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Methodenartikel

Ein immunkompetentes Mausmodell für die interstitielle Laser-Wärmetherapie des Glioblastoms

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DOI:

10.3791/67381

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15. November 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Human Anatomy and Cell Sciences, University of Manitoba, 2Department of Pathology, University of Manitoba, 3Department of Medical Microbiology & Infectious Diseases, University of Manitoba, 4CancerCare Manitoba

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das Glioblastom ist eine verheerende Form des primären Hirntumors, und die interstitielle Laser-Wärmetherapie entwickelt sich zu einer vielversprechenden Alternative zur konventionellen chirurgischen Resektion bei inoperablen Glioblastomen. Dieses Protokoll beschreibt ein optimiertes präklinisches Mausmodell, das zur Untersuchung von Behandlungseffekten oder adjuvanten und kombinatorischen Behandlungen verwendet werden kann.

Zusammenfassung

Das Glioblastom (GB), die aggressivste Form des primären Hirntumors, macht etwa die Hälfte aller hochgradigen primären Hirntumoren bei Erwachsenen aus und ist nicht heilbar. Die interstitielle Laser-Wärmetherapie (LITT) ist eine von der Food and Drug Administration (FDA) zugelassene Behandlung für GB und wird bei Patienten eingesetzt, die möglicherweise nicht für eine konventionelle chirurgische Resektion in Frage kommen. Während die klinische Wirksamkeit von LITT nachgewiesen wurde, ist die Forschung, die über klinische Fallstudien und Fallserien hinausgeht, begrenzt und wird durch das Fehlen eines etablierten Tiermodells behindert. Dieses Protokoll verwendet C57BL/6-Mäuse und eine syngene CT2A-Gliom-Krebszelllinie, um menschliches GB genau zu rekapitulieren, während gleichzeitig ein 1064-nm-Neodym-dotierter Yttrium-Aluminium-Granat-Laser (Nd:YAG) verwendet wird, wie er in einem der beiden von der FDA zugelassenen LITT-Systeme verwendet wird, was eine hervorragende präklinische Relevanz bietet. Die erfolgreiche Etablierung dieses LITT-Mausmodells wird eine wertvolle Plattform für die Untersuchung der einzigartigen Merkmale der LITT-Ablation und ihrer Auswirkungen auf die Tumormikroumgebung bieten, was möglicherweise zu verbesserten therapeutischen Strategien führen kann.

Einleitung

Krebs ist die häufigste Todesursache in Kanada. Das Glioblastom (GB), die häufigste Form aggressiver Hirntumoren, macht 48 % bis 60 % aller hochgradigen primären Hirntumoren bei Erwachsenenaus 1. Die Prognose für GB ist besonders düster mit einem 5-Jahres-Nettoüberleben von 4,8 % bei konventionellen Behandlungen, einschließlich chirurgischer Resektion, Chemo- und Strahlentherapie 1,2.

Die Laser Interstitial Thermal Therapy (LITT) ist ein von der FDA zugelassenes Verfahren mit einem Laser zur hyperthermischen in-situ Tumorablation bei Patienten mit inoperablen Hirntumoren und stellt eine attraktive therapeutische Alternative zur konventionellen chirurgischen Resektiondar 3. Es fehlt jedoch ein detailliertes und gut charakterisiertes Mausmodell für die LITT-Behandlung von GB, was die präklinische Forschung behindert.

Dieses Protokoll zielt darauf ab, ein optimiertes präklinisches Mausmodell für die GB-Behandlung mit LITT zu präsentieren. Wir haben uns für die Verwendung von C57BL/6-Mäusen und der syngenen Gliom-Zelllinie CT2A für dieses Modell entschieden, vor allem, weil CT2A humanes hochgradiges GB mit ähnlichen histologischen Merkmalen, Invasivität, Chemo- und Strahlenresistenz und stammartigen Merkmalen mit Selbsterneuerung und Re-Etablierung von Tumoren genau rekapituliert4. Diese Eigenschaften bieten eine hervorragende Plattform für eine Vielzahl von Studien, die sich mit Immunantworten oder neuartigen therapeutischen Strategien befassen. Darüber hinaus sind die technischen Aspekte dieses LITT-Protokolls auch leicht für andere allo- und xenotransplantierte Mausmodelle 4,5,6 anpassbar, auf die weiter eingegangen wird.

Zu den Vorteilen dieses Protokolls gehören konsistente Ergebnisse mit einem einfachen, aber effektiven LITT-Behandlungsparadigma. Der verwendete 1064-nm-Neodym-dotierte Yttrium-Aluminium-Granat-Laser (Nd:YAG) ist derselbe, der klinisch in einem der beiden derzeit von der FDA zugelassenen Systeme eingesetzt wird, und ermöglicht Experimente, die eng mit der klinischen Anwendung von LITT zur Behandlung von hochgradigen Gliomen übereinstimmen. Der Hauptnachteil dieses Protokolls ist die äußerste Sorgfalt, die sowohl bei der Tumorzellimplantation als auch bei der LITT-Behandlung angewendet werden muss, um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Darüber hinaus ist das Protokoll aufgrund der aggressiven Natur der CT2A-Zelllinie sehr zeitkritisch. Die meisten Experimente müssen in maximal 20 Tagen abgeschlossen sein, was die Untersuchung einiger adaptiver Immunantworten oder anderer zellulärer und molekularer Mechanismen, die über einen längeren Zeitraum auftreten, einschränken könnte.

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Protokoll

Die Tierethik für dieses Protokoll wurde vom Animal Care Committee der University of Manitoba in Übereinstimmung mit den ethischen Richtlinien des Canadian Council for Animal Care (CCAC) genehmigt. Im Rahmen dieses Protokolls wurden 8-12 Wochen alte immunkompetente C57BL/6-Mäuse und die syngene Gliomzelllinie CT2A für ein präklinisches Modell mit einem breiten Anwendungsspektrum verwendet, einschließlich Experimenten, die sich auf histologische Analysen, immunologische Veränderungen oder kombinatorische therapeutische Interventionen konzentrierten. Das Protokoll kann je nach den experimentellen Anforderungen leicht an andere Mausarten oder Zelllinien angepasst werden.

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Abbildung 1: Grafisches Schema des grundlegenden Versuchsdesigns. Erstellt mit BioRender.com Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

1. Die Zellvorbereitung in Kürze (Tag 0)

  1. Stellen Sie vor dem Start der Zellkultur sicher, dass der Schrank und alle erforderlichen Pipetten vollständig mit UV und Ethanol sterilisiert sind.
  2. Erwärmen Sie das DMEM/F12 mit 10 % FBS-Medien, phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und Trypsin im Wasserbad auf Raumtemperatur (RT).
  3. Pipettieren Sie das Medium aus dem T25-Kolben heraus und spülen Sie die Zellen kurz mit PBS aus. 1 ml Trypsin werden in die Zellen gegeben und 30-60 s lang inkubiert, bis sich die Zellen vom Kolben lösen.
  4. Bestätigen Sie die abgelösten Zellen unter einem Lichtmikroskop und fügen Sie 4 ml Medium hinzu, um die enzymatische Aktivität von Trypsin zu stoppen.
  5. Zählen Sie Zellen mit einem automatisierten Zellzähler.
    1. Mischen Sie 10 μl der Zellsuspension mit 10 μl Trypanblau und geben Sie dann 10 μl in den Zellzählobjektträger.
    2. Setzen Sie den Objektträger in das Zellzählgerät ein und notieren Sie die Gesamtzellzahl, die Anzahl der lebenden Zellen und den Prozentsatz der lebenden Zellen.

HINWEIS: Wenn kein automatisiertes Zellzählgerät verfügbar ist, kann eine manuelle Zählung mit einem Hämozytometer durchgeführt werden.

  1. Berechnen Sie die Zellen, die für alle geplanten Injektionen benötigt werden.
    HINWEIS: Für CT2A werden 5000 Zellen pro 1,5 μl injiziertes Volumen und ein Minimum an 100 μl Gesamtvolumen für jedes Präparat empfohlen.
  2. Schleudern Sie die Zellen 5 Minuten lang bei 134 x g , um die Zellen zu pelletieren und so viel Medium wie möglich abzusaugen.
  3. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit 5 % Basalmembranextrakt in PBS, um das in einem Mikrozentrifugenröhrchen benötigte Volumen zu erhalten. Während kleinere Röhrchen am besten für die Vorbereitung der Zellsuspension geeignet sind, ist ein 2-ml-Röhrchen besser für die Lagerung während der Operation geeignet, da die Zellen weniger wahrscheinlich in den abgerundeten Boden verklumpen und sich durch sanftes Schnippen leicht neu verteilen.
  4. Halten Sie die Zellen für die Injektion auf Eis und bereiten Sie bei Bedarf alle 4-5 Stunden frische Zellsuspensionen vor.

2. Orthotope Implantation (Tag 0)

  1. Bereiten Sie den Operationsbereich vor und stellen Sie sicher, dass alle erforderlichen Instrumente steril und einsatzbereit sind.
  2. Betäuben Sie die Maus mit Isofluran (3% verdampft in 1 L/min O2) in einer Kammer und überwachen Sie dabei die Atemfrequenz (Ziel 60 Schläge pro Minute).
  3. Ermitteln und erfassen Sie das Tiergewicht für die Medikamentendosierung.
  4. Rasieren Sie den Operationsbereich vorsichtig, um Augen, Ohren und Schnurrhaare zu vermeiden.
  5. Übertragen Sie das Tier in einen stereotaktischen Rahmen.
    1. Setzen Sie die Schneidezähne in das Loch der Beißstange ein und stellen Sie den Nasenkonus so ein, dass er fest sitzt, indem Sie die Halteschraube festziehen, um ihn zu sichern.
    2. Überprüfen Sie die Narkosetiefe mit beidseitigen Zehenkneifungen an den Hintergliedmaßen und sichern Sie gegebenenfalls den Schädel mit Ohrsteckern und bringen Sie den Kopf des Tieres in eine neutrale, waagerechte Position.
    3. Überwachen Sie die Kerntemperaturen der Tiere mit einem geschmierten rektalen Temperaturfühler und sorgen Sie mit einem Heizkissen unter dem Körper für eine zusätzliche Erwärmung bei 37 °C.
      ACHTUNG: Achten Sie darauf, den Nasenkegel nicht zu fest anzuziehen, da bereits mäßiger Druck auf das Nasenbein zu Atemstillstand führen kann. Wenn ein elektrisches Heizkissen verwendet wird (z. B. ein Heizkissen für ein Terrarium), stellen Sie sicher, dass die Temperatureinstellungen korrekt sind und die eingestellte Temperatur konstant bleibt.
  6. Tragen Sie die Augensalbe großzügig auf beide Augen auf, um ein Austrocknen zu verhindern.
  7. Verabreichen Sie prophylaktische Injektionen und überprüfen Sie die Narkosetiefe.
    1. Injizieren Sie subkutan (s.c.) Meloxicam oder andere langwirksame Schmerzmittel gemäß den Richtlinien der örtlichen Tierhaltungseinrichtung (z. B. 5,0 mg/kg Meloxicam) mit einer 28 G x 1/2" Spritze.
    2. Verabreichen Sie eine Injektion von 20 mg/kg s.c. vorgewärmter normaler Kochsalzlösung zur prophylaktischen Flüssigkeitsunterstützung bei längeren Eingriffen.
    3. Reduzieren Sie das Anästhetikum auf 1,5 % bis 2,0 % Isofluran, um die angestrebte Atemfrequenz aufrechtzuerhalten.
  8. Mit einer aseptischen Technik das Tier drapieren und den Operationsbereich vorbereiten.
    1. Tragen Sie mit einem sterilen Wattestäbchen eine Povidon-Jod- oder Chlorhexidin-Desinfektionslösung auf. Beginnen Sie medial an der Inzisionsstelle und drehen Sie den Tupfer nach jedem Durchgang, arbeiten Sie sich nach außen und tragen Sie dann mit einem frischen sterilen Wattestäbchen 70% Ethanol auf die Stelle auf ähnliche Weise auf.
    2. Wiederholen Sie das Peeling mit Jod, gefolgt von 70 % Ethanol zwei weitere Male (insgesamt 3 Mal).
  9. Überprüfen Sie die Anästhesietiefe erneut, bevor Sie mit der chirurgischen Exposition fortfahren. Überwachen Sie die Atemfrequenz während des gesamten Eingriffs genau und passen Sie das Anästhetikum nach Bedarf an.
  10. Beginnend in der Mittellinie und etwas posterior der Augen machen Sie mit einem Skalpell #15 einen 1-1,5 cm langen Schnitt in der Mitte des sagittalen Bereichs in kaudaler Richtung. Alternativ können Sie einen kurzen Skalpellschnitt mit einer Irisschere verlängern.
    HINWEIS: Die Schnitte sollten in der Mittellinie beginnen, können aber bei einseitigen Injektionen leicht seitlich abgewinkelt werden, um die gleichzeitige Visualisierung und den Zugang von Bregma und der Position des Bohrlochs zu erleichtern.
  11. Reflektieren Sie mit einem sterilen Wattestäbchen die Wundränder, um den Schädel sichtbar zu machen, und reiben Sie vorsichtig das Bindegewebe von der Stelle ab.
    1. Verwenden Sie bei Bedarf ein steriles, in Wasserstoffperoxid getränktes Wattestäbchen, um die Schädeloberfläche zu reinigen und die Schädelnähte sichtbar zu machen.
  12. Lokalisieren Sie das Bregma an der Stelle, an der sich die linke und rechte Kronennaht an der Mittellinie mit der sagittalen Naht treffen (siehe Abbildung 2).
    1. Machen Sie mit einem ungiftigen farbigen Acrylharz und einem sterilen Holzzahnstocher oder ähnlichem einen sehr kleinen Fleck auf Bregma.
      HINWEIS: In einigen Fällen spiegeln sich die linke und die rechte Kronennaht nicht gegenseitig; Verwenden Sie in solchen Fällen eine "Linie der besten Anpassung", um ungefähr zu bestimmen, wo sie sich entlang der mittleren Sagittalebene schneiden sollten.
  13. Stellen Sie sicher, dass die Kopfposition des Tieres nicht gekippt oder gedreht ist (d. h. in einer flachen Ebene).
    1. Null stereotaktische Koordinaten bei Bregma. Die x-Koordinate bezieht sich auf die Bewegung in der medial-lateralen (ML) Ebene, die y-Koordinate in der anterior-posterioren (AP) Ebene und die z-Koordinate in der dorsal-ventralen (DV) Ebene.
    2. Stellen Sie sicher, dass sich Lambda in derselben DV-Ebene wie Bregma befindet (d. h. z = 0 an beiden Orientierungspunkten). Stellen Sie in ähnlicher Weise bei +2,0 mm (x = 2) und -2,0 mm (x = -2,0) lateral von Bregma sicher, dass sich der Schädel in der gleichen Ebene befindet, wobei die DV/z-Koordinate ungefähr gleich ist. Stellen Sie sicher, dass der Schädel sicher sitzt und sich nach einer Anpassung nicht bewegt.
  14. Bohren Sie ein Fräsloch bei +2,0 mm (ML) und +0,5 mm (AP) aus Bregma (Abbildung 3).
    1. Senken Sie mit einem stereotaktischen Bohraufsatz die Spitze des Bohrers vorsichtig ab, bis sie mit Bregma in Berührung kommt, und stellen Sie die Koordinaten auf Null.
    2. Heben Sie den Bohrer leicht an und stellen Sie den Bohrer auf die entsprechenden AP- und ML-Koordinaten ein.
    3. Senken Sie den Bohrer langsam ab und achten Sie darauf, dass er nur durch den Schädel bohrt.
    4. Alternativ können Sie auch eine Mikroliterspritze im stereotaktischen Rahmen verwenden, um die Nadelspitze bis zum Kontakt mit Bregma abzusenken und die Koordinaten auf Null zu setzen.
    5. Heben Sie die Nadel leicht an und stellen Sie sie auf die entsprechenden AP- und ML-Koordinaten ein.
    6. Senke die Spitze, bis sie den Schädel berührt, und notiere dir die genaue Stelle.
    7. Heben Sie die Nadel leicht an und markieren Sie sie mit einem chirurgischen Marker an der Zielstelle.
    8. Heben oder drehen Sie den Nadelträger aus dem Weg und bohren Sie ihn mit einer Handbohrmaschine durch den Schädel, wobei Sie darauf achten müssen, das darunter liegende Gehirn nicht zu beschädigen. ACHTUNG: Im Allgemeinen haben ältere männliche Mäuse einen relativ dickeren Schädel und erfordern umfangreichere Bohrungen. Das Bohren von Hand sollte vorsichtig und mit minimalem Druck durchgeführt werden, da plötzliche Durchbrüche durch den Schädel die darunter liegenden Hirnhäute und/oder das Gehirn schädigen.
      HINWEIS: Eine Verlängerung des Fräslochs ist erforderlich, um die Thermoelementsonde während des LITT-Verfahrens aufzunehmen. Dies kann während der ersten Injektionsoperation einfacher durchgeführt werden und ermöglicht eine schnellere und effizientere LITT-Operation. Alternativ kann das Bohrloch während der LITT-Operation auf die gleiche Weise erweitert werden, was das Risiko eines extrakraniellen Tumorwachstums verringern kann.
  15. Erstellen Sie ein zweites Fräsloch bei +3,0 mm ML und +0,5 mm AP (1,0 mm lateral zur Injektionsstelle) für das Thermoelement.
    1. Befolgen Sie das Bohrverfahren wie im vorherigen Schritt beschrieben.
    2. Um Schwierigkeiten im Zusammenhang mit dem Nachwachsen des Knochens zu vermeiden, entfernen Sie den Knochen zwischen den beiden Löchern.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, +2,0 mm ML, +0,5 mm AP und -2,5 mm DV von Bregma als Koordinaten für die Tumorimplantation zu verwenden. Diese Lokalisation im oberen Striatum führt zu einem gleichmäßigen Tumorwachstum, das von den Tieren gut vertragen wird - das Protokoll kann jedoch an andere Lokalisationen angepasst werden.
  16. Bereiten Sie CT2A Maus-Gliomzellsuspension in einer Mikroliterspritze vor (5000 Zellen in 1,5 μl).
    1. Nehmen Sie das vorbereitete Mikrozentrifugenröhrchen mit den Zellen aus dem Eis und schnippen Sie vorsichtig mit einer Fingerspitze, um es wieder zu suspendieren.
    2. Ziehen Sie vorsichtig 2 μl in eine 5 μl oder 10 μl Spritze und achten Sie darauf, Blasen zu vermeiden.
    3. Drücken Sie 0,5 μl ab, um jegliche Luft zu entfernen und sicherzustellen, dass die Nadel grundiert ist und ordnungsgemäß funktioniert.
    4. Wischen Sie den Nadelschaft mit einem Alkoholtupfer ab, um die exprimierte Flüssigkeit und alle Zellen auf der Außenfläche zu entfernen (die das Wachstum eines leptomeningealen Tumors verursachen können).
  17. Laden Sie die Spritze in eine Mikroinjektor-Spritzenpumpe (oder einen manuellen stereotaktischen Aufsatz) und senken Sie die Nadel langsam ab.
    1. Senken Sie die Nadel langsam auf die Tiefe (z = -3,0 mm) ab und pausieren Sie 1 Min.
    2. Ziehen Sie die Nadel langsam 0,5 mm (z = -2,50 mm) zurück und injizieren Sie die Zellen (≤ 0,5 μL/min). Halten Sie den Bereich um die Spritze herum mit einem mikrochirurgischen Schwammspeer trocken und achten Sie darauf, die Nadel nicht zu beschädigen.
    3. Warten Sie mindestens 2 Minuten, nachdem die Injektion abgeschlossen ist, und ziehen Sie die Spritze dann langsam über einen Zeitraum von 3-4 Minuten zurück. Stellen Sie sicher, dass die ersten 4-5 Retraktionsintervalle 100 μm pro Retraktion betragen, um zu vermeiden, dass Zellen von ihrer ursprünglichen Injektionsstelle entfernt werden.
    4. Wischen Sie die Außenseite der Nadel vorsichtig mit einem Alkoholtupfer von Blut oder Flüssigkeit ab und spülen und reinigen Sie die Spritze gemäß den Richtlinien des Herstellers. Verwenden Sie PBS und destilliertes Wasser zwischen den Injektionen, um sicherzustellen, dass die Nadel nicht verstopft. Wenn die Injektionen abgeschlossen sind, spülen Sie die Nadel großzügig mit 70 % Ethanol, um alle verbleibenden Zellen von der Nadel zu entfernen.
      ACHTUNG: Wenn die Nadel nach jeder Injektion nicht gespült wird, kann dies zu einer Verstopfung führen. Wenn Sie mehr als einen Zelltyp injizieren, verwenden Sie für jeden Typ eine separate Nadel, um eine mögliche Kreuzkontamination zu vermeiden.
  18. Nähern Sie sich dem Schnitt wieder an und achten Sie darauf, die Wundränder leicht umzukehren, damit sich die darunter liegende Dermis berührt. Verschließen Sie die Wunde mit einem Wundclip oder 3 unterbrochenen Stichen mit einer 5-0-Naht. Tragen Sie Povidon-Jod-Lösung auf die geschlossene Wunde auf.
  19. Nehmen Sie das Tier aus dem stereotaktischen Rahmen und setzen Sie es in einen mit Papier ausgekleideten Auffangkäfig auf ein auf 37 °C eingestelltes Wärmekissen. Stellen Sie sicher, dass das Brustbein liegt, bevor Sie das Tier mit einer kleinen Schüssel mit nassem Futter auf dem Käfigboden zurück in den Käfig bringen.
  20. Überwachen Sie das Tier mindestens zweimal täglich, beginnend am Tag der Operation, für die folgenden 2 Tage. Meloxicam nach 24 Stunden, 48 Stunden und 72 Stunden oder gemäß den Richtlinien der Einrichtung erneut verabreichen.

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Abbildung 2: Grafische Darstellung eines Mausschädels und wichtiger anatomischer Orientierungspunkte für die stereotaktische Chirurgie. Erstellt mit BioRender.com Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Grafische Darstellung der Positionen von Bohrlöchern und Lasergeräten. Die Abbildung zeigt die relativen Positionen des Bregma-Orientierungspunkts, (A) das anfängliche Bohrloch für die (A')-Laserfaser und (B) das zweite oder erweiterte Bohrloch für die (B')-Thermoelementsonde. Auf der rechten Seite ist eine ausgeschnittene Darstellung der Laserfaser- und Thermoelementsonden zu sehen, die zeigt, wie die Sonden in einem stereotaktischen Endfuß mit vorgebohrten Löchern in der gewünschten Größe und im gewünschten Abstand stabilisiert werden. Erstellt mit BioRender.com Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

3. Überwachung der Tumorlast vor der LITT (Tag 9)

  1. Führen Sie eine T2-gewichtete Magnetresonanztomographie (MRT) gemäß den institutionellen Richtlinien durch, um das Tumorwachstum am Tag vor der LITT zu beurteilen.
    HINWEIS: Tumore sollten einen Durchmesser von ~1,5-2,0 mm haben.
    1. Erhalten Sie einen geeigneten koronalen Scan des gesamten Mausgehirns unter Verwendung der folgenden Parameter: schnelle Spin-Echo-Sequenz, TR = 5000 ms, TE = 45 ms, Echozüge = 7, FOV = 30 x 30 mm2, Matrixgröße = 250 x 256, Gesamtschnitte = 18, Schichtdicke = 0,3 mm, Mittelwerte = 2.
      HINWEIS: Es wird auch empfohlen, eine regelmäßige MRT durchzuführen, die etwa am 6. Tag nach der Implantation beginnt, um eine erfolgreiche Allotransplantation zu bestätigen und das Tumorwachstum zu überwachen - insbesondere während der ersten Experimente -, da selbst geringfügige Änderungen am Verfahren den Zeitplan ändern können. CT2A ist sehr aggressiv und die Tiere müssen genau überwacht werden. Hierfür eignet sich ein T2-gewichteter Koronascan gut. Die Verwendung von fluoreszenzmarkierten oder Luciferin-markierten CT2A-Zellen in Verbindung mit einem In-vivo-Bildgebungssystem (IVIS) kann auch geeignet sein, wenn der Zugang zu einer MRT für Kleintiere nicht möglich ist. Die Wachstumskinetik und andere Tumoreigenschaften unterscheiden sich jedoch von diesem Protokoll.

4. LITT-Operation (Tag 10)

  1. Wiederholen Sie wie in Abschnitt 2 die Schritte 2.1-2.13, um das Tier auf die LITT vorzubereiten.
    HINWEIS: Die Wundheilung nach der vorherigen Operation kann je nach Spezies und Variationen im experimentellen Zeitrahmen in unterschiedlichen Stadien verlaufen. Achten Sie auf dünneres oder empfindlicheres Gewebe, wenn Sie den Schnitt neu machen.
  2. Reinigen Sie den Schädel vorsichtig mit einem sterilen Wattestäbchen und entfernen Sie jegliches Gewebe, das Bregma verdeckt, oder das zuvor entstandene Bohrloch. Falls erforderlich, bohren Sie das Bohrloch erneut, obwohl aufgrund der Geschwindigkeit der CT2A-Tumorbildung nur ein geringes oder gar kein Knochenwachstum zu erwarten ist.
  3. Wenn der LITT-Aufsatz im stereotaktischen Rahmen platziert ist, nullen Sie die Koordinaten bei Bregma für die Spitze der Laserfaser.
    ACHTUNG: Die Laserfaser ist sehr zerbrechlich und reißt, wenn sie gebogen wird. Achten Sie darauf, dass Sie aufhören, sobald die Spitze der Laserfaser den Schädel berührt.
  4. Heben Sie die Spitze leicht an und bewegen Sie sich zu den gewünschten ML- und AP-Koordinaten, dann senken Sie die Sonden langsam auf die DV-Zielkoordinate ab, um das Ziel zu erreichen (2,0 mm ML, 0,5 mm AP, -2,0 mm DV).
  5. Stellen Sie die Parameter der LITT-Behandlung ein: Modus: kontinuierlich; Leistung: 1 W
  6. Schalten Sie den Laser von Standby auf Active um und aktivieren Sie den Laser mit dem Fußpedal für 60 s. Wenn die Temperatur über 46 °C ansteigt, halten Sie kurz inne, schalten Sie sie dann wieder ein und versuchen Sie, die Temperatur so nah wie möglich an 46 °C zu halten.
  7. Ziehen Sie die Laserbaugruppe langsam ein und wischen Sie die Laserfaser und das Thermoelement vorsichtig mit einem Alkoholtupfer sauber. Drehen Sie die Baugruppe aus dem Weg und achten Sie darauf, dass die Sonden den Rahmen nicht berühren.
  8. Verschließen Sie die Wunde und bergen Sie das Tier wie in den Schritten 2.18-2.20 oben nach der Tumorimplantation beschrieben.

5. Bewertung nach dem LITT (Tag 11)

  1. Führen Sie am Tag nach der LITT-Behandlung eine T2-gewichtete MRT nach der LITT-Behandlung durch, um eine erfolgreiche LITT-Tumorablation anhand der Sequenz und der Parameter aus Schritt 3.1 oben zu beurteilen.
    HINWEIS: Darüber hinaus kann eine FLAIR-Sequenz (Fluid-Attenuated Inversion Recovery) bei der Beurteilung eines postoperativen Ödems hilfreich sein.
  2. Führen Sie vor Ende der Studie Nachuntersuchungen durch, um Veränderungen nach der Behandlung oder das Nachwachsen des Tumors zu überwachen.

6. Ende der Studie (Tag 11/Tag 15/Tag 20)

  1. Euthanasieren Sie die Tiere an den gewählten experimentellen Endpunkten gemäß den Richtlinien der Einrichtung.
    HINWEIS: Endpunkte nach Tag 20 sind mit CT2A nicht durchführbar, selbst bei Impfungen mit extrem niedriger Zellzahl, da Kontrolltiere (d. h. Scheinoperation oder keine Behandlung) und einige Tiere der Behandlungsgruppe moribunde sein können und eine Euthanasie benötigen. Für längere Experimente sollten Sie alternative Maus-Gliom-Zellmodelle in Betracht ziehen.
  2. Sammeln Sie Gewebe für die Fixierung und Verarbeitung.
    1. Führen Sie eine Herzperfusion mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) durch und sammeln Sie das gewünschte Gewebe.
    2. Postfixieren Sie das Hirngewebe durch Eintauchen in 4% PFA über Nacht bei 4 °C.
    3. Verarbeiten Sie die Proben unter Verwendung der Standardverfahren für die formalinfixierte Paraffin-eingebettete (FFPE) oder fixierte Gefrieranalyse.

7. Würdigung

  1. Verifizieren Sie die erfolgreiche LITT-Ablation mit einer T2-gewichteten MRT und validieren Sie mit grundlegenden histologischen Techniken wie einer Hämatoxylin- und Eosin-Färbung.
  2. Führen Sie alle zusätzlichen Analysen durch, die für die Experimente erforderlich sind (z. B. Immunhistochemie, Immunfluoreszenz).

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Ergebnisse

Erfolgreiche CT2A-Tumorimplantationen und LITT-Behandlungen können mit Hilfe der T2-gewichteten MRT charakterisiert werden, wie in Abbildung 4, Abbildung 5 und Abbildung 6 gezeigt. MRT-Bilder wurden unter Verwendung eines kryogenfreien supraleitenden 7T-Magneten mit einer 17-cm-Bohrung und einer Quadratur-Mauskopfspule unter Verwendung der im obigen Protokoll beschriebenen Sequenzparameter erstellt. Die sorgfältige ...

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Diskussion

Es gibt eine schnell wachsende Menge an Literatur zu LITT; Sie beschränkt sich jedoch in erster Linie auf klinische Fallstudien oder Fallserien am Menschen. In der Tat wurden mehrere potenzielle Vorteile für LITT gezeigt, darunter niedrigere postoperative Komplikationsraten und -kosten bei gleichzeitigem Überleben ohne Progression 7,8,9,10,11.

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Offenlegungen

Wir sind dankbar für die Unterstützung von Monteris Medical, einschließlich der Sachspende von Lasergeräten.

Danksagungen

Zu den Finanzierungsquellen für dieses Projekt gehören die Natural Sciences and Engineering Council of Canada (NSERC)-Alliance, Mitacs-Accelerate, Research Manitoba-IPOC, Canadian Institutes for Health Research (CIHR) CGS-M und das University of Manitoba Graduate Fellowship. CT2A-Gliom-Zelllinie, großzügig gespendet von Dr. Peter Fecci an der Duke University, Durham, NC. Wir danken auch dem Histology Service Lab und der Small Animal and Material Imaging Core Facility an der University of Manitoba für ihre hervorragende technische Unterstützung bei diesem Projekt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AbsorptionsstangenFST18105-01Hämostatische Schwämme.
Adson-GewebezangeFST11006-12
C57BL/6 MäuseJackson LaboratoriesStamm #0006646 bis 12 Wochen alt männlich und weiblich
Applikatoren mit Wattespitze (6")Elektronenmikroskopie Sciences72308
CT2A Gliom-ZelllinieGroßzügig gespendet von Dr. Peter Fecci, Duke University.
Cultrex Basalmembranextrakt mit reduziertem Wachstumsfaktor, PathClearBiotechne, R& D systems3433-010-01
DMEM/F-12, HEPESGibco, ThermoFisher Scientific11330032
Zweikammer-Objektträger BIO-RAD1450003
Eppendorf Safe-Lock Tubes 2,0 mLEppendorf22363352
Ethylalkohol wasserfreiGreenfield GlobalP016EAANVerdünnen auf 70% mit ddH2O
Fetal Bovine Serum, qualifiziert, KanadaGibco, ThermoFisher Scientific12483020
Glad Press-n-Seal PlastikfolieAmazon.ca
HochgeschwindigkeitsbohrmaschineKopf InstrumentsModell 1474
K & J Thermoelement-TemperaturmessgerätOmegaHH509R
Metacam (meloxicam)WDDC114424
MikroinjektionsspritzenpumpeWPIUMP3T-1
Mikroliterspritze (Serie 700)Hamilton87908Kundenspezifische Nadeln sind erhältlich. Eine steile Nadelfase hilft bei der präzisen Auslage, und eine kürzere Nadellänge trägt zur Stabilität bei.
Nadeltreiber/NadelhalterFST12500-12Aufgrund des begrenzten Arbeitsraums ist eine feine Spitze am besten geeignet, aber viele Ausführungen sind je nach Vorliebe für den Griff geeignet.
Opixcare Plus AugensalbeWDDC135941
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (10x)Fisher BioreagenzienBP399-41x mit ddH2O
Povidon-iodThermoFisher Scientific3955-16Aliquat in kleinere Röhrchen zur Verwendung mit Applikatoren mit Wattespitze verdünnen.
Kochsalzlösung (normal)WDDC126588
Skalpell, Einmalgebrauch (#15 Klinge)FeatherFeather NO15
Schere, feine chirurgischeFST91460-11Feine Studentenschere, Iris oder Bonn sind alle geeignet.
Stereotaktischer RahmenKopf InstrumentsModell 940Mit digitaler Anzeigekonsole und Maus, Nasenkonus und Ohrbügeln.
Stereotaktischer SpritzenhalterKopf InstrumentsModell 1772-FWenn keine Injektionspumpe verwendet wird.
Nähte (5-0 monofil)EthiconMCP463Gmonocryl violett monofil mit umgekehrter Schneidspitze
Spritze, 28 g & (0,5 ml) BDBD 329461BD Lo-Dose U-100 Insulinspritzen
TC20 Automatisierter ZellzählerBIO-RAD1450102
Thermoelementsonde, feiner Durchmesser (Typ K)OmegaTJM-CA316-IM025G-150
Trypsin-EDTA (0,25%), phenolrotGibco, ThermoFisher Scientific25200072
Vetbond von 3M, Veterinärgewebekleber WDDC126125
Wahl ErdnussschneiderWDDC/Wahl100963Auch direkt ab Hersteller erhältlich.
WärmekissenBensen Medical70308/121873Jeder ähnliche Artikel kann verwendet werden.
Webcol Alcohol prepsElectron Microscopy Sciences71005-20Alcohol Prep Tuch, 2-lagig, mittlere Größe.
12587704417

Referenzen

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