Methodenartikel

Isolierung von mesenchymalen Stammzellen aus der Nabelschnur mit hoher Ausbeute und geringer Schädigung

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DOI:

10.3791/66835

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5. Juli 2024

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1Beijing University of Chinese Medicine, 2Department of Central Laboratory, Shenzhen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, 3Obstetrical Department, Longgang District Maternity & Child Healthcare Hospital of Shenzhen City, 4Longgang Maternity and Child Institute of Shantou University, Medical College

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Studie stellt ein einzigartiges stumpfes Dissektionsverfahren vor, um die Integrität von Wharton-Gelee (WJ) zu erhalten, was zu weniger beschädigtem WJ und einer größeren Menge und Lebensfähigkeit der entnommenen mesenchymalen Stammzellen (MSCs) führt. Die Methode zeigt eine überlegene Ausbeute und Proliferationsfähigkeit im Vergleich zu herkömmlichen scharfen Dissektionsmethoden.

Zusammenfassung

Mesenchymale Stammzellen (MSCs) sind eine Population multipotenter Zellen mit bemerkenswerten regenerativen und immunmodulatorischen Eigenschaften. Wharton-Gelee (WJ) aus der Nabelschnur (UC) hat als herausragende Quelle für MSCs im biomedizinischen Bereich zunehmend an Interesse gewonnen. Es sind jedoch Herausforderungen wie das begrenzte Angebot und die mangelnde Standardisierung bestehender Methoden entstanden. In diesem Artikel wird eine neuartige Methode zur Verbesserung der MSC-Ausbeute vorgestellt, indem intaktes WJ aus der Nabelschnur präpariert wird. Bei der Methode wird die Epithelschicht durch stumpfe Dissektion entfernt, wodurch die Integrität des gesamten WJ erhalten bleibt und die Menge und Rentabilität der geernteten MSCs erhöht wird. Dieser Ansatz reduziert den WJ-Abfall im Vergleich zu herkömmlichen scharfen Dissektionsmethoden erheblich. Um die Reinheit der WJ-MSCs zu gewährleisten und den externen zellulären Einfluss zu minimieren, wurde ein Verfahren durchgeführt, bei dem die innere Spannung zum Abziehen des Endothels nach dem Umklappen des UC verwendet wird. Zusätzlich wurde die Petrischale während der Explantatkultur für kurze Zeit invertiert, um die Anheftung und das Zellwachstum zu verbessern. Vergleichende Analysen zeigten die Überlegenheit der vorgeschlagenen Methode und zeigten eine höhere Ausbeute an WJ und WJ-MSCs bei besserer Rentabilität als bei herkömmlichen Methoden. Die ähnliche Morphologie und das Expressionsmuster von Zelloberflächenmarkern bei beiden Methoden bestätigen ihre Charakterisierung und Reinheit für verschiedene Anwendungen. Diese Methode bietet einen Ansatz mit hoher Ausbeute und hoher Lebensfähigkeit für die WJ-MSC-Isolierung und zeigt ein großes Potenzial für die klinische Anwendung von MSCs.

Einleitung

Seit der ersten Isolierung von mesenchymalen Stammzellen (MSCs) aus Wharton-Gelee (WJ) im Jahr 1991 haben diese multipotenten Stammzellen aufgrund ihrer regenerativen Eigenschaften und ihrer Fähigkeit zur Differenzierung mehrerer Linien große Aufmerksamkeit bei Forschern auf sich gezogen1. MSCs können aus verschiedenen Quellen isoliert werden, darunter Knochenmark, peripheres Blut, Zahnpulpa, Fettgewebe, fetales Gewebe (Abtreibung beim Menschen) und geburtsbedingtes Gewebe2. Die Nabelschnur (UC) hat sich aufgrund ihrer nicht-invasiven Natur, ihrer reichlichen Zellausbeute und Differenzierungsfähigkeit als vielversprechendes Reservoir erwiesen und weist eine hohe Proliferationsrate, ein hohes Differenzierungspotenzial und Immunmodulationseigenschaften auf3. Fetale MSCs weisen eine starke Stamm- und Immunität auf, was sie zum Hauptaugenmerk klinischer Studien und der Grundlagenforschung macht, die in den letzten zwei Jahrzehnten durchgeführt wurden 2,4,5. UC-abgeleitete MSCs haben im Vergleich zu anderen MSC-Quellen, wie Knochenmark oder Fettgewebe, ein überlegenes therapeutisches Potenzial 6,7.

Das UC besteht aus Amnionepithel, drei Gefäßen (zwei Arterien und einer Vene) und der gallertartigen Substanz WJ3. Interessanterweise stellt die UC ein einfaches Gefäßsystem dar, das nur aus dem Endothel und dem Mesothel, nicht aber aus der Tunica adventitia besteht; der WJ enthält keine Lymphe oder Nerven8. Der UC stellt eine einzigartige Struktur dar, die sich ideal für die Segmenttrennung eignet. UC-MSCs befinden sich hauptsächlich im WJ. MSCs konnten aus verschiedenen Kompartimenten des WJ isoliert werden, einschließlich Amnion, Subamnion (das Amnion und Subamnion, das auch als Nabelschnurauskleidungsregion bezeichnet wird) und dem perivaskulären Bereich des WJ8. Jede Region des WJ hat ihre eigene Struktur, immunhistochemische Eigenschaften und Funktion 3,6.

MSCs, die aus dem WJ der UC isoliert wurden, gelten weithin als überlegener klinischer Nutzen im Vergleich zu denen aus anderen Regionen3. WJ-MSCs wurden aufgrund ihres Mehrlinien-Differenzierungspotenzials, ihrer immunmodulatorischen Eigenschaften, ihrer parakrinen Wirkungen, ihrer entzündungshemmenden Wirkung und ihrer immunprivilegierten Eigenschaften in präklinischen und klinischen Umgebungen ausgiebig für die Behandlung verschiedener Krankheiten untersucht 2,3. WJ-MSCs haben sich bei der Behandlung einer Reihe von Krankheiten als vielversprechend erwiesen, darunter die Graft-versus-Host-Reaktion (GvHD), die Abstoßung von Transplantaten, Morbus Crohn, Autoimmunerkrankungen und Herz-Kreislauf-Erkrankungen 9,10,11,12,13,14. Da die klinische Nachfrage nach WJ-MSCs weiter steigt, ist das knappe Angebot an Nabelschnüren derzeit ein Hindernis für ihre weit verbreiteten Anwendungen.

Die Ausbeute an WJ-MSCs hängt von der Methode ab, die für die Zellextraktionverwendet wird 15. Während WJ-MSCs durch Explantatkultur oder Enzymverdau isoliert werden können, hat die letztere Methode eine längere Laufzeit, die das Risiko von Zellschäden erhöhen und die Lebensfähigkeit der Zellen verringern kann16. Zahlreiche Studien haben jedoch gezeigt, dass die Explantatkulturmethode die Zellausbeute und -lebensfähigkeit erhöht und dass parakrine Faktoren, die aus Explantatgeweben freigesetzt werden, auch die Zellproliferation fördern17,18.

In dieser Studie wurde ein einzigartiger Dissektionsansatz angewendet, um den gesamten WJ zu erhalten, der MSCs mit verbesserter Proliferationskapazität, Lebensfähigkeit und Menge lieferte und gleichzeitig die Schädigung des WJ minimierte. Diese innovative Methode bietet eine optimierte Strategie zur Isolierung von WJ-MSCs, die kritische Anforderungen in MSC-Anwendungen erfüllt.

Protokoll

Die Proben wurden von den einwilligenden, gesunden Spendern des Shenzhen Longgang District Maternity and Child Healthcare Hospital in Guangdong, China, entnommen. Die Verwendung von Humanproben für die Studie wurde von der Ethikkommission des Shenzhen Hospital, der Beijing University of Chinese Medicine (SZLDH2020LSYM-095) und der Medical Ethics Committee des Shenzhen Longgang District Maternity and Child Healthcare Hospital (LGFYYXLLS-2020-005) genehmigt. Alle Versuche wurden nach den genehmigten Richtlinien durchgeführt. Die Details zu den Reagenzien und den verwendeten Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Entnahme der menschlichen Nabelschnur

  1. Entnahme von humanen Nabelschnurproben aus dem Kooperationskrankenhaus unter sterilen Bedingungen.
    HINWEIS: Wählen Sie einen Spender unter 35 Jahren, vorzugsweise einen Primipara, ohne Vorgeschichte von Hepatitis, sexuell übertragbaren Krankheiten oder genetischen Störungen. Die Ergebnisse der Aufnahmeuntersuchung für das Hepatitis-B-Virus, das Hepatitis-C-Virus und das Cytomegalievirus müssen negativ sein. Wählen Sie als Entbindungsart einen Kaiserschnitt.
  2. Wählen Sie ein gerades und intaktes Stück UC von ca. 10-15 cm Länge.
  3. Verschließen Sie beide Enden mit einer hämostatischen Pinzette und ligieren Sie mit chirurgischen Knoten am inneren Ende zwischen den Pinzetten direkt nach der Entbindung eines reif geborenen Neugeborenen per Kaiserschnitt. (gesammelte UC, wie in Abbildung 1, Schritt 1 gezeigt).
    HINWEIS: Die Operation des Kaiserschnitts stellt sicher, dass die Entnahme steril ist. Verwenden Sie chirurgische Knoten der Nahtgröße 0 oder 2-0 für eine bessere Zugfestigkeit.
  4. Schneiden Sie die gebundene Nabelschnur zwischen Pinzette und Knoten mit einer chirurgischen Schere ab (Abbildung 1, Schritt 1).
  5. Spülen Sie es mit Kochsalzlösung aus, um alle kontaminierenden Blutgerinnsel auf der Oberfläche zu entfernen, und geben Sie es umgehend in ein steriles 50-ml-Kunststoffröhrchen mit 20 ml steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
    HINWEIS: Während des Transfers wurde kein Antibiotikum verwendet.
  6. Verschließen Sie das Rohr. Legen Sie es auf Eis in eine Styroporbox und lagern Sie es bei 4 °C, bevor Sie es ins Labor transportieren.
    HINWEIS: Sezieren Sie das Kabel innerhalb von 4 Stunden nach der Entnahme.

2. Isolierung von Wharton-Gelee aus der Nabelschnur

  1. Verarbeiten Sie die Nabelschnur mit den folgenden Schritten:
    1. Bereiten Sie ein sterilisiertes Tablett mit chirurgischen Instrumenten, aseptisch verpackten 90-mm-Schalen, 1000-μl-Pipetten, sterilem PBS, 75%iger Ethanollösung und xenofreiem humanem MSC-Kulturmedium vor.
      HINWEIS: Die gezahnte Pinzette und die Moskitoklemmen ermöglichen eine effiziente Behandlung der glitschigen Nabelschnur.
    2. Dekontaminieren Sie die erforderlichen Gegenstände und den Arbeitsbereich an der Oberfläche, bevor Sie sie in die Biosicherheitswerkbank legen.
      HINWEIS: Lassen Sie die Luft im Arbeitsbereich einige Minuten lang entweichen, bevor Sie mit der Arbeit beginnen.
    3. Desinfizieren Sie die Oberfläche des Röhrchens und entnehmen Sie die Probe in eine Petrischale in der Biosicherheitswerkbank. Tauchen Sie die Probe mit den Knoten 30 s lang in 75%iges Ethanol und spülen Sie sie dann mehrmals mit sterilem PBS in einer neuen Petrischale.
      HINWEIS: Das Kabel muss vor dem Eintauchen in 75%iges Ethanol ligiert werden, und die Zeit des Eintauchens sollte auf 30 s bis 1 min begrenzt werden, um das Kabel vollständig und ohne Beschädigung zu desinfizieren.
    4. Schneiden Sie die Knoten ab und schneiden Sie die Schnur zwischen zwei Knoten quer mit einer chirurgischen Schere und Pinzette in kurze Stücke von ca. 2 cm Länge.
      HINWEIS: Die Enden der Schnur mit Knoten sollten entsorgt werden. Die Länge des UC sollte nicht zu lang oder zu kurz sein; Beide Bedingungen können die Schwierigkeit der Operation erhöhen.
    5. Die Vene (größeres Gefäß) wird mit 1000 μl Pipetten mit PBS perfundiert, bis die Flüssigkeit, die am anderen Ende des Rückenmarks austritt, vollständig transparent wird19.
  2. Präpariere die Nabelschnur.
    1. Übertragen Sie eines der bereits geschnittenen Stücke in eine neue Petrischale.
      HINWEIS: Zwei Arterien und eine Vene sollten im Querschnitt8 sichtbar freigelegt werden (Abbildung 2B).
    2. Fügen Sie die entsprechende Menge PBS hinzu, um das Kabel während des gesamten Vorgangs feucht zu halten.
    3. Fassen Sie die Nabelschnur mit einer Pinzette und ziehen Sie die Arterien entlang der Längsachse mit Hilfe von Mückenklemmen heraus.
      HINWEIS: Versuchen Sie, vom anderen Ende des Rückenmarks zu ziehen, wenn die Arterie abgerissen wurde, da die Arterienwand eine große Elastizität aufweist.
    4. Fixieren Sie die Nabelschnur waagerecht mit der dickeren Seite nach oben, indem Sie eine Klinge der Pinzette in die Nabelvene einführen und dann fest klemmen, um sicherzustellen, dass die Pinzette auf der dickeren Seite klemmt.
    5. Machen Sie mit einem Skalpell einen linearen Schnitt in der Schicht des Amnionepithels von einem Ende zum anderen entlang der Kante der anderen Klinge der Pinzette (Abbildung 3).
      HINWEIS: Bewahren Sie die Unversehrtheit des Wharton-Gelees, indem Sie so wenig WJ wie möglich schneiden.
    6. Beginnen Sie an einer Ecke des Schnittspalts. Heben Sie die Ecke des Amnionepithels mit Zahnklammern an und schneiden Sie mit einer Hornhautschere weiter horizontal etwas weiter entlang der Innenfläche des Epithels.
      1. Trennen Sie das Wharton-Gelee und das Amnionepithel mit Klammern und dehnen Sie sich allmählich auf den gesamten Kreis eines Endes der UC aus. Ziehen Sie die Epithelschicht in Längsrichtung ab (Abbildung 3).
        HINWEIS: Das Wharton-Gelee ist ein schleimiges Bindegewebe, das vom dichten Amnionepithel8 umschlossen wird. Der gesamte Vorgang sollte reibungslos verlaufen, aber Moskitoklemmen können für eine stumpfe Dissektion verwendet werden, wenn man beim Schälen auf Schwierigkeiten stößt.
    7. Führen Sie beide Klingen der Pinzette in die Vene ein, klemmen Sie einen Teil von WJ ein und drehen Sie ihn dann auf links, um das Epithel der Nabelvene freizulegen (Abbildung 3).
    8. Ziehen Sie das Epithel der Vene leicht ab, da die innere Spannung eine Trennung zwischen dem Epithel der Vene und dem perivaskulären WJ schafft (Abbildung 3).
  3. Präparieren Sie das UC mit der herkömmlichen Methode zum Vergleich20.
    1. Wählen Sie eine andere, bereits geschnittene Probe mit fast demselben Gewicht wie die vorherige Schnur und übertragen Sie sie in eine neue Petrischale.
    2. Schneiden Sie mit einer Schere entlang der Nabelvene in Längsrichtung und spreizen Sie die UC, um die Gefäße und WJ freizulegen.
    3. Entfernen Sie die Nabelvene und zwei Arterien und entfernen Sie den WJ mit Schere und Skalpell von der Endothelschicht.

3. Isolation und Kultur von UC-MSCs

  1. Legen Sie den gesammelten WJ in eine vorbeschriftete 90 mm Petrischale und schneiden Sie ihn mit Schere und Pinzette in 1-3 mm große Stücke.
  2. Drehen Sie die Schale mit dem Deckel auf dem Boden um und stellen Sie sie für 30 min in einen 5%igen CO2 -Inkubator bei 37 °C, um die Befestigung zwischen den Teilen und der Kunststoffoberfläche zu verstärken.
  3. Drehen Sie die Schale um und fügen Sie vorsichtig eine angemessene Menge humanes MSC-Nährmedium für die weitere Kultur hinzu.
    HINWEIS: Verwenden Sie die niedrigste Geschwindigkeit, um sicherzustellen, dass die Teile noch befestigt sind.
  4. Wechseln Sie das humane MSC-Kulturmedium alle 3 Tage. Tauschen Sie zwei Drittel des Mediums aus und beobachten Sie in den ersten 7 Tagen alle 2 Tage das Auftreten des Auswachsens von fibrösen Zellen, wechseln Sie das volle Medium und beobachten Sie es danach täglich.
    HINWEIS: Vermeiden Sie es, die Petrischale in den ersten 7 Tagen zu bewegen. Das ausgeprägte Auswachsen von Fibroblasten-ähnlichen Zellen wurde nach etwa 4 Tagen beobachtet.
  5. Subkultur, bis der Zusammenfluss 80% erreicht.
    HINWEIS: Dieser Schritt dauert 7-10 Tage.
    1. Das PBS, 0,25 % Trypsin und xenofreies humanes MSC-Kulturmedium in einem Wasserbad auf 37 °C vorwärmen.
    2. Spülen Sie mit PBS, nachdem Sie den Überstand mit Pipetten abgesaugt haben, und lösen Sie die Zellen mit vorgewärmtem 0,25 % Trypsin, bis die Zellen durch Klopfen auf die Petrischale entfernt werden können.
    3. Inaktivieren Sie das Trypsin, indem Sie vorgewärmtes MSC-Kulturmedium im Verhältnis 4:1 mischen, die Zellsuspension auffangen und bei 300 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
      HINWEIS: Diese Zellen werden als Durchgang 0 (P0) betrachtet.
    4. Entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette, resuspendieren Sie die Zellen im humanen MSC-Kulturmedium und inokulieren Sie in neue Petrischalen mit einer Aussaatdichte von 1x104 Zellen/cm2 für die Vermehrung.
  6. Zählen Sie mit einem Hämozytometer die Gesamtzellzahl der beiden Methoden nach der Amplifikation bei erster, zweiter und dritter Passage. Bestimmen Sie die Zellmorphologie unter dem Mikroskop in der ersten, dritten und fünften Passage.
    HINWEIS: Die Morphologie dieser Zellen sollte ähnlich wie bei den P0-Zellen sein.
  7. Verwenden Sie Zellen an der fünften Passage für Durchflusszytometrie und andere Experimente.

4. Expression von Zelloberflächenmarkern durch Durchflusszytometrie

  1. Passage 5 (P5)-Zellen mit 0,25 % Trypsin ablösen, die Zellen mit Zellfärbepuffer waschen und bei 300 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Resuspendieren Sie die Pellets mit Zellfärbepuffer auf jeweils 100 μl.
  2. Markieren Sie jedes Röhrchen und fügen Sie die entsprechenden Mengen an Antikörpern hinzu, die mit Allophycocyanin (APC), Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) oder Phycoerythrin (PE) konjugiert wurden: CD44-APC, CD73-APC, CD90-FIFC, CD105-FIFC, CD11B-PE, CD19-PE, CD43-PE, HLA-DR-PE gemäß den Anweisungen des Herstellers21. 15-20 min im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren.
  3. Die gefärbten Zellen werden bei 300 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert, der Überstand mit einer Pipette abgesaugt und einmal mit Zellfärbepuffer gewaschen.
  4. Wiederholen Sie die Zentrifugation und Resuspension der Zellen mit 300 μl des Zellfärbepuffers.
  5. Lassen Sie die Zellen durch das Durchflusszytometer laufen und analysieren Sie die antikörpergefärbten Zellen gemäß den Anweisungen des Herstellers.

5. Bestimmung der Zellwachstumskurve durch die Zellzählmethode

  1. Bereiten Sie eine einzellige Suspension von P5-Zellen mit zwei Methoden vor, indem Sie sie in einem humanen MSC-Kulturmedium verdünnen.
  2. Keimen Sie 8.000 Zellen pro Well in einer 24-Well-Platte, wobei von jeder Methode insgesamt 21 Wells ausgesät werden.
    HINWEIS: Mischen Sie die Zellen vorsichtig, indem Sie sie vor der Aussaat mit Pipetten blasen und absaugen.
  3. Ernten Sie Zellen aus drei Vertiefungen nach 24 Stunden Aussaat. Führen Sie eine Zellzählung mit einem Hämozytometer durch, um den Mittelwert zu berechnen.
    HINWEIS: Schütteln Sie die Platte vor der Zellzählung. Die Dauer des Schüttelns kann verlängert werden, um die Bildung von Zellaggregaten zu verhindern.
  4. Wiederholen Sie die Zellzählung alle 24 Stunden für eine Gesamtdauer von 7 Tagen. Zeichnen Sie eine Wachstumskurve mit der Zeit (d) auf der X-Achse und der Zellzahl (x104/ml) auf der Y-Achse.

Ergebnisse

Die Verfahren zur Erhebung und Kultivierung von UC-MSCs sowie deren anschließende Analyse sind in Abbildung 1 zusammengefasst. Die UC wurde mit der einzigartigen Methode sauber in mehrere Abschnitte zerlegt; Das spezifische Operationsdiagramm der wichtigsten Verfahren ist in Abbildung 2 dargestellt. Das Auswachsen von Zellen aus Explantatkulturen wurde routinemäßig überwacht und aufgezeichnet. Anhaftende spindelförmige Zellen wurden etwa 4 Tage nach der Kultivierung der Explantate beobachtet und krochen vermehrt in eine Wirbelform. Diese Zellen wurden auch als P0 identifiziert und vermehrten sich für die nachfolgende Passage weiter, während sie während der Proliferation und Passage eine einheitliche Größe und Morphologie beibehielten. Die konventionellen und die aktuellen Methoden wiesen vernachlässigbare Unterschiede in Bezug auf Zellgröße und Morphologie auf (Abbildung 3).

Bei der herkömmlichen Dissektionsmethode wird das WJ von den Blutgefäßen und dem inneren Epithel des UC abgekratzt. Die WJ-Ausbeute stellte einen signifikanten Unterschied zwischen den beiden Methoden durch Gewichtsanpassung dar. Die Ausbeute von WJ kann berechnet werden, indem der Gewichtsanteil des WJ in der 2 cm langen Schnur (2,4 g ± 0,2 g) gemessen wird. Ein Vergleich des Verhältnisses der WJ-Ausbeute zwischen der aktuellen und der traditionellen Methode zeigte eine signifikante Steigerung der WJ-Ausbeute mit dem neuartigen Ansatz (Abbildung 4A). Eine weitere Analyse, bei der die Gesamtmenge der WJ-MSCs, die mit beiden Methoden aus dem äquivalenten Gewicht von UC gewonnen wurden, gleichzeitig gezählt wurde, zeigte eine ausgeprägte Lücke in der Zellmenge mit zunehmender Passagenzahl (Abbildung 4B). Die Wachstumskurve zeigte, dass die Proliferationsrate von MSCs in der neuen Methode signifikant höher war als in der konventionellen Methode bei gleicher Inokulationsdichte nach 2 Tagen (Abbildung 4C). Diese Experimente zeigen die Vorteile der aktuellen Methode, die es ermöglicht, die effiziente Versorgung mit dem gleichen Material effizient zu erhöhen.

Gemäß den Mindestkriterien der Richtlinie der International Society for Cell and Gene Therapy (ISCT) für die Definition von MSCs zeigt der Immunphänotyp von MSCs eine positive Expression von CD105, CD44, CD90, CD73 (mehr als 95%), während CD45, CD19, CD34, CD11b und HLA-DR (weniger als 2%) nicht vorhanden sind)22. WJ-abgeleitete MSCs wurden mittels quantitativer Durchflusszytometrie untersucht (Abbildung 5); Die mit beiden Methoden isolierten Zellen waren sehr positiv für die Oberflächenantigene CD105, CD44, CD90 und CD73 (alle über 99%), wobei die Expression der Oberflächenmoleküle CD45, CD19, CD34, CD11b und HLA-DR unterhalb der nachweisbaren Werte lag (Daten nicht gezeigt). Basierend auf den Ergebnissen von Zelloberflächenmarkern können adhärente Zellen fein als MSCs betrachtet und ihre Identifizierung und Reinheit sichergestellt werden.

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Abbildung 1: Schematische Darstellung der Dissektion und Isolierung von WJ-MSCs aus der Nabelschnur. Schritt 1: Die menschliche Nabelschnurprobe wird dem Neugeborenen entnommen und mit einer Kochsalzlösung gespült, gefolgt von einer Perfusion der Vene. Die Schnur wird dann in 2 cm große Stücke geschnitten. Schritt 2: Reines Wharton-Gelee (WJ) wird mit der aktuellen Methode gewonnen, bei der die Arterien, das Amnionepithel und das Venenepithel getrennt werden. Zum Vergleich wird auch die traditionelle Methode verwendet. Die Nabelschnur wird entsprechend präpariert. Schritt 3: Der präparierte WJ wird in 1-3 mm große Stücke geschnitten und die Schale für 30 Minuten kopfüber in den Inkubator gestellt, um die Befestigung zwischen den Stücken und der Kunststoffoberfläche zu verstärken. Die WJ-Stücke werden dann kultiviert und bei einer Aussaatdichte von 1 x 104 Zellen/cm2 bis zu einer Konfluenz von 80 % durchgelassen. Schritt 4: Die Durchflusszytometrie wird verwendet, um die P5-Zellen durch die Analyse von Oberflächenmarkern der mesenchymalen Stammzellen (MSC) zu charakterisieren. Schritt 5: Die Proliferationsfähigkeit der Zellen wird bestimmt, indem eine Zellwachstumskurve mit der Zellzählmethode gezeichnet wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Anatomie der Nabelschnur und schematische Demonstration der Dissektion. (A) Der Querschnitt der UC mit den Arterien (A), der Vene (V), dem Wharton-Gelee (WJ) und der anschließenden Dissektion unterteilt die UC in verschiedene Kompartimente. (B) Schematische Demonstration der Entfernung der Amnionepithelschicht. Der Schnitt erfolgt entlang der gestrichelten Linie am Amnionepithel, wobei das Epithel beginnend mit der seitlichen Ecke der Nabelschnur getrennt wird. (C) Schematische Demonstration der Entfernung des Venenepithels. Wenn Sie die Nabelschnur auf links drehen (die Richtung des Pfeils zeigt die Richtung der Kraft an), wird das Venenepithel zur Entfernung freigelegt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Morphologische Merkmale von primär kultivierten und passageierten WJ-MSCs. Differenziertes Wachstum von fibroblastoiden Zellen aus den Explantaten kann um den Tag 4 herum beobachtet werden (gekennzeichnet durch die Pfeile) und zeigt zunehmend ein wirbelartiges Wachstumsmuster. Die Explantate wurden entfernt und subkultiviert; Die isolierten Zellen waren homogen in Bezug auf die visualisierte Größe und Morphologie. Es wurde ein unbedeutender Unterschied in der Größe und Morphologie der Zellen zwischen den beiden Methoden beobachtet. Maßstab: 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Grafisch vergleichende Analyse des WJ-Ertrags und der Wachstumsmerkmale der kultivierten MSCs. (A) Vergleich der WJ-Ausbeute unter Verwendung von 2 cm UC mit einem Anfangsgewicht von 2,4 g ± 0,2 g nach beiden Methoden. WJ-Ausbeute = (Gewicht von WJ) / (Anfangsgewicht der unbearbeiteten Nabelschnur. Verhältnis von WJ-Rendite (%) = (WJ-Rendite) / (durchschnittliche WJ-Rendite der aktuellen Methode) × 100. (B) Vergleich der Zellzählung nach Kultur und Passage unter gleichen Bedingungen mit beiden Methoden. (C) Wachstumskurven von P5-Zellen in beiden Methoden. Alle Experimente umfassten drei biologische Replikate, und die statistischen Unterschiede wurden mit der bidirektionalen ANOVA-Methode analysiert (***p < 0,001). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5: Zelloberflächenexpression von MSC, analysiert mittels Durchflusszytometrie. P5-Zellen, die sowohl mit konventionellen als auch mit aktuellen Methoden gewonnen werden, werden einer durchflusszytometrischen Analyse unterzogen. Die Oberflächenantigene CD44, CD105, CD90 und CD73 waren sehr positiv (alle über 99%), während die Expressionen von CD45, CD19, CD34, CD11b und HLA-DR Oberflächenmolekülen unterhalb der Nachweisgrenze lagen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

MSCs stellen ein dynamisches Forschungsgebiet mit tiefgreifenden Auswirkungen auf die regenerative Medizindar 22. Ihre einzigartigen Eigenschaften machen sie zu einem zentralen Punkt für wissenschaftliche Untersuchungen und bergen das Potenzial, die Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten und Verletzungen zu revolutionieren7. WJ-MSCs sind eine eigenständige Untergruppe der MSCs, die aus dem gallertartigen Bindegewebe innerhalb der UC gewonnen werden können, das sich zwischen dem intervaskulären und dem amniotischen Epithelbefindet 23. Die klinische Anwendung von MSCs liegt in der Erreichung einer ausreichenden Zellzahl24. Mit zunehmender Passagezahl zeigten die Zellen jedoch ein gewisses Maß an Alterungsphänomen, und die proliferative Kapazität der MSCs nahm nach P5allmählich ab 24. Daher ist es unerlässlich, die Methoden zur Steigerung der MSC-Ausbeute zu optimieren.

Der effizienteste Weg, WJ-MSCs zu isolieren, besteht darin, den gesamten WJ zu präparieren und dabei seine Integrität zu bewahren6. Untersuchungen zeigen, dass diese Grenzzellen aus Nabelschnurrandregionen ein höheres Migrationsmerkmal und eine höhere Proliferationsrate aufweisen als intervaskuläre WJ-MSCs23. Die Regionen und Methoden zur Präparierung von WJ wurden jedoch nicht standardisiert, und es bleibt unklar, ob die Stammzellpopulationen innerhalb der WJ-MSCs die gleichen Eigenschaften aufweisen, da es keine klaren histologischen Grenzen zwischen den Partitionengibt 3.

Frühere Studien haben signifikante Unterschiede in den Eigenschaften von WJ-MSCs gezeigt, die aus verschiedenen Kompartimenten der Nabelschnur stammen, wobei Zellen, die sich in der Nähe der Amnionoberfläche befinden, eine erhöhte proliferative Fähigkeit aufweisen3. Die derzeit einzigartige Methode zur Präparierung von UC und Isolierung von WJ-MSCs zielt darauf ab, sowohl den Verlust des WJ der Auskleidung als auch die Zellschädigung zu reduzieren, was die Ausbeute und Lebensfähigkeit der Zellen verbessert. Dieses Protokoll demonstriert eine Methode, die die Verarbeitung von UC in nahezu intaktes WJ erleichterte. Der primäre Schritt des Protokolls besteht darin, die Epithelschicht durch Peeling und stumpfe Dissektion zu entfernen. Der Innovationsschritt besteht darin, die Epithelschicht mit Moskitoklemmen in Längsrichtung abzuziehen. Dieser Ansatz ist wirksam bei der Verringerung der benachbarten Zellschäden, die durch die herkömmliche scharfe Dissektion mit einer Schere verursachtwerden 25.

Das Endothel der Vene ist zerbrechlich und schwer wieder loszuwerden. Nach der Entnahme des Amnionepithels aus der Nabelvene wird die Nabelschnur durch die Vene geschoben, um das Endothel freizulegen. Die durch das WJ erzeugte innere Spannung wird dann verwendet, um das Endothel der Vene abzulösen, wodurch die Interferenz durch menschliche Nabelvenen-Endothelzellen (HUVECs) während nachfolgender Zellkulturprozesse minimiert wird.

Die Explantatkulturmethode wird übernommen, da sie im Vergleich zu anderen verfügbaren Methoden eine höhere Ausbeute aufweist18. Die nicht gebundenen Zellen werden nach und nach durch den Austausch des humanen MSC-Kulturmediums entfernt, was zum Verlust von Zellenführt 26. Die Explantate, die nicht am Kunststoff haften, könnten nach früheren Erfahrungen das Zellwachstum behindern. Die Auswirkungen des Wasserdampfes, der aufgrund der Änderungen der Innen- und Außentemperatur des Inkubators aus dem Gewebe abgegeben wird, müssen berücksichtigt werden. Um den trockenen Zustand der Petrischale zu erhalten, wurde ein innovativer Schritt implementiert, bei dem die Schale während der Inkubation 30 Minuten lang mit dem Deckel auf dem Boden auf den Kopf gestellt wird. Diese Umkehrung einer Schale verhinderte die Kondensation von Wasserdampf am Kontakt zwischen Gewebe und der Oberfläche der Petrischale, was wiederum eine bessere Befestigung der Exosomen an der Kunststoffoberfläche ermöglichte, um das Zellwachstum zu verbessern.

Die derzeitige Methode wird mit der herkömmlichen Präpariermethode verglichen, indem der Gewichtsprozentsatz des erhaltenen WJ und die Menge der kultivierten und passageierten MSC gemessen werden. eine signifikant höhere Ausbeute an WJ und eine weitere Menge an geernteten MSCs wurden durch die neuartige Methode gezeigt. Obwohl jedes Protokoll zur Isolierung von Stammzellpopulationen aus jedem dieser Kompartimente das Risiko einer Zellkontamination aus den anderen Kompartimenten birgt, zeigten die Ergebnisse die Reinheit der isolierten MSCs, die sich durch eine hohe Expression mesenchymaler Marker (alle über 99%) und einen minimalen Nachweis von hämatopoetischen und endothelialen Markern auszeichneten (Daten nicht gezeigt). Die Ergebnisse zeigten, dass die WJ-MSCs rein und für verschiedene Anwendungen geeignet sind und den ISCT-Richtlinien21 entsprechen. Die kultivierten MSCs wiesen in kurzer Zeit fibroblastenähnliche Zellen auf, und die Zellen formten sich zunehmend zu wirbelförmigen Zellen, die ein großes proliferatives Potenzial und Migrationseigenschaften aufwiesen.

Das in dieser Studie skizzierte Protokoll weist mehrere Mängel auf. Erstens sind die erforderlichen Fähigkeiten des Bedieners hoch, was sich in der Trennung des Amnionepithels zeigt. Dies könnte seine breite Einführung in der Forschung oder in klinischen Anwendungen behindern. Zweitens stützt sich das Protokoll stark auf manuelle Manipulationen während der Dissektion, was zu Inkonsistenzen zwischen Experimenten oder Bedienern führen kann. Eine Standardisierung des Präparierprozesses würde die Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit des Protokollserhöhen 25. Darüber hinaus lässt das Fehlen anderer Vergleiche mit der herkömmlichen Methode Fragen offen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die derzeitige Methode eine effiziente Möglichkeit bietet, das intakte WJ vom Amnionepithel und den Gefäßen zu trennen, was zu einer Entnahme führt, die das perivaskuläre und subamniotische Wharton-Gelee umfasst. Die Einführung eines invertierten Inkubationsschritts trägt zusätzlich zu einer verbesserten MSC-Bindung bei. Die vergleichende Analyse mit traditionellen Methoden zeigt die signifikanten Vorteile des vorgeschlagenen Protokolls in Bezug auf die Erzielung eines höheren WJ-Ertrags und die Ernte von mehr MSCs mit besserer Proliferationsfähigkeit. Die Ergebnisse unterstreichen auch die Reinheit der isolierten MSCs, was durch ein ausgeprägtes Muster der Markerexpression auf der Zelloberfläche angezeigt wird. Diese Methode könnte die MSC-Ausbeute und die Proliferationsfähigkeit verbessern und bietet eine kostengünstige Methode zur Steigerung der MSC-Produktion.

Offenlegungen

Die Autoren berichten von keinen Interessenkonflikten.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde finanziell unterstützt von der National Natural Science Foundation of China (82172107), der Natural Science Foundation of Guangdong Province, China (2021A1515011927, 2021A1515010918, 2020A1515110347), Shenzhen Medical Research Fund (SMRF. D2301015), das Shenzhen Municipal Science and Technology Innovation Committee (JCYJ20210324135014040, JCYJ20220530172807016, JCYJ20230807150908018, JCYJ20230807150915031) und der Longgang District Special Fund for Economic and Technological Development (LGKCYLWS2022007).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
APC anti-humaner CD44 Antikörper Biolegende 
24-Well-ZellkulturplattenThermo Scientific142475
APC Anti-Human-CD73 (Ecto-5'-Nukleotidase) Antikörper Biolegende 
APC Mouse IgG1, κ Isotyp Ctrl (FC) AntikörperBiolegend 
AutoklavHIRAYAMAHVE-50
Automatischer ZellzählerCountstarFL-CD
BAMBANKER KryokonservierungslösungWako302-14681
ZellfärbepufferBiolegende 
ZentrifugalmaschineEppendorf5424R
Clean BenchShanghai ZhiChengC1112B
CO2 InkubatorThermo ScientificHERAcell 150i
D-PBSSolarbioD1040
Elektrothermostatischer HochofenShanghai JingHongDHG-9423A
FITC Anti-Human-CD105 Antikörper Biolegende 
FITC Anti-Human-CD90 (Thy1)-Antikörper Biolegende 
FITC Maus IgG1, κ Isotyp Ctrl (FC) AntikörperBiolegend 400110
DurchflusszytometrieBeckmanCytoFLEX
HämozytometerSuperior Marienfeld640410
Intrazelluläre Färbung Permeabilisierung Waschpuffer (10&fach;) Biolegende 
Inverses Biologisches MikroskopZEISSAxio Vert. A1
Flüssigstickstoff-LagertankThermo ScientificCY50935-70
Normale Kochsalzlösung (NS)MeilunbioMA0083
PBSSolarbioP1032
PE Anti-Human-CD11b AntikörperBiolegend 
PE anti-humaner CD19 Antikörper Biolegende 
PE Anti-Human-CD34-AntikörperBiolegend 
PE Anti-Human-CD45-AntikörperBiolegend 368510
PE Anti-Human-HLA-DR-Antikörper Biolegende 
PE Maus IgG1, κ Isotyp Ctrl (FC) AntikörperBiolegend 
PE Maus IgG2a, κ Isotyp Ctrl (FC) AntikörperBiolegend 
PräzisionswaageSatoriusPRACTUM313-1CN
Schneeflocken-EismaschineZIEGRAZBE 30-10
sterilisiert 50 mL KunststoffrohrGreniner227270
Thermostatisches WasserbadShanghai YiHengHWS12
Trypsin 1:250SolarbioT8150
UltraGRO-AdvancedHelios 
Reinst- und Reinstwasser-ReinigungssystemMilli-QMilli-Q Referenz
Xenofreies humanes MSC-KulturmediumFUKOKU
338806344006400122420201323204328108421002393112392506343606307606400114400214HPCFDCGL50T2011301

Referenzen

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