Methodenartikel

Effektiver Nachweis von Zellen der Hoechst-Seitenpopulation mittels Durchflusszytometrie

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DOI:

10.3791/67012

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23. August 2024

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1Institute of Hematology, Department of Hematology, State Key Laboratory of Biotherapy, West China Hospital, Sichuan University, 2The Lab of Aging Research, State Key Laboratory of Biotherapy, National Clinical Research Center for Geriatrics, West China Hospital, Sichuan University, 3Precision Medicine Research Laboratory, West China Hospital, Sichuan University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier zeigen wir, dass Hochleistungslaser 375 nm und 405 nm Laser Hoechst 33342 effektiv anregen und als praktikable Alternative zum 355 nm Laser für die Detektion von Seitenpopulationszellen (SP) dienen können, wodurch das Spektrum der verfügbaren Laser in der Durchflusszytometrie erweitert wird.

Zusammenfassung

Die Zellen der Seitenpopulation (SP) werden durch Hoechst 33342-Färbung identifiziert und mittels Durchflusszytometrie (FCM) analysiert. Das Hoechst SP-Verfahren wird für die Isolierung von Stammzellen auf der Grundlage der Farbstoffausflusseigenschaften von ATP-bindenden Kassette (ABC)-Transportern eingesetzt. Die Methode wurde ursprünglich für die Identifizierung und Isolierung von hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) eingesetzt, hat sich aber weiterentwickelt und konzentriert sich nun hauptsächlich auf die Identifizierung und Isolierung von Krebsstammzellen (CSCs). Bei der traditionellen Detektionsmethode von FCM wird ein 355-nm-Laser verwendet, um den Farbstoff zum Nachweis von SP-Zellen anzuregen. Durch diese Studie ist es uns gelungen, alternative Ansätze zur Farbstoffanregung zu identifizieren, die die Detektion von SP-Zellen mit einem 355-nm-Laser effektiv ersetzen können. Dies wird durch den Einsatz von Hochleistungslasern mit 375 nm oder 405 nm erreicht. Dies ermöglicht es uns, eine verbesserte Selektivität bei der Detektion von SP-Zellen auszuüben, anstatt nur auf die 355-nm-Laser-Durchflusszytometrie beschränkt zu sein.

Einleitung

Die Zellen der Seitenpopulation (SP) werden durch Hoechst 33342-Färbung identifiziert und mittels Durchflusszytometrie (FCM) analysiert. Die SP-Zellen zeichnen sich dadurch aus, dass der fluoreszierende DNA-Farbstoff durch ihren ATP-bindenden Kassettentransporter(ABC) 1,2 aus den Zellen gepumpt wird. Die Methode wurde ursprünglich für die Isolierung von hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) des murinen Knochenmarks etabliert1. Die Knochenmark-SP-Zellen wurden mit einer Population von HSCs angereichert, die durch eineniedrige CD117+Sca-1+Lin-Thy1-Expression gekennzeichnet waren 3,4. Danach wurde die Methode häufig verwendet, um Stammzellen aus anderen Geweben zu isolieren und anzureichern, darunter Herzmuskel5, Leber6, Lunge7, Niere8 und Vorderhirn9. Insbesondere wurde die Methode in den letzten zehn Jahren zur Isolierung von Krebsstammzellen (CSCs) angewendet. CSCs stellen eine kleine Population von Zellen dar, die die Eigenschaften der Tumorinitiierung, der Selbsterneuerung, der Resistenz gegen Chemotherapie und des Metastasierungspotenzials besitzen10. CSCs wurden zunächst bei hämatopoetischen Malignomen11 identifiziert und anschließend bei verschiedenen soliden Tumoren wie Prostata12, Eierstock13, Magen14, Brust15 und Lunge16 beobachtet. Trotz der Verfügbarkeit verschiedener Techniken zur CSC-Identifizierung bleibt die SP-Technik aufgrund ihrer breiten Anwendbarkeit in verschiedenen Geweben und Zelllinien eine bevorzugte Wahl. Darüber hinaus ist es eine wertvolle Technik zur Isolierung von CSCs mittels Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS)16,17,18. Die experimentellen Befunde zeigen, dass SP-Zellen eine ausgeprägte Tumorigenität aufweisen und erhöhte Expressionsniveaus von Stammzell-assoziierten Genen aufweisen19,20. Unsere vorherige Studie21 hat auch gezeigt, dass die transkriptomische Analyse isolierter SP-Zellen beim Multiplen Myelom eine Anreicherung von Signalwegen zeigt, die mit Stammzellen assoziiert sind, wie z. B. dem Hedgehog-Signalweg. In der Zwischenzeit führten wir Signalanreicherungsanalysen an den Genen durch, die in den SP-Zellen der akuten myeloischen Leukämie unterschiedlich exprimiert werden22. Die veränderten Gene wurden in stammzellbezogenen Signalwegen angereichert (Wnt/β-Catenin, TGF-β, Hedgehog, Notch). Wir fanden heraus, dass 1 x 105 SP-Zellen Tumore in BALB/c-Null-Mäusen bilden konnten22, während Nicht-SP-Zellen dies nicht konnten, was darauf hindeutet, dass SP-Zellen Eigenschaften von Leukämie-Stammzellen aufwiesen. Die Wirksamkeit der Hoechst SP-Methode bei der Identifizierung von CSCs ist offensichtlich.

Das Hoechst SP-Protokoll wurde im Laufe der Forschung verfeinert und verbessert. Das Protokoll beinhaltet eine strenge Kontrolle der Farbstoffkonzentration, der Zelldichte, der Inkubationstemperatur und -dauer, der Pufferzusammensetzung und des pH-Wertes. Die nach diesem Protokoll vorbereiteten Zellproben wurden einer durchflusszytometrischen Analyse unterzogen. Aufgrund der Anregung des Hoechst-Farbstoffs mit einem UV-Laser bei 355 nm und der Detektion seiner Fluoreszenzemission sowohl mit einem 690/50 nm Filter (Hoechst Red) als auch mit einem 450/50 nm Filter (Hoechst Blue) ist für FCM ein 350 nm Laser erforderlich. 350-nm-Laser sind jedoch aufgrund ihrer hohen Kosten in den meisten FCMs nicht üblich. Daher haben wir versucht, einen alternativen Ansatz zur Farbstoffanregung für den effektiven Nachweis von SP-Zellen mittels Durchflusszytometrie zu finden. In dieser Studie wurde die Fähigkeit der 375-nm- und 405-nm-Laser zur Detektion von SP-Zellen bewertet und mit der des 355-nm-Lasers verglichen. Unsere Ergebnisse zeigen eine bemerkenswerte Ähnlichkeit zwischen den SP-Zellen, die von den 355-nm-, 375-nm- und 405-nm-Lasern detektiert wurden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Hochleistungslaser 375 nm und 405 nm als praktikable Alternativen zu den 355 nm Lasern für die SP-Zelldetektion dienen können. Die Einbeziehung zusätzlicher Anregungslichtquellen für Hoechst 33342 ermöglicht die Verwendung weiterer Durchflusszytometrie-Modelle.

Protokoll

Die Experimente in dieser Studie verwendeten insgesamt 10 C57BL/6-Mäuse im Alter zwischen 8 und 12 Wochen. Die Versuche wurden in Übereinstimmung mit einem Protokoll durchgeführt, das vom Institutional Animal Care and Use Committee der Sichuan University (#201609309) genehmigt wurde. Die experimentellen Materialien und die Parameter der Durchflusszytometrie, die in diesem Artikel verwendet werden, sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Isolierung und Entnahme von Knochenmarkzellen der Maus

  1. Euthanasieren Sie Mäuse in strikter Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien. Um bei der Maus Bewusstlosigkeit hervorzurufen, verabreichen Sie Inhalationsanästhetika, beginnend mit 2% Isofluran, gefolgt von einer allmählichen Erhöhung der Dosierung auf 5% Isofluran bis zum Ende der Atmung.
  2. Sezieren Sie die Mäuse im Operationssaal oder im Abzug. Reinigen und sterilisieren Sie die Mäuse mit 70% Ethanol.
  3. Schneiden Sie die Haut und den Muskel des Beins mit einer scharfen Schere vollständig ab und präparieren Sie die Oberschenkelknochen.
  4. Zerkleinern Sie den Oberschenkelknochen vorsichtig mit einem Mahlstab in einem Mörser und spülen Sie die Knochenmarkzellen mit DMEM-Medium aus, bis der Knochen weiß wird.
  5. Die gewonnenen Knochenmarkzellen werden mit einem 100 μm Filter in 15 mL Röhrchen filtriert. Zentrifugieren Sie bei 800 x g für 5 min bei 4 °C.
  6. Der Überstand wird verworfen und die verbleibenden roten Blutkörperchen werden 1 Minute lang bei 4 °C mit 1 ml Lysepuffer für rote Blutkörperchen lysiert. Zentrifugieren Sie bei 800 x g für 5 min bei 4 °C. Nach der Zentrifugation erneut mit DMEM-Medium waschen.
  7. Resuspendieren Sie die Zellen in 2 mL Inkubationslösung (DMEM-Medium + 5% FBS), zählen Sie die Zellen mit einem automatischen Zellzähler und stellen Sie die Zellkonzentration auf 1,0 x 106 Zellen/ml mit Inkubationslösung ein.

2. Zelluläre Färbung

  1. Ergänzen Sie 2 ml Knochenmarkzellsuspension von jeder Maus mit 5 μg/ml Hoechst 33342. Zu einem weiteren 1 ml Aliquot fügen Sie 100 μM Verapamil als Negativkontrolle hinzu.
  2. In einem Wasserbad bei 37 °C für 90 min inkubieren und alle 30 min leicht umrühren.
  3. Nach der Inkubation die Zellen 5 min auf Eis abkühlen lassen und anschließend bei 250 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Resuspendieren Sie die Zellen in einer kaltfließenden Lösung (HBSS + 2% FBS). 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
  4. Resuspendieren Sie das resultierende Zellpellet in 500 μl laufender Lösung pro Probe. Vor der FCM-Analyse die Zellen mit 2 μg/ml Propidiumiodid (PI) ergänzen und ca. 5 Minuten auf Eis legen.

3. Durchflusszytometrie

HINWEIS: Eine Übersicht über die verschiedenen verwendeten Systeme und Konfigurationen finden Sie in Tabelle 1.

  1. Kalibrieren Sie die Werte des Variationskoeffizienten (CV) der erforderlichen Kanäle unter Verwendung der täglichen Qualitätskontrolle (QC) in den FCMs und führen Sie nach erfolgreichem Abschluss der Qualitätskontrolle Probentests durch.
    1. Wählen Sie die Desktop-Verknüpfung der Software aus und starten Sie die Software.
    2. Wählen Sie im Menü QC/Standardization die Option QC/Standardization starten , um auf das QC-Experiment zuzugreifen.
    3. Setzen Sie das QC-Fluorosphären-Probenröhrchen in den Röhrchenhalter ein.
    4. Wählen Sie Start aus, um das Beispiel zu laden und mit dem Ausführen der QC-Prozedur zu beginnen. FCMs sind nach dem QC-Durchlaufen einsatzbereit.
  2. Stimulieren Sie den Hoechst-Farbstoff 33342 derselben Proben mit einem 355-nm-, 375-nm- bzw. 405-nm-Laser für die Detektion von Hoechst-Rot im 690/50-nm-Kanal und von Hoechst-Blau im 450/50-nm-Kanal.
    1. Erstellen Sie ein neues Experiment, indem Sie im Menü Datei die Option Neues Experiment auswählen, den Dateipfad angeben und das Experiment speichern.
    2. Wählen Sie Kanal einstellen im Menü Einstellungen. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen für das Kanalsignal (Y585, V450, V660, NUV450, NUV660, UV450, UV660) und fügen Sie dann den Namen des Reagenzes in der Spalte Beschriftung hinzu (Y585: PI; V450: Hoechst Blau-405 nm; V660: Hoechst rot-405 nm; NUV450: Hoechst Blau-375 nm; NUV660: Hoechst Blau-375 nm; UV450: Hoechst Blau-355nm; UV660: Hoechst Blue-355 nm).
    3. Klicken Sie im Zeichnungsbereich auf die Symbole für Pseudofarbplots , um Plots zu erstellen. Wählen Sie einen Achsennamen aus, um zu ändern, welcher Kanal angezeigt wird.
    4. Klicken Sie im Bildschirm Reagenzglas auf Röhrchen hinzufügen , um neue Probenröhrchen zu erstellen und deren Namen zu ändern.
    5. Wählen Sie Ausführen aus, um die Stichprobe zu laden, die Diagramme anzuzeigen und die Gates festzulegen. Passen Sie die Verstärkungs- und Schwellenwerteinstellungen an. Wählen Sie Datensatz aus, um die Daten zu speichern.
  3. Entwerfen Sie die Logik der Gattereinstellung.
    1. Klicken Sie für das erste Diagramm auf die X-Achse , um FSC-W auszuwählen, und klicken Sie auf die Y-Achse , um FSC-A auszuwählen. Wählen Sie Polygon-Gate aus, um Gate A zu zeichnen, um die einzelne Zelle zu umkreisen und anhaftende Zellen auszuschließen (Abbildung 1A).
    2. Klicken Sie für das zweite Diagramm auf die X-Achse , um FSC-A auszuwählen, und klicken Sie auf die Y-Achse , um SSC-A auszuwählen. Wählen Sie Polygon-Gate aus, um Gate B zu zeichnen, um nicht-fragmentäre Zellen zu trennen und zelluläre Trümmer auszuschließen (Abbildung 1B).
    3. Klicken Sie für das dritte Diagramm auf die X-Achse , um PI-A auszuwählen, und klicken Sie auf die Y-Achse , um SSC-A auszuwählen. Wählen Sie das Polygon-Gatter aus, um Gate D zu zeichnen. Wählen Sie Live-Zellen mit negativem PI aus (Abbildung 1C), und ziehen Sie Gate C, um lebende Zellen zu erhalten.
    4. Klicken Sie für das vierte zweidimensionale Diagramm auf die X-Achse , um Hoechst Rot auszuwählen, und klicken Sie auf die Y-Achse , um Hoechst Blau auszuwählen. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Diagramm , und wählen Sie Eigenschaft aus dem Dropdown-Menü aus. Wählen Sie "Lineares Format" fürdie X-Achse und die Y-Achse. Wählen Sie Polygon-Gate aus, um Gate-SP zu zeichnen, um SP-Zellen abzurufen (Abbildung 1D).
  4. Zur Beurteilung der Eignung der Probe ist eine Auflösung von 355 nm eines spezifischen Durchflusszytometers23 für den Nachweis von SP-Zellen zu verwenden.
  5. Verwenden Sie die Laser 355 nm (Laserleistung: 20 mW) und 405 nm (Laserleistung: 80 mW) gleichzeitig, um sowohl die Kontrollzellen (mit Zusatz von Verapamil) als auch die experimentellen Zellen zu detektieren.
  6. Erfassen Sie Fluoreszenzsignale an den Kanälen 690/50 nm und 450/50 nm, die den beiden Lasern entsprechen. Beobachten Sie die effektive Stimulation des Farbstoffs Hoechst 33342 durch 355-nm- und 405-nm-Laser mit klaren SP-Zellen (Abbildung 2B-C).
  7. Verwenden Sie für die gleichen Proben die Laser 375 nm (Laserleistung: 60 mW) und 405 nm (Laserleistung: 80 mW) für die Zelldetektion.

Ergebnisse

In Abbildung 2 wurde die Kontrollgruppe mit Verapamil behandelt, das ABC-Transporter in Stammzellen blockiert, um die Eliminierung von Hoechst 33342 zu verhindern. Dabei stoßen die Stammzellen der Nicht-Verapamil-Gruppe Hoechst 33342 aus und bilden eine negative Zellpopulation, die als SP-Zellen bezeichnet wird. Der 355-nm-Laser regte den Farbstoff Hoechst 33342 effektiv an, was zu einer klaren Beobachtung von SP-Zellen des Knochenmarks führte (Abbildung 2A). Es stellte sich heraus, dass die SP-Zellen der gleichen Proben, die mit dem 355-nm-Laser und dem 405-nm-Laser detektiert wurden, im Wesentlichen identisch sind (Abbildung 2D).

Aus Abbildung 2 und Abbildung 3 haben wir gesehen, dass auch andere Modelle von nicht-traditionellen Durchflussmessern SP-Zellen identifizieren können. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass sowohl 375-nm- als auch 405-nm-Laser Hoechst 33342 effektiv anregten, um SP-Zellen zu erhalten (Abbildung 3A-B). Wenn es notwendig ist, CSCs oder HSCs zu detektieren oder zu isolieren, können wir uns anstelle eines 355-nm-Lasers für einen 375-nm- oder 405-nm-Laser entscheiden.

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Abbildung 1: Durchflusszytometrie-basierte Gate-Setting-Logik zum Nachweis von SP-Zellen. (A) FSC-A und FSC-W wurden verwendet, um adhärente Zellen auszuschließen. Gatter A stellt den einzelligen Cluster dar. (B) Die Parameter FSC-A und SSC-A wurden für die Entfernung von Zelltrümmern verwendet. Gate B repräsentiert den nicht-fragmentären Zellcluster. (C) Lebende Zellen mit negativem Propidiumiodid (PI) wurden ausgewählt. Gate C repräsentiert den lebenden Zellcluster. (D) Die Fluoreszenzsignale wurden über die Kanäle 690/50 nm (Hoechst-rot) und 450/50 nm (Hoechst-blau) erfasst. Gate SP stellt den SP-Zellcluster dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Der Hochleistungslaser 405 nm detektiert SP-Zellen genauso effektiv wie der 355 nm Laser. (A) Der Farbstoff Hoechst 33342 wurde durch den 355-nm-Laser eines herkömmlichen Durchflusszytometers angeregt, um die SP-Zellen des Knochenmarks zu detektieren. (B, C) Die SP-Zellen des Knochenmarks wurden mit den 355 nm und 405 nm Lasern desselben FCM identifiziert. (D) Es wurde festgestellt, dass die SP-Zellen derselben Proben, die mit dem 355-nm-Laser und dem 405-nm-Laser detektiert wurden, im Wesentlichen identisch sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Hochleistungslaser mit 375 nm und 405 nm sind in der Lage, SP-Zellen zu detektieren. (A) Hochleistungslaser mit 375 nm können SP-Zellen detektieren. (B) Die SP-Zellen des Knochenmarks können auch mit den 405-nm-Lasern detektiert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

LasertypLaser-Wellenlänge (nm)Laserleistung (mW)Hoechst Rotfilter (nm)Hoechst Blaufilter (nm)
Moflo Astrios EQArgongas355100692/75448/59
CytoFLEX LXHalbleiter35520690/50450/50
40580690/50450/50
CytoFLEX SHalbleiter37560690/50450/50
CytoFLEX SRTHalbleiter40580690/50450/50

Tabelle 1: Zusammenfassung der Konfigurationen von Durchflusszytometern.

Diskussion

Wir verwendeten das beschriebene Protokoll, um drei Experimente durchzuführen, wobei jeder Versuch 3-4 Mäuse umfasste, was zu insgesamt 10 Mäusen führte. Der Anteil der SP-Zellen lag zwischen 0,05 % und 0,76 %. Es ist wichtig zu beachten, dass bei den Mäusen individuelle Unterschiede beobachtet wurden. Wir setzten vier Durchflusszytometer ein, um die Hoechst-Proben zu analysieren. Es wird beobachtet, dass die Anregung des Hoechst-Farbstoffs durch einen 20 mW 355 nm Laser auf der neuen Version der Durchflusszytometrie der eines 100 mW 355 nm Lasers auf der altmodischen Durchflusszytometrie entspricht. Dieses Phänomen ist auf die Variation der Lasertypen zurückzuführen, die in beiden Systemen verwendet werden. Der mögliche Grund für den beobachteten Effekt von 375 nm und 405 nm Lasern könnte auf die beträchtliche Leistung beider Laser in Verbindung mit der Verwendung des Avalanche Photodiode (APD) Detektors zurückgeführt werden. Der Hoechst Red-A-Kanal erfasste die nahe rote lange Wellenlänge von 690 nm, bei der der photoelektrische Umwandlungswirkungsgrad der Photomultiplier-Röhre (PMT) relativ gering war. Der APD zeigte jedoch einen etwa zehnmal höheren Wirkungsgrad der photoelektrischen Umwandlung als der des PMT24. In Kombination mit Hochleistungslasern von 375 nm und 405 nm unterscheiden APD-Detektoren daher effizient SP-Zellen. Der 405-nm-Laser detektiert nicht nur effektiv SP-Zellen, sondern zeigt im Vergleich zum 355-nm-Laser auch eine überlegene Fähigkeit bei der Unterscheidung einer Untergruppe schwach positiver Hoechst-Red-Populationen.

Der kritische Schritt des Protokolls besteht darin, die Durchflusszytometrie mit einem 375-nm-Laser oder einem 455-nm-Laser zu verwenden, um Zellen mit 690/50 nm (Hoechst-rot) und 450/50 nm (Hoechst-blau) Kanälen zu detektieren. Während die Technik SP-Zellen mit 375-nm- und 405-nm-Lasern anstelle von 355-nm-Lasern (traditioneller Laser zur Analyse von SP-Zellen1) detektiert, die in FCMs häufiger vorkommen, sind Hochleistungslaser mit 375 nm und 405 nm erforderlich. Dies führt zu den Grenzen dieser Technologie. Die Bedeutung der Methode besteht darin, das Spektrum der Laser zur Detektion von Hoechst-Farbstoffen zu erweitern, so dass andere Modelle der Durchflusszytometrie für die SP-Zelldetektion verwendet werden können.

Offenlegungen

Es wurden keine Interessenkonflikte angegeben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch die Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (Nr. 81800207) an J.H. unterstützt. Wir wissen die Unterstützung von Beckman Coulter, Inc. bei der Durchflusszytometrie und Parameterkalibrierung sehr zu schätzen. Wir danken Jiao Chen vom State Key Laboratory of Oral Diseases, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, und Yu Qi vom Regenerative Medicine Research Center, West China Hospital, Sichuan University, für ihre Unterstützung bei der Datenerfassung in der Durchflusszytometrie.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Automatischer ZellzählerCountstar1M1200
Zellfilter (100 & Mikro; m)BIOFILCSS-013-100
Fluorosphären für die tägliche QualitätskontrolleBeckman CoulterB5230
Dulbecco's Modification of Eagle's Medium mit 4,5 g/L Glucose (DMEM-Medium)CORNING10-013-CVRC
Fötales RinderserumCORNING35-081-CV
HBSSHycloneSH30030.02
Hoechst 33342Sigma-AldrichB2261
Propidiumiodid (PI)Sigma-AldrichP4170
Puffer zur Lyse roter BlutkörperchenBeyotimeC3702
VerapamilSigma-AldrichV4629

Referenzen

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Schlagwörter

Hoechst 33342 F rbungKrebsstammzellenStammzellisolationFarbstoffeffluxABC TransporterKnochenmarkzellenLaserexcitationPropidiumiodid
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