Methodenartikel

Generierung von Gefäßorganoiden aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen

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DOI:

10.3791/67125

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13. Dezember 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Columbia University, 2College of Dental Medicine, Division of Periodontics, Columbia University, 3Department of Pharmaceutical Sciences, University at Buffalo, The State University of New York

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt ein Verfahren zur Erzeugung von Gefäßorganoiden unter Verwendung menschlicher pluripotenter Stammzellen vor.

Zusammenfassung

Vaskuläre Organoide, die aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) gewonnen werden, rekapitulieren die Zelltypenvielfalt und die komplexe Architektur menschlicher Gefäßnetzwerke. Dieses dreidimensionale (3D) Modell birgt ein erhebliches Potenzial für die Modellierung der Gefäßpathologie und das In-vitro-Wirkstoffscreening . Trotz der jüngsten Fortschritte besteht nach wie vor eine zentrale technische Herausforderung darin, Organoide mit gleichbleibender Qualität reproduzierbar zu erzeugen, was für nachgelagerte Assays und Anwendungen von entscheidender Bedeutung ist. Hier wird ein modifiziertes Protokoll vorgestellt, das sowohl die Homogenität als auch die Reproduzierbarkeit der Generierung von vaskulären Organoiden verbessert. Das modifizierte Protokoll beinhaltet die Verwendung von Mikrowells und des CEPT-Cocktails (Chroman 1, Emricasan, Polyamine und der integrierte Stressreaktionshemmer trans-ISRIB), um die Körperbildung von Embryoiden und das Überleben der Zellen zu verbessern. Differenzierte, reife Gefäßorganoide, die mit diesem Protokoll erzeugt werden, werden mittels 3D-Immunfluoreszenzmikroskopie charakterisiert, um ihre Morphologie und komplexe Gefäßstruktur zu analysieren. Dieses Protokoll ermöglicht die skalierbare Herstellung hochwertiger vaskulärer Organoide und erleichtert so möglicherweise deren Einsatz in der Krankheitsmodellierung und beim Wirkstoffscreening.

Einleitung

In vitro sind in den letzten zehn Jahren mikrophysiologische In-vitro-Modelle, einschließlich Organoid- und Tissue-on-a-Chip-Systeme, entstanden 1,2,3. Diese dreidimensionalen (3D), aus menschlichen Zellen gewonnenen Systeme beheben die Einschränkungen herkömmlicher zweidimensionaler (2D) Zellkultur- und Tiermodelle, wie z. B. das Fehlen vieler Komponenten in der physiologischen Mikroumgebung bzw. genetische Unterschiede zwischen den Arten. Sie liefern physiologischere Erkenntnisse und eignen sich besser für die Modellierung von Krankheiten und das Wirkstoffscreening als herkömmliche Modelle. Unter den mikrophysiologischen Modellen haben Organoide, die aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) gewonnen wurden, bewiesen, dass sie die architektonischen Merkmale nativer menschlicher Gewebe effektiv rekapitulieren und so entwickelt wurden, dass sie verschiedene menschliche Organe nachahmen, einschließlich des Gehirns 4,5, der Niere6, der Leber 7,8 und der Netzhaut9. Hier konzentrieren wir uns insbesondere auf die Erzeugung von vaskulären Organoiden aus hiPS-Zellen und skizzieren ein schlankes Protokoll, das darauf abzielt, die Variationen zwischen verschiedenen Organoidproben und -chargen zu minimieren und dadurch die Reproduzierbarkeit insgesamt zu verbessern.

Das Gefäßsystem spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der physiologischen Homöostase in allen menschlichen Organen. Die Bildung von Gefäßen umfasst die Prozesse der Vaskulogenese und Angiogenese, die durch die Wechselwirkungen zwischen Endothel- und Wandzellen (z. B. Perizyten und vaskuläre glatte Muskelzellen) orchestriert und durch verschiedene Reize beeinflusst werden10. Penninger, Wimmer und Kollegen entwickelten die erste Methode zur Erzeugung von vaskulären Organoiden11,12, die diese beiden Prozesse nachahmt. Mit den aus dieser Methode generierten Organoiden haben ihre Gruppe12 und wir13,14 das Potenzial von Gefäßorganoiden für die Modellierung von Gefäßstörungen bei Krankheiten demonstriert. Zum Beispiel wurden in unseren jüngsten Arbeiten 13,14 unterschiedliche Phänotypen beobachtet, wie z.B. Gefäßkeimungen und Variationen der Zusammensetzung von Wandzellen, zwischen krankheitsimitierenden Gefäßorganoiden und ihren Wildtyp-Gegenstücken. Diese Beispiele zeigen, dass das Modell der vaskulären Organoide als Plattform für das Wirkstoffscreening dienen könnte, indem es krankheitsbedingte Gefäßfehlfunktionen nachahmt.

Aufbauend auf den ersten Arbeiten zur Generierung von Gefäßorganoiden11,12 wird ein überarbeitetes Protokoll vorgestellt, das die Verwendung von Mikrowells zur Erleichterung der Bildung eines homogenen Embryoidkörpers (EB) beinhaltet, ein kritischer Faktor bei der Minimierung der Variationen, die häufig innerhalb derselben Organoid-Generationscharge auftreten. Darüber hinaus wird der CEPT-Cocktail, eine Kombination aus Chroman 1, Emricasan, Polyaminen und dem integrierten Stress-Response-Inhibitor (trans-ISRIB)15, eingesetzt, um die Lebensfähigkeit von hiPSCs und differenzierten Zellen während des EB-Bildungsprozesses zu verbessern. Diese Modifikation dient hauptsächlich dazu, die Schwankungen zwischen verschiedenen Organoidproben und Chargen zu reduzieren. Mit diesem etwa zweiwöchigen Protokoll können einheitliche vaskuläre Organoide hergestellt werden, bei denen die Vaskulogenese induziert wird, um das Endothel an Tag 1 in primitiven röhrenförmigen Netzwerken zu organisieren, gefolgt von einer Angiogenese-Induktion an Tag 5, um komplexe Gefäßnetzwerke in Organoiden zu entwickeln. An Tag 12-15 sollten die erzeugten Organoide reife Gefäßnetzwerke aufweisen, die sowohl aus Endothel- als auch aus Wandzellen bestehen.

Protokoll

Abbildung 1 zeigt einen Überblick über die Schritte, die an diesem Protokoll beteiligt sind. Detaillierte Informationen zu den in diesem Protokoll verwendeten Reagenzien und Materialien finden Sie in der Materialtabelle. Es wird empfohlen, alle Medien vor der Verwendung auf 37 °C vorzuwärmen, sofern nicht anders angegeben. Alle Zellkulturmaterialien und -materialien sollten entweder autoklaviert oder steril sein, und die Zellhandhabung sollte in einer Biosicherheitswerkbank erfolgen. Zusätzlich sollte der pH-Wert der Kollagen-I-Mischung sorgfältig auf pH 7,3 eingestellt werden, um mögliche Verfestigungsprobleme zu vermeiden.

1. Aufrechterhaltung der menschlichen iPS-Zellen

  1. Tauen Sie den Basalmembranmatrix-Extrakt auf Eis auf, schütteln Sie die Flasche vorsichtig, um die Lösung zu mischen, und stellen Sie mit einer P1000-Pipette und vorgekühlten Spitzen 0,5-ml-Aliquote in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen her. Lagern Sie die Aliquots bis zu 1 Jahr bei -20 °C.
  2. Tauen Sie ein Aliquot des Matrixextrakts (0,5 mL) auf Eis auf. Mischen Sie es mit 49,5 mL vorgekühltem DMEM/F12-Medium in einem 50-ml-Röhrchen. Verteilen Sie die Mischung in 6-Well-Platten und schütteln Sie die Platte dann vorsichtig, um sicherzustellen, dass die flüssige Lösung die gesamte Vertiefung bedeckt. Verschließen Sie die Platten mit Paraffinfolie und lagern Sie sie bis zu 1 Woche bei 4 °C.
  3. Bereiten Sie das hiPSC-Expansionsmedium wie in Tabelle 1 beschrieben vor. Das gesamte Medium (40 ml/Röhrchen) aliquotiert und bis zu 1 Jahr bei -20 °C lagern.
  4. Legen Sie eine vorbeschichtete Platte für 1 h in den 37 °C-Inkubator, bevor Sie die hiPSC-Kultur beginnen.
  5. Das hiPSC-Expansionsmedium (40 mL) bei 37 °C vorwärmen und das hiPSC-Saatmedium wie in Tabelle 2 beschrieben vorbereiten.
  6. Übertragen Sie die beschichtete Platte aus dem 37 °C Inkubator in die Biosicherheitswerkbank. Ersetzen Sie das Medium in der beschichteten Platte durch hiPSC-Sämedium (1 mL/Well).
  7. Tauen Sie ein kryokonserviertes Fläschchen mit hiPS-Zellen aus dem Kryotank in einem 37 °C warmen Wasserbad für 1 min auf.
  8. Übertragen Sie die Zellen in ein 15-ml-Röhrchen und fügen Sie dann 5 mL DMEM/F12-Medium hinzu, gefolgt von einer Zentrifugation bei 100 x g für 3 Minuten bei Raumtemperatur, um die Zellen zu sammeln.
  9. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen mit 1,5 mL hiPSC-Seeding-Medium. Resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig im 15-ml-Röhrchen.
  10. Aliquotieren Sie 10 μl der Zellsuspension und mischen Sie sie mit 10 μl Trypanblaulösung. Übertragen Sie die 10-μl-Mischung auf den Objektträger des Hämazytometers und decken Sie ihn mit einem Deckglas ab.
  11. Montieren Sie den Objektträger auf der Halterung und setzen Sie ihn in den automatischen Zellzähler ein. Warten Sie, bis das Instrument den Fokus gefunden hat, oder stellen Sie den Fokus manuell ein, indem Sie die Fokustaste +/- auf dem Bildschirm drücken. Verwenden Sie anschließend die Standardeinstellung und drücken Sie die Aufnahmetaste. Verwenden Sie den LIVE-Zelldichtemesswert als Konzentration der in Schritt 1.9 hergestellten hiPSC-Suspension.
  12. Saat 2 × 105 Zellen in jede Vertiefung und achtet darauf, dass die Zellen gleichmäßig in der Vertiefung verteilt sind.
  13. Kulturieren Sie die Zellen bei 37 °C mit 5 % CO2 und ersetzen Sie das Medium nach 24 h durch hiPSC-Expansionsmedium (1,5 mL/Well).
  14. Wechseln Sie das Medium täglich, bis die Zellen eine Konfluenz von 80% erreichen. Überprüfen Sie routinemäßig die Zellmorphologie und die Koloniegröße, um sicherzustellen, dass keine spontane Differenzierung erfolgt. Verwerfen Sie die Kultur und starten Sie sie mit einer neuen Charge von hiPSCs neu, wenn eine umfangreiche (>5%) spontane Differenzierung beobachtet wird.

2. EB-Bildung (Tag 0)

  1. Bereiten Sie an Tag 0 das DMEM/F12-Medium, das hiPSC-Aussaatmedium und die Zellablösung, und wärmen Sie es 20-30 Minuten lang bei 37 °C vor.
  2. Nehmen Sie das Nährmedium von der 6-Well-Platte und fügen Sie eine vorgewärmte Zellablösungslösung (1,5 ml/Well) hinzu. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für 5-7 min.
  3. Übertragen Sie die Platte in die Biosicherheitswerkbank, klopfen Sie auf die Platte, um hiPS-Kolonien zu lösen, und brechen Sie die Aggregate auf.
  4. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15-ml-Röhrchen. Fügen Sie 4,5 mL DMEM/F12-Medium hinzu. Pipettieren Sie die Mischung vorsichtig mit einer serologischen 10-ml-Pipette fünfmal auf und ab, um die Zellen in eine Einzelzellsuspension zu dissoziieren. Vermeiden Sie die Bildung von Blasen.
  5. Zentrifugieren Sie bei 100 x g für 3 min bei Raumtemperatur, um die Zellen zu sammeln.
  6. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig mit 1 ml hiPSC-Seeding-Medium unter Verwendung einer P1000-Pipette.
  7. Mischen Sie 10 μl Zellsuspension mit 10 μl Trypanblau-Lösung für die Zellzählung. Übertragen Sie 10 μl der Mischung auf den Objektträger des Hämazytometers und decken Sie ihn mit einem Deckglas ab. Montieren Sie den Objektträger auf der Halterung und setzen Sie ihn in den automatischen Zellzähler ein. Nachdem das Gerät den Fokus gefunden hat, drücken Sie die Capture-Taste und verwenden Sie den LIVE-Zelldichtemesswert , um die Konzentration der hiPSC-Suspension zu bestimmen.
  8. Aussaat der Zellen in der Mikrotiterplatte mit extrem geringer Bindung mit rundem Boden und einer Dichte von 2,7 × 105 Zellen/Well, um 500-1.000 Zellen pro EB zu erhalten.
  9. Geben Sie 2 ml hiPSC-Aussaatmedium in jede Vertiefung und mischen Sie die Lösung vorsichtig, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen.
  10. Die Zellen werden bei 37 °C mit 5 % CO2 für 24 h kultiviert.

3. Gefäßdifferenzierung (Tag 1 - 5)

  1. Bereiten Sie an Tag 1 das Mesoderm-Induktionsmedium (MIM) wie in Tabelle 3 und Tabelle 4 beschrieben vor und wärmen Sie es 20 Minuten lang bei 37 °C vor. Das MIM-Medium muss frisch hergestellt werden.
  2. Verwenden Sie eine P200-Pipette, um das Medium vorsichtig aus der Mikrotiterplatte zu aspirieren, ohne die EBs am Boden zu stören.
  3. Geben Sie langsam 2,5 ml MIM mit einer P200-Pipette hinzu. Kultivieren Sie die EBs 2 Tage lang in MIM bei 37 °C mit 5 % CO2 .
  4. Ersetzen Sie das Medium an Tag 3 vorsichtig durch vorgewärmte, frisch hergestellte 2,5 mL des Gefäßdifferenzierungsmediums 1 (VDM1, Tabelle 5), ohne die EBs am Boden der Mikrovertiefung zu stören. Kulturieren Sie die Zellen bei 37 °C mit 5% CO2 für weitere 2 Tage.

4. Hydrogel-Einbettung (Tag 5)

  1. Bereiten Sie die Kollagen-I-Mischung wie in Tabelle 6 beschrieben vor. Stellen Sie ein 50-ml-Röhrchen auf Eis und fügen Sie anschließend Kollagen-I-Lösung, H2O, 10 × DMEM/F12-Medium, Natriumbicarbonat und HEPES hinzu. Mischen Sie gründlich, indem Sie die Tube leicht schütteln. Geben Sie 1 M NaOH-Lösung tropfenweise hinzu, während Sie die gemischte Lösung schütteln, um den pH-Wert auf 7,3 einzustellen, und überprüfen Sie den pH-Wert der Mischung mit einem pH-Messgerät.
    HINWEIS: Alle Lösungen sollten vor der Verwendung auf Eis vorgekühlt werden. Führen Sie den Eingriff die ganze Zeit auf Eis in der Biosicherheitswerkbank durch. Die Zugabe der NaOH-Lösung ist von entscheidender Bedeutung, und eine schnelle Dispergierung zur Herstellung einer homogenen Lösung ist erforderlich, um eine lokale Aushärtung von Kollagen I zu vermeiden. Das Volumen von NaOH kann je nach Chargennummer der verwendeten Kollagen-I-Lösung variieren. Zum Mischen nicht kräftig pipettieren, da die Scherspannung zu einer unerwünschten Vorhärtung führen kann.
  2. Bereiten Sie die Kollagen-I-Basalmembran-Matrix-Mischung wie in Tabelle 7 beschrieben vor. Geben Sie 1,25 ml Basalmembranmatrix zu der 5 ml Kollagen I-Mischung, die in Schritt 4.1 hergestellt wurde. Mischen Sie die Lösung vorsichtig, indem Sie das Röhrchen schütteln.
  3. Stellen Sie eine 12-Well-Platte für 2 Minuten auf Eis.
  4. Geben Sie die Kollagen-I-Basalmembran-Matrix-Mischung langsam mit den Spitzen mit breiter Bohrung in die 12-Well-Platte (1,5 ml/Well). Achten Sie darauf, dass die Mischung gleichmäßig verteilt ist.
  5. Legen Sie die Platte für 2 h in den 37 °C Inkubator, um die erste Schicht Hydrogel zu verfestigen.
  6. Bewahren Sie die restliche Kollagen-I-Basalmembran-Matrix-Mischung für die spätere Verwendung auf Eis auf.
  7. Übertragen Sie ~60 Zellaggregate in ein 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen und kühlen Sie das Röhrchen 5 Minuten lang auf Eis ab. Entfernen Sie das Medium vorsichtig mit einer P200-Pipettenspitze.
    HINWEIS: Starten Sie diesen Schritt 1,5 Stunden nach Schritt 4.5.
  8. Geben Sie tropfenweise 1,5 ml Kollagen-I-Basalmembran-Mischung zu den Aggregaten und mischen Sie sie vorsichtig mit P200-Pipettenspitzen mit breiter Bohrung.
  9. Übertragen Sie die Platte mit der ersten Schicht Hydrogel aus dem Inkubator (Schritt 4.5) in die Biosicherheitswerkbank.
  10. Geben Sie 1,5 mL der Zuschlagstoffsuspension auf die ausgehärtete Schicht. Schütteln Sie die Platte vorsichtig, um die Zuschlagstoffe gleichmäßig zu verteilen. Vermeiden Sie die Erzeugung von Blasen.
  11. Die Platte bei 37 °C mit 5 % CO2 für weitere 2 h inkubieren.
  12. Bereiten Sie das vaskuläre Differenzierungsmedium 2 (VDM2; Tabelle 8) und das Medium vor der Verwendung 20 min in einem 37 °C warmen Wasserbad vorwärmen.
  13. Geben Sie 2 ml VDM2 in jede Vertiefung und kultivieren Sie die Zellen bei 37 °C mit 5 % CO2.
  14. Wechseln Sie das Medium alle 3 Tage mit vorgewärmtem, frisch zubereitetem VDM2.
    HINWEIS: (Optional) Gefäßorganoide können aus der Gelmischung freigesetzt werden, indem das Gel mit einer Spritzennadel entfernt wird. Die aus dem Gel gewonnenen Gefäßorganoide können einzeln in einer 96-Well-Platte mit VDM2 (200 μL/Well) aufbewahrt werden. Wechseln Sie das Medium alle 2-3 Tage.

5. 3D Immunfluoreszenz-Assay

  1. Gefäßorganoide sollten etwa am 13. Tag reif werden. Bei Organoiden, die in das Hydrogel eingebettet sind, aspirieren Sie das Medium vorsichtig und waschen Sie es dreimal (jeweils 10 min) mit 2 mL PBS. Für Organoide, die aus dem Gel entnommen werden (nach Schritt 4.14), sammeln Sie 6-10 Organoide in einem 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, aspirieren Sie das Medium und waschen Sie es dreimal (jeweils 10 min) mit 2 mL PBS.
  2. Geben Sie 2 ml 4 % Paraformaldehyd (PFA) in die Probe und inkubieren Sie sie über Nacht bei 4 °C mit Paraffinfilmversiegelung.
  3. Entfernen Sie die PFA-Lösung und waschen Sie die Probe viermal (jeweils 15 min) mit 2 mL PBS.
  4. 2 ml Blockierungspuffer (Tabelle 9) zugeben und 2 h bei Raumtemperatur inkubieren.
  5. Entfernen Sie den Blockierungspuffer und fügen Sie 1,5 ml Primärantikörper hinzu (siehe Materialtabelle für Antikörperinformationen; Antikörper sollten im Blockierungspuffer verdünnt werden). Die Probe wird 2 Tage lang unter leichtem Schütteln mit Primärantikörpern bei 4 °C inkubiert.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, den Primärantikörper (CD31, PDGFRβ und ERG1) im Blockierungspuffer im Verhältnis 1:400 zu verdünnen (weitere Informationen finden Sie in der Materialtabelle ).
  6. Entfernen Sie die primäre Antikörperlösung und waschen Sie sie sechsmal 1 h lang mit 2 mL PBST.
  7. Geben Sie 2 ml Sekundärantikörper (siehe Materialtabelle für die Antikörperinformationen; Antikörper sollten in PBST verdünnt werden) in die Probe. Wickeln Sie die Platte mit Alufolie ein und inkubieren Sie sie 2 Tage lang bei 4 °C unter leichtem Schütteln.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, den Sekundärantikörper in PBST im Verhältnis 1:1000 zu verdünnen (weitere Informationen finden Sie in der Materialtabelle ). Halten Sie die Platte während der Inkubation vom Licht fern und waschen Sie sie anschließend aus diesem Schritt.
  8. Entfernen Sie die sekundäre Antikörperlösung und waschen Sie sie sechsmal (jeweils 1 h) mit 2 mL TBST. Geben Sie DAPI (1 μg/ml) in den Waschpuffer, der für den letzten Waschschritt verwendet wird, wenn eine Zellkernfärbung erforderlich ist.
  9. Schneiden Sie für diese in Gel eingebetteten Organoide das Gel in 4 Stücke und geben Sie sie vorsichtig mit einem Spatel in 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Entfernen Sie für die zurückgewonnenen Organoide den Waschpuffer.
  10. Verwenden Sie Tücher, um die restliche Lösung aufzunehmen, ohne das Gel oder die Organoide zu berühren.
  11. Geben Sie 2 ml wasserlösliches gewebereinigendes Reagenz (Brechungsindex = 1,49) in jedes Röhrchen. Inkubieren Sie die Proben mit dem Clearing-Reagenz bei Raumtemperatur im Dunkeln, bis die Organoide klar sind (in der Regel über Nacht). Schütteln Sie die Proben nicht.
  12. Übertragen Sie die Organoide mit dem Clearing-Reagenz vorsichtig mit einem Spatel in die Mitte der Glasbodenschale.
  13. Decken Sie die Organoide oder das Gelstück mit einem Deckglas von 24 mm × 24 mm ab.
  14. Schieben Sie das Deckglas vorsichtig nach unten, bis es flach liegt, und legen Sie die Proben auf den Glasboden.
  15. Entfernen Sie das überflüssige Reinigungsreagenz in der Schale und versiegeln Sie das Deckglas mit Nagellack.
  16. Verwenden Sie für die 3D-Bildgebung ein konfokales Mikroskop mit einem 10×Objektiv. Verwenden Sie den Kachelscan und den Z-Stapel-Scan, um Whole-Mount-Images von Organoiden zu erhalten.

Ergebnisse

Abbildung 1A zeigt das Schema dieses Protokolls, einschließlich der Schlüsselkomponenten, die in jeder Phase verwendet werden. Die Differenzierung begann mit der EB-Bildung, gefolgt von der Mesoderminduktion und der Spezifizierung der Gefäßlinie (Abbildung 1B-D). Die Aggregate wurden im Laufe der Zeit größer und weniger kugelförmig. Organoide zeigten ab Tag 5 Ecken und Kanten. Nach der Eingebettetheit in das Kollagen-I-Basalmembran-Matrix-Gemisch keimten vaskuläre Endothelzellen und Perizyten und wuchsen bereits am 7. Tag zu komplexen Gefäßnetzwerken heraus (Abbildung 1E). Da der Hauptzweck dieser modifizierten Methode darin besteht, die Schwankungen zwischen verschiedenen Generationschargen zu minimieren, haben wir die EB-Größe von zwei unabhängigen Chargen gemessen, und sowohl die Größenmessungen als auch die statistische Analyse bestätigten die Konsistenz und Gleichmäßigkeit dieser Methode (Abbildung 1F).

Um die vaskuläre Differenzierung zu validieren, wurden Organoide an Tag 5 vor der Einbettung entnommen und mit vaskulären Markern wie CD31, ERG1 und PDGFRβ gefärbt. Die Organoide exprimierten CD31, ERG1 und PDGFRβ (Abbildung 2), was auf das Vorhandensein von vaskulären Endothelzellen und Perizyten hinweist.

Nach der Gewebereinigung wurden die Gefäßnetzwerke mit einer Immunfluoreszenzmikroskopie analysiert (Abbildung 3A). Reife Organoide wurden an Tag 17 (Abbildung 3B, Probe im Gelblock) und Tag 28 (Abbildung 3C, die Probe wurde aus dem Gelblock entnommen und einzeln in einer 96-Well-Platte kultiviert) mit CD31, ERG1 und PDGFRβ gefärbt; beachten Sie, dass das Gefäßnetzwerk an den Rändern die Sphäroide umhüllte, anstatt sich nach der Entnahme aus dem Gelblock radial auszudehnen).

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Abbildung 1: Erzeugung von Gefäßorganoiden. (A) Schema der Schritte und Zeitleiste für die Erzeugung von Gefäßorganoiden. (B-E) Repräsentative Hellfeldbilder von vaskulären Organoiden in verschiedenen Stadien. Maßstabsstäbe: 100 μm. (F) Statistische Analyse in EB-Größe von zwei verschiedenen EB-Erzeugungschargen unter Verwendung der in dieser Arbeit vorgestellten Mikrotitermethode. Für die EB-Generierung wurden 1.000 Zellen pro Mikrotiter verwendet, für die Chargen 1 und 2 n = 42 bzw. n = 40. Signifikanz wird als ns dargestellt, nicht signifikant. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Immunfärbung von vaskulären Organoiden vor der Geleinbettung. Repräsentative Fluoreszenzbilder von Organoiden, die mit den Endothelmarkern (A) CD31 (grün) und (B) ERG1 (grün) bzw. (C) dem Perizytenmarker PDGFRβ (grün) gefärbt wurden. Die Zellkerne wurden mit DAPI (blau) gegengefärbt. Maßstabsstäbe: 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Immunfluoreszierende Charakterisierungen des Gefäßnetzwerks in vaskulären Organoiden. (A) Ein repräsentatives Bild zeigt in Gel eingebettete Gefäßorganoide in der Glasschale nach der Gewebereinigung. Die Organoide waren transparent, aber unter einem 385 nm UV-Licht sichtbar. (B) Ein repräsentatives 3D-Whole-Mount-Bild eines Gefäßorganoids an Tag 17. Das Gefäßorganoid wurde mit DAPI (blau), dem vaskulären Endothelzellmarker CD31 (grün) und dem Perizytenmarker PDGFRβ (magenta) gefärbt. (C) Eine repräsentative 3D-Bildgebung eines entnommenen Gefäßorganoids an Tag 28, gefärbt mit den Endothelmarkern CD31 (rot) und ERG1 (grün). Maßstabsbalken: 150 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

hiPSC Expansionsmedium500 mL
mTeSR Plus Basalmedium400 mL
mTeSR Plus Ergänzung100 mL
Gentamicin (50 mg/ml)1 mL

Tabelle 1: Zusammensetzung des hiPSC-Expansionsmediums.

hiPSC-Sämedium20 mL
PSC-Expansionsmedium20 mL
Chroman 1 (100 μM)10 μL
Emricasan (1 mM)30 μL
Polyamin-Ergänzung (1000x)ca. 20 μl
trans-ISRIB (1 mM)14 μL

Tabelle 2: Zusammensetzung des hiPSC-Saatmediums.

N2B27 mittel100 mL
DMEM/F-12, GlutaMAX Ergänzung48,6 mL
NeuroBasales Medium48,6 mL
GlutaMAX Ergänzung (100x)0,5 mL
MEM Lösung für nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA, 100x)0,5 mL
2-Mercaptoethanol (1000x)0,1 mL
Gentamicin (50 mg/ml)0,1 mL
N2-Zuschlag (100x)0,5 mL
B27 Supplement minus Vitamin A (50x)1 mL
Heparin, 4 kU/ml0,1 mL

Tabelle 3: Zusammensetzung des N2B27-Mediums.

Mesoderm-Induktionsmedium (MIM)3 mL
N2B27 mittel3 mL
BMP4 (100 ng/μL)0,9 μl
CHIR99021 (12 mM)3 μL

Tabelle 4: Zusammensetzung des Mesoderm-Induktionsmediums (MIM).

Gefäßdifferenzierungsmedium 1 (VDM1)3 mL
N2B27 mittel3 mL
Forsklin (12 mM)0,5 μl
VEGFA (100 ng/μL)3 μL

Tabelle 5: Zusammensetzung des vaskulären Differenzierungsmediums 1 (VDM1).

Kollagen I Mischung5 mL
Kollagen I (3,61 g/ml)2,77 mL
10x DMEM/F12 mittel0,5 mL
Natriumbicarbonat, 7,5 %0,5 mL
HEPES, 1 M0,5 mL
H2O0,73 mL
NaOH, 1M75 μL

Tabelle 6: Zusammensetzung der Kollagen-I-Mischung.

Kollagen I - Basalmembran-Matrix-Gemisch6,5 mL
Collage I Mischung5 mL
Matrigel (10 mg/ml)1,5 mL

Tabelle 7: Zusammensetzung des Kollagen-I-Basalmembran-Matrix-Gemisches.

Gefäßdifferenzierungsmedium 2 (VDM2)5 mL
DMEM/F-12, GlutaMAX™ Ergänzung3,67 mL
Gentamicin (50 mg/ml)5 μL
MEM Lösung für nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA, 100X)50 μL
2-Mercaptoethanol (1000x)5 μL
Heparin, 4 kU/ml5 μL
Knockout-Serum-Ersatz0,75 mL
FBS0,5 mL
VEGFA (100 ng/μL)5 μL
FGF2 (100 ng/μL)5 μL

Tabelle 8: Zusammensetzung des vaskulären Differenzierungsmediums 2 (VDM2).

Blockieren des Puffers50 mL
Esel-Serum2,5 mL
Tween 200,25 mL
Triton X-1000,25 mL
Natriumdesoxycholatlösung (1 Gew.-%, wt/v)0,5 mL
PBS46,5 mL

Tabelle 9: Zusammensetzung des Blockierungspuffers für die Immunfärbung.

Diskussion

Das beschriebene Protokoll umfasst zwei wichtige Modifikationen für die homogene und reproduzierbare Erzeugung hochwertiger vaskulärer Organoide. Die erste Modifikation ist die Verwendung einer Mikrotiterplatte, um eine bessere Kontrolle der EB-Gleichmäßigkeit zu ermöglichen. Als Ausgangspunkt für die vaskuläre Differenzierung ist die Größe der EBs von entscheidender Bedeutung, da sie das Schicksal der Stammzellen und die Wirksamkeit der Differenzierung gegenüber verschiedenen Linien reguliert. Variationen in der EB-Größe führen in der Regel zu heterogenen Organoiden mit inkonsistenter Struktur und Organisation16,17. Die konventionelle EB-Erzeugungsmethode durch Anheben von hiPS-Kolonien11,12 erschwert die Kontrolle der Zellzahlen für einzelne EBs und führt in der Regel zu einer heterogenen EB-Bildung. In diesem Protokoll werden hiPS-Zellen in Einzelzellsuspensionen dissoziiert und in Mikrovertiefungen reaggregiert16,18. Durch die Anpassung der Anzahl der Seeding-Zellen kann die Größe der EBs optimiert werden, um eine konsistente und effektive mesodermale Differenzierung zu gewährleisten. Für die Aussaat von Mikrotitern werden 500-1.000 Zellen verwendet, was relativ kleine EBs (mit einem Durchmesser von 100-200 μm) ergeben kann. Mit diesem Verfahren konnten reproduzierbar einheitliche EBs mit den gewünschten Größen von Charge zu Charge (Abbildung 1F) und zwischen verschiedenen Zelllinienerzeugt werden 13. Seit Tag 0 hat sich die Morphologie des EB im Laufe der Zeit während der Differenzierung verändert: Die Form wird weniger kugelförmig und die Oberfläche rauer (Abbildung 1), aber das Volumen nimmt nicht signifikant zu. Die Morphologie des 3D-Gefäßsystems hängt von der Einbettungsdichte und der Größe der eingebetteten Organoide ab. Zu große (>500 μm) Organoide führen in der Regel zu einer unzureichenden Differenzierung der Gefäßzellen, während zu kleine Organoide tendenziell ein unterentwickeltes Gefäßsystem aufweisen.

Die zweite Modifikation ist die Einbeziehung des CEPT-Cocktails, um die Lebensfähigkeit der hiPS-Zellen während der EB-Bildung zu verbessern. Neben der Qualität der hiPS-Kolonien ist die Lebensfähigkeit der Zellen während dieses Prozesses entscheidend. Wenn hiPS-Zellen in eine Einzelzellsuspension dissoziiert werden, wird in der Regel der ROCK-Inhibitor Y27632 hinzugefügt, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu verbessern. Y27632 hat sich jedoch als suboptimal für hiPSCs in geringer Dichte erwiesen und kann unerwünschten Membranstress verursachen, während der CEPT-Cocktail (bestehend aus Chroman 1, Emricasan, Polyaminen und trans-ISRIB) den Zellstress signifikant reduzieren und die Lebensfähigkeit während dieses EB-Bildungsprozesses mit hiPSCs in geringerer Dichte verbessernkönnte 15.

Vor der Einbettung der Organoide in das Gel werden die Organoide in der Mikrotiterplatte gehalten, und der Wechsel des Mediums sollte sanft erfolgen, um eine mögliche Störung zu vermeiden. Es wäre besser, eine 200 μL Pipette zu verwenden, um das Medium für die ersten 5 Tage zu wechseln. Alle Medien, die für die Erzeugung von Gefäßorganoiden verwendet werden, müssen vor der Verwendung vorgewärmt werden. Insbesondere nach der Geleinbettung könnte die Verwendung von kalten Medien die Basalmembranmatrix teilweise verflüssigen und die 3D-Hydrogelnische für die Bildung von Gefäßnetzwerken beeinflussen. Auch die Einbettungsdichte und die gleichmäßige Verteilung der Organoide sind kritische Faktoren für die Bildung von Gefäßnetzwerken. Eine dichte Einbettung von Organoiden könnte möglicherweise zu einer übermäßigen Fusion von Gefäßnetzwerken führen, während eine geringe Einbettungsdichte zu einer unzureichenden Netzwerkbildung führen könnte. Das Aussäen von 60-80 Organoiden pro Vertiefung und das vorsichtige Hin- und Herbewegen der Platte unmittelbar nach dem Hinzufügen zur ersten Schicht des 3D-Gels kann diese Organoide besser verteilen.

Dieses Protokoll kann für verschiedene Anwendungen weiter modifiziert werden. Zum Beispiel können Signale der Blut-Hirn-Schranke (BHS) angewendet werden, um die vaskulären Endothelzellen weiter von der Bildung der BHS-Grenzflächeabzuhalten 19,20,21,22,23,24,25. Die Zusammensetzung des 3D-Hydrogels kann ebenfalls angepasst werden. Zum Beispiel werden Fibrin und Vitronektin häufig für die Bildung von Gefäßnetzwerken in vitro verwendet 25,26,27,28,29,30,31,32. Die Basalmembranmatrix ohne Kollagen I kann zur Einbettung verwendet werden, was den Einbettungsprozess vereinfachen und unterschiedliche mechanische Reize liefern kann.

Obwohl die aus diesem Protokoll generierten Gefäßorganoide möglicherweise für die Modellierung von Krankheiten oder für das Wirkstoffscreening verwendet werden könnten, besteht eine Einschränkung darin, dass diese Organoide nur hauptsächlich das Kapillargefäßsystem mit wenigen größeren Gefäßen rekapitulieren. Für Forschungen, die sich auf größere Gefäße konzentrieren, kann die Erzeugung von Organoiden zusätzliche mechanische Stimuli erfordern 24,31,32,33. Die Verbindung der Gefäßorganoide mit der Rezirkulation, wie z. B. die Transplantation bei Tieren34 oder mikro-/makrofluidische Geräte mit Perfusionspumpen33, könnte dies möglicherweise lösen.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Danksagungen

Wir möchten uns für die technische Unterstützung durch die Confocal and Specialized Microscopy Shared Resource des Herbert Irving Comprehensive Cancer Center an der Columbia University bedanken, die zum Teil durch den NIH Center Grant (P30CA013696) finanziert wurde. Diese Arbeit wird unterstützt von NIH (R21NS133635, Y.-H.L.; UH3TR002151, K. W. L.). Abbildung 1A wurde mit BioRender erstellt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2-Mercaptoethanol (1000x)Gibco21985023
AccutaseSigma-AldrichA6964
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson Immuno Research Labs711-546-152rekonstituieren mit 0,25 mL 50% Glycerin,  lagern bei -20&Grad; C für bis zu 1 Jahr, Verdünnungsverhältnis für den Gebrauch: 1:1000
Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Jackson Immuno Research Labs705-606-147rekonstituiert mit 0,25 ml 50 % Glycerin, Lagerung bei -20 μg; C für bis zu 1 Jahr, Verdünnungsverhältnis für den Gebrauch: 1:1000
B27-Supplement minus Vitamin A (50x)Gibco12587010 Auftauen bei 4 & Grad; C, aliquot und bei -20 ° lagern; C, Gefrier-Auftau-Zyklus vermeiden
BMP4ProSpecCYT-081rekonstituiert mit sterilem ddH2O in einer Konzentration von 100 ng/µ L, aliquot und bei -20 & deg lagern; C
CD31 Antikörper abcamab28364Verdünnungsverhältnis: 1:400
ZentrifugeEppendorf022626001
CHIR99021Tocris Bioscience4423/10Die Stammlösung bei 12 mM mit DMSO herstellen und bei -20 & deg lagern; C für bis zu 1 Jahr.
Chroman 1Tocris7163/10stellt die Stammlösung bei 100 & Mikro her; M mit DMSO und lagern bei -20 & Grad; C für bis zu 1 Jahr.
Kollagen I Corning40236
KonfokalmikroskopNikonAXRMP/Ti2
Corning Elplasia PlattenCorning4441
Countess II FL automatisierter ZellzählerThermo FisherAMQAF1000
DMEM/F-12, GlutaMAX ErgänzungGibco10565018
DMEM/F-12, PulverGibco1250006210x Stammlösung mit biograde ddH2O herstellen und mit einem 0,2 &; Mikro sterilisieren; m Filter. Bei 4 °C lagern.
Edi042ACedars Sinai
EmricasanMedchemexpress LLCHY1039610MGdie Stammlösung bei 1 mM mit DMSO herstellen und bei -20 & deg lagern; C für bis zu 1 Jahr.
ERG AntikörperCell Singali Technology97249Verdünnungsverhältnis: 1:400
Fötales Kälberserum - PremiumAtlanta BiologicalsS11150Auftauen bei 4 ° C  und aliquot, speichern at  -20 &Grad; C für bis zu fünf Jahre oder bei 4 Grad lagern; C für bis zu einem Monat
FGF2ProSpecCYT557rekonstituiert mit sterilem ddH2O in einer Konzentration von 100 ng/&mikro; L, aliquot und bei -20 & deg lagern; C
Fluorodish ZellkulturschaleWorld Precision InstrumentsFD35-100
ForskolinTocris Bioscience1099rekonstituiert mit DMSO in einer Konzentration von 12 mM, aliquotiert und lagert bei -20 & deg; C
Gentamicin (50 mg/ml)Gibco15710064
GlutaMAX Supplement (100x)Gibco35050061
Heparin, 100 kUMilliporeSigma375095100KUrekonstituieren mit sterilem ddH2O in einer Konzentration von 4 kU/mL
HEPES (1 M)Gibco15630080
InkubatorThermo Scientific13998123
Knockout Serum ReplacementGibco10828028bei 4 & Grad auftauen; C, aliquot und bei -20° lagern; C, Frost-Tau-Zyklus vermeiden
Matrigel, GFR Basalmembran MatrixCorning356230Auftauen bei 4 & Grad; C, aliquotieren und bei -80° lagern; C, Frost-Tau-Zyklus vermeiden
MEM Lösung für nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA, 100x)Gibco11140050
Molecular Biology Grade WaterCorning46000CV
mTeSR plus KitSTEMCELL Technologies1001130Auftauen bei 4 & Grad; C, aliquot und bei -20° lagern; C, Frost-Tau-Zyklus vermeiden
N2-Ergänzung (100x)Gibco17502048Auftauen bei 4 & Grad; C, aliquot und bei -20° lagern; C, Frost-Tau-Zyklus
vermeiden NaOH-Lösung (1 M)Cytiva  HyCloneSH31088.01
NeuroBasalmediumGibco21103049
NIS-Elements, ver 5.42Nikon
Normales EselsserumJackson Immuno Research Labs17000121rekonstituieren mit 10 mL sterilem ddH2O, lagern bei 4 > C für bis zu zwei Wochen
Paraformaldehyd, 20%Elektronenmikroskopie Sciences15713Sverdünnt mit PBS
PBST, 20xThermofisher28352
PDGFRβ AntikörperR& DAF385Verdünnungsverhältnis: 1:400
Polyamin-Supplement (1000x)Sigma-AldrichP8483
Rapiclear Clearing-Reagenz, 1,49SUNJIN LABRC149001
Natriumbicarbonat (7,5%)Gibco25080094
Natriumdesoxycholat-MonohydratThermofisherJ6228822ddH2O für 1% (wt/v) Stammlösung auflösen
TBST, 20xThermofisher28360
trans-ISRIBTocris Bioscience5284/10stellen die Stammlösung bei 1 mM mit DMSO her und lagern bei -20°; C für bis zu 1 Jahr.
Tritin X-100Sigma-AldrichT8787-50ML
Trypan Blue Stain (0,4%)Thermo Fisher15250061
Tween 20Sigma-AldrichP7949-100ML
VEGF-AProSpecCYT-116rekonstituieren mit sterilem ddH2O in einer Konzentration von 100 ng/µ L, aliquot und bei -20° lagern; C
mit

Referenzen

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