Dieses Protokoll stellt ein Verfahren zur Erzeugung von Gefäßorganoiden unter Verwendung menschlicher pluripotenter Stammzellen vor.
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Methodenartikel
Generierung von Gefäßorganoiden aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Vaskuläre Organoide, die aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) gewonnen werden, rekapitulieren die Zelltypenvielfalt und die komplexe Architektur menschlicher Gefäßnetzwerke. Dieses dreidimensionale (3D) Modell birgt ein erhebliches Potenzial für die Modellierung der Gefäßpathologie und das In-vitro-Wirkstoffscreening . Trotz der jüngsten Fortschritte besteht nach wie vor eine zentrale technische Herausforderung darin, Organoide mit gleichbleibender Qualität reproduzierbar zu erzeugen, was für nachgelagerte Assays und Anwendungen von entscheidender Bedeutung ist. Hier wird ein modifiziertes Protokoll vorgestellt, das sowohl die Homogenität als auch die Reproduzierbarkeit der Generierung von vaskulären Organoiden verbessert. Das modifizierte Protokoll beinhaltet die Verwendung von Mikrowells und des CEPT-Cocktails (Chroman 1, Emricasan, Polyamine und der integrierte Stressreaktionshemmer trans-ISRIB), um die Körperbildung von Embryoiden und das Überleben der Zellen zu verbessern. Differenzierte, reife Gefäßorganoide, die mit diesem Protokoll erzeugt werden, werden mittels 3D-Immunfluoreszenzmikroskopie charakterisiert, um ihre Morphologie und komplexe Gefäßstruktur zu analysieren. Dieses Protokoll ermöglicht die skalierbare Herstellung hochwertiger vaskulärer Organoide und erleichtert so möglicherweise deren Einsatz in der Krankheitsmodellierung und beim Wirkstoffscreening.
Einleitung
In vitro sind in den letzten zehn Jahren mikrophysiologische In-vitro-Modelle, einschließlich Organoid- und Tissue-on-a-Chip-Systeme, entstanden 1,2,3. Diese dreidimensionalen (3D), aus menschlichen Zellen gewonnenen Systeme beheben die Einschränkungen herkömmlicher zweidimensionaler (2D) Zellkultur- und Tiermodelle, wie z. B. das Fehlen vieler Komponenten in der physiologischen Mikroumgebung bzw. genetische Unterschiede zwischen den Arten. Sie liefern physiologischere Erkenntnisse und eignen sich besser für die Modellierung von Kran....
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Protokoll
Abbildung 1 zeigt einen Überblick über die Schritte, die an diesem Protokoll beteiligt sind. Detaillierte Informationen zu den in diesem Protokoll verwendeten Reagenzien und Materialien finden Sie in der Materialtabelle. Es wird empfohlen, alle Medien vor der Verwendung auf 37 °C vorzuwärmen, sofern nicht anders angegeben. Alle Zellkulturmaterialien und -materialien sollten entweder autoklaviert oder steril sein, und die Zellhandhabung sollte in einer Biosicherheitswerkbank erfolgen. Zusätzlich sollte der pH-Wert der Kollagen-I-Mischung sorgfältig auf pH 7,3 eingestellt werden, um möglich....
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Ergebnisse
Abbildung 1A zeigt das Schema dieses Protokolls, einschließlich der Schlüsselkomponenten, die in jeder Phase verwendet werden. Die Differenzierung begann mit der EB-Bildung, gefolgt von der Mesoderminduktion und der Spezifizierung der Gefäßlinie (Abbildung 1B-D). Die Aggregate wurden im Laufe der Zeit größer und weniger kugelförmig. Organoide zeigten ab Tag 5 Ecken und Kanten. Nach der Eingebettetheit in das Kollagen-I-Basalmemb.......
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Diskussion
Das beschriebene Protokoll umfasst zwei wichtige Modifikationen für die homogene und reproduzierbare Erzeugung hochwertiger vaskulärer Organoide. Die erste Modifikation ist die Verwendung einer Mikrotiterplatte, um eine bessere Kontrolle der EB-Gleichmäßigkeit zu ermöglichen. Als Ausgangspunkt für die vaskuläre Differenzierung ist die Größe der EBs von entscheidender Bedeutung, da sie das Schicksal der Stammzellen und die Wirksamkeit der Differenzierung gegenüber verschiedenen Linien reg.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.
Danksagungen
Wir möchten uns für die technische Unterstützung durch die Confocal and Specialized Microscopy Shared Resource des Herbert Irving Comprehensive Cancer Center an der Columbia University bedanken, die zum Teil durch den NIH Center Grant (P30CA013696) finanziert wurde. Diese Arbeit wird unterstützt von NIH (R21NS133635, Y.-H.L.; UH3TR002151, K. W. L.). Abbildung 1A wurde mit BioRender erstellt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 2-Mercaptoethanol (1000x) | Gibco | 21985023 | |
| Accutase | Sigma-Aldrich | A6964 | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Research Labs | 711-546-152 | rekonstituieren mit 0,25 mL 50% Glycerin, lagern bei -20&Grad; C für bis zu 1 Jahr, Verdünnungsverhältnis für den Gebrauch: 1:1000 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson Immuno Research Labs | 705-606-147 | rekonstituiert mit 0,25 ml 50 % Glycerin, Lagerung bei -20 μg; C für bis zu 1 Jahr, Verdünnungsverhältnis für den Gebrauch: 1:1000 |
| B27-Supplement minus Vitamin A (50x) | Gibco | 12587010 Auftauen bei 4 & Grad; C, aliquot und bei -20 ° lagern; C, Gefrier-Auftau-Zyklus vermeiden | |
| BMP4 | ProSpec | CYT-081 | rekonstituiert mit sterilem ddH2O in einer Konzentration von 100 ng/µ L, aliquot und bei -20 & deg lagern; C |
| CD31 Antikörper | abcam | ab28364 | Verdünnungsverhältnis: 1:400 |
| Zentrifuge | Eppendorf | 022626001 | |
| CHIR99021 | Tocris Bioscience | 4423/10 | Die Stammlösung bei 12 mM mit DMSO herstellen und bei -20 & deg lagern; C für bis zu 1 Jahr. |
| Chroman 1 | Tocris | 7163/10 | stellt die Stammlösung bei 100 & Mikro her; M mit DMSO und lagern bei -20 & Grad; C für bis zu 1 Jahr. |
| Kollagen I | Corning | 40236 | |
| Konfokalmikroskop | Nikon | AXRMP/Ti2 | |
| Corning Elplasia Platten | Corning | 4441 | |
| Countess II FL automatisierter Zellzähler | Thermo Fisher | AMQAF1000 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX Ergänzung | Gibco | 10565018 | |
| DMEM/F-12, Pulver | Gibco | 12500062 | 10x Stammlösung mit biograde ddH2O herstellen und mit einem 0,2 &; Mikro sterilisieren; m Filter. Bei 4 °C lagern. |
| Edi042A | Cedars Sinai | ||
| Emricasan | Medchemexpress LLC | HY1039610MG | die Stammlösung bei 1 mM mit DMSO herstellen und bei -20 & deg lagern; C für bis zu 1 Jahr. |
| ERG Antikörper | Cell Singali Technology | 97249 | Verdünnungsverhältnis: 1:400 |
| Fötales Kälberserum - Premium | Atlanta Biologicals | S11150 | Auftauen bei 4 ° C und aliquot, speichern at -20 &Grad; C für bis zu fünf Jahre oder bei 4 Grad lagern; C für bis zu einem Monat |
| FGF2 | ProSpec | CYT557 | rekonstituiert mit sterilem ddH2O in einer Konzentration von 100 ng/&mikro; L, aliquot und bei -20 & deg lagern; C |
| Fluorodish Zellkulturschale | World Precision Instruments | FD35-100 | |
| Forskolin | Tocris Bioscience | 1099 | rekonstituiert mit DMSO in einer Konzentration von 12 mM, aliquotiert und lagert bei -20 & deg; C |
| Gentamicin (50 mg/ml) | Gibco | 15710064 | |
| GlutaMAX Supplement (100x) | Gibco | 35050061 | |
| Heparin, 100 kU | MilliporeSigma | 375095100KU | rekonstituieren mit sterilem ddH2O in einer Konzentration von 4 kU/mL |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630080 | |
| Inkubator | Thermo Scientific | 13998123 | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco | 10828028 | bei 4 & Grad auftauen; C, aliquot und bei -20° lagern; C, Frost-Tau-Zyklus vermeiden |
| Matrigel, GFR Basalmembran Matrix | Corning | 356230 | Auftauen bei 4 & Grad; C, aliquotieren und bei -80° lagern; C, Frost-Tau-Zyklus vermeiden |
| MEM Lösung für nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA, 100x) | Gibco | 11140050 | |
| Molecular Biology Grade Water | Corning | 46000CV | |
| mTeSR plus Kit | STEMCELL Technologies | 1001130 | Auftauen bei 4 & Grad; C, aliquot und bei -20° lagern; C, Frost-Tau-Zyklus vermeiden |
| N2-Ergänzung (100x) | Gibco | 17502048 | Auftauen bei 4 & Grad; C, aliquot und bei -20° lagern; C, Frost-Tau-Zyklus |
| vermeiden NaOH-Lösung (1 M) | Cytiva HyClone | SH31088.01 | |
| NeuroBasalmedium | Gibco | 21103049 | |
| NIS-Elements, ver 5.42 | Nikon | ||
| Normales Eselsserum | Jackson Immuno Research Labs | 17000121 | rekonstituieren mit 10 mL sterilem ddH2O, lagern bei 4 > C für bis zu zwei Wochen |
| Paraformaldehyd, 20% | Elektronenmikroskopie Sciences | 15713S | verdünnt mit PBS |
| PBST, 20x | Thermofisher | 28352 | |
| PDGFRβ Antikörper | R& D | AF385 | Verdünnungsverhältnis: 1:400 |
| Polyamin-Supplement (1000x) | Sigma-Aldrich | P8483 | |
| Rapiclear Clearing-Reagenz, 1,49 | SUNJIN LAB | RC149001 | |
| Natriumbicarbonat (7,5%) | Gibco | 25080094 | |
| Natriumdesoxycholat-Monohydrat | Thermofisher | J6228822 | ddH2O für 1% (wt/v) Stammlösung auflösen |
| TBST, 20x | Thermofisher | 28360 | |
| trans-ISRIB | Tocris Bioscience | 5284/10 | stellen die Stammlösung bei 1 mM mit DMSO her und lagern bei -20°; C für bis zu 1 Jahr. |
| Tritin X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | |
| Trypan Blue Stain (0,4%) | Thermo Fisher | 15250061 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-100ML | |
| VEGF-A | ProSpec | CYT-116 | rekonstituieren mit sterilem ddH2O in einer Konzentration von 100 ng/µ L, aliquot und bei -20° lagern; C |
Referenzen
- Park, S. E., Georgescu, A., Huh, D. Organoids-on-a-chip. Science. 364 (6444), 960-965 (2019).
- Takebe, T., Wells, J. M. Organoids by design. Science. 364 (6444), 956-959 (2019).
- Griffith, L. G., Swartz, M. A.
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Nachdrucke und Genehmigungen
