Das Protokoll stellt ein Überlebensmodell für Nagetiere vor, um Venoplastik-Ballon-Eingriffe (VB) in nicht-thrombotischen, thrombotischen und postthrombotischen tiefen Venen zu testen.
Methodenartikel
Das Protokoll stellt ein Überlebensmodell für Nagetiere vor, um Venoplastik-Ballon-Eingriffe (VB) in nicht-thrombotischen, thrombotischen und postthrombotischen tiefen Venen zu testen.
Die Ballonvenoplastik ist eine häufig verwendete klinische Technik zur Behandlung von tiefen Venenstenosen und -verschlüssen als Folge von Traumata, angeborenen anatomischen Anomalien, akuter tiefer Venenthrombose (TVT) oder Stents. Die chronische tiefe Venenobstruktion ist histopathologisch durch Thrombose, Fibrose oder beides gekennzeichnet. Derzeit gibt es keine direkte Behandlung, um diese pathologischen Prozesse zu bekämpfen. Daher ist ein zuverlässiges in vivo Tiermodell notwendig, um neuartige Interventionen zu testen. Das Venoplastik-Ballonmodell (VBM) für das Überleben der Vena cava inferior (IVC) von Nagetieren ermöglicht die Untersuchung der Ballonvenoplastik bei nicht-thrombotischen und postthrombotischen Zuständen über mehrere Zeitpunkte. Die lokale und systemische Wirkung von beschichteten und unbeschichteten Venoplastik-Ballons kann über Gewebe-, Thrombus- und Blutassays wie Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR), Western Blot, Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), Zymographie, Venenwand- und Thrombus-Zellanalyse, Vollblut- und Plasma-Assays und histologische Analyse quantifiziert werden. Das VBM ist reproduzierbar, repliziert chirurgische Eingriffe am Menschen, kann lokale Veränderungen des Venenwand-Thromben-Proteins identifizieren und ermöglicht mehrere Analysen aus derselben Probe, wodurch die Anzahl der benötigten Tiere pro Gruppe verringert wird.
Tiefvenenobstruktionen durch ungelöste Thromben sind eine häufige Folge der tiefen Venenthrombose (TVT) und eine der Ursachen für das postthrombotische Syndrom (PTS), das Milliarden von Dollar im Gesundheitswesen kostet und die Lebensqualität erheblich beeinträchtigt 1,2,3. PTS ist eine einzigartige entzündliche Pathologie mit einer daraus resultierenden Venenwandfibrose4, die in den TVT-Modellen von Kleintieren nicht vollständig erfasst wurde 5,6,7, und was noch wichtiger ist, frühere Modelle können das Ansprechen auf therapeutische Interventionen nicht bewerten. Thrombotische Venenobstruktionen werden häufig durch Stents und Ballonvenoplastik behandelt 8,9; Solche Eingriffe werden durch eine hohe Reinterventionsrate aufgrund von Restenose und Okklusion erschwert 10,11,12.
Trotz der Verfügbarkeit von medikamentenbeschichteten Ballons zur Behandlung arterieller Stenosen/Verschlüsse gibt es keine für tiefe Venen. Der molekulare Mechanismus hinter der Restenose ist in den Venen nur unzureichend verstanden und es gibt keine direkte Therapie4. Daher ist es unser Ziel, ein Tiermodell vorzustellen, das lokal verabreichte Therapeutika über Venoplastikballons testen kann, die postthrombotische Obstruktionen der tiefen Vene simulieren. Dieses Modell reproduziert den postthrombotischen Zustand und bewertet, wie sich verschiedene Arten von Venoplastikballons in vivo auf die Venenwand auswirken.
Das folgende Protokoll folgt den Richtlinien und Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Michigan (UMICH), den Grundsätzen der US-Regierung für die Nutzung und Pflege von Wirbeltieren, die in Tests, Forschung und Ausbildung verwendet werden, und den ANARRIVE-Richtlinien 2.0. Das UMICH Animal Welfare Assurance-Abkommen ist konform mit OLAW und USDA und ist vollständig von AAALAC International akkreditiert. Dieses Protokoll wurde mit der ID-Nummer PRO00010841 genehmigt. Es wurden männliche ausgezüchtete Sprague Dawley-Ratten aus den Charles River Laboratories mit einem Gewicht von 450 g und einem Alter von 15 Wochen verwendet.
1. Rattenanästhesie
2. Ultraschalluntersuchung von Ratten
3. Mikrochirurgie und Genesung von Ratten

Abbildung 1: Verteilung der transabdominalen Duplexmaße des transversalen IVC-Durchmessers (mittlerer infrarenierender Abschnitt). Die Messung erfolgte anhand des Tiergewichts. Es wurde keine signifikante Korrelation zwischen dem Gewicht und dem IVC-Durchmesser gefunden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
4. Vorbereitung der Probe
Das VBM ist ein Modell, das die Wirkung von Venoplastikballons bei der vollständigen Blutstillungskontrolle bewertet. Zunächst quantifizierten wir den IVC-Durchmesser (mittlerer infrarenaler Schnitt), wie in Abbildung 1 gezeigt, für die korrekte Ballongröße. Zweitens ist die entwickelte mikrochirurgische Schritt-für-Schritt-Technik in Abbildung 2 dargestellt, und wir zeigen auch Beispiele für die kritischen Schritte in Abbildung 3. Beachten Sie den retrograden Ansatz, der für die IVC-Kanülierung mit dem geschärften Führungsdraht verwendet wird.

Abbildung 2: Mikrochirurgische Technik zur Untersuchung von Venoplastik-Ballons bei Ratten. Die verwendete Technik wird hier beschrieben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: In-vivo-Bilder der Einsatztechnik. (A) Hämostatische Kontrolle. (B) U-Stich auf infrarenale IVC. (C) Einführen des Drahtes durch U-Stich mit 3 mm Sirolimus-beschichtetem Ballon. (D) Retrograder Einsatz der Ballonvenoplastik (Sirolimus-beschichtet). Abkürzungen: IVC = Vena cava inferior; AO = Aorta; CBV = Beschichtete Ballonvenoplastik. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Andere normale venöse Gefäßmessungen und die Unterscheidung zwischen der IVC und der Aorta sind in Abbildung 4 hervorgehoben. Die Befunde des thrombotischen Ultraschalls sind in Abbildung 5 dargestellt. Schließlich ist in Abbildung 6 ein Vergleich zwischen dem Durchmesser des präoperativen Ultraschalls und der postthrombotischen Messungen zu sehen. Die durchschnittliche gepulste Doppler-Strömungsgeschwindigkeit (mm/s) in der Vena cava inferior vor und nach der Platzierung des Clips des Gefäßes ist in Abbildung 7 dargestellt.

Abbildung 4: Repräsentative transabdominale Duplexbilder mit Beispielen für eine Berechnung des transversalen IVC-Durchmessers. (A) Proximale IVC. (B) Mittelinfrarenale IVC. (C) Distale IVC. Farbdoppler-Analyse von (D) mittlerer infrarenierender IVC und (E) abdominaler Aorta. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5. Bilder mit Bildern vor und nach dem Clip. (A) Ultraschallbefunde nach der Clip-Platzierung, die den IVC-Verschluss bestätigen. (B) Proximaler und distaler Aortenfluss. (C) Proximaler IVC-Fluss. (D) Vena iliaca communis. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6. Ultraschallbilder. Der Ultraschall ändert sich vor und nach 15 Minuten, 30 Minuten und 45 Minuten, was den IVC-Verschluss bestätigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 7: Durchschnittliche gepulste Doppler-Strömungsgeschwindigkeit. Mittlere Strömungsgeschwindigkeit (mm/s) in der unteren Hohlvene vor und nach der Clipplatzierung (**: P ≤ 0,01, Mann-Whitney-Test durchgeführt). Fehlerbalken zeigen den Standardfehler an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Um das Ergebnis verschiedener Venoplastiken mit neuartigen Beschichtungen zu analysieren, empfehlen wir die Messung wirksamer Proteine, die die On-Target-Wirkung des interessierenden Medikaments nachweisen können. Für den hier verwendeten Sirolimus-beschichteten Venoplastikballon haben wir die phosphorylierten AKT (p-AKT)-Proteinspiegel von IVC-Lysaten von Ratten gemessen, was die Hemmung des mTOR-Signalwegs bestätigt, da p-AKT ein nachgeschaltetes Protein ist, das als Reaktion auf Sirolimus abnimmt14,15. In Abbildung 8 können wir beobachten, wie nach der beschichteten Ballonvenoplastik (CBV) die p-AKT im Vergleich zur Scheingruppe signifikant verringert ist.

Abbildung 8: Protein-p-AKT-Spiegel. Die Proteinspiegel von Ratten-IVC-Lysaten der Schein- vs. Mantelballon-Venoplastik (CBV) unter normalen Bedingungen bestätigen die Zielwirkung bei der Hemmung des mTOR-Signalwegs unter Verwendung von Sirolimus-Venoplastik-beschichteten Ballons. (**: P ≤ 0,01, Mann-Whitney-Test durchgeführt). Fehlerbalken zeigen den Standardfehler an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Die VBM kann an Ratten ≥ 250 g mit Ballons im Bereich von 2,5 bis 3,5 mm durchgeführt werden. Bei Ratten mit einem Gewicht von mehr als 750 g ist die Technik durch eine höhere Menge an Fettgewebe in der Bauchhöhle und die Organgröße begrenzt und nicht durch Veränderungen des IVC-Durchmessers. Aus unserer Erfahrung haben wir festgestellt, dass 10 oder mehr Tiere pro Gruppe erforderlich sind, um eine statistische Signifikanz zwischen den Gruppen für die Analyse von Venenwandproteinen oder Aktivitätsassays und die Histologie zu erhalten. Eine regelmäßige Temperaturkontrolle und Überwachung der Atemfrequenz während chirurgischer Eingriffe sind sehr wichtig, um den Erfolg des Eingriffs zu gewährleisten, ebenso wie ein sorgfältiges postoperatives Management.
VBM ist sicher (91,2% Überlebensrate, 83/91 durchgeführte Eingriffe) und reproduzierbar mit einer durchschnittlichen Eingriffszeit von 30 Minuten. Die verfahrensbedingte Morbidität umfasst anästhetische Komplikationen (1%, 1/91), Opioid-Nebenwirkungen (1%, 1/91), Blutungen (2,1%, 2/91) und Thrombosen (4,3%, 4/91). Die IVC-Blutung wurde während der Modellentwicklung signifikant reduziert, indem ein retrograder IVC-Kanulationsansatz verwendet wurde, bei dem der Einführpunkt neben der infrarenalen IVC lag, was einen breiteren Winkel für die Drahteinführung mit weniger Eingriffen durch die Bauchorgane bietet. Auch während der Einführ- und Insufflationsphase empfehlen wir eine chirurgische Assistentin, um den korrekt verabreichten Druck, die Aufblaszeit und den geschärften Rückzug des Führungsdrahtes zu gewährleisten. Nach der Entleerung muss eine korrekte Entnahme des Venoplastik-Ballons sichergestellt werden, um zu verhindern, dass die IVC-Wand an der Einführstelle gerissen wird. Druckmessungen werden vom Hersteller befolgt, um ein Aufblasen und Platzen des Ballons zu vermeiden. Diese Messungen tragen insgesamt zu einem stabileren Ansatz bei, verringern Blutungskomplikationen und verbessern das Überleben der Tiere.
IVC-Blutungen können auch mit den folgenden Vorsichtsmaßnahmen gemildert werden. Überprüfen Sie zunächst die vollständige Verätzung der hinteren Äste und die Ligatur der Seitenäste. Dies garantiert auch die Reproduzierbarkeit der Befunde auf der Grundlage früherer IVC-Ligatur-Stasis-Analysenvon Nagetieren 5,16,17. Zweitens überprüfen Sie die korrekte Okklusion mit den proximalen und distalen Clips, um eine vollständige hämostatische Kontrolle zu gewährleisten. Überprüfen Sie abschließend den vollständigen Verschluss der U-Naht bei der Ballonentfernung, bevor Sie die IVC-Clips entfernen. Wenn Blutungen vorhanden sind, wird die Blutung in der Regel durch sanften Druck auf die IVC mit einem Applikator mit Wattespitze gestoppt, bis eine hämostatische Kontrolle erreicht ist. Zusätzliche hämostatische Bekämpfungsmittel, wie z. B. resorbierbares Gelatinepulver, können bei Blutungen verwendet werden.
Thrombotische Komplikationen sollten minimal sein, wenn die Zeit für das Aufblasen des Ballons, die Deflation und die Schließzeit der U-Naht-Naht weniger als 5 Minuten beträgt. Bei Bedarf kann eine Antikoagulation verabreicht werden. Bisher gibt es kein vollständig perkutanes Verfahren, um die minimal-invasiven Ballonvenoplastiken, die derzeit beim Menschen durchgeführt werden, nachzuahmen. Die Größe des Zugangsgefäßes (Vena femoralis der Ratte) ist deutlich kleiner (durchschnittlich 0,81 mm)18 als der Außendurchmesser der kleinsten kommerziell erhältlichen 4F-Schleuse (1,61 mm), die für einen vollständig endovaskulären Eingriff erforderlich wäre. Zu den Einschränkungen gehören der Bedarf an qualifizierten Mikrochirurgen und der Bedarf an Spezialgeräten.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das VBM-Modell das klinische Szenario einer tiefen venösen Venoplastik nach TVT genau simuliert. Es ist ein wertvolles Instrument, um die endovaskuläre Wirkung von Venoplastikballons auf die IVC mit verschiedenen Medikamentenalternativen zu mehreren Zeitpunkten zu untersuchen. Zu den zukünftigen Anwendungen dieser Technik gehören die präklinische Prüfung anderer medizinischer Geräte, darunter Stents, Thrombektomiekatheter, Ballonbeschichtungen und neuartige pharmakologische Therapeutika.
Es wurden keine Interessenkonflikte erklärt.
Diese Studie wird durch das American Venous Forum (AVF) 2023 Basic Science Research Grant und Surmodics, Inc. unterstützt.
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 3-0 DemeCRYL | DemeTech | G183019F4P | 12 pro Karton |
| 5-0 DemeCRYL | DemeTech | G285017B0P | 12 pro Karton |
| 7-0 DemeLENE | DemeTech | PM197011F13M | 12 pro Karton |
| 8-0 DemeLON | DemeTech | NL868007C7P | 12 pro Karton |
| Abgewinkelter Clip-Applier | SCANLAN | 3795-01A | 7-1/4″ (18,5 cm) |
| Baxter 0,9% Natriumchlorid Bewässerungsflasche | Baxter | SKU: 195-7124 | 1000mL Flasche |
| Bovie Cautery Low Temperature Fine Tip | Symmetry Surgical Inc | AA00 | 10/bx |
| Buprenorphin | Fidelis Animal Health | SKU- 099114 | 1,3mg/mL, 3mL |
| CD (Sprague Dawley) Ratten | Charles River | Stamm Code 001 | Männlich, 400 g |
| Clip-It Rückverfolgbarer Timer | RÜCKVERFOLGBARE PRODUKTE | Kat. Nr. 5046 | |
| Watte-Applikator 3" | Dukal Corporation | 922-00037BX100 | 1000/BOX |
| Enzymatisches chirurgisches Instrumentenwaschmittel und Presoak | Medline | MDS88000B9 | 1 Gal |
| Augenschmiermittel | Optixcare | SKU-065441 | 20gm |
| Gaymar T/Pump Stryker Lokalisiertes Wärme-/Kühltherapiesystem | Stryker | TP700 | |
| Heifetz Mikroclips 12 mm x 2,25 mm | SCANLAN | 3795-20 | Gerade |
| Heifetz Mikroclips 12 mm x 2,25 mm | SCANLAN | 3795-28 | Gebogene |
| Heifetz Mikroclips 8 mm x 1,75 mm | SCANLAN | 3795-14 | Gerade |
| Heifetz Mikroclips 8mmx1.75mm | SCANLAN | 3795-18 | Gebogene |
| Aufblasvorrichtung | Merit Medical | IN4130 | BasixCOMPAK mit Analoganzeige |
| Isofluran | MFR VETONE | SKU-501017 100mL | , Flüssigkeit zur Inhalation |
| Mikrochirurgie-Kit mit Pinzette und Pinzette | Kundenspezifischer | ||
| Sauerstoff, E-Tank | Medline | MDM1630 | |
| Geschärfter Führungsdraht | Kundenspezifisch | ||
| Steril Glad Press-n-Seal | Glad | SKU # PSS-140 | ETO freiliegende |
| sterile Vlies-Mullschwämme 2s 4ply 4x4 | Medline | SKU PRM21444H | 100Ct |
| Operationsmikroskop | Zeiss | S100 / OPMI pico | |
| OP-Peeling & Handwäsche | Vetoquinol | NDC: 17030-003-16 | 16 oz |
| Ultraschallgel | Medline | CTR001305 | 8,5 oz, 12/CS |
| Ultraschallsystem | Siemens | ACUSON Antares | 3-D, Farbe, Dauerstrich (CW), gepulste Welle (PW), Power CW / CW Spektraler |
| Venoplastik-Ballon | kundenspezifisch |