben gleichzeitig durchzuführen. Darüber hinaus muss die Kernlösung mit Vorsicht behandelt werden, um die Kerne nicht zu zerbrechlich zu machen. Fragile Zellkerne sind anfällig für Platzen bei der GEM-Generierung, was zu großen Mengen an Umgebungs-RNA in der Probe führen kann. In diesem Protokoll wurde der Filterschritt mit einer Spritze (beschrieben im STAR-Protokoll¹⁶) ausgeschlossen, um die Integrität der Zellkerne zu erhalten.

Die Wahl der Methode der Bibliotheksvorbereitung hängt von der Forschungsfrage ab. Wir haben sowohl mit einem tröpfchenbasierten als auch mit einem Nano-Well-basierten Einzelkernansatz gearbeitet. Der Nano-Well-basierte Ansatz profiliert 1200-1600 Zellkerne und etwa 3000-6000 nachgewiesene Gene pro Zellkern¹⁶. Darüber hinaus unterstützt dieser Ansatz die Transkriptomik in voller Länge, die die Untersuchung von strukturellen Variationen, Pseudogenen und Spleißvarianten ermöglicht²⁷. Im Vergleich dazu können mehr als 10.000 Zellkerne mit dem tröpfchenbasierten Ansatz profiliert werden, jedoch auf Kosten einer geringeren Anzahl von Genen, die pro Zellkern nachgewiesen werden (2-3-fach niedriger). Für dieses Protokoll haben wir uns für eine der tröpfchenbasierten Plattformen entschieden, da wir durch die größere Anzahl der profilierten Zellkerne eine größere Kapazität haben, seltene Zelltypen mit einer geringen Abundanz zu erkennen²⁸.

Die Haupteinschränkung von snRNA-seq ist der Verlust des zytosolischen Gehalts, wodurch die Expressionsanalyse auf nukleäre Transkripte beschränkt wird. Der Zellkern enthält 10-100-mal weniger mRNA als die der gesamten Zelle²⁹, was für die Aufdeckung aller Zelltypen in einem Gewebe von Belang sein könnte. Eine aktuelle Studie von Gupta et al. ergab jedoch, dass die nukleäre Transkriptomik - im Vergleich zur Ganzzell-Transkriptomik²⁹ - ähnliche Zellpopulationen und Expressionsprofile biologisch relevanter Gene in kultivierten Präadipozyten und reifen Adipozyten nachweist. Ähnliche Ergebnisse wurden bei anderen Zelltypen gefunden^30,31.

Die Isolierung von Einzelkernen hat ihre Vorteile bei der Bereitstellung von Genexpressionsmustern für fragile Zellen mit Einzelzellauflösung (sc), die mit scRNA-seq nicht kompatibel sind. Darüber hinaus können gefrorene Biobankproben verwendet werden, und die Zellkernisolierung erfordert keinen enzymatischen Verdau des Gewebes, der eine Stressreaktion in den Zellen hervorrufen kann, die das Transkriptom^{beeinflusst 32}. Durch die Verwendung von snRNA-seq konnten wir Adipozyten und andere Zelltypen, die in IMAT vorhanden sind, transkriptionell profilieren, was mit scRNA-seq nicht möglich wäre, da Adipozyten lipidbeladen und mit dem tröpfchenbasierten Ansatz inkompatibel sind.

Eine wichtige Anwendung von snRNA-Seq von IMAT ist die Entschlüsselung der Zellzusammensetzung und der transkriptionellen Unterschiede von IMAT in verschiedenen Stoffwechselzuständen. Darüber hinaus können snRNA-seq-Datensätze verwendet werden, um RNA-seq auf IMAT zu dekonvolutieren, um Unterschiede in der Zellzusammensetzung auf einer größeren Skala zu bewerten³³. Darüber hinaus kann die Pseudo-Zeitanalyse von snRNA-seq-Daten dazu dienen, Verläufe der Zellreifung zu identifizieren, was insbesondere in Geweben wie IMAT von Interesse ist, in denen die zelluläre Herkunft der reifen Adipozyten noch diskutiert wird.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,2 &Mikro; M Corning Spritzenvorsatzfilter	Millipore Sigma	CLS431229
1,7 mL DNA-LoBind-Röhrchen	Eppendorf	22431021	Low-Bind-Röhrchen
10% Tween 20	Bio-Rad	1662404
100x Proteaseinhibitor	Thermo Fisher Scientific	78437
10X Magnetseparator	10X Genomics	230003
10X Vortex Adapter	10X Genomics
15 mL kanonische Röhrchen	Sarstedt	6,25,54,502
2100 Bioanalysator	Agilent	G2939BA
50 mL konische Röhrchen	Sarstedt	6,25,47,254
CellRanger	Genomics	N/A
Chromium iX Zubehörkit	10X Genomics	PN1000323
Chromium iX Controller	10X Genomics	PN1000326
Chromium Next GEM Chip G Einzelzell-Kit	10X Genomics	PN1000127
Chrom Next GEM Einzelzelle 3' Gel Bead Kit v3.1	10X Genomics	PN1000129
Chrom Next GEM Einzelzell-GEM Kit v3.1	10X Genomics	PN1000130
Countess 3 Automatisierter Zellzähler	Thermo Fisher Scientific	AMQAX2000	Automatisierter Zellzähler
Countess Zellzählkammer Objektträger	Thermo Fisher Scientific	C10228
DoubletFinder	R	N/A
DPBS (kein Calcium, kein Magnesium)	Thermo Fisher Scientific	14190144
DTT	Thermo Fisher Scientific	R0861
Dual Index Kit TT Set A, 96 rxns	10X Genomics	PN1000215
Dynabeads MyOne SILANE	10X Genomics	PN2000048
Falcon 100 & micro; m Zellsieb	Corning Life Science	352360
Falcon 40 µ m Zellsieb	Corning Life Science	352340
Glycerin (Glycerin), 50% (v/v) Wässrige Lösung	Ricca Chemical Company	3290-32
KCL	Thermo Fisher Scientific	AM9640G
Library Construction Kit v3.1	10X Genomics	PN1000196
MACS SmartStrainers (30&Mikro; m)	Miltenyi Biotec	130-098-458
Mastercycler Nexus Gradient Thermocycler	Eppendorf	6331000017
MgCl2	Ambion	AM9530G
Mörser und Stößel	Logistik im Gesundheitswesen	14075
NucBlue Live Ready Sonden Reagenz	Thermo Fisher Scientific	R37605
Nukleasefreies Wasser (nicht DEPC-behandelt)	Thermo Fisher Scientific	AM9930
Probumin Rinderserum Albumin Albumin ohne Fettsäuren, Pulver	Sigma-Aldrich	820024
Qiagen Puffer EB	Qiagen	19086
Ribolock RNAse Inhibitor	Thermo Fisher Scientific	EO0382
Seurat	R	N/A
Saccharose	Sigma-Aldrich	S0389
SUPERasin 20 U/µ L	Thermo Fisher Scientific	AM2695
ThermoMixer C	Eppendorf
Gewebehomogenisator	Glass-Col	099C K54
Tris-Puffer pH 8,0	Thermo Fisher Scientific	AM9855G
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	AC327372500
UltraPure 0,5M EDTA pH 8,0	Gibco	15575020