Methodenartikel

Beurteilung der funktionellen Wiederherstellung der Eupneik-Zwerchfellaktivität nach einseitiger Hemisektion des zervikalen Rückenmarks bei Ratten

DOI:

10.3791/66828

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14. Juni 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology and Biomedical Engineering, Mayo Clinic, 2Department of Anesthesiology and Perioperative Medicine, Mayo Clinic

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Atemwegskomplikationen sind die häufigste Todesursache bei Personen mit zervikaler Rückenmarksverletzung (cSCI). Tiermodelle für cSCI sind für mechanistische Bewertungen und präklinische Studien unerlässlich. In dieser Arbeit stellen wir eine reproduzierbare Methode vor, um die funktionelle Wiederherstellung der Zwerchfellmuskelaktivität (DIAm) nach einseitiger C2 spinaler Hemisektion (C2SH) bei Ratten zu beurteilen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nach einer cSCI kann die Aktivierung des DIAm je nach Ausmaß der Verletzung beeinträchtigt werden. Das vorliegende Manuskript beschreibt ein unilaterales C 2-Hemisektionsmodell (C2SH) der cSCI, das die elektromyographische (EMG) Aktivität des eupneischen ipsilateralen Zwerchfells (iDIAm) während der Atmung bei Ratten stört. Um die Wiederherstellung der motorischen Kontrolle der DIAm zu bewerten, muss zunächst das Ausmaß des Defizits aufgrund von C2SH eindeutig festgestellt werden. Durch die Verifizierung eines vollständigen anfänglichen Verlusts des iDIAm-EMG während der Atmung kann die anschließende Genesung entweder als nicht vorhanden oder als vorhanden klassifiziert werden, und das Ausmaß der Genesung kann anhand der EMG-Amplitude abgeschätzt werden. Darüber hinaus kann durch die Messung des anhaltenden Fehlens von iDIAm-EMG-Aktivität während der Atmung nach der akuten Wirbelsäulenschockphase nach C2SH der Erfolg der initialen C2SH validiert werden. Die Messung der EMG-Aktivität des kontralateralen Zwerchfells (cDIAm) kann Aufschluss über die kompensatorische Wirkung von C2SH geben, die auch die Neuroplastizität widerspiegelt. Darüber hinaus können DIAm-EMG-Aufzeichnungen von wachen Tieren wichtige physiologische Informationen über die motorische Steuerung der DIAm nach C2SH liefern. Dieser Artikel beschreibt eine Methode für ein rigoroses, reproduzierbares und zuverlässiges C2SH-Modell von cSCI bei Ratten, das eine hervorragende Plattform für die Untersuchung der respiratorischen Neuroplastizität, der kompensatorischen cDIAm-Aktivität sowie therapeutischer Strategien und Arzneimittel darstellt.

Einleitung

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In den Vereinigten Staaten gibt es mehr als 300.000 Menschen mit Rückenmarksverletzungen, von denen etwa die Hälfte Gebärmutterhalsverletzungen hat1. Diese Verletzungen führen zu einem erheblichen Verlust des Wohlbefindens und stellen eine finanzielle Belastung für den Einzelnen, seine Familien und das Gesundheitssystem dar. Glücklicherweise ist die Mehrheit der Querschnittlähmungen unvollständig – was das Potenzial zur Stärkung verschonter Signalwege bietet1. Diese Neuroplastizität kann die Wiederherstellung zumindest einiger Funktionen ermöglichen, einschließlich der DIAm-Aktivität, die für beatmungstechnisches und nicht-beatmungsbezogenes Verhalten wichtig ist. Daher ist die Förderung der Neuroplastizität ein vielversprechender Forschungsweg, um Menschen mit Rückenmarksverletzung2 zu helfen.

Nagetiermodelle für Querschnittlähmung haben das Potenzial, einen wesentlichen Beitrag zur Entdeckung von Behandlungen zur Verbesserung der menschlichen Gesundheit zu leisten. Eines der klassischen Modelle der Querschnittlähmung, das zur Untersuchung der Neuroplastizität verwendet wird, ist eine einseitige Durchtrennung (Hemisektion) des Rückenmarks bei C2 (C2SH), bei der die kontralaterale Seite intakt bleibt 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. Die Wirkung von C2SH auf die phrenische Ausscheidung und die Bedeutung verschonter kontralateraler Wege wurde erstmals vor über hundert Jahren von Porter12 aufgedeckt, dessen bahnbrechender Artikel den Grundstein für moderne Studien zur respiratorischen Neuroplastizität legte. Das C2SH-Modell unterbricht absteigende Inputs aus der rostralen ventralen Atmungsgruppe (rVRG) in der Medulla, die prämotorische Neuronen enthält, die für die Übertragung der Ausgabe der Atmungsrhythmusgeneration verantwortlich sind14. Diese rVRG-Prämotorneurone übertragen auch exzitatorischen neuronalen Antrieb an phrenische Motoneuronen (Abbildung 1). Mehrere Forscher haben unterschiedliche Ansätze für das C2SH-Modellgewählt 10,11,15,16, was teilweise einen Teil der Variabilität in der Genesung zwischen den Studien erklären könnte. Kurz gesagt, die Ansätze variieren in Bezug auf die Schonung der dorsalen Funikuli, die Durchführung einer vollständigen Hemisektion oder die Durchführung einer lateralen Teildurchtrennung, die die absteigenden Eingaben aus dem ipsilateralen rVRG nicht vollständig unterbricht. Im Allgemeinen sind C2SH-Modelle besonders nützlich für die Untersuchung der respiratorischen Neuroplastizität aufgrund der Raten der spontanen Erholung der elektromyographischen (EMG) eupneischen iDIAm-Aktivität im Laufe der Zeit, die durch mehrere Faktoren, einschließlich der neurotrophen Signalgebung, verbessert werden kann 17,18,19,20,21. Ein anfänglicher Funktionsverlust – definiert als die Stilllegung der eupneischen iDIAm-EMG-Aktivität – muss jedoch zunächst festgestellt werden, bevor eine Wiederherstellung eindeutig klassifiziert werden kann. Diese Validierung der Inaktivität zum Zeitpunkt von C2SH wurde in mehreren Studiennicht durchgeführt 3,4,6,7,11,22,23.

Histologische Untersuchungen des exzidierten Rückenmarks liefern nur Hinweise auf eine Schädigung der geeigneten Lokalisation der ipsilateralen exzitatorischen bulbospinalen Bahnen, die phrenische Motoneuronen im Rückenmark innervieren, aber die Histologie ersetzt keine physiologische Evidenz (z. B. DIAm EMG). Darüber hinaus werden histologische Untersuchungen ex vivo zu Endzeitpunkten (oft mehrere Wochen bis Monate nach der Verletzung) durchgeführt und liefern daher keine "Echtzeit"-Informationen. Einige Forscher haben festgestellt, dass das Ausmaß der Läsion mit dem Ausmaß des funktionellen Defizits oder dessen Fehlen zusammenhängt 5,24,25,26. Es ist wichtig zu beachten, dass die Gültigkeit solcher Behauptungen wahrscheinlich stark davon abhängt, wie "Funktion" klassifiziert wird (d.h. was die funktionellen Aufgaben sind und wie sie quantifiziert werden), und die Variabilität zwischen den Studien unterstreicht die Schwierigkeit, funktionell identische Läsionen bei Tieren zu erzeugen. In der Tat haben die Forscher betont, dass die Beziehung zwischen dem Ausmaß der Verletzung und der Bewegungsfunktion der Gliedmaßenmuskulatur (quantifiziert durch den Basso-, Beattie- und Bresnahan-Score (BBB)24) nicht linear ist27,28. In früheren Studien haben wir keinen Zusammenhang zwischen dem Ausmaß des C2SH und dem Ausmaß der Erholung der eupneischen iDIAm EMG-Aktivität nach einer Verletzung gefunden 10,29,30,31, obwohl andere Forscher über einen Zusammenhang zwischen der Beatmungsfunktion und dem Ausmaß der Schonung der weißen Substanz berichtet haben 5. Daher ist im Falle des C2SH-Modells ein Ansatz zur funktionellen Validierung der iDIAm-Inaktivität zum Zeitpunkt der Operation und vorzugsweise zu Beginn des Zeitverlaufs von Experimenten mit chronischen Rückenmarksverletzungen sowohl vorteilhaft als auch notwendig.

Der vorliegende Artikel unterstreicht die Verwendung von DIAm EMG zur Echtzeit-Bestätigung des anfänglichen Verlustes von DIAm EMG während der Atmung nach dem C2SH sowie die anschließende Bestätigungsbeurteilung 3 Tage (Tag 3) nach der Verletzung 18,21,31,32,33. In früheren Arbeiten mit dem C2SH-Modell wurden wiederholte Laparotomien durchgeführt, um das DIAm EMG 10,13,30,34 aufzuzeichnen. In neueren Arbeiten wurden jedoch chronische EMG-Elektroden verwendet, die die Aufzeichnung von EMG bei anästhesierten und wachen Ratten ermöglichen. Darüber hinaus verringern chronische Elektroden das Risiko eines Pneumothorax und erfordern keine wiederholten Laparotomien, die zu einer Hemmung des DIAmführen können 35,36. Obwohl Versionen des C2SH-Modells von vielen Forschern verwendet wurden, wurde zum Zeitpunkt der Operation keine Bestätigung für die Stilllegung der iDIAm-Aktivität vorgenommen 3,4,6,7,11,22,23. Ohne eine solche Bestätigung der Inaktivität ist es schwierig zu wissen, welcher Anteil der nachfolgenden Genesung auf die Neuroplastizität von ipsilateralen und kontralateralen Signalwegen zurückzuführen ist, was unterschiedliche Auswirkungen haben kann. Dies ist eine wichtige Überlegung, da der inspiratorische neuronale Antrieb vom rVRG zu den phrenischen Motoneuronen primär ipsilateral ist, mit einem Verlust von etwa 50% der exzitatorischen glutamatergen Inputs zu phrenischen Motoneuronen nach C2SH33. Es gibt jedoch verbleibende inspiratorische exzitatorische Inputs aus dem kontralateralen rVRG, die unterhalb der Stelle der Läsion kreuzen, um ipsilaterale phrenische Motoneuronen zu innervieren, und die durch Neuroplastizität verstärkt werden können, um die funktionelle Wiederherstellung zu fördern. Durch das Entfernen des vorherrschenden ipsilateralen exzitatorischen Inputs zu phrenischen Motoneuronen geht die eupneische iDIAm-EMG-Aktivität verloren (zumindest unter Narkose), während die Aktivität des cDIAm anhält und sogar verstärkt wird. Der Verlust der iDIAm EMG-Aktivität während der Atmung ist somit ein Maß für eine erfolgreiche C2SH (Abbildung 2).

Ein gewisses Maß an iDIAm-EMG-Aktivität ist bereits 1-4 Tage nach C2SH bei wachen Tieren vorhanden23,37. Darüber hinaus ist bei Dezerebrattieren die iDIAm-Aktivität innerhalb von Minuten bis Stunden nach der oberen zervikalen Hemisektion vorhanden und wird durch Anästhesie unterdrückt38. Zusätzlich wird der Erfolg des C2SH validiert, indem das Fehlen einer iDIAm EMG-Aktivität während der Atmung (Eupnoe) bei anästhesierten Ratten am Tag 3 nach der Verletzung bestätigt wird. Konfokale bildgebende Untersuchungen bestätigten den Verlust glutamaterger synaptischer Inputs an phrenischen Motoneuronen während dieses Anfangsstadiums der Verletzung37. Wenn am Tag 3 nach der Verletzung eine verbleibende eupneische iDIAm-EMG-Aktivität vorhanden ist, wird dies als Beweis für eine unvollständige Entfernung des ipsilateralen absteigenden Inspirationsantriebs aus dem rVRG interpretiert. Der vorliegende Artikel gliedert sich in drei Abschnitte: (1) chronische DIAm-EMG-Aufzeichnungen, (2) C2SH und (3) EMG-Datenerfassung bei wachen und anästhesierten Tieren. Dieses Protokoll beschreibt ein rigoroses, reproduzierbares und zuverlässiges C2SH-Modell der cSCI bei Ratten, das eine hervorragende Plattform für die Untersuchung der respiratorischen Neuroplastizität, der kompensatorischen cDIAm-Aktivität sowie therapeutischer Strategien und Arzneimittel darstellt.

Protokoll

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Dieses Protokoll wurde vom Mayo Clinic Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt (Protokollnummer: A00003105-17-R23). Bei den Tieren in der vorliegenden Studie handelte es sich um eine Mischung aus männlichen und weiblichen Sprague-Dawley-Ratten, die etwa 3 Monate alt waren und zwischen 200 g und 350 g wogen. Die Einzelheiten zu den Reagenzien und der in der Studie verwendeten Ausrüstung sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Elektrodenimplantation

  1. Vorbereiten der Elektroden
    1. Stellen Sie sicher, dass die erwähnte Ausrüstung verfügbar ist: (1) mehrsträngiger Edelstahldraht, (2) Skalpell mit #11 Klinge, (3) Schere, 4) Dissektionsmikroskop, (5) Lineal, (6) Pinzette, (7) 25 g Nadeln, (8) 2 Zangen (mindestens eine mit Crimpzone).
    2. Einzelheiten zum Verfahren zur Herstellung von Elektroden sind in Abbildung 3 dargestellt. Wiederholen Sie diesen Vorgang mindestens zweimal für gepaarte differentielle Aufzeichnungselektroden.
    3. Zuerst 18 cm des Edelstahldrahtes abmessen und abschneiden.
    4. Binden Sie einen einfachen Überhandknoten in 4 cm Entfernung von einem Ende des Drahtes, wie in Abbildung 3 gezeigt; Dies dient als Anker, wenn die kurze Seite des Drahtes implantiert und in das DIAM vernäht wird.
    5. Entfernen Sie mit einem Skalpell und einem chirurgischen Dissektionszielfernrohr vorsichtig 2 mm Isolierung unmittelbar neben dem Knoten an der kürzeren Seite des Drahtes. Achten Sie darauf, dass Sie keine Litzen des mehrdrähtigen Drahtes durchtrennen.
      HINWEIS: Dieser nicht isolierte Teil dient als leitende Oberfläche der Elektrode. Im Allgemeinen beginnt sich die Signalqualität zu verschlechtern, wenn versehentlich drei oder mehr Litzen durchtrennt werden, und wenn dies der Fall ist, wird die Elektrode ausgetauscht.
    6. Als nächstes isolieren Sie ~5 mm vom Ende der kurzen Seite des Drahtes ab, der dann in das Lumen einer 25-G-Nadel eingeführt wird, um ein nahtfadenartiges Werkzeug herzustellen, mit dem die Elektrode in das DIAM implantiert wird.
      HINWEIS: Je nach persönlicher Vorliebe können auch Nadeln mit höherer Stärke (z. B. bis zu 28 G) verwendet werden. Aufgrund des dünneren Durchmessers von Nadeln mit höherer Feinheit kann das Risiko eines Pneumothorax möglicherweise verringert werden. Es kann aber auch schwieriger sein, die mehrdrähtigen Drähte in das kleinere Lumen der Nadel einzuführen.
    7. Nehmen Sie dazu eine 25-G-Nadel aus der Verpackung und biegen Sie die Nadel mit beiden Zangen vorsichtig in einem Abstand von ~1 cm vom scharfen, abgeschrägten Ende von einer Seite zur anderen, bis sie bricht.
      HINWEIS: Dieser Vorgang darf nicht überstürzt werden. Andernfalls können die Scherkräfte dazu führen, dass sich das Lumen der Nadel schließt, so dass der Vorgang wiederholt werden muss.
    8. Führen Sie das abisolierte Ende des Drahtes in das Lumen der abgebrochenen 1 cm langen Nadel ein, wobei Sie darauf achten, dass die Nadel unmittelbar neben dem verbleibenden isolierten Teil des Drahtes aufliegt.
    9. Stellen Sie sicher, dass sich kein unisolierter Teil zwischen der Nadel und der verbleibenden kürzeren Seite des Drahtes befindet, und crimpen Sie die Nadel, um sie am Draht zu befestigen.
    10. Biegen Sie anschließend mit den beiden Zangen die angebrachte Nadel vorsichtig, um ihr eine Krümmung zu verleihen, die der einer normalen chirurgischen Nahtnadel ähnelt.
    11. Zum Schluss isolieren Sie ~5 mm vom Ende der langen Seite des Drahtes ab (Abbildung 3). Nachdem die Elektroden in das DIAm eingenäht wurden, wird die lange Seite des Drahtes für den externen Zugang getunnelt, um DIAm EMG-Aufzeichnungen zu ermöglichen.
    12. Wiederholen Sie den Vorgang, um eine zweite Elektrode für differentielle Aufnahmen herzustellen.
  2. Platzierung der Membran-EMG-Elektrode
    1. Sterilisieren oder autoklavieren Sie vor der Operation alle chirurgischen Geräte, einschließlich (1) Haarschneider für kleine Tiere, (2) Skalpell mit #11-Klinge, (3) chirurgische Schere, (4) Pinzette und (5) Mikronadelhalter.
    2. Besorge dir einen sauberen Käfig und sorge für Futter, Wasser, Einstreu und Umweltbereicherung. Auf einem Heizkissen beiseite stellen. Dieser Käfig wird verwendet, um das Tier nach der Operation unterzubringen.
    3. Sterilisieren Sie das Operationsfeld mit geeignetem Desinfektionsmittel und ziehen Sie persönliche Schutzausrüstung (Kittel, Mützen, Maske und OP-Handschuhe) an. Legen Sie die zuvor vorbereiteten Elektroden in einen Pool mit 70%igem Isopropylalkohol.
    4. Legen Sie ein Heizkissen in den Operationsbereich, um die Körpertemperatur der Ratte während der Anästhesie und Operation zu halten. Decken Sie das Heizkissen mit einem sterilisierten chirurgischen Handtuch ab.
    5. Wiegen Sie die Ratte und berechnen Sie die geeignete Anästhesiedosis auf der Grundlage der institutionellen Tierhaltungs- und Verwendungsrichtlinien.
    6. Betäuben Sie die Ratte mit einer intramuskulären Injektion von Ketamin (80 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) oder einem anderen geeigneten Anästhetikum (gemäß den institutionell anerkannten Protokollen). Injizieren Sie präoperativ Buprenorphin (1 mg/kg) und Carprofen (5 mg/kg) mit verlängerter Freisetzung. Fahren Sie fort, sobald das Tier nicht mehr auf das Einklemmen der Zehen reagiert.
    7. Rasieren Sie die Ratte mit einer Schermaschine vom Xiphoid-Prozess bis etwa zur Hälfte der Hintergliedmaßen. Rasieren Sie auch den Rücken der Ratte, wo die Elektroden außerhalb der Reichweite des Tieres nach außen geführt werden (normalerweise um die Schulterblätter herum). Reinigen Sie überschüssiges Haar mit einem Stück Gaze.
    8. Bereiten Sie die Haut auf den Schnitt vor, indem Sie sie mit steriler Gaze reinigen, die in Chlorhexidingluconat (4 Vol.-%) getaucht ist.
    9. Legen Sie das Tier in Rückenlage auf das sterilisierte Heizkissen. Beginnend mit dem Xiphoid-Prozess verwenden Sie das Skalpell und eine saubere #11-Klinge, um einen 4-5 cm langen rostrocaudalen Schnitt zu machen. Dadurch sollten die darunter liegenden Bauchmuskelschichten freigelegt werden.
    10. Machen Sie einen weiteren Schnitt (3-4 cm) entlang der Mittellinie in den Muskelschichten, um den Bauchinhalt freizulegen. Achten Sie darauf, dass Sie nicht in die Bauchorgane eindringen.
    11. Stellen Sie sicher, dass die abdominale (d. h. untere) Oberfläche des DIAm sichtbar ist, obwohl die rechte Seite des Tieres von der Leber verdeckt wird.
    12. Drücke mit einem Skalpellstiel oder einem anderen stumpfen Instrument die Leber und andere Organe nach unten, um die Bauchseite des DIAm freizulegen.
    13. Bereiten Sie die Elektrode für den Gebrauch vor, indem Sie sie aus dem Pool mit Isopropylalkohol nehmen und mit steriler Kochsalzlösung waschen. Richten Sie dann mit einem Mikronadelhalter eine der zuvor präparierten Elektroden senkrecht zu den Muskelfasern im mittleren Rippenbereich des DIAM aus. Die Muskelfasern verteilen sich radial über das DIAm.
      HINWEIS: Der DIAm ist dünn (~2 mm) und darf nicht durchstochen werden. Vielmehr besteht das Ziel darin, den unisolierten Teil des Elektrodendrahtes (Abbildung 3) in das DIAm einzubetten.
    14. Führen Sie den Elektrodennahtdraht (Nadelende) vorsichtig mit dem Operationsmikroskop in das DIAM ein. Lassen Sie die Elektrode durch die Krümmung der Nadel in die Bauchfläche des DIAM hinein und dann wieder heraus führen, um sicherzustellen, dass der gesamte nicht isolierte Teil des Drahtes vollständig in den Muskel eingebettet ist.
    15. Ziehen Sie die Nadel vorsichtig durch, bis sich der Knoten im Draht im DIAm verankert. Stellen Sie sicher, dass der nicht isolierte Teil (2 mm) des Elektrodendrahtes vollständig innerhalb des DIAm liegt, mit einem Knoten an der Stelle, an der die Nadel zum ersten Mal in den DIAm eingetreten ist.
    16. Schneiden Sie dann die Nadel vom Elektrodendraht ab und entsorgen Sie sie in einem Behälter für scharfe Gegenstände.
    17. Binden Sie mit zwei Pinzetten einen Knoten an der Stelle, an der die Nahtnadel (3-0) aus dem DIAm austrat. Binden Sie dazu eine Schlaufe in die kurze Seite des Drahtes, schieben Sie die Schlaufe bis zur Bauchfläche des DIAm und ziehen Sie die Schlaufe vorsichtig zu einem Knoten fest. Die Elektrode (nicht isolierter Teil) sollte nun sowohl an ihrem Ein- als auch an ihrem Austrittspunkt verankert sein.
    18. Schneiden Sie den überschüssigen Teil der kürzeren Seite des Drahtes ab.
    19. Befolgen Sie die Schritte 1.2.14-1.2.18, um eine weitere Elektrode auf der gleichen Seite des DIAm, ~3 mm von der ersten entfernt, einzunähen.
    20. Führen Sie die Implantation eines Elektrodenpaares in das entgegengesetzte Hemmidiaphragma auf die gleiche Weise durch.
    21. Stellen Sie als Nächstes sicher, dass sich die längere Seite der Elektrodendrähte alle außerhalb der Bauchhöhle befindet, und beginnen Sie, die Muskelschichten zu nähen (3-0), um den Bauch zu schließen. Machen Sie für jedes Elektrodenpaar eine Schlaufe und verankern Sie sie.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass 2-3 cm Draht in der Bauchhöhle verbleiben, damit sich die Ratte dehnen kann, ohne die DIAm zu verspannen.
    22. Reinigen Sie überschüssiges Blut mit Kochsalzlösung und nähen Sie dann die Muskelschicht in einem kontinuierlichen Muster (3-0), um das Bauchfell zu schließen.
    23. Tunneln Sie einen 16-G-Katheter von der medialen Rückenhaut der Ratte durch die offene Bauchhaut und ziehen Sie ein Paar Elektrodendrähte durch den Rücken der Ratte.
    24. Wiederholen Sie den Vorgang mit einem zweiten Katheter auf der anderen Seite und ziehen Sie das zweite Paar Elektrodendrähte durch.
    25. Vernähen Sie die Bauchhaut mit einer 3-0-Naht in einem unterbrochenen Nahtmuster.
    26. Binden Sie als Nächstes für jedes Paar die Elektrodendrähte zu einem Knoten und nähen Sie sie fest.
    27. Geben Sie dem Tier eine subkutane Kochsalzinjektion (~1 ml pro 50 g Tiermasse). Setzen Sie das Tier in einen sauberen Käfig über einem Heizkissen, damit es sich erholen kann.
      HINWEIS: Die Laparotomie kann zu einer Hemmung der DIAM-Aktivität führen35,36. Warten Sie mindestens 72 Stunden, bevor EMG-Messungen quantitativ analysiert werden.

2. Halswirbelsäulen-Hemisektion

  1. Bereiten Sie den sterilen Operationsbereich wie bisher vor.
  2. Vor der Operation alle chirurgischen Geräte autoklavieren oder sterilisieren. Erforderliche Ausrüstung: (1) Haarschneider für kleine Tiere, (2) Skalpell mit #11 Klinge, (3) chirurgische Schere, (4) Pinzette, (5) Rongeure, (6) Retraktoren, (7) abgewinkeltes Präpariermesser.
  3. Etwa 72 Stunden nach der Implantation der DIAm EMG-Elektrode wiegen Sie die Ratte und berechnen Sie die geeignete Anästhesiedosis auf der Grundlage der institutionellen Tierhaltungs- und Verwendungsrichtlinien.
  4. Bevor Sie die Ratte betäuben, setzen Sie sie in einen Bowman-ähnlichen Käfig und zeichnen Sie ein bilaterales DIAm-EMG auf, wie in Schritt 3.2 beschrieben.
  5. Betäuben Sie die Ratte mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin (80 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) oder einem anderen geeigneten Anästhetikum gemäß dem Protokoll des örtlichen Institutional Animal Care and Use Committee. Präoperativ ist Buprenorphin (1 mg/kg) mit verlängerter Freisetzung subkutan und Carprofen (5 mg/kg) intraperitoneal zu injizieren.
  6. Fahren Sie fort, sobald das Tier nicht mehr auf das Einklemmen der Zehen reagiert. Überprüfen Sie die Narkosetiefe mit einer Zehenkneifung etwa alle 15 Minuten.
  7. Bringen Sie die Ratte vor Beginn der Operation in Bauchlage und zeichnen Sie das EMG bei der anästhesierten Ratte auf, wie in Schritt 3.3 beschrieben.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle Aufnahmen mit der Ratte in derselben Position durchgeführt werden.
  8. Rasieren Sie die Haare vom Hals etwa auf Höhe des Ohres bis hinunter zu den Schulterblättern und entfernen Sie sie mit feuchter Gaze.
  9. Reinigen Sie die Haut mit Chlorhexidingluconat (4 % Vol.-%) und decken Sie das Tier mit sterilen chirurgischen Abdeckungen ab (mit Ausnahme des oberen Rückens).
  10. Machen Sie mit einem Skalpell einen 4 cm langen rostro-kaudalen Schnitt. Ziehen Sie die Haut zurück und schneiden Sie den Musculus acromiotrapezius ab. Präparieren Sie dann den Rautenmuskel, um die Spinalis-Muskeln freizulegen.
    HINWEIS: Der Akromiotrapezius ist der mittlere Trapezmuskel, und seine Muskelfasern verlaufen ungefähr parallel zur Wirbelsäule. Der Rautenmuskel ist in der Ebene unterhalb des Schulterdachs freigelegt und seine Muskelfasern verlaufen diagonal.
  11. Ziehen Sie die Wirbelsäulenmuskulatur von C1 nach C3 zurück.
    HINWEIS: Die Spinalismuskulatur verläuft unmittelbar neben der Wirbelsäule.
  12. Führen Sie vorsichtig eine Laminektomie an C2 mit einem Rongeur durch, während Sie durch ein Operationsmikroskop schauen, um sicherzustellen, dass keine großen Arterien oder Nerven beschädigt werden.
  13. Die Dura mater bei C 2 einschneiden und einziehen.
  14. Verbinden Sie freiliegende Elektrodendrähte vom Rücken der Ratte mit dem Verstärker, während Sie die Wirbelsäulenhälfte durchführen. Weitere Informationen finden Sie in Schritt 3.
  15. Führen Sie bei der Überwachung des DIAm-EMG das abgewinkelte Präpariermesser knapp unterhalb des Punktes ein, an dem die dorsale Wurzel in das Rückenmark eintritt, und schneiden Sie es bis zum Mittelpunkt der ventralen Fläche durch, wie in Abbildung 2A gezeigt.
    HINWEIS: Wenn Sie ein elektronisches Heizkissen verwenden, kann es erforderlich sein, dieses während der EMG-Überwachung auszuschalten, um Geräusche zu vermeiden.
  16. Stellen Sie innerhalb von Sekunden nach diesem Schnitt sicher, dass die eupneische DIAm-EMG-Aktivität ipsilateral der Verletzung aufhört und ein kompensatorischer Anstieg der cDIAm-EMG-Aktivität erkennbar ist (Abbildung 2C).
  17. Wenn die EMG-Aktivität von eupneic iDIAm anhält, führen Sie einen weiteren Schnitt mit dem Präpariermesser durch, wie in Abbildung 2C dargestellt. Schneiden Sie jedoch nicht über die Mittellinie; Das Schneiden auf die kontralaterale Seite führt höchstwahrscheinlich zum Tod des Tieres.
  18. Vernähen Sie die Muskeln und dann die Haut mit sterilen Nähten (3-0).
  19. Um die Flüssigkeitszufuhr aufrechtzuerhalten, injizieren Sie subkutan 1 ml Kochsalzlösung pro 50 g Tiermasse und setzen Sie das Tier zur Erholung in einen sauberen Käfig mit einem Heizkissen. Überwachen Sie das Tier, während es sich von der Operation erholt.
  20. Etwa 72 Stunden später (Tag 3 Post-C2SH) zeichnen Sie die EMG-Aktivität bei wachen Ratten gemäß dem Protokollschritt 3.2 auf. Achten Sie darauf, die Stiche am Rücken der Ratte nicht zu beschädigen.
  21. Als nächstes betäuben Sie die Ratte erneut (gemäß den institutionell anerkannten Protokollen) mit einer geringeren Dosis Anästhetikum, als für eine chirurgische Ebene erforderlich wäre (zwischen 1/3 und 1/2 einer normalen Dosis). Zusätzliche Dosen können verabreicht werden, solange die Ratten einen intakten Hornhautreflex zeigen und auf das Einklemmen der Zehen reagieren.
  22. Überwachen Sie die DIAm-EMG-Aktivität gemäß Protokollschritt 3.
    HINWEIS: Platzieren Sie die Ratte in der gleichen Position, die für die Erstbeurteilung der iDIAm EMG-Aktivität verwendet wurde.
  23. Wenn an Tag 3 keine eupnoische iDIAm-EMG-Aktivität (d. h. Aktivität in Phase mit inspiratorischer cDIAm-EMG-Aktivität) vorhanden ist, schließen Sie daraus, dass die anfängliche C2SH erfolgreich war, und beziehen Sie dasselbe Tier für weitere Analysen ein.

3. Datenerfassung und -analyse

  1. Allgemeine Einstellungen und Datenextraktion
    1. Stellen Sie die Bandpassfilter des Vorverstärkers auf 100 Hz (Hochpass) und 1000 Hz (Tiefpass) ein.
      HINWEIS: Diese Filtereinstellungen eliminieren Bewegungsartefakte und reduzieren deutlich das 60-Hz-Rauschen und die EKG-Kontamination (die eine Spitzenleistung von ~75 Hz aufweist), während der überwiegende Teil des Frequenzinhalts des intramuskulären DIAM-EMG-Signals erhalten bleibt. Basierend auf der Nyquist-Theorie digitalisieren Sie mit einer Abtastfrequenz von 2000 Hz, um Aliasing zu vermeiden und eine angemessene Auflösung zu ermöglichen, um die Aktivität der motorischen Einheit im zusammengesetzten EMG zu erfassen. Wenn Sie spezielle Frequenzgehaltsanalysen für den Frequenzbereich unter 100 Hz durchführen, ist es wichtig, die Filtereinstellungen des Vorverstärkers so einzustellen, dass die interessierenden Frequenzen nicht gefiltert werden.
    2. Überwachen Sie zwei Kanäle (linkes und rechtes Hemidiaphragma-EMG) in einer Visualisierungssoftware auf einem Computer und speichern Sie die Daten in einem geeigneten Format für weitere Analysen.
    3. Sammeln Sie mindestens 1-2 Minuten an eupneischen Aufnahmen, um genügend Daten für Analysen zu haben.
    4. Stellen Sie sicher, dass die Daten zu drei oder mehr Zeitpunkten erfasst werden:
      1. Vor C2SH ist eine eupneische Ausgangsaufzeichnung im Wachzustand und in Anästhesie zu erstellen.
      2. Während der C2SH-Operation zur Feststellung einer Stummschaltung der eupnoischen iDIAm EMG-Aktivität unter narkotisierten Bedingungen.
      3. An Tag 3 nach C2SH, um zu bestätigen, dass das Fehlen einer eupneischen iDIAm-EMG-Aktivität anhält, und um einen ersten Punkt für das Ausmaß des Defizits bei wachen Tieren zu ermitteln, das nicht so stark durch einen Spinalschock beeinflusst wird 2,39 oder die Verabreichung von Atemdepressiva wie Buprenorphin.
    5. Analysieren Sie die DIAm EMG-Aufzeichnungen mit einer beliebigen Software, die Berechnungen mit digitalisierten Signalen ermöglicht (z. B. Matlab, Python, R). Der grundlegende Prozess ist wie folgt:
      1. Laden Sie die rohen EMG-Dateien. Abhängig von den Filtereinstellungen kann es erforderlich sein, einen DC-Offset im Signal zu berücksichtigen.
        HINWEIS: Eine einfache Lösung besteht darin, den Mittelwert des rohen EMG-Signals von sich selbst zu subtrahieren.
      2. Berechnen Sie den Mittelwert des Quadrats des EMG-Signals mit einem gleitenden Fenster von 50 ms. Dies kann erreicht werden, indem ein 50-ms-Berechnungsfenster jeweils um einen Abtastpunkt nach vorne verschoben wird, bis das Ende des Signals erreicht ist.
        HINWEIS: Analysen einzelner DIAm-EMG-Ereignisse bieten die größte statistische Aussagekraft und ermöglichen eine Clusterbildung von eupneischer und nicht-eupneischer Aktivität. Daher ist die Erkennung des Beginns und der Verschiebung einzelner Atemzüge im DIAm-EMG von größter Bedeutung, wie in einem früheren Berichthervorgehoben wurde 40.
    6. Führen Sie die Filterung der eupneischen Aktivität durch, indem Sie die Histogramme der momentanen Atemfrequenz und der Burst-Dauer visualisieren, wie in einem früheren Berichtgezeigt 41.
  2. Wache Aufnahmen.
    1. Führen Sie Wachaufnahmen durch, indem Sie Ratten in einen Nagetierkäfig im Bowman-Stil setzen. Ein zylindrischer Käfig im Bowman-Stil kann erwachsene Ratten bis zu 750 g aufnehmen.
    2. Schrauben Sie die Metallstangen an einer Seite des Käfigs im Bowman-Stil ab und locken Sie die Ratte vorsichtig hinein. Schrauben Sie die Metallstangen wieder an und fangen Sie die Ratte im zylindrischen Käfig ein.
      HINWEIS: Gewöhnen Sie die Ratten mindestens 30 Minuten lang an den Käfig, bevor Sie mit der Aufnahme fortfahren. Wenn möglich, ist es am besten, Ratten mehrere Tage lang an den Bowman-Käfig zu gewöhnen, bevor sie gemessen werden. Es empfiehlt sich, den Ratten während dieser Eingewöhnungsphase Leckerlis zu geben, während sie sich im Käfig befinden.
    3. Um äußere visuelle Reize zu minimieren, verwenden Sie ein Papiertuch oder einen ähnlichen Gegenstand, um ein Zelt um die Vorderseite des Käfigs zu bauen, wo sich der Kopf der Ratte befindet. Minimieren Sie außerdem laute Geräusche und sorgen Sie an allen Stellen für den körperlichen Komfort der Ratte.
      HINWEIS: Offensichtliche Anzeichen von Unbehagen sind Zappeln, schnelles Atmen und das Kämpfen gegen den Käfig. Wenn eines dieser Anzeichen beobachtet wird, kann es erforderlich sein, die Ratte in den Heimkäfig zurückzubringen und Aufnahmen zu machen, wenn die Ratte ruhiger ist.
    4. Bei kleineren Ratten (<300 g) fülle Füllstoffe (z. B. Papiertuch, Wattebällchen) in zusätzliche Lücken im Käfig ein, um die Ratte davon abzuhalten, sich um 180 Grad zu drehen.
    5. Nachdem sich die Ratte akklimatisiert hat, verbinden Sie vorsichtig die Drähte, die aus dem Rücken der Ratte austreten, mit einem Vorverstärker, der die analogen Signale in einen Analog-Digital-Wandler einspeist, und befolgen Sie die in Schritt 3.1 beschriebenen Verfahren.
  3. Anästhesierte Aufnahmen
    1. Platzieren Sie Ratten jedes Mal in der gleichen Position, vorzugsweise in Bauchlage, um die Wachhaltung der Ratte besser nachzuahmen.
    2. Verbinden Sie die Drähte, die aus dem Rattendorsum austreten, mit einem Vorverstärker, der die analogen Signale in einen Analog-Digital-Wandler einspeist, und befolgen Sie die in Schritt 3.1 beschriebenen Verfahren.
  4. Rückgewinnung von Tieren
    1. Setzen Sie Ratten in einen leeren, sauberen Rattenkäfig ohne Einstreu zur Erholung.
    2. Stellen Sie den Käfig auf ein Heizkissen.
    3. Überwachen Sie die Ratte in regelmäßigen Abständen (<15 Minuten) während der ersten 3 Stunden oder bis die Ratte beginnt, sich zu bewegen. Überwachen Sie in weniger regelmäßigen Abständen (30 Minuten), bis das Tier wieder wach ist.
    4. Nachdem die Ratte gehfähig ist, setzen Sie sie in einen sauberen Käfig mit Einstreu, Zugang zu Futter und Wasser und Bereicherung für die Umgebung.
    5. Überwachen Sie die Ratte während des gesamten Verlaufs des Versuchs mindestens einmal täglich. Achten Sie besonders auf Veränderungen des Gewichts/der Ernährungsfähigkeit sowie auf die Unversehrtheit der Inzisionsstellen und Nähte.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der in diesem Artikel vorgestellte Ansatz minimiert die Variabilität zwischen den Operatoren, indem er klare Kriterien für die Bewertung der DIAm-EMG in einem Rattenmodell von C2SH festlegt. Zunächst muss die Beendigung der eupneischen iDIAm EMG-Aktivität unmittelbar nach C2SH beobachtet werden, wie in Abbildung 2 gezeigt. Ist dies nicht der Fall, kann eine zweite Durchtrennung durchgeführt werden, bis die eupneische iDIAm-Aktivität verschwindet. Zweitens muss an Tag 3 nach C2SH die anhaltende Abwesenheit von eupneischem iDIAm EMG überprüft werden, während die Tiere anästhesiert werden. Abbildung 4A zeigt ein Beispiel für eine erfolgreiche C2SH, die durch das anhaltende Fehlen von eupneischer iDIAm EMG-Aktivität unter Narkose am Tag 3 nach der Verletzung bestimmt wurde. Abbildung 4B zeigt die DIAm-EMG-Aktivität bei ein und demselben Tier unter nicht anästhesierten Wachbedingungen, was die Verringerung – aber nicht das Fehlen – der iDIAm-Aktivität im Vergleich zum Ausgangswert vor der Verletzung hervorhebt. Bemerkenswert ist, dass die cDIAm-EMG-Aktivität sowohl im Wachzustand als auch im anästhesierten Zustand erhöht ist. Die anästhesierten Aufzeichnungen an Tag 3 bestätigen, dass die anfängliche C2SH erfolgreich war, aber quantitative Analysen sollten bei wachen Tieren durchgeführt werden. Bei wachen Tieren stellt die DIAm-EMG-Aktivität an Tag 3 nach C2SH den Ausgangspunkt für die Genesung dar. Abbildung 4B zeigt, dass die iDIAm-EMG-Aktivität an Tag 3 bei wachen Ratten reduziert, aber nicht abwesend ist.

In einigen Fällen geht C2SH nicht mit einer vollständigen Beendigung der eupneischen iDIAm EMG-Aktivität einher (Abbildung 5A). Eine inadäquate C2SH tritt in weniger als 5% aller Fälle bei Anwendung des in der vorliegenden Handschrift skizzierten Ansatzes auf; Es ist jedoch wichtig, dass eine Bewertung der DIAm-EMG-Aktivität an Tag 3 nach C2SH an jeder Ratte durchgeführt wird, um den Erfolg der C2SH zu validieren. Abbildung 5A zeigt ein Beispiel für die DIAm EMG-Aktivität einer Ratte an Tag 3 nach der Verletzung, bei der die C2SH die eupneische iDIAm EMG-Aktivität bis zum Tag 3 nicht ausreichend eliminierte. Es ist wichtig zu beachten, dass die Validierung der Wirksamkeit des C2SH durchgeführt wurde, während das Tier anästhesiert wurde. Die anhaltende eupneische EMG-Aktivität deutet darauf hin, dass zumindest ein Teil des absteigenden ipsilateralen bulbospinalen Signalwegs verschont blieb, was die Interpretation der Ergebnisse erschweren kann. Abbildung 5B zeigt, dass die iDIAm-EMG-Aktivität an Tag 3 bei wachen Ratten reduziert, aber nicht fehlend ist. Die Schonung von ipsilateral absteigenden Einträgen kann jedoch das anfängliche Defizit verringern.

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Abbildung 1: Konzeptioneller Rahmen. Die rostrale ventrale Respiratorische Gruppe (rVRG) sendet absteigende Eingaben an phrenische Motoneuronen im zervikalen Rückenmark (C3-C 5). Die Mehrzahl dieser absteigenden Axone innerviert den ipsilateralen phrenischen Motoneuronenpool, aber ein kleiner Teil überquert die Mittellinie, um den kontralateralen Motoneuronenpool zu aktivieren. Unmittelbar nach einem C2SH sind die absteigenden Eingänge vom rVRG in den ipsilateralen phrenischen Motoneuronenpool gestört. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Repräsentative C2SH- und DIAm EMG-Aktivität. (A) Dargestellt ist die Queransicht des Rückenmarks und der Tran-Stelle der Ratte (rot schattiert) mit wichtigen Strukturen, die beschriftet sind. Die Wirbelsäulenläsion wird durchgeführt, indem ein Präpariermesser direkt unter der Stelle, an der die dorsale Wurzel eintritt, eingeführt und bis etwa zur Mittellinie (schattierter durchscheinender roter Bereich) durchgeschnitten wird. Man beachte die Durchtrennung der großen motorischen Bahnen in den lateralen und ventralen Funiculi, aber die Schonung der dorsalen Funiculi. (B) Die Längsschnittansicht, die die Stilllegung der ipsilateralen Motoneuronenaktivität darstellt, ergänzt die rohen EMG-Spuren, die zur Echtzeitbestätigung einer zufriedenstellenden Läsion verwendet werden (C). Wenn das Rückenmark läsioniert wird, hört die eupneische iDIAm-EMG-Aktivität auf, was darauf hindeutet, dass ipsilaterale Inputs zu phrenischen Motoneuronen durchtrennt wurden. In der Zwischenzeit erhöht das cDIAm EMG sofort seine Aktivität, wie gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Elektrodenherstellung. Gezeigt wird der Prozess zur Herstellung von DIAm EMG-Elektroden. Der grundlegende Prozess umfasste das Messen und Schneiden einer geeigneten Drahtlänge (Schritt 1), das Binden eines Verankerungsknotens und das Abisolieren der Wegisolierung, um die Elektrode freizulegen (Schritt 2), das Anbringen einer 25-Gauge-Nadel am Draht (Schritte 3 und 4), das Biegen der Nadel, um ihr eine Krümmung ähnlich einer chirurgischen Nahtnadel zu verleihen (Schritt 5). und Entfernen der Isolierung, um einen Teil des Kabels freizulegen, der für die Aufzeichnung von EMG mit dem Verstärker verbunden wird (Schritt 6). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Erfolgreiche Wirbelsäulenhemisektion. (A) Die DIAm-EMG-Aktivität zeigt sich bei einer anästhesierten Ratte vor C2SH und an Tag 3 nach der Verletzung. Es gibt keine Hinweise auf eine eupneische iDIAm-EMG-Aktivität bei dieser Ratte am Tag 3 nach der Verletzung, was darauf hindeutet, dass die anfängliche C2SH erfolgreich war. Beachten Sie die kompensatorische Erhöhung der cDIAm-EMG-Aktivität und die Erhöhung der Atemfrequenz im Vergleich zum Zustand vor der Verletzung. (B) Die DIAm-EMG-Aktivität wird bei derselben Ratte unter nicht anästhesierten Wachbedingungen an Tag 3 nach C2SH gezeigt. Es gibt klare Hinweise auf eine reduzierte, wenn auch nicht vollständig zum Schweigen gebrachte iDIAm-EMG-Aktivität. Beachten Sie die kompensatorische Erhöhung der cDIAm-EMG-Aktivität und die Erhöhung der Atemfrequenz im Vergleich zum Zustand vor der Verletzung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5: Erfolglose spinale Hemisektion. (A) Die DIAm-EMG-Aktivität wird bei einer anästhesierten Ratte vor C2SH und an Tag 3 nach der Verletzung gezeigt. Bei dieser Ratte blieb die eupneische iDIAm-EMG-Aktivität an Tag 3 nach der Verletzung bestehen, was darauf hindeutet, dass das anfängliche C2SH unzureichend war. Dementsprechend wurde diese Ratte von weiteren Analysen der funktionellen Erholung ausgeschlossen. Zu beachten ist die kompensatorische Erhöhung der cDIAm-EMG-Aktivität trotz erfolgloser C2SH, aber minimaler Anstieg der Atemfrequenz. (B) Die DIAm-EMG-Aktivität zeigt sich im selben Lauf unter unanästhesierten Wachbedingungen an Tag 3 nach C2SH. Es gibt Hinweise auf ein vermindertes iDIAm-EMG, eine erhöhte cDIAm-EMG-Aktivität und einen leichten Anstieg der Atemfrequenz. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C2 Hemisektion der Wirbelsäule
Das in diesem Artikel beschriebene Verfahren konzentriert sich auf die Beurteilung der DIAm-EMG-Aktivität, die als Validierung einer C 2-Wirbelsäulenläsion dient, die die lateralen und ventralen Funiculi durchschneidet, während die dorsalen Funicul geschont werden (Abbildung 2A). Der vorgeschlagene chirurgische Ansatz hat zwei wesentliche Vorteile. Erstens werden die dorsalen Funikuli geschont, die bei Ratten die ambulante Funktion erhalten, während die ipsilateralen Inputs zu den phrenischen Motoneuronen immer noch unterbrochen werden. Zweitens können wir durch die Überwachung des DIAm-EMG die Wirksamkeit der C 2-Läsion bei der Eliminierung der eupneischen iDIAm-EMG-Aktivität zunächst während der Operation validieren, während die Tiere anästhesiert sind. An Tag 3 nach der Verletzung, während die Tiere narkotisiert werden, überprüfen wir, ob die eupneische iDIAm-EMG-Aktivität tatsächlich weiterhin stummgeschaltet wird. Es wurde bereits gezeigt, dass die exzitatorischen rVRG-Inputs auf phrenischen Motoneuronen und die NMDA-Rezeptorexpression in phrenischen Motoneuronen 3 bis 7 Tage nach der Verletzung reduziert sind und dass sowohl der glutamaterge synaptische Input als auch die NMDA-Rezeptorexpression im Laufe der Zeit 7 Tage nach der Verletzung zunehmen33,42. Diese Daten, kombiniert mit der histologischen Bestätigung der C 2-Läsion 10,13,29,30,33, deuten darauf hin, dass eine fortgesetzte Inaktivität unter Narkose am Tag 3 nach der Verletzung Aufschluss über die Wirksamkeit der anfänglichen C 2 SH gibt. In Studien, die über mehrere Jahre hinweg durchgeführt wurden, wurden 14 Tage nach C 2 SH relativ stabile Raten der spontanen Genesung unter Narkose zwischen 30 % und 40 % beobachtet 18,19,20,29,31,43, was darauf hindeutet, dass diese Methode zur Überprüfung des Erfolgs des C2SH reproduzierbar und zuverlässig ist.

Das C2SH-Verfahren umfasst mehrere kritische Schritte. Wichtig ist, dass das hier vorgeschlagene C2SH-Modell die dorsalen Funiculus schont und somit nicht zu motorischen Defiziten der Gliedmaßen führt. In vollständigen C 2-Wirbelsäulenhemisektionsmodellen, an denen die dorsalen Funikuli beteiligt sind, sind die motorischen Defizite der Gliedmaßen erheblich größer 3,4,5,6,7,37. Ein zusätzlicher Vorteil des C2SH-Modells (Abbildung 2A) besteht daher darin, dass neben der Stummschaltung der eupneischen iDIAm EMG-Aktivität bei anästhesierten C2 -läsionierten Ratten die Ratten in Bezug auf die Gehfähigkeit und andere Funktionen funktionell ähnlich wie Scheinlaminektomie-Ratten sind. Dementsprechend sind sie in der Regel in der Lage, sich selbst zu füttern und zu pflegen, was die Pflegebelastung reduziert und gleichzeitig Studien zur neuromotorischen Kontrolle und zur respiratorischen Neuroplastizität von DIAm ermöglicht. Um sicherzustellen, dass das C2-Modell angemessen implementiert wird, muss große Sorgfalt darauf verwendet werden, übermäßige Läsionen zu vermeiden. Das Präpariermesser direkt unterhalb der Stelle, an der die Rückenwurzel in das Rückenmark eintritt, einzuführen und den ventralen Teil sparsam zu durchtrennen, sind hilfreiche Faustregeln. Ziel ist es, sicherzustellen, dass die EMG-Aktivität von eupneic iDIAm eingestellt wird. Dies kann bei Bedarf mit mehreren kleinen Schnitten erfolgen. In der Tat wird sich in der Woche nach der C2SH zeigen, ob es zu einer übermäßigen Schädigung des Rückenmarks gekommen ist, wenn die Tiere Schwierigkeiten haben, zu gehen und nach Futterpellets zu greifen.

Elektrodenplatzierung und EMG-Aufzeichnungen
Chronische DIAm EMG-Elektroden haben mehrere klare Vorteile gegenüber anderen Ansätzen. Elektroden können (und sollten) einige Tage vor dem C2SH-Eingriff implantiert werden, so dass genügend Zeit für die Genesung bleibt und keine Laparotomie und C2SH während derselben chirurgischen Sitzung erforderlich sind. Dies ist wichtig, da allgemein anerkannt ist, dass die Laparotomie eine Hemmung der DIAmbewirkt 35,36. Durch die Implantation chronischer DIAM-Elektroden sind auch keine wiederholten Laparotomien erforderlich, wie sie in früheren Arbeiten durchgeführt wurden 10,13; Es besteht auch ein verringertes Risiko für einen Pneumothorax, da die Elektroden nicht bei jeder Sitzung in das DIAm eingeführt werden. Es können jedoch mehrere potenziell schwerwiegende unerwünschte Ereignisse als Folge der Elektrodenplatzierung auftreten. Obwohl das Risiko eines Pneumothorax durch die Vermeidung wiederholter Elektrodeneinführungen verringert wird, wird es nicht vollständig aufgehoben, und in der Tat kann ein Pneumothorax auftreten, der entweder zum sofortigen Tod oder zu anhaltenden Problemen führt. Um dieses Risiko zu verringern, empfiehlt es sich, sicherzustellen, dass die Nadel, die durch das DIAm gefädelt wird, die obere Oberfläche des DIAm nicht perforiert. Vermeiden Sie außerdem die Verwendung einer scharfen Pinzette, die das DIAm beschädigen könnte, während die Elektrodendrähte manipuliert werden. Gelegentlich können die Ratten die Stiche an ihrem Bauch kauen und sich möglicherweise selbst ausweiden, wenn sie sich selbst überlassen werden. Ratten sollten in regelmäßigen Abständen nach dem Platzieren der Elektrode beobachtet werden, um diese Art von Verhaltensweisen frühzeitig zu erkennen. In einigen Fällen kann es möglich sein, die Ratten zu betäuben, um Schäden an den Nähten zu reparieren. Es ist jedoch am besten, wenn ein solches Verhalten durch eine angemessene Schmerzlinderung während und nach der Operation gemildert wird und sichergestellt wird, dass das sterile Feld während der Operation nicht unterbrochen wird. In extremen Fällen kann es notwendig sein, Ratten, die wiederholt ihre Fäden ziehen, einzuschläfern.

Die Aufzeichnung und Analyse der EMG-Signale steht nicht im Vordergrund der vorliegenden Studie und ist stark von den jeweiligen Geräten und der Software abhängig, die in jedem Labor zur Verfügung stehen. Obwohl die Geräteinformationen in der Materialtabelle enthalten sind, gibt es eine Vielzahl von Hardwareoptionen für die Verstärkung und Aufzeichnung der EMG-Aktivität, und die Einzelheiten hängen von einer Mischung aus Funktionen, Verfügbarkeit und Erschwinglichkeit für jedes Labor ab. Es gibt jedoch einige allgemeine Prinzipien der EMG-Aufzeichnung, die wichtig zu erwähnen sind. Ein potenzielles Problem ist die Bewegung oder Zerstörung implantierter Elektroden, was die quantitative Beurteilung des DIAm-EMG einschränken kann. Wenn sich die Elektroden von der DIAm gelöst haben oder wenn es den Ratten gelungen ist, die externen Drähte zu verbrauchen oder anderweitig zu beschädigen, ist es möglicherweise nicht möglich, die EMG-Aktivität aufzuzeichnen, oder der Geräuschpegel kann sich ändern. Dies kann vermieden werden, indem bestätigt wird, dass die Elektroden fest im DIAm befestigt sind und während der DIAm-Elektrodenplatzierung ein Signal mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) von ihnen aufgezeichnet werden kann. Darüber hinaus ist das Auslagern der Elektrodendrähte hoch am Rücken und das Abschneiden des überschüssigen Drahtes, so dass die Ratten keinen Zugang zu den Elektrodendrähten haben, förderlich für den Erfolg chronischer Elektroden. Als Alternative zu externen Drähten können Kopfkappen37 oder Telemetrie44, 45 sinnvolle Optionen sein. Beide Ansätze können Aufzeichnungen bei wachen Tieren leichter erhalten, sind aber möglicherweise etwas schwieriger umzusetzen als die einfache Externalisierung der mehrdrähtigen Drähte. Alle in der Nähe befindlichen elektronischen Quellen können potenziell Lärmquellen sein. Es ist von größter Bedeutung, dass alle Geräte angemessen geerdet sind, abgeschirmte Kabel verwendet werden und die Ratten während der aktiven Aufnahmen nicht berührt werden. Zusätzlich zum Ausschalten elektronischer Heizkissen während der Aufnahme müssen möglicherweise Leuchten, Geräte in der Nähe, elektrisch betriebene Operationstische und andere derartige Geräte vorübergehend ausgeschaltet werden, um geräuscharme Aufnahmen zu erzielen. Um Umwelteinflüsse zu minimieren, sollten elektronische Geräte, die für die DIAm EMG-Aufzeichnungen nicht eingeschaltet sein müssen, ausgeschaltet werden. Die Aufnahmen sollten nach Möglichkeit in einem elektrisch abgeschirmten Raum gemacht werden. Im Laufe der Zeit können Gewebevernarbungen und Fibrose um die DIAm EMG-Elektroden die Leitfähigkeit der Elektrode verringern und das SNR verringern. Darüber hinaus können selbst geringfügige Änderungen der Körperhaltung große Auswirkungen auf das DIAm EMG-Signal haben. Um diese potenziell komplizierten Probleme zu minimieren, sollte das DIAm-EMG daher mit den Ratten in der gleichen Haltung über die Aufnahmesitzungen hinweg aufgezeichnet werden.

Ein weiterer wichtiger Aspekt sind die Filter- und Sampling-Einstellungen. Die Art der Elektrode (d. h. intramuskulär vs. ösophageal/Oberfläche) ist äußerst relevant, wenn es darum geht, den Frequenzgehalt eines Signals und damit geeignete Hoch- und Tiefpassfilter für ein Signal zu bestimmen. Es wurde erheblicher Aufwand betrieben, um die optimalen Filter für das Oberflächen-/Ösophagus-DIAmEMG 46 zu bestimmen. Ähnliche Studien an der Ratten-DIAm wurden nicht durchgeführt, aber zuvor haben wir gezeigt, dass der gesamte Frequenzgehalt des DIAM-EMG, das mit chronischen intramuskulären Elektroden bei Ratten aufgezeichnet wurde, unter 1000 Hz lag, wobei die Schwerpunktfrequenz bei etwa 300 Hzlag 47. In einem direkten Vergleich der mittleren und medianen Frequenzen des Leistungsspektrums des Bizeps brachialis EMG beim Menschen, die sowohl über Oberflächen- als auch über intramuskuläre Elektroden erhalten wurden, fanden Christensen et al.48 heraus, dass sowohl die mittlere als auch die mediane Frequenz für intramuskuläre Elektroden im Vergleich zu Oberflächenelektroden etwa 3-fach höher waren. In der DIAm haben die Forscher Schwerpunktfrequenzen von etwa 100 Hz bei Verwendung von bipolaren Ösophaguselektrodenberichtet 49,50,51,52,53,54, was darauf hindeutet, dass die 300 Hz, die zuvor für intramuskuläre Elektroden bestimmt wurden, ungefähr dem gleichen Trend entsprechen, der von Christensen et al. gezeigt wurde.48. Trotzdem haben mehrere veröffentlichte Studien, in denen intramuskuläres DIAm-EMG in Nagetiermodellen verwendet wurde, ihre Hochpassfilter bei 300 Hz 4,37,55,56 platziert, und einige sind sogar bis zu 500 Hz 57 gegangen. Es ist unumstritten, dass ein solcher Filteransatz die Amplitude des DIAm EMG-Signals erheblich um mindestens die Hälfte reduzieren würde. Wir schlagen einen weitaus weniger destruktiven Ansatz vor: (1) Hochpassfilterung bei 100 Hz, da der Großteil des EKG-Leistungsspektrums unter 100 Hz liegt, während vergleichsweise wenig des DIAm EMG-Leistungsspektrums unter 100 Hzliegt 51,52, und (2) anschließende Entfernung des übrig gebliebenen EKGs durch Wellenformanpassung58. Daher können die geeigneten Filter für DIAm EMG für die meisten Studien zwischen 100 Hz und 1000 Hz eingestellt werden, mit einer Abtastfrequenz von mindestens 2000 Hz, um alle relevanten Merkmale in den Daten zu erfassen. Detaillierte Analysen des DIAm EMG können dann mit den in früheren Berichten 40,41,47,58 veröffentlichten Techniken durchgeführt werden.

Wache und betäubte Tiere
Insbesondere haben einige Studien gezeigt, dass C2SH-Modelle der cSCI nicht zu einer vollständigen Inaktivität von eupneic iDIAm EMGführen 23,37. In gewisser Weise ist dies nicht überraschend, da bereits festgestellt wurde, dass "Durchbruchs"-Aktivität bei Verhaltensweisen auftritt, die einen höheren Antrieb erfordern (z. B. tiefe Atemzüge und die Reaktion auf Atemwegsverschlüsse)4,7,29,42. Diese Daten deuten darauf hin, dass es wahrscheinlich nicht angemessen ist, das C2SH-Modell als ein echtes Modell kontinuierlicher Inaktivität zu betrachten. In der Tat scheint es, dass der Antrieb bei wachen Tieren hoch genug ist, um bereits vier Tage nach einer vollständigen C2SH37 eupneische iDIAm-EMG-Aktivität zu zeigen, obwohl sie einen Tag nach der Verletzung nicht konsistent vorhanden ist23. In allen Fällen unterdrückt die Anästhesie die iDIAm-Aktivität nach einer Hemisektion der oberen Halswirbelsäule, wie in früheren Berichten23,38 hervorgehoben und in Abbildung 4 und Abbildung 5 gezeigt. Es liegen keine veröffentlichten Daten zur DIAm-EMG-Aktivität bei wachen Ratten mit dem im vorliegenden Manuskript vorgeschlagenen C2SH mit verschonten dorsalen Funiculi vor (Abbildung 2A). Zukünftige Arbeiten sollen eine detaillierte Charakterisierung des zeitlichen Verlaufs der DIAm-EMG-Aktivität bei wachen Tieren mit diesem C2SH-Modell ermöglichen. Nichtsdestotrotz ist es immer noch ratsam, die anhaltende Abwesenheit von eupneischer iDIAm-Inaktivität am Tag 3 nach der Verletzung unter Narkose zu validieren, um die experimentellen Bedingungen nachzuahmen, unter denen das Rückenmark ursprünglich läsioniert/durchtrennt wurde. Wenn an Tag 3 nach der Verletzung eine eupneische iDIAm-EMG-Aktivität bei wachen Tieren vorhanden sein kann, wird darauf hingewiesen, dass selbst halbe Dosen von Anästhetika in der Regel zu einer vollständigen Beendigung der eupneischen iDIAm-EMG-Aktivität führen. Mit diesen Dosen sind die Tiere ruhig und ruhig. Zusätzlich zur Überprüfung der Stilllegung der eupnoischen iDIAm-EMG-Aktivität während C2SH und am Tag 3 nach der Verletzung wird empfohlen, das Rückenmark nach dem terminalen Experiment zu extrahieren, um die histologische Bestätigung der Lokalisation und des Ausmaßes des C2SHdurchzuführen 9,29,59. Die histologische Bestätigung der Verletzung – in Kombination mit der funktionellen Bestätigung der stillgelegten eupnoischen iDIAm EMG-Aktivität – liefert einen starken Beweis für eine erfolgreiche C2SH.

Der vorliegende Artikel stellt eine C2SH von cSCI bei Ratten vor, die zu einer sofortigen Stilllegung der eupnoischen iDIAm EMG-Aktivität mit anhaltender Stilllegung unter Narkose am Tag 3 nach der Verletzung führt. Aufgrund der Schonung des dorsalen Funiculus im C2SH-Modell, das im vorliegenden Manuskript vorgeschlagen wird, bleibt die motorische Funktion der Gliedmaßen erhalten, wodurch Off-Target-Effekte vermieden werden. Dies ermöglicht es, Längsschnittstudien zu den Auswirkungen einer hohen zervikalen Läsion auf die neuromotorische Kontrolle der DIAm bei Ratten durchzuführen, die ansonsten relativ gesund sind, wodurch der Pflegeaufwand für die Forscher minimal wird. Die Validierung der Inaktivität unter Narkose am Tag 3 nach der Verletzung stellt sicher, dass eine klare Ausgangsbasis für die Beurteilung des späteren Ausmaßes der Genesung des eupneischen iDIAm EMG geschaffen wird. Dieser Ansatz bietet eine rigorose, zuverlässige und reproduzierbare Methode, um eine C2SH bei Ratten durchzuführen. Dieses Modell hat das Potenzial, das Verständnis des zeitlichen Verlaufs der respiratorischen Neuroplastizität und seiner Überschneidung mit potenziellen therapeutischen Strategien erheblich zu verbessern.

Offenlegungen

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren weisen auf die NIH-Finanzierungsquelle (NIH R01HL146114) hin.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
25 G NadelCardinal Health1188825100Covidien Monoject Hypdermic Standard Nadeln: 25 G x 1" (0,508 mm x 2,5 cm) A
3-0 Vicryl Violet BraidedEthiconJ774D3-0 Fature
Adson-Brown ForcepsFine Science Tools11627-12Spitzenform: Gerade, Spitzen: Haifischzähne, Spitzenbreite: 1,4 mm, Spitzenabmessungen: 2 x 1,4 m, Legierung / Material: Edelstahl, Länge: 12 cm
Bowman Style CageBraintree ScientificPOR-530Gewichtsbereich: 250 bis 750 g; Maximale Länge: 9" (228 mm); Die Grundeinheit besteht aus 123 mm (.5") juwelenbesetztem Acryl
Castroviejo NadelhalterFine Science Tools12565-14Spitzenform: Gerade, Spitzenbreite: 1,5 mm, Klemmlänge: 10 mm, Verriegelung: Ja, Schere: Nein, Legierung / Material: Edelstahl, Länge: 14 cm, gezahnt:
Ja, Feature: Wolframkarbid-Clip-Kabel
1m TP AbgeschirmtBiopac Systems, IncLEAD110SAbgeschirmte Anschlussdrähte für
LabChartLabChart 7.3.8Datenaufzeichnungs-, Visualisierungs- und Analysesoftware für Mehrkanalaufzeichnungen und Echtzeitbewertungen
Datenanalyse-Software - Matlab 2023bMathworks, Inc.Version 23.2Universelle Programmiersprache für die Post-hoc-Analyse
PräpariermesserFine Science Tools10056-12Schneide: 4 mm, Dicke: 0,5 mm, Legierung / Material: Edelstahl, Länge: 12,5 cm, Klingenform: Abgewinkelt 30°;
Dumont #3 PinzetteFine Science Tools11293-00Stil: #3, Spitzenform: Gerade, Spitzen: Standard, Spitzenabmessungen: 0,17 x 0,1 mm, Länge: 12 cm, Legierung / Material: Dumostar
Elektromyogramm-VerstärkerBiopac Systems, IncEMG100CEMG-Verstärker
Friedman RongeurFine Science Tools16000-14Spitzenform: gebogen, Pfannengröße: 2,5 mm, Legierung / Material: Edelstahl, Länge: 13 cm, Gelenkwirkung: Single
Friedman-Pearson RongeursFine Science Tools16021-14Legierung / Material: Edelstahl, Länge: 14cm, Gelenkwirkung: Einzeln, Bechergröße: 1mm, Spitzenform: Gebogenes
isoliertes NetzteilmodulBiopac Systems, IncIPS100CBetrieb von Verstärkermodulen der Serie 100 unabhängig von der MP-Serie von Biopac Systems, Inc. Datenerfassungssystem
Kelly HemostatsFine Science Tools13019-14Spitzen: gezahnt, Spitzenbreite: 1,5 mm, Klemmlänge: 22 mm, Legierung / Material: Edelstahl, Länge: 14 cm, Spitzenform: gebogene
MesserküretteV. MuellerVM101-4414Spitze: Scharf, Spitzendurchmesser: 2 mm
Mikro-PräparierschereBiomedical Research Instruments, Inc.11-2420Länge: 4", Winkel: Gerade, Klingenlänge: 23 mm
mehradriger EdelstahldrahtCooner Wire, Inc.AS 631AWG 40; Gesamtdurchmesser: 0,011 mm (mit Isolierung), 0,008 mm (ohne Isolierung).
PowerLab 8/35ADInstrumentsPL3508Datenerfassungssystem
Skalpellklinge #11Fine Science Tools10011-00Klingenform: Abgewinkelt, Schneide: 20 mm, Dicke: 0.4 mm, Legierung / Material: Kohlenstoffstahl
Skalpellgriff #3Fine Science Tools10003-12Legierung / Material: Edelstahl, Länge: 12 cm
Sprague Dawley RatInotivBestellcode: 002Sprague Dawley gezüchtete Ratten (weiblich und männlich)
OperationsmikroskopOlympusSZ61Operationsmikroskop 
NahtschereGeorge Tiemann & Co.110-1250SBLegierung / Material: Edelstahl, Spitzenform: Gerade, Spitzen: Scharf/Blunt, Länge: 4,5"
Vannas FederschereFine Science Tools15000-08Spitzen: Scharf, Schneide: 2,5 mm, Spitzendurchmesser: 0,05 mm, Länge: 8 cm, Legierung / Material: Edelstahl, gezahnt: Nein, Spitzenform: Gerade
Weitlaner RetraktorCodman50-5647Zinken: 2 x 3 Blunt, Länge: 4,5"
.EMG-Datenerfassungssoftware

Referenzen

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