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Methodenartikel

Nachweis von DNA-Brüchen in sich teilenden menschlichen Zellen durch neutralen Kometen-Assay

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DOI:

10.3791/67110

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23. August 2024

 , 
1Department of Molecular Biosciences, University of South Florida, Tampa

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um das Ausmaß der DNA-Schäden zu untersuchen, die während der DNA-Replikation auftreten. Unter neutralen Bedingungen kann die Induktion von DNA-Brüchen innerhalb eines kurzen Zeitrahmens gut beurteilt werden. Darüber hinaus ist das Protokoll an andere Zelltypen und verschiedene Replikationsstressreagenzien anpassbar.

Zusammenfassung

Die DNA-Replikation wird ständig durch eine Vielzahl von endogenen und exogenen Stressoren herausgefordert, die die DNA schädigen können. Solche Läsionen, die während der Genomduplikation auftreten, können Replisomen blockieren und Replikationsgabeln in Doppelstrangbrüche umwandeln. Wenn diese toxischen DNA-Brüche nicht repariert werden, können sie chromosomale Umlagerungen auslösen, was zu einer erhöhten Instabilität des Genoms und einer erhöhten Wahrscheinlichkeit einer zellulären Transformation führt. Darüber hinaus weisen Krebszellen einen anhaltenden Replikationsstress auf, was die Anfälligkeit der Replikationsgabel in Tumorzellen zu einer attraktiven Strategie für die Chemotherapie macht. Eine äußerst vielseitige und leistungsstarke Technik zur Untersuchung von DNA-Brüchen während der Replikation ist der Comet-Assay. Diese Gelelektrophorese-Technik detektiert zuverlässig die Induktion und Reparatur von DNA-Brüchen auf Einzelzellebene. Darin wird ein Protokoll skizziert, das es den Forschern ermöglicht, das Ausmaß der DNA-Schädigung bei der mitotischen Teilung menschlicher Zellen mit Hilfe von Gabel-Stalling-Mitteln über mehrere Zelltypen hinweg zu messen. Die Kopplung mit der automatisierten Kometenbewertung ermöglicht eine schnelle Analyse und erhöht die Zuverlässigkeit bei der Untersuchung der Induktion von DNA-Brüchen.

Einleitung

Der Comet-Assay ist eine Gelelektrophorese-Methode, die zum Nachweis von DNA-Brüchen auf Einzelzellebene verwendet wird. Es beruht auf dem Prinzip, dass offene DNA-Brüche unter elektrophoretischen Bedingungen wandern, während intakte DNA weitgehend statisch bleibt. Gebrochene DNA wandert, weil Brüche zu einer Entspannung der supercoiled DNA führen, was zu einer allmählichen räumlichen Verlagerung in Richtung der Anode in der elektrophoretischen Kammer führt, was zu einem kometenähnlichen Aussehen führt, das durch Immunfluoreszenz beobachtet wird 1,2. Das Ausmaß der DNA-Schädigung wird dann gemessen, indem die Menge an gebrochener DNA, die im Verhältnis zur kompakten DNA migriert ist, quantifiziert wird.

Die beiden am häufigsten verwendeten Kometen-Assay-Methoden sind der alkalische Kometen-Assay (AC) und der neutrale Kometen-Assay (NC). Der AC-Assay wird unter denaturierenden Bedingungen mit einer Lösung mit hohem alkalischen pH-Wert durchgeführt, während der NC-Assay in einer Lösung mit neutralem pH-Wert durchgeführt wird. Sowohl NC- als auch AC-Assays können DNA-Brüche, die im Zellkern auftreten, zuverlässig nachweisen. Die alkalische Variante ist aber auch vorteilhaft für die Detektion alkali-labiler Stellen3. Beide Formate des Assays erfordern die Verwendung von Lysebedingungen, um sicherzustellen, dass die DNA vor der Elektrophorese frei von Proteinen ist.

Dieser Assay ist eine einfache Methode zum Nachweis von DNA-Brüchen und bietet mehrere einzigartige Vorteile bei der Bestimmung von zellulären DNA-Schäden. Die Methode ist relativ einfach einzurichten und erfordert Reagenzien, die entweder im Labor hergestellt oder von kommerziellen Anbietern gekauft werden können. Da es sich um eine Einzelzellauflösungstechnik handelt, benötigt der Assay nur sehr wenig Ausgangsmaterial. Insbesondere kann der NC-Assay Brüche mit hoher Empfindlichkeit messen, die Berichten zufolge zwischen 50 und 10.000 Brüche pro Zelle erkennensoll 4. Die Vielseitigkeit dieser Technik zeigt sich in ihrem breiten Anwendungsspektrum, darunter Ökotoxikologie5, Human-Biomonitoring6 und Genotoxizitätsstudien7. Der Assay kann auch zuverlässig über verschiedene Zelltypen hinweg eingesetzt und für Hochdurchsatz-Assays8 und für die Beurteilung von Brüchen in bestimmten genomischen Regionenangepasst werden 9. Somit dient dieser Assay als schnelle und zuverlässige Technik zur Untersuchung der Bruchbildung auf Einzelzellebene.

Der Prozess der DNA-Replikation wird ständig durch mehrere endogene und exogene Stressoren herausgefordert 10,11. Ein Stillstand der Replisomen aufgrund solcher Läsionen kann zu DNA-Brüchen führen und zu einer erhöhten Instabilität des Genoms führen. DNA-Brüche entstehen auch häufig als Replikationszwischenprodukte, um die DNA-Reparatur zu erleichtern12. Darüber hinaus induzieren mehrere Chemotherapeutika replikationsabhängige Doppelstrangbrüche (DSBs), wie z. B. Camptothecin (CPT)13,14,15 und PARP-Inhibitoren 16,17. Daher dient dieser Assay als leistungsfähige Methodik, um die Art von DNA-Läsionen zu untersuchen, die Prozessierung von Replikationsgabeln zu beurteilen und das therapeutische Potenzial von DNA-schädigenden Wirkstoffen zu untersuchen. Anpassungen des Assays, die die Markierung neu synthetisierter DNA mit BrdU beinhalten, waren nützlich für die Untersuchung der replikationsassoziierten Stressphänotypen 18,19,20,21. Insbesondere ist der NC-Assay eine zuverlässige Methode zur Untersuchung der DNA-Bruchinduktion im Rahmen der Replikation, wie Studien zur Charakterisierung von Gabelproteinen22,23, zur Analyse von Replikationszwischenprodukten24,25 und zur Untersuchung von Transkriptions-Replikationskonflikten bei der Genomerhaltunggezeigt haben 26,27. Darin skizzieren wir ein NC-Assay-Protokoll mit dem Ziel, DNA-Brüche während der Replikation in menschlichen Zellen zu quantifizieren. Dieses Protokoll kann von Forschern, die daran interessiert sind, Replikationsstress-assoziierte Schäden in einer Vielzahl von sich teilenden menschlichen Zellen zu bewerten, leicht implementiert werden.

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Protokoll

Dieses Protokoll (Abbildung 1) verwendet in erster Linie adhärente U2OS-Krebszelllinien, ist aber auch an eine Vielzahl von adhärenten und Suspensionszellen anpassbar, die in Gewebekulturen gezüchtet wurden. Die in dieser Studie verwendeten Lösungen und Puffer sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung der Materialien

  1. Stellen Sie vor dem Tag des Experiments die mitgelieferte Flasche mit niedrigschmelzender Agarose (1% niedrigschmelzende Agarose in PBS) für 5-10 Minuten in ein heißes Wasserbad, um sicherzustellen, dass die Agarose vollständig geschmolzen ist.
    HINWEIS: Erhitzen Sie die Flasche nicht in der Mikrowelle.
  2. Nach dem Schmelzen aliquotieren Sie schnell 100 μl der Agarose in 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen nach Bedarf und lagern Sie die Röhrchen bei 4 °C. Die erstarrte Agarose kann bei 4 °C bis zu 1 Jahr gelagert werden.
  3. Am Tag des Versuchs ist die erforderliche Anzahl von Zentrifugenröhrchen aus dem 4 °C-Lager zu entnehmen. Schmelzen Sie die Agarose, indem Sie die Röhrchen in einen Wärmeblock oder ein Wasserbad bei 42 °C legen.
    HINWEIS: Stellen Sie die Röhrchen vor der Ernte der Zellen bei 42 °C auf, um sicherzustellen, dass die Agarose für die Resuspension vollständig geschmolzen ist (Schritt 3.7).
  4. Bereiten Sie am Tag des Experiments frischen Lysepuffer und TAE-Puffer vor und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei Raumtemperatur bzw. 4 °C. Aliquotieren Sie außerdem 1x PBS in einem konischen 15-ml-Röhrchen und stellen Sie es in den Kühlschrank, um es in der Resuspensionsstufe (Schritt 3.5) zu verwenden.
  5. Markieren Sie die Probenidentifikationen auf dem mattierten Ende der 2-Well-Kometenobjektträger und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei Raumtemperatur.

2. Vorbereitung der Proben

  1. Vor dem Tag des Experiments werden die Zellen in einer 6-Well-Schale ausgesät und über Nacht bei 37 °C mit 5 % CO2 kultiviert. Für U2OS-Zellen wurden für jede Probe etwa 2-3 x 105 Zellen ausgesät.
    HINWEIS: Die Anzahl der Zellen muss je nach dem für die Analysen verwendeten Zelltyp möglicherweise angepasst werden.
  2. Behandeln Sie die Zellen am Tag des Experiments mit den Bedingungen gemäß dem Versuchsplan. Als Positivkontrolle zum Nachweis der replikationsabhängigen Bruchinduktion werden die Zellen 1 h lang mit 1 μM CPT behandelt. CPT ist ein Topoisomerase-1-Inhibitor, der Doppelstrangbrüche replikationsabhängig induziert14.

3. Zellresuspension und Lyse

  1. Zellkulturmedien aspirieren und zweimal mit 1x PBS spülen.
  2. Geben Sie 300 μl Trypsin in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Schale in einem Gewebekultur-Inkubator für 2-3 Minuten.
    HINWEIS: Eine längere Inkubation in Trypsin kann bei Kometenanalysen zu falschen Ergebnissen führen.
  3. Geben Sie 700 μl Zellkulturmedium in jede Vertiefung. Resuspendieren Sie die Proben vorsichtig und überführen Sie sie in 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, Zellen in diesem Schritt zu zählen, um die entsprechende Zelldichte in Schritt 3.6 zu erhalten und die Häufigkeit von überlappenden Schwänzen während der Analyse zu reduzieren.
  4. Die Zellsuspension bei 2400 x g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.
  5. Aspirieren Sie das Medium und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml kaltem 1x PBS.
  6. Schritt 3.4 und Schritt 3.5 zweimal wiederholen und die Zellen in Kälte 1x PBS bei einer Zelldichte von 2 x 105 Zellen pro ml resuspendieren.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, die Lebensfähigkeit der Zellen in diesem Schritt zu beurteilen, um sicherzustellen, dass eine ausreichende Anzahl lebensfähiger Zellen vorhanden ist. Eine Lebensfähigkeit von mindestens 90 % wird empfohlen.
  7. Resuspendieren Sie 10 μl der Zellsuspension in 100 μl aliquotierter Agarose, mischen Sie die Mischung vorsichtig mit derselben Pipettenspitze und verteilen Sie sie gleichmäßig in einer Vertiefung des Objektträgers. Wiederholen Sie diesen Schritt bei Bedarf für alle Proben.
    HINWEIS: Vermeiden Sie es, alle Aliquote auf einmal aus dem 42 °C Wasserbad zu entfernen, um ein Festigen der Agarose zu verhindern. Dieser Schritt sollte vorzugsweise durch das Wasserbad durchgeführt werden, und jede Probe wird resuspendiert und gestaffelt verteilt. Vermeiden Sie das Einbringen von Blasen beim Verteilen der Agarose auf dem Objektträger, da die Lufteinschlüsse die Wanderung der Kometenschweife während der Elektrophorese beeinflussen (Schritt 4.5) und Risse im Trocknungsschritt (Schritt 5.3) verursachen
  8. Lagern Sie die Objektträger bei 4 °C im Dunkeln für 15-20 Minuten, um sicherzustellen, dass die Agarose vollständig erstarrt ist (Abbildung 2A).
  9. Legen Sie die Objektträger in Coplin-Gläser und tauchen Sie die Objektträger 1 h lang bei Raumtemperatur in Lysepuffer.
  10. Spülen Sie die Objektträger einmal mit kaltem TAE-Puffer ab und tauchen Sie die Objektträger für 30 min bei 4 °C in kalten TAE-Puffer.

4. Elektrophorese

  1. Stellen Sie die elektrophoretische Kammer auf eine ebene Fläche und nivellieren Sie das System mit den vier Nivellierknöpfen an den Rändern des Geräts. Legen Sie Kühlakkus in die untere Kammer, um die Lösung während der Elektrophorese kalt zu halten.
  2. Gießen Sie ca. ~850 mL kalten 1x TAE-Puffer in das Gerät.
  3. Nehmen Sie die Objektträger bei 4 °C heraus und legen Sie sie in der richtigen Ausrichtung auf die Elektrophoreseschale, um die Migration der zerbrochenen DNA zu ermöglichen.
    HINWEIS: Das Tablett fasst zehn 2-Well-Objektträger. Platzieren Sie die Objektträger in der Mitte des Tabletts, wenn Sie mit weniger Proben arbeiten. Wenn Sie mit einer ungeraden Anzahl von Folien arbeiten, fügen Sie eine leere Folie so ein, dass jede Vertiefung 2 Folien aufnehmen kann.
  4. Legen Sie die mitgelieferte Folienablage vorsichtig auf die Ablage, um die Objektträger abzudecken.
    HINWEIS: Für einen ordnungsgemäßen Betrieb des Geräts sollte das Volumen des TAE-Puffers nicht niedriger sein als die Unterseite des Overlays und nicht größer als die Oberseite des Overlays.
  5. Stellen Sie nach dem Anschließen der Kabel die Stromversorgung auf 21 V ein und führen Sie eine Elektrophorese (1 V/cm) für 40 Minuten durch.
    HINWEIS: Die Elektrophoresezeit muss je nach dem für die Analysen verwendeten Zelltyp möglicherweise angepasst werden. Lange Schwänze in unbehandelten Proben deuten auf eine übermäßige Laufzeit hin. Umgekehrt können kurze Schwänze in Positivkontrollproben eine unzureichende Laufzeit widerspiegeln.

5. Färben

  1. Nach Abschluss der Elektrophorese werden die Objektträger aus dem Gerät genommen und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in DNA-Fällungslösung getaucht.
  2. Entsorgen Sie die DNA-Fällungslösung und tauchen Sie die Objektträger 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in 70%ige Ethanollösung.
  3. Die 70%ige Ethanollösung verwerfen. Die Objektträger werden entnommen und in einem Hybridisierungsofen bei 45 °C für 30 min im Dunkeln getrocknet (Abbildung 2B).
    HINWEIS: Die Objektträger können für den Trocknungsschritt über Nacht an einem dunklen, trockenen Ort aufbewahrt werden.
  4. Inkubieren Sie die Vertiefungen mit 100 μl 1x SYBR Green Lösung für 30 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.
  5. Dekantieren Sie die SYBR Green-Lösung, indem Sie die Objektträger kippen und den Überschuss entfernen, indem Sie den Rand der Vertiefung vorsichtig mit einem fusselfreien Tuch abtupfen.
  6. Legen Sie die Dias in eine Schublade und lassen Sie sie 30 Minuten trocknen.
  7. Fahren Sie mit der Bildgebung der Objektträger fort.

6. Bildgebung und Analysen

  1. Richten Sie das Mikroskop für bildgebende Zwecke ein.
    HINWEIS: Alle Bilder wurden mit einem Epifluoreszenzmikroskop aufgenommen. Es wurde eine 10-fache Vergrößerung mit 0,45 numerischer Apertur mit einer Belichtungszeit von 1/40s und einer Verstärkung von +6dB verwendet. Der Capture-Modus von monochromem 8bit wurde mit 2 x 2 Binning und Schwarzabgleichskorrektur verwendet.
  2. Legen Sie die Objektträger auf den Mikroskoptisch und beginnen Sie mit der Bildgebung mit dem FITC-Filter.
    HINWEIS: Verwenden Sie zuerst die unbehandelte Probe, um die Expositionszeit zu testen. Die meisten Zellen weisen keine Kometenschweife auf, da die DNA kompakter ist. Wechseln Sie zur Vertiefung mit CPT-behandelten Zellen und bilden Sie bei gleicher Belichtungszeit ab. Kometenschweife mit zunehmender Länge werden in dieser Probe aufgrund der Migration von gebrochenen DNA-Enden beobachtet.
  3. Erfassen Sie Bilder von mindestens 100 Kometen pro Probe mit der gleichen Belichtungszeit für drei technische Replikate.
    HINWEIS: Kometenschwänze am Ende von Deckgläsern neigen dazu, ungleichmäßig zu wandern und wirken als Ausreißer in der Probenverteilung. Die meisten Kometen, die für die Analyse aufgenommen wurden, befinden sich in der Nähe der Mitte des Deckglases (Abbildung 3).
  4. Exportieren Sie Bilder und bewerten Sie die Kometen entweder manuell (mit Image J) oder mit Hilfe einer frei verfügbaren Kometenbewertungssoftware. Kometen, die individuell unterscheidbar sind und vollständig im Sichtfeld enthalten sind, werden für die Bewertung ausgewählt. Überlappende oder teilweise sichtbare Kometen werden für weitere Analysen nicht berücksichtigt (Abbildung 4).
    HINWEIS: Benutzer können Kometen auf Bild J mit dem folgenden Plugin bewerten: https://cometbio.org/index.html. Details zur Bewertung von Kometen mit der CometScore-Software sind in Abbildung 5 enthalten.
  5. Plot Tail Momente, die aus den Analysen als Box- und Whisker-Plots gewonnen wurden, die 10-90 Perzentilwerte darstellen. Führen Sie Normalitätstests durch, um zu bestimmen, ob parametrische oder nicht-parametrische Tests für statistische Analysen verwendet werden sollten.
    HINWEIS: In den meisten Fällen werden nichtparametrische Tests mit dem Mann-Whitney-Test angewendet, wenn nur zwei Stichproben verglichen werden, oder mit dem Kruskal-Wallis-Test mit den Mehrfachvergleichen von Dunn, wenn drei oder mehr Stichproben verglichen werden.

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Ergebnisse

Analyse der Bruchinduktion durch Replikationsstressreagenzien
U2OS-Zellen wurden 4 h lang mit DMSO, 4 mM Hydroxyharnstoff (HU) oder 100 nM CPT behandelt und mit dem NC-Assay auf Bruchakkumulation analysiert (Abbildung 6A). Während CPT während der S-Phase Brüche induziert, indem es die Topoisomerase-1blockiert 13, blockiert die HU-induzierte Depletion von Nukleotidpools die Replikationsgabeln, die progressiv in DSBs umgewandelt werden

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Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt einen NC-Assay zur Beurteilung von DNA-Brüchen in menschlichen Zellen, die sich einer aktiven Replikation unterziehen. Das Protokoll ist relativ einfach durchzuführen und kann von den Forschern problemlos an Bedingungen mit hohem pH-Wert für alkalische Analysen angepasstwerden 8. Es umfasst zwei kritische Schritte, wie in den Schritten 3.7 und 4.5 beschrieben. In Schritt 3.7 ist es wichtig, die geschmolzene Agarose mit den Zellen gleichmäßig über die Vertiefung zu verte...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.

Danksagungen

Wir danken den Mitgliedern des Dungrawala-Labors für ihren Input und ihr Feedback. Diese Arbeit wurde durch NIH-Zuschüsse R35GM137800 für die Huntington-Krankheit finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1x DPBSGibco14190144
CamptothecinSelleckchemS1288
Comet LMAgarose (LMA)R& D systems4250-050-02
CometAssay Elektrophorese-System IIR& D systems4250-050-ESInklusive Elektrophoresetank, Sicherheitsdeckel, Kabeln, 2/20-Wells-Objektträgerschalen und Objektträger-Tablett-Overlay
CometScore-SoftwareTriTekOpen-Source-CometSlide
R& D systems4250-050-03
DMEM,Gibco11965092
DMEM/F12Gibco11320033
DMSO FisherSciD128-4
EpifluoreszenzmikroskopKeyenceBZ-X810
Fötales Rinderserum - PremiumBio-TechneS11150
Gibco Trypsin-EDTA (0,05%), phenolrotGibco25300054
GraphPad Prism 10.0GraphPad
HEK293T ZellenATCCCRL-11268
hTERT-RPE-1-ZellenATCCCRL-4000
HydroxyharnstoffMillipore SigmaH8627
PARP-Inhibitor OlaparibSelleckchemS8096
PowerPac FisherSciFB300Q
Oberflächenbehandelte sterile GewebekulturplatteFisherSciFB012927
SYBR Green I Nukleinsäure-Gel-Färbung (10.000x)FisherSciS7567
U2OS-ZellenATCCHTB-96
UVP  HB-1000 Hybridisierungs-InkubatorFisherSciUVP95003001

Referenzen

  1. Olive, P. L. Cell proliferation as a requirement for development of the contact effect in Chinese hamster v79 spheroids. Radiat Res. 117 (1), 79-92 (1989).
  2. Olive, P. L., Banath, J. P., Durand, R. E. Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells measured using the "comet" assay. Radiat Res. 122 (1), 86-94 (1990).
  3. Singh, N. P., Mccoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Exp Cell Res. 175 (1), 184-191 (1988).
  4. Olive, P. L., Banath, J. P. The comet assay: A method to measure DNA damage in individual cells. Nat Protoc. 1 (1), 23-29 (2006).
  5. De Lapuente, J., et al. The comet assay and its applications in the field of ecotoxicology: A mature tool that continues to expand its perspectives. Front Genet. 6, 180(2015).
  6. Azqueta, A., et al. Application of the comet assay in human biomonitoring: An hcomet perspective. Mutat Res Rev Mutat Res. 783, 108288(2020).
  7. Speit, G., Hartmann, A. The comet assay: A sensitive genotoxicity test for the detection of DNA damage. Methods Mol Biol. 291, 85-95 (2005).
  8. Collins, A., et al. Measuring DNA modifications with the comet assay: A compendium of protocols. Nat Protoc. 18 (3), 929-989 (2023).
  9. Rapp, A., Hausmann, M., Greulich, K. O. The comet-fish technique: A tool for detection of specific DNA damage and repair. Methods Mol Biol. 291, 107-119 (2005).
  10. Saldivar, J. C., Cortez, D., Cimprich, K. A. The essential kinase atr: Ensuring faithful duplication of a challenging genome. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (10), 622-636 (2017).
  11. Cimprich, K. A., Cortez, D. Atr: An essential regulator of genome integrity. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (8), 616-627 (2008).
  12. Cortez, D. Replication-coupled DNA repair. Mol Cell. 74 (5), 866-876 (2019).
  13. Strumberg, D., et al. Conversion of topoisomerase I cleavage complexes on the leading strand of ribosomal DNA into 5'-phosphorylated DNA double-strand breaks by replication runoff. Mol Cell Biol. 20 (11), 3977-3987 (2000).
  14. Pommier, Y. Topoisomerase I inhibitors: Camptothecins and beyond. Nat Rev Cancer. 6 (10), 789-802 (2006).
  15. Hsiang, Y. H., Hertzberg, R., Hecht, S., Liu, L. F. Camptothecin induces protein-linked DNA breaks via mammalian DNA topoisomerase i. J Biol Chem. 260 (27), 14873-14878 (1985).
  16. Bryant, H. E., et al. Specific killing of brca2-deficient tumours with inhibitors of poly(adp-ribose) polymerase. Nature. 434 (7035), 913-917 (2005).
  17. Helleday, T. The underlying mechanism for the parp and BRCA synthetic lethality: Clearing up the misunderstandings. Mol Oncol. 5 (4), 387-393 (2011).
  18. Mcglynn, A. P., et al. The bromodeoxyuridine comet assay: Detection of maturation of recently replicated DNA in individual cells. Cancer Res. 59 (23), 5912-5916 (1999).
  19. Morocz, M., Gali, H., Rasko, I., Downes, C. S., Haracska, L. Single cell analysis of human rad18-dependent DNA post-replication repair by alkaline bromodeoxyuridine comet assay. PLoS One. 8 (8), e70391(2013).
  20. Thakar, T., et al. Lagging strand gap suppression connects BRCA-mediated fork protection to nucleosome assembly through PCNA-dependent CAF-1 recycling. Nat Commun. 13 (1), 5323(2022).
  21. Vaitsiankova, A., et al. Parp inhibition impedes the maturation of nascent DNA strands during DNA replication. Nat Struct Mol Biol. 29 (4), 329-338 (2022).
  22. Dungrawala, H., et al. Radx promotes genome stability and modulates chemosensitivity by regulating rad51 at replication forks. Mol Cell. 67 (3), 374-386.e5 (2017).
  23. Townsend, A., Lora, G., Engel, J., Tirado-Class, N., Dungrawala, H. Dcaf14 promotes stalled fork stability to maintain genome integrity. Cell Rep. 34 (4), 108669(2021).
  24. Lemacon, D., et al. Mre11 and exo1 nucleases degrade reversed forks and elicit mus81-dependent fork rescue in brca2-deficient cells. Nat Commun. 8 (1), 860(2017).
  25. Leung, W., et al. Atr protects ongoing and newly assembled DNA replication forks through distinct mechanisms. Cell Rep. 42 (7), 112792(2023).
  26. Bhowmick, R., Mehta, K. P. M., Lerdrup, M., Cortez, D. Integrator facilitates RNApii removal to prevent transcription-replication collisions and genome instability. Mol Cell. 83 (13), 2357-2366.e8 (2023).
  27. Mosler, T., et al. R-loop proximity proteomics identifies a role of ddx41 in transcription-associated genomic instability. Nat Commun. 12 (1), 7314(2021).
  28. Petermann, E., Orta, M. L., Issaeva, N., Schultz, N., Helleday, T. Hydroxyurea-stalled replication forks become progressively inactivated and require two different rad51-mediated pathways for restart and repair. Mol Cell. 37 (4), 492-502 (2010).
  29. Sestili, P., Cantoni, O. Osmotically driven radial diffusion of single-stranded DNA fragments on an agarose bed as a convenient measure of DNA strand scission. Free Radic Biol Med. 26 (7-8), 1019-1026 (1999).
  30. Sestili, P., Martinelli, C., Stocchi, V. The fast halo assay: An improved method to quantify genomic DNA strand breakage at the single-cell level. Mutat Res. 607 (2), 205-214 (2006).
  31. Gorczyca, W., Gong, J., Darzynkiewicz, Z. Detection of DNA strand breaks in individual apoptotic cells by the in situ terminal deoxynucleotidyl transferase and nick translation assays. Cancer Res. 53 (8), 1945-1951 (1993).
  32. Hanada, K., et al. The structure-specific endonuclease mus81 contributes to replication restart by generating double-strand DNA breaks. Nat Struct Mol Biol. 14 (11), 1096-1104 (2007).

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