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Methodenartikel

Verankerung des verdrehten Hodens: Ein Rattenmodell der Ischämie-Reperfusionsverletzung des Hodens

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DOI:

10.3791/67181

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14. November 2025

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1Department of Physiology, Ladoke Akintola University of Technology, 2Department of Anaesthesia, Afe Babalola University, 3Department of Pharmacology, Bowen University, 4Reproductive Biology and Toxicology Research Laboratory, Oasis of Grace Hospital

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt ein Schritt-für-Schritt-Verfahren zur Erstellung eines Modells der Hodentämie/Reperfusion zur Erstellung eines reproduzierbaren Modells der Hodentorsion bei der Untersuchung der pathologischen Mechanismen der Ischämie-Reperfusionsverletzung im Hoden.

Zusammenfassung

Ischämie-Reperfusions-Verletzungen (IR) sind mit verschiedenen Pathologien verbunden, einschließlich Hodenverletzungen. Frühere Tiermodelle der Hoden-IR, bei denen der Samenstrang verdreht wird, um eine Ischämie zu erreichen, sind mit vielen technischen Schwierigkeiten behaftet, die dazu führen, dass das Modell nicht konsistent reproduziert werden kann. Daher stellen wir eine einfache Methode zur Induktion von Hoden-IR in einem Rattenmodell vor, die leicht repliziert werden kann.

Bei dieser Methode wird das Gubernaculum vom Hoden getrennt, ein Hodensack angelegt, der Hoden an seinem unteren Pol um 720° im Uhrzeigersinn gedreht und der Hoden an der Basis des Hodensacks verankert. Dieses Modell verengt effektiv die Hodengefäße und induziert eine Hodenischämie. Nach 1 h Ischämie wird der Verankerungsstich entfernt und der Hoden aufgedreht. Das Kabel und die dazugehörigen Gefäße werden auf Durchgängigkeit überprüft. Nach der IR wird der Hoden entnommen und für die histopathologische Beurteilung geschnitten.

Die Hodenhistologie wurde auf fokale hämorrhagische Läsionen, Gefäßstauungen, einen erweiterten interstitiellen Raum und eine Infiltration von Entzündungszellen untersucht. Darüber hinaus wurden Marker für oxidativen Stress (Malondialdehyd, reduziertes Glutathion, Katalase und Superoxiddismutase), Entzündungen (MPO, TNF-α, IL-1β) und Apoptose (Caspase-3-Expression) untersucht. Diese Methode bietet ein einfacheres und leicht reproduzierbares Modell zur Untersuchung der Pathophysiologie der Hoden-IR-Verletzung. Darüber hinaus öffnet dieses Modell ein Fenster für die Erforschung potenzieller Therapeutika bei der Behandlung von Hoden-IR-Verletzungen.

Einleitung

Die Torsion des Hodens (TT) ist ein akuter urologischer Notfall, bei dem sich der Samenstrang zusammen mit den zugehörigen Gefäßen verdreht, was zu einer Ischämie des Hodens führt. Sie ist gekennzeichnet durch starke Bauchschmerzen, Übelkeit und Erbrechen1. Die Ischämie führt, wenn sie nicht durch rechtzeitige Detorsion behoben werden kann, zu einer Nekrose und zum Verlust des betreffenden Hodens2. Ein rechtzeitiger chirurgischer Eingriff durch Aufdrehen und Wiederherstellen des Blutflusses zum Hoden führt jedoch zu einer Ischämie-Reperfusionsverletzung (IRI), die zu einer histologischen und biochemischen Störung des Hodens und seiner Funktionen führt 3,4.

Tiermodelle der TT wurden ausgiebig verwendet, um die Mechanismen der IRI zu untersuchen, die ausnahmslos aus Versuchen resultiert, das Fortschreiten der TT zur Nekrosezu verhindern 5,6. Es gibt zwei Modelle von TT, die Samenstrangklemmung und die Nabelschnurverdrillung. Beide werden unter sterilen Bedingungen und unter angemessener Anästhesie durchgeführt. Zu den häufig verwendeten Anästhetika gehört Ketamin allein oder in Kombination mit Xylazin7. Andere häufig verwendete Anästhetika sind Urethan und Thiopental-Natrium, die normalerweise intraperitoneal verabreicht werden7. Nichtsdestotrotz haben beide Modelle ihre Grenzen.

Während das direkte Klemmen der Hodenarterie mit mikrovaskulären Clips 8,9 als Mittel zur Induktion einer Ischämie für eine bestimmte Zeit (normalerweise 1 h) vor der Induktion der Reperfusion durch Entfernen der Klemmen verwendet wurde, ahmt das Verfahren das klinische Erscheinungsbild einer Torsion des Hodens10 nicht genau nach. Obwohl die chirurgische Verdrehung des Samenstrangs zur Erzielung einer Ischämie 11,12 repräsentativer für das klinische Erscheinungsbild ist, ist sie mit vielen technischen Schwierigkeiten behaftet, die in den kurzen Beschreibungen im Methodenteil der Artikel zu diesem Thema nicht angesprochen wurden.

Eine offensichtliche technische Schwierigkeit, auf die man häufig stieß, bestand darin, den Hoden wieder am Boden des Hodensacks zu verankern, um ein Aufdrehen während der Zeit der Ischämie zu verhindern. Während einige Untersucher die Verankerung des Hodens an der Hodensackwand nicht erwähnen13,14, verschreiben andere die Verankerung des Hodens an der Hodensackwand, indem die Tunica albuginea daran genähtwird 15,16,17. Die Beschreibungen des Prozesses der Verankerung des Hodens an der Hodensackwand sind im Großen und Ganzen sehr kurz undnicht explizit 7,18. Versuche, die in den Methodenabschnitten früherer Artikel beschriebenen Verfahren zu duplizieren, stießen daher auf ernsthafte praktische Schwierigkeiten, wie z. B. die Verletzung des Hodens durch Perforation der Tunica albuginea und die Unfähigkeit, den Hoden ohne übermäßige Druckausübung in den Hodensack zurückzuführen. Darüber hinaus war in praktischer Hinsicht die Rückkehr des Hodens in den Hodensack nach der Induktion der Torsion eine große Herausforderung bei unseren Versuchen, die experimentelle TT chirurgisch zu induzieren. Solche technischen Schwierigkeiten haben daher dazu geführt, dass das Modell bei verschiedenen Forschern nicht konsistent repliziert werden konnte.

Das in dieser Studie beschriebene Verfahren zur Erstellung eines Modells von TT bei Ratten identifiziert daher die technischen Schwierigkeiten, die in früheren Modellen aufgetreten sind, und bietet Lösungen für diese an. Dieses Modell bietet eine einfache Technik, die leicht reproduzierbar ist und die menschliche Erfahrung nachahmt. Das Modell ist daher ein zuverlässiger und reproduzierbarer Ausgangspunkt für die Erforschung der pathologischen Mechanismen, die sich aus der IRI ergeben.

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Protokoll

Die Studie wurde vom Ethikprüfungsausschuss der Fakultät für medizinische Grundlagenwissenschaften der Ladoke Akintola University of Technology, Ogbomoso, Oyo State, Nigeria genehmigt (ERCFBMSLAUTECH:033/05/2024). Für diese Studie wurden zwanzig männliche Albino-Wistar-Ratten im Alter von 10 bis 12 Wochen und einem Gewicht von 180 ± 10 g verwendet. Sie wurden 2 Wochen lang akklimatisiert und dann nach dem Zufallsprinzip entweder in die scheinoperierte Gruppe (SO) oder die Torsions-/Detorsionsgruppe (T/D) eingeteilt (n = 10 Ratten pro Gruppe). Die SO-Ratten wurden einer ähnlichen Operation unterzogen, genau wie die T/D-Ratten, aber die Hoden wurden nicht verdreht oder verankert, um T/D zu induzieren.

1. Präoperative Vorbereitung und Anästhesie

  1. Setzen Sie die Tiere (SO- und T/D-Gruppen) vor der Operation über Nacht einem 12-stündigen Fasten aus.
  2. Am Tag der Operation werden die Tiere (SO- und T/D-Gruppen) mit einer Kombination aus Ketamin 50 mg/kg und Xylazin 10 mg/kg intraperitoneal betäubt und die Angemessenheit und Tiefe der Anästhesie bestätigt, indem die mangelnde Reaktion der Tiere auf den Druck des Pfotenballens und die leichte Stimulation der Schnurrhaare beobachtet wird.
  3. Rasieren Sie den linken Skrotal-, Damm- und Leistenbereich der Tiere (SO- und T/D-Gruppen) und reinigen Sie sie dann mit Brennspiritus und antiseptischer Povidonlösung.

2. Induktion einer Ischämie des Hodens

  1. Mobilisation des Hodens
    1. Üben Sie sanft Druck nach unten auf den Bauch aus, um den linken Hoden (sowohl der SO- als auch der T/D-Gruppe) in den Hodensack zu drücken.
    2. Fassen Sie den linken Hoden (sowohl der SO- als auch der T/D-Gruppe) fest und machen Sie einen hohen Skrotalschnitt, ~1,5 cm lang, um den darunter liegenden Hoden in der Tunica vaginalis (TV) freizulegen.
    3. Lokalisieren Sie den unteren Pol des Hodens (sowohl der SO- als auch der T/D-Gruppe), insbesondere den Cauda Epididymis, und machen Sie mit einer kleinen Präparierschere einen Schnitt in den darüber liegenden Fernseher.
    4. Legen Sie die Schere unter den Fernseher und verbreitern Sie sie leicht, um die beiden Kanten des Fernsehers zu sehen, und fassen Sie dann die Kanten auf beiden Seiten mit einer gebogenen Mückenzange. Dies gilt sowohl für die SO- als auch für die T/D-Gruppe.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist sehr wichtig, da er eine Gewebeebene schafft, die eine einfache Rückkehr des Hodens in den Hodensack nach Induktion der Torsion ermöglicht.
    5. Verlängern Sie den Schnitt (sowohl der SO- als auch der T/D-Gruppe) im Fernsehgerät proximal um ~0,5 cm.
    6. Üben Sie sanften Druck auf den Unterbauch aus, um den Hoden (sowohl der SO- als auch der T/D-Gruppe) nach außen zu zeigen.
    7. Nur für die T/D-Gruppe mobilisieren Sie den Hoden und identifizieren den Gubernaculum-Hoden, dann schneiden Sie ihn, um den Hoden vom Boden des Hodensacks zu lösen.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist wichtig, da er das Verdrehen des Hodens ermöglicht. Das Gubernaculum wird als das Band bezeichnet, das sich vom kaudalen Ende des Hodens bis zum Leistenkanal erstreckt und in einer knubbelartigen Ausdehnung endet19,20.
    8. Fassen Sie den Hoden (der T/D-Tiere) an seinem unteren Pol (wo sich der Cauda Epididymis befindet), drehen Sie ihn um 720° im Uhrzeigersinn und notieren Sie die Uhrzeit (die den Beginn der Ischämie markiert).
  2. Verankerung des ischämischen Hodens
    1. Erstellen Sie einen Hodensack, indem Sie den verdrehten Hoden (der T/D-Tiere) an Ort und Stelle halten und eine lange Präparierschere entlang der Gewebeebene unter dem Fernseher nach unten in den Hodensack schieben, um einen Beutel zu bilden.
    2. Führen Sie nur bei den T/D-Tieren den Verankerungsstich ein, indem Sie die Schere an Ort und Stelle halten und einen Verankerungsstich mit Chrom 2-0 Naht von der Außenseite des tiefsten Punktes des zuvor erstellten Hodensacks einführen. Führen Sie den Stich in das Bindegewebe am unteren Pol des Hodens ein und bringen Sie ihn wieder nach unten in den Beutel und außerhalb desselben neben dem ursprünglichen Eintrittspunkt.
    3. Verankern Sie den Hoden an der Basis des Hodensacks, indem Sie den verdrehten Hoden (der T/D-Tiere) in den Hodensack ziehen und sanft einen Abwärtszug auf die beiden Enden der Naht ausüben, und binden Sie dann die beiden Enden der Naht fest an die Hodensackhaut.
    4. Den Skrotalschnitt (der SO- und T/D-Tiere) mit einer durchgehenden Beutelnaht mit Chrom 2-0 verschließen.
      HINWEIS: Dies wird für eine einfache Entfernung empfohlen, wenn eine Reperfusion durchgeführt werden soll.

3. Biochemische und histopathologische Untersuchungen

HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Prüfärzte, die die biochemischen Assays und histopathologischen Untersuchungen durchführen, für das Studienprotokoll verblindet sind.

  1. Am Ende des Versuchszeitraums lassen Sie die Tiere über Nacht 12 Stunden fasten und euthanasieren Sie sie (50 mg/kg Ketamin und 10 mg/kg Xylazin i.p.).
  2. Entfernen und trennen Sie die linken Hoden von den anhaftenden Strukturen.
  3. Homogenisieren Sie fünf von 10 Hodengeweben aus jeder Gruppe in Homogenisierungspuffer (0,25 M Saccharose, 0,5 mM EDTA, 5 mM Histidin und PI gelöst in PBS, pH 7,4) und fixieren Sie die restlichen fünf Hodengewebe in Bouins Lösung für die histologische Untersuchung.
  4. Die Homogenate werden bei 10.000 × g für 15 min bei 4 °C in einer Kaltzentrifuge geschleudert, um den Überstand für biochemische Analysen zu erhalten.
  5. Bestimmen Sie die Aktivität der hodenförmigen Xanthinoxidase (XO) durch einen enzymatischen kolorimetrischen Assay unter Verwendung von Standard-Laborkits gemäß den Richtlinien des Herstellers.
  6. Bestimmung des Gehalts an Hodenmalondialdehyd (MDA) durch Kolorimetrie21.
    1. Bestimmung der Lipidperoxidationskonzentration mit den bei der Lipidperoxidation entstehenden Thiobarbitursäure-Reaktivsubstanzen (TBARS)
      HINWEIS: Diese Methode basiert auf der Reaktion zwischen 2-Thiolobarbitursäure (TBA) und Malondialdehyd, einem Endprodukt der Lipidperoxidation. Durch Erhitzen bei saurem pH-Wert entsteht ein rosafarbener Chromogenkomplex ([TBS] 2-Malondialdehyd-Addukt), dessen Extinktion bei 532 nm gemessen wird.
      1. 200 μl der Probe mit 500 μl Trichloressigsäure (TCA) deproteinisieren und 10 min bei 3.000 U/min zentrifugieren.
      2. 1 mL 0,75 % TBA zu 0,1 mL des Überstands geben, 20 min bei 100 °C im Wasserbad kochen und mit Eiswasser abkühlen lassen.
      3. Die Extinktion der Probe/des Standards bei 532 nm mit einem Spektralphotometer gegen den Rohling ablesen. Bestimmen Sie die Konzentration von TBARS, die durch Extrapolation von der Standardkurve erzeugt wird.
  7. Assay der Hodenaktivitäten von Superoxiddismutase (SOD)22, Katalase23 und Glutathionperoxidase (GPx)24 unter Verwendung etablierter Protokolle, wie zuvor berichtet.
    1. SOD-Bestimmung
      1. 1 ml der Probe in 9 ml destilliertem Wasser verdünnen, um eine Verdünnung von 1 zu 10 zu erhalten. 0,2 mL dieser verdünnten Probe werden zu 2,5 mL 0,05 M Karbonatpuffer (pH 10,2) für den Spektralphotometer-Äquilibrierungszweck gegeben.
      2. Starten Sie die Reaktion durch Zugabe von 0,3 ml frisch zubereitetem 0,3 mM Adrenalin zu der Mischung und mischen Sie sie schnell durch Inversion.
      3. Geben Sie zur Referenzküvette 2,5 mL Puffer, 0,3 mL des Substrats (Adrenalin) und 0,2 mL Wasser.
      4. Überwachen Sie den Anstieg der Absorption alle 30 s für 150 s bei 480 nm.
    2. Bestimmung der Katalase
      1. Mischen Sie 1 ml des Überstands des Hodenhomogenats mit 19 ml verdünntem Wasser, um eine Verdünnung der Probe von 1:29 zu erhalten.
      2. 4 ml H2O2 -Lösung (800 μmol) und 5 ml Phosphatpuffer werden in einen 10-ml-Flachkolben gegeben.
      3. 1 ml des ordnungsgemäß verdünnten Enzympräparats (Schritt 4.6.3.1) mit dem Reaktionsgemisch (Schritt 4.6.3.2) wird bei 37 °C leicht gedreht. 1 ml des Reaktionsgemisches wird entnommen und in Abständen von 60 s zu 2 ml Dichromat/Essigsäure-Reagenz gegeben.
      4. Bestimmen Sie den Katalase-Gehalt in der Probe, indem Sie die Extinktion bei 653 nm mit der eines zertifizierten Katalase-Standards vergleichen.
    3. GPx-Assay
      1. Das Reaktionsgemisch mit der Probe wird 3 min lang bei 37 °C inkubiert, 0,5 ml 10 % Trichloressigsäure (TCA) zugegeben und 5 min lang bei 3.000 U/min zentrifugiert.
      2. Zu 1 ml des Überstands werden 2 ml Phosphatpuffer und 1 ml 5'-5'-Dithiobis-(2-dinitrobenzoesäure (DTNB)-Lösung hinzugefügt und die Extinktion bei 412 nm gegen einen Blindwert abgelesen.
      3. Bestimmen Sie die Glutathionperoxidase-Aktivität, indem Sie die Standardkurve darstellen und die Konzentration des verbleibenden GSH aus der Kurve extrapolieren.
  8. MPO- und Tumornekrosefaktor-alfa (TNFα)-Assay
    HINWEIS: Dieser Assay beinhaltet die Oxidation von Guajakol zu oxidiertem Guajakol in Gegenwart von Wasserstoffperoxid. Guajakol in seiner oxidierten Form hat eine braune Farbe, die photometrisch bei 470 nm gemessen wird.
    1. Verwenden Sie Standard-ELISA-Kits, um die Aktivität der testikulären Myeloperoxidase (MPO)21,25 und den Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α)-Spiegel zu bestimmen.
  9. Histopathologische Untersuchung mittels Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) 26,27 und Immunhistochemie zur Caspase-3-Expression
    1. Bewahren Sie das Hodengewebe in der Bouin-Flüssigkeit; Waschen Sie das Tuch mit Toluol, tauchen Sie es in Paraffinwachs und inkubieren Sie es über Nacht bei 60 °C.
    2. Nehmen Sie ~5 μm dicke Abschnitte, entparaffinisieren und rehydrieren Sie sie, entnehmen Sie das Antigen mit vorgewärmtem Citratpuffer und lassen Sie es 30 Minuten abkühlen.
    3. Reinigen Sie die Objektträger mit Labortüchern, markieren Sie die Schnittbereiche mit einem hydrophoben Stift und ordnen Sie die Objektträger in einer befeuchteten Kammer an.
    4. Inkubieren Sie die Objektträger 10 Minuten lang, nachdem Sie die endogene Peroxidaseaktivität mit Wasserstoffperoxid blockiert haben. Spülen Sie die Objektträger einmal mit PBS aus, tragen Sie den Proteinblock auf und inkubieren Sie ihn 10 Minuten lang.
    5. Spülen Sie die Objektträger mit PBS 2x, tragen Sie die entsprechenden Primärantikörper (Caspase 3) auf, inkubieren Sie die Objektträger für 45 min und spülen Sie 2x mit PBS.
    6. Den Sekundärantikörper auftragen, 25 min inkubieren, mit PBS 2x spülen und das HRP-Polymer hinzufügen. Wiederholen Sie den Zyklus der Inkubation für 25 Minuten und spülen Sie 2x mit PBS.
    7. Die Abschnitte 5 Minuten lang in Diaminobenzidin (DAB) Substrat inkubieren, 2x mit PBS spülen, mit Hämatoxylin gegenfärben und mit destilliertem Wasser spülen.
    8. Tragen Sie die Bläuungslösung auf die Abschnitte auf, spülen, dehydrieren, klären und montieren Sie sie zur qualitativen Untersuchung.
    9. Untersuchen Sie das Gewebe unter einem Lichtmikroskop und machen Sie Mikroaufnahmen mit 100- und 400-facher Vergrößerung mit einer am Mikroskop angebrachten Digitalkamera.

4. Statistische Auswertung

  1. Führen Sie statistische Analysen mit der Software Ihrer Wahl durch. Führen Sie den Anderson-Darling-Test, den D'Agostino- und Pearson-Test und den Shapiro-Wilk-Test durch, um die Normalität zu testen.
  2. Führen Sie einen ungepaarten t-Test durch, um auf signifikante Unterschiede zwischen beiden Gruppen zu testen: SO und T/D.
  3. Stellen Sie die Daten als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts dar. Legen Sie das Signifikanzniveau auf p < 0,05, p < 0,01 und p < 0,001 fest (wie in den Abbildungslegenden angegeben).

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Ergebnisse

Die XO-Aktivität, der MDA-Spiegel und die Aktivitäten von SOD, Katalase und GPx im Hoden wurden als Marker für oxidativen Stress verwendet. Torsion/Detorsion (T/D) erhöhte die XO-Aktivität und MDA-Spiegel deutlich und reduzierte die Hodenaktivitäten von SOD, Katalase und GPx bei T/D-Ratten im Vergleich zu den scheinoperierten Ratten (Abbildung 1), was die Rolle von oxidativem Stress bei T/D-induzierten Verletzungen zeigt.

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Diskussion

Dieser Artikel und das dazugehörige Video geben eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Beschreibung der chirurgischen Induktion von TT zur Untersuchung der hodenikulären IRI unter Verwendung des Anchorage-Ansatzes. Das Verfahren ist insofern besonders nützlich, als es diedurch Klemmtechniken verursachte verlängerte Exteriorisation des Hodens vermeidet 7 und gleichzeitig das klinische Erscheinungsbild der TT beim Menschen genauer modelliert10,12

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.

Danksagungen

Wir danken Herrn Ojeniran, dem Leiter der audiovisuellen Abteilung des College of Health Sciences, für seine Unterstützung, der bei der Aufnahme und dem Schnitt des Eingriffs mitgeholfen hat.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1 cc SpritzenNicht zutreffendNicht zutreffendfür Anästhesie
2-0 chromische NahtNicht zutreffendNicht zutreffendFür Chirurgie
Bard Parker MessergriffNicht zutreffendNicht zutreffendFür Chirurgie
Gebogene Mosquito-ArterienklemmeNicht zutreffendNicht zutreffendFür Chirurgie
SezierschereNicht zutreffendNicht zutreffendFür Chirurgie
GraphPad Prism (Version 8.0.2)
KetamineinjektionSwiss Parenterals LTD Gujarat India2321154Anästhetikum
ParacetamolinjektionShanxi Zhongbao Pharmaceuticals, China220637Analgetikum
PovidonJAWA International limited Nigeria 135SAntiseptische Wäsche
Procain-Penicillin-PulverAnhui Chengshi Pharmaceutical Co Ltd China201906Für Chirurgie
Chirurgisches MesserNicht zutreffendNicht zutreffendFür Chirurgie
Chirurgische HandschuheZhenjiang huayang latex products China210325
NähschereNicht zutreffendNicht zutreffendFür Chirurgie
Gezahnte SezierzangeNicht zutreffendNicht zutreffendFür Chirurgie
XylazininjektionBioveta Tschechische Republik396228AAnästhetikum
LichtmikroskopNovel Microscope, ChinaNicht zutreffendFür histopathologische Auswertung
DigitalkameraHayear, ChinaNicht zutreffendFür histopathologische Auswertung
TNF-α KitElabscience, USAE-EL-H0109Für Assay
Thermo Fischer Kit (Anti-Maus-Caspase-3-Monoklonal für Caspase-3-Expression)Thermo Fischer Scientific Inc., USANicht zutreffendFür Immunhistochemie (Caspase 3)

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Verankerung des verdrehten Hodens: Ein Rattenmodell der Ischämie-Reperfusionsverletzung des Hodens
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