Dieses Protokoll wurde entwickelt, um das Ausmaß der DNA-Schäden zu untersuchen, die während der DNA-Replikation auftreten. Unter neutralen Bedingungen kann die Induktion von DNA-Brüchen innerhalb eines kurzen Zeitrahmens gut beurteilt werden. Darüber hinaus ist das Protokoll an andere Zelltypen und verschiedene Replikationsstressreagenzien anpassbar.
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Methodenartikel
Nachweis von DNA-Brüchen in sich teilenden menschlichen Zellen durch neutralen Kometen-Assay
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die DNA-Replikation wird ständig durch eine Vielzahl von endogenen und exogenen Stressoren herausgefordert, die die DNA schädigen können. Solche Läsionen, die während der Genomduplikation auftreten, können Replisomen blockieren und Replikationsgabeln in Doppelstrangbrüche umwandeln. Wenn diese toxischen DNA-Brüche nicht repariert werden, können sie chromosomale Umlagerungen auslösen, was zu einer erhöhten Instabilität des Genoms und einer erhöhten Wahrscheinlichkeit einer zellulären Transformation führt. Darüber hinaus weisen Krebszellen einen anhaltenden Replikationsstress auf, was die Anfälligkeit der Replikationsgabel in Tumorzellen zu einer attraktiven Strategie für die Chemotherapie macht. Eine äußerst vielseitige und leistungsstarke Technik zur Untersuchung von DNA-Brüchen während der Replikation ist der Comet-Assay. Diese Gelelektrophorese-Technik detektiert zuverlässig die Induktion und Reparatur von DNA-Brüchen auf Einzelzellebene. Darin wird ein Protokoll skizziert, das es den Forschern ermöglicht, das Ausmaß der DNA-Schädigung bei der mitotischen Teilung menschlicher Zellen mit Hilfe von Gabel-Stalling-Mitteln über mehrere Zelltypen hinweg zu messen. Die Kopplung mit der automatisierten Kometenbewertung ermöglicht eine schnelle Analyse und erhöht die Zuverlässigkeit bei der Untersuchung der Induktion von DNA-Brüchen.
Einleitung
Der Comet-Assay ist eine Gelelektrophorese-Methode, die zum Nachweis von DNA-Brüchen auf Einzelzellebene verwendet wird. Es beruht auf dem Prinzip, dass offene DNA-Brüche unter elektrophoretischen Bedingungen wandern, während intakte DNA weitgehend statisch bleibt. Gebrochene DNA wandert, weil Brüche zu einer Entspannung der supercoiled DNA führen, was zu einer allmählichen räumlichen Verlagerung in Richtung der Anode in der elektrophoretischen Kammer führt, was zu einem kometenähnlichen Aussehen führt, das durch Immunfluoreszenz beobachtet wird 1,2. Das Ausmaß der DNA-Schädigung wird dann gemessen, indem die ....
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Protokoll
Dieses Protokoll (Abbildung 1) verwendet in erster Linie adhärente U2OS-Krebszelllinien, ist aber auch an eine Vielzahl von adhärenten und Suspensionszellen anpassbar, die in Gewebekulturen gezüchtet wurden. Die in dieser Studie verwendeten Lösungen und Puffer sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.
1. Vorbereitung der Materialien
- Stellen Sie vor dem Tag des Experiments die mitgelieferte Flasche mit niedrigschmelzender Agarose (1% niedrigschmelzende Agarose in PBS) für 5-10 Minuten in ein heißes W....
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Ergebnisse
Analyse der Bruchinduktion durch Replikationsstressreagenzien
U2OS-Zellen wurden 4 h lang mit DMSO, 4 mM Hydroxyharnstoff (HU) oder 100 nM CPT behandelt und mit dem NC-Assay auf Bruchakkumulation analysiert (Abbildung 6A). Während CPT während der S-Phase Brüche induziert, indem es die Topoisomerase-1blockiert 13, blockiert die HU-induzierte Depletion von Nukleotidpools die Replikationsgabeln, die progressiv in DSBs umgewandelt werden
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Diskussion
Dieses Protokoll beschreibt einen NC-Assay zur Beurteilung von DNA-Brüchen in menschlichen Zellen, die sich einer aktiven Replikation unterziehen. Das Protokoll ist relativ einfach durchzuführen und kann von den Forschern problemlos an Bedingungen mit hohem pH-Wert für alkalische Analysen angepasstwerden 8. Es umfasst zwei kritische Schritte, wie in den Schritten 3.7 und 4.5 beschrieben. In Schritt 3.7 ist es wichtig, die geschmolzene Agarose mit den Zellen gleichmäßig über die Vertiefung zu verte.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.
Danksagungen
Wir danken den Mitgliedern des Dungrawala-Labors für ihren Input und ihr Feedback. Diese Arbeit wurde durch NIH-Zuschüsse R35GM137800 für die Huntington-Krankheit finanziert.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1x DPBS | Gibco | 14190144 | |
| Camptothecin | Selleckchem | S1288 | |
| Comet LMAgarose (LMA) | R& D systems | 4250-050-02 | |
| CometAssay Elektrophorese-System II | R& D systems | 4250-050-ES | Inklusive Elektrophoresetank, Sicherheitsdeckel, Kabeln, 2/20-Wells-Objektträgerschalen und Objektträger-Tablett-Overlay |
| CometScore-Software | TriTek | Open-Source-CometSlide | |
| R& D systems | 4250-050-03 | ||
| DMEM, | Gibco | 11965092 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO | FisherSci | D128-4 | |
| Epifluoreszenzmikroskop | Keyence | BZ-X810 | |
| Fötales Rinderserum - Premium | Bio-Techne | S11150 | |
| Gibco Trypsin-EDTA (0,05%), phenolrot | Gibco | 25300054 | |
| GraphPad Prism 10.0 | GraphPad | ||
| HEK293T Zellen | ATCC | CRL-11268 | |
| hTERT-RPE-1-Zellen | ATCC | CRL-4000 | |
| Hydroxyharnstoff | Millipore Sigma | H8627 | |
| PARP-Inhibitor Olaparib | Selleckchem | S8096 | |
| PowerPac | FisherSci | FB300Q | |
| Oberflächenbehandelte sterile Gewebekulturplatte | FisherSci | FB012927 | |
| SYBR Green I Nukleinsäure-Gel-Färbung (10.000x) | FisherSci | S7567 | |
| U2OS-Zellen | ATCC | HTB-96 | |
| UVP HB-1000 Hybridisierungs-Inkubator | FisherSci | UVP95003001 |
Referenzen
- Olive, P. L. Cell proliferation as a requirement for development of the contact effect in Chinese hamster v79 spheroids. Radiat Res. 117 (1), 79-92 (1989).
- Olive, P. L., Banath, J. P., Durand, R. E.
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Nachdrucke und Genehmigungen
