Hochauflösende Respirometrie in einer kleinvolumigen Kammer

Zusammenfassung

Hier zeigen wir, dass die 0,5-ml-Kammer für die hochauflösende Respirometrie Ergebnisse zeigt, die mit denen der 2,0-ml-Kammer übereinstimmen, wenn eine geeignete instrumentelle_{O2-Hintergrundkorrektur} angewendet wird. Es werden weniger Proben benötigt, was für Studien mit begrenzter Verfügbarkeit oder geringen Atmungskapazitäten von Vorteil ist.

Zusammenfassung

Die Untersuchung der Atemströme ist entscheidend für das Verständnis des komplexen Zusammenspiels von Stoffwechselprozessen. Studien an Zellen und Geweben mit begrenzter Probenverfügbarkeit und niedrigen Atemfrequenzen können von kleinen Versuchsvolumina profitieren. Wir untersuchten, ob die 0,5-ml-Kammer bei identischen Probenkonzentrationen, die in der hochauflösenden Respirometrie mit dem Oroboros verwendet werden, konsistente Ergebnisse liefert. Der_{Hintergrund-O2-Fluss} war in 0,5-ml-Kammern bei Luftsättigung 4-fach höher als in 2,0-ml-Kammern, war aber reproduzierbar, was eine genaue Hintergrundkorrektur ermöglichte. Die optimale Rührgeschwindigkeit lag zwischen 550 Umdrehungen pro Minute (U/min) und 750 U/min in der 0,5-ml-Kammer. Die respiratorischen Flüsse in lebenden Zellen, permeabilisierten Zellen und isolierten Mitochondrien wurden parallel in den 0,5-ml- und 2,0-ml-Kammern unter Verwendung von Substrat-Uncoupler-Inhibitor-Titrationsprotokollen mit 14 bis 20 Titrationen gemessen. Die_{O2-Flussmittel} in den verschiedenen Kammertypen waren innerhalb der Nachweisgrenzen identisch. Die 0,5-ml-Kammer, die fast viermal weniger Probe benötigt als die 2,0-ml-Kammer, bietet einen erheblichen Vorteil für Studien mit begrenzten Probenmengen oder geringen Atemkapazitäten.

Einleitung

Die Untersuchung der mitochondrialen Atmungswege ist der Schlüssel, um die metabolischen Mechanismen zu verstehen, die verschiedenen Krankheiten, dem Altern oder der Reaktion auf Stress zugrunde liegen, und bietet so potenzielle Ziele für therapeutische Interventionen und verbessert die diagnostischen Fähigkeiten ^1,2,3. Die hochauflösende Respirometrie (HRR) ermöglicht eine detaillierte Analyse des mitochondrialen Signalwegs und der Kupplungskontrolle bei der oxidativen Phosphorylierung (OXPHOS) über eine Vielzahl von Probentypen und Präparaten⁴. Das Volumen der Experimentierkammer ist ein grundlegendes Konstruktionsmerkmal respirometrischer Instrumente. Das zuvor festgelegte Kammervolumen beträgt 2,0 mL in den Oroboros. Dieses Volumen wurde optimiert, um einen geringen instrumentellen_{Hintergrund-O2-Fluss} zu erzielen und die Homogenität des gerührten Mediums zu gewährleisten. Diese gehören zu den wichtigsten Qualitätskriterien für die genaue Messung der Atmung bei sauerstoffarmen und hyperoxischen Bedingungen, die für die mitochondriale Sauerstoffkinetik bzw. permeabilisierte Muskelfasern erforderlich sind 5,6,7,8,9. Darüber hinaus benötigen mehrere Multisensor-Einsätze¹⁰ den Platz der 2,0-ml-Kammer (Tabelle 1).

In der vorliegenden Studie haben wir die Machbarkeit untersucht, das Kammervolumen für HRR von 2,0 mL auf 0,5 mL zu verringern. Können niedrigere Zellzahlen oder Gewebemengen in respirometrischen Assays in einer kleineren Kammer angewendet werden, ohne die Genauigkeit zu beeinträchtigen? Die Klärung dieser Frage ist wichtig für die Untersuchung von menschlichen Gewebe- und Flüssigbiopsien, Primärzellen und langsam wachsenden Zellkulturen¹. In ähnlicher Weise ist eine Verringerung des Kammervolumens potenziell vorteilhaft bei Studien an Proben mit geringer Atmungsaktivität in defekten Mitochondrien¹¹ und mitochondrialen Signalwegen mit inhärent geringen Kapazitäten, wie z. B. der Fettsäureoxidation im Gehirn¹². Bei geringer Kammergröße kann die Auflösung jedoch aufgrund überproportional zunehmender Artefakte der_{O2-Rückdiffusion} und einer ungenauen Volumenkalibrierung verringert werden^13,14. Aus diesem Grund analysierten wir die instrumentelle Leistung der Oroboros mit der kleinvolumigen Kammer (sV), die mit einem minimalen experimentellen Volumen von 0,5 mL kalibriert wurde, im Vergleich zur klassischen Volumenkammer (cV), die mit 2,0 mL kalibriert wurde. Insbesondere analysierten wir den instrumentellen Hintergrund des_O2-Flusses und die optimale Rührgeschwindigkeit.

SUIT-Protokolle (Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration) werden verwendet, um Atemfrequenzen und -zustände in der OXPHOS-Analyse zu beurteilen. Die ^{SUIT-Protokolle} umfassten 14 bis 20 Titrationen pro respirometrischem Assay und umfassten respiratorische_O2-Flüsse, die von einigen pmol∙^s-1∙^mL-1 bis zu Hunderten von pmol∙^s-1∙^mL-1 reichten. Zu den Kopplungskontrollzuständen gehört die Leckrate L, d. h. die dissipative Komponente der Atmung, die für die Phosphorylierung von Adenosin-5'-diphosphat (ADP) zu Adenosin-5'-triphosphat (ATP) nicht verfügbar ist und aus Protonenleck, Protonenschlupf, Kationenzyklus und Elektronenleck resultiert. Die OXPHOS-Kapazität P erklärt die Atmung der Mitochondrien, wenn der Elektronentransfer, gemessen als O₂ -Verbrauch (Oxidation), an die ATP-Synthese (Phosphorylierung) in Gegenwart von ADP gekoppelt ist. Die Elektronentransferkapazität E im entkoppelten Zustand wird durch Titrationen eines Protonophors in Gegenwart von mitochondrialen Substraten¹⁵ quantifiziert. Der Restsauerstoffverbrauch rox wird nach Zugabe der Complex I- und Complex III-Hemmer Rotenon und Antimycin A bestimmt.

Wir maßen die Atmung von Zellen und mitochondrialen Präparaten in den sv und cv Kammern. Blutplättchen sind kernhaltige zytoplasmatische Fragmente von Megakaryozyten und stellen eine leicht zugängliche Quelle für menschliche Mitochondrien dar. Daher wurden Blutplättchen als Modell für lebende Zellen (oder Zellpartikel) mit intakten Plasmamembranen verwendet. Die Atmung der Blutzellen dient als Biomarker für systemische mitochondriale Erkrankungen und korreliert mit der bioenergetischen Fitness stoffwechselaktiver Organe 16,17,18,19, obwohl diese Befunde nicht verallgemeinert werden können 20,21,22. Humane Fibroblasten wurden für ihre Anwendung als zelluläres Modell der mitochondrialen Dysfunktion ausgewählt 1,23,24,25. Die Unversehrtheit der Plasmamembranen ist für die Lebensfähigkeit der Zellen notwendig, aber ihre selektive Permeabilisierung ermöglicht den Austausch von Molekülen zwischen dem Zytosol und dem umgebenden Medium. Daher wurden Fibroblasten mit chemisch permeabilisierten Plasmamembranen als Beispiel für permeabilisierte Zellen untersucht, verglichen mit isolierten Mitochondrien, die zur Beurteilung der mitochondrialen Funktion verwendet wurden und zur Trennung von mitochondrialen Subpopulationen erforderlich waren^26,27.

Protokoll

Für die Studie an menschlichen Blutplättchen gaben acht Freiwillige eine schriftliche Einverständniserklärung zur Teilnahme an der Studie ab, die von der schwedischen Ethikprüfungsbehörde (Nr. 2013/181) genehmigt wurde. Zwei humane Hautfibroblasten-Zelllinien von männlichen Neugeborenen wurden von ATCC gekauft und gemäß der ethischen Genehmigung des Gesundheitsministeriums der Tschechischen Republik verwendet (Projekt: AZV MZ CR NU22-07-00474). Die Verfahren mit Mäusen wurden in Übereinstimmung mit dem österreichischen Tierversuchsgesetz und in Übereinstimmung mit dem Europäischen Übereinkommen zum Schutz der für Versuche und andere wissenschaftliche Zwecke verwendeten Wirbeltiere (Tierversuchsgesetz 2012; Richtlinie 2010/63/EU; BMWFM-66.011/0128-WF/V/3b/2016). Das 3R-Prinzip wurde angewendet, um die Anzahl der Versuchstiere zu minimieren.

1. Kalibrierung des Volumens

1. Montieren Sie die Kammern mit kleinem Volumen (sV) oder die Kammern mit klassischem Volumen (cV) auf den Oroboros (Abbildung 1A,B; Tabelle 1).
2. Schalten Sie die Oroboros ein und verbinden Sie sich mit DatLab.
3. Trocknen Sie die Kammern.
4. Pipettieren Sie 0,54 mL H₂O in das sV (0,50 mL effektives Versuchsvolumen plus 0,04 mL Kapillartotvolumen) oder 2,07 mL H₂O in das cV (2,00 mL effektives Volumen plus 0,07 mL Kapillartotvolumen).
   HINWEIS: Um Flüssigkeitsverluste zwischen der Oberseite des Glaszylinders und dem Kammerhalter aus Polyoxymethylen (POM) zu vermeiden, führen Sie die Pipettenspitze tief genug ein, um die Wand der Glaskammer zu berühren.
5. Schalten Sie die Rührwerke ein.
6. Befeuchten Sie vor dem Schließen der Kammer die O-Ringe der Stopfen, während Sie ihre Kapillaren trocken halten. Lösen Sie die Volumenkalibrierringe und setzen Sie die Stopfen nach unten ein, bis Flüssigkeit die Stopfenkapillare füllt und ein kleiner Tropfen in den Behälter am oberen Ende der Kapillare gelangt (Tabelle 1).
7. Die Volumenkalibrierringe werden festgezogen, um ihre Position so zu fixieren, dass das kalibrierte Volumen durch aufeinanderfolgendes Einsetzen der Stopfen erhalten wird.

2. Allgemeine Einstellung von Oroboros

1. Starten Sie die DatLab-Software .
2. Die Versuchstemperatur (37 °C) und die Rührdrehzahl sind auf 550 U/min (9,2 Hz bzw. Umdrehungen pro s) in der Kammer sV bzw. 750 U/min (12,5 Hz) in der Kammer cV einzustellen. Das Intervall für die Datenabtastung wird auf 2 s mit einer Glättung von über 80 s (40 Datenpunkte) bei instrumentellen O₂ Hintergrundtests oder 40 s (20 Datenpunkte) für die Respirometrie festgelegt.
   HINWEIS: Die Magnetrührstäbchen (AlNiCo beschichtet mit Polyvinylidendifluorid [PVDF]; Tabelle 1) werden durch ein gepulstes rotierendes Magnetfeld mit 3,5 mT Feldstärke auf Höhe des Rührers in der Kammer bewegt.
3. Die Luftkalibrierung²⁸ in MiR05 oder in demselben Inkubationsmedium durchführen, das in nachfolgenden Experimenten verwendet wurde.
4. Führen Sie gelegentlich Null-Sauerstoff-Kalibrierungen durch, aber nie unmittelbar vor Beginn der Experimente.
   1. Bereiten Sie eine frische Na-Dithionit-Stammlösung vor,_{indem Sie} O2-Zero-Pulver in 50 mM Phosphatpuffer (pH 8,0) auf eine Konzentration von 2,5 mM bzw. 10 mM für dies-V - bzw.c-V-Kammern auflösen.
   2. Titrieren Sie Na-Dithionit im Überschuss, um das Rohsignal R0 oder den Nullstrom [μA] bei O₂ -Konzentration 0 μM^14,28 zu erhalten.

3. Instrumenteller O₂ -Hintergrundtest

1. Kammer sV
   1. Schließen Sie nach der Luftkalibrierung die Kammer. Das Sauerstoffsignal wird ca. 60 min lang überwacht, bis die O₂ -Konzentration von der Luftsättigung auf etwa 150 μM abnimmt. Auf dem Diagramm sind vier Markierungen J°₁ bis J°₄ anzusetzen: "O₂ Steigung negativ".
      HINWEIS: Führen Sie diesen instrumentellen O₂ -Hintergrundtest jeden Tag durch, bevor Sie mit einem Experiment beginnen.
   2. OPTIONAL: Titrieren Sie mit einer Hamilton-Spritze den gemäß Schritt 2.4.1 hergestellten Na-Dithionit, um eine_{O2-Konzentration} von 100 μM zu erreichen (Abbildung 1C).
      HINWEIS: In einem anderen Protokoll wird Na-Dithionit mit Hilfe der Titrationsinjektions-Mikropumpe (TIP2k; Ergänzende Abbildung 1 und ergänzende Abbildung 2) zum Vergleich mit einem Standardverfahren zur Bestimmung des instrumentellen Hintergrund-O2-Flusses²⁸.
2. Kammer cV
   1. Nach der Luftkalibrierung schließen Sie die Kammer, warten auf die Stabilisierung der Neigung O₂ und setzen die Markierung J°₁ auf dem Diagramm 'O2 Neigung neg.^'28. Mit einer Hamilton-Spritze wird der nach Schritt 2.4.1 hergestellte Na-Dithionit titriert. in Schritten von 0,7 μL, um dem Sauerstoffregime der Kammer sV zu entsprechen und die_{O2-Konzentration} auf 150 μM zu senken.
   2. Fügen Sie einen weiteren Na-Dithionit-Titrationsschritt (ca. 7 μL) hinzu, um die_{O2-Konzentration} auf 100 μM zu senken (Abbildung 1D).
3. Instrumentelle O₂ Hintergrunddatenanalyse
   1. Berechnen Sie die instrumentelle_Ø 2-Hintergrundsteigung in DatLab²⁸. Wählen Sie Flux/Slope aus dem oberen Menü.
   2. Öffnen Sie das Fenster O₂ Hintergrundkorrektur . Wählen Sie Active File als Quelle für den O_{2-Hintergrund} und wählen Sie die J°-Markierungen aus, die für die Berechnung der linearen Regression verwendet werden sollen. Wenden Sie die Hintergrundkorrektur O₂ an.

Abbildung 1: Kammern mit kleinem Volumen (sV) und klassischem Volumen (cV) und instrumenteller O₂ -Hintergrundtest. a) Kammer sv. (B) Kammer cV. (C) Repräsentative Spuren von negativen Steigungs- und J°_{1-Markierungen}, sV (0,5 mL; grün) und cV (2,0 mL; blau). (D) Entsprechende Sauerstoffkonzentration und R1-Markierungen. Drei manuelle Na-Dithionit-Titrationen (ca. 0,7 μL, 10 mM Stamm; cV) und abschließende 7,0 μl Titration von 2,5 mM bzw. 10 mM Stamm in der sV und cV Kammer. Durch Titrationen verursachte Spikes wurden eliminiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

4. Zugabe der Probe zu den Oroboro-Kammern

HINWEIS: Die Probe kann auf zwei Arten in die Kammer gegeben werden: partieller Volumenersatz (Thrombozyten und Fibroblasten in der vorliegenden Studie) oder vollständiger Volumenersatz (isolierte Mitochondrien in der vorliegenden Studie).

1. Teilweiser Austausch von Volumes
   1. Entfernen Sie den vollständig eingesetzten Stopfen. Pipettieren und verwerfen Sie ein Volumen V_aus MiR05. V_out ist 60-70 μl für Blutplättchen und 80-150 μl für Fibroblasten, berechnet nach den Zellkonzentrationen in der Stammzellsuspension.
   2. Äquivalent zu V_out pipettieren Sie das gleiche Volumen V_J.i der Stammzellsuspension (mit bekannter Zellkonzentration) in die Kammer (Abbildung 2).
   3. Berechnen Sie die experimentelle Zellkonzentration im tatsächlichen Volumen V' (0,54 mL und 2,07 mL), das größer ist als das effektive experimentelle Volumen V (0,5 mL und 2,0 mL).
      HINWEIS: Die Konzentrationen der Stammzellensuspension und der experimentellen Zellkonzentration sollten so geplant werden, dass Volumina von V_J.i = V_out erhalten werden, die mit einem kleinen Titrationsfehler kompatibel sind. In den Experimenten mit Blutplättchen wurde ein Prototyp-Stopfen für die Kammer sV mit einem Kapillartotvolumen von 0,05 mL verwendet.
2. Vollständiger Austausch des Volumes
   1. Das gesamte Medium wird aus der Kammer abgesaugt und durch mindestens 0,54 ml oder 2,07 ml isolierte Mitochondrien-Stammlösung bei der experimentellen Probenkonzentration in den sV bzw. cV Kammern ersetzt.
   2. Schließen Sie die Kammer und saugen Sie die überschüssige mitochondriale Stammlösung aus dem Stopfengefäß ab.
      HINWEIS: Ein vollständiger Volumenersatz schließt jegliche Variabilität der mitochondrialen Konzentration aus, die durch Titration in die geschlossene Kammer durch die Stopfenkapillare mit einer Hamilton-Spritze auftreten kann. Das letztgenannte Verfahren ist anwendbar auf Proben mit kleinem Durchmesser, die in konzentrierten Stammsuspensionen (z. B. isolierte Mitochondrien) hergestellt wurden; Es setzt fragile Zellen jedoch einer möglichen Schädigung der Plasmamembranen durch Scherkräfte aus, die auf die 51 mm lange Nadel der Hamilton-Spritze (0,41 mm Innendurchmesser) ausgeübt werden. Dies wird vermieden, indem der Stopfen entfernt und die Probe durch teilweisen oder vollständigen Volumenaustausch in die Kammer pipettiert wird. Es wurden drei Arten von mitochondrialen Präparaten untersucht. Die Probenvorbereitungen sind in der Zusatzdatei 1 1,26,29,30 beschrieben.
3. Lebende Zellen: menschliche Blutplättchen
   1. Die Kryofläschchen mit den Blutplättchen in ein Wasserbad bei 37 °C geben und den Inhalt auftauen, bis nur noch wenig Eis übrig bleibt.
   2. Öffnen Sie die Kryoröhrchen und geben Sie langsam 1 mL vorgewärmtes Medium (DPBS + 10 mM EGTA, 37 °C) in Tropfen hinzu.
   3. Mischen Sie die Blutplättchen vorsichtig und geben Sie sie in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen mit einem Gesamtvolumen von 10 mL vorgewärmtem Medium (DPBS + 10 mM EGTA, 37 °C). Bei 1000 g für 10 min bei Raumtemperatur (RT) mit einem Ausschwingrotor zentrifugieren (Beschleunigung 6, Bremse 2).
   4. Resuspendieren Sie die Blutplättchen in 0,25 ml DPBS + 10 mM EGTA (RT) und fügen Sie sie durch teilweisen Volumenaustausch bis zu einer anfänglichen experimentellen Zellkonzentration von 157 · 10⁶ bis 210 · 10⁶ x·^mL-1 in der 0,5-ml-Kammer und ab 164 · 10⁶ bis 220 · 10⁶ x·^mL-1 in der 2,0-ml-Kammer (siehe³¹ für Details zur Elementareinheit x).
      ANMERKUNG: Ein Oroboros war mit den Kammern sV und cV in den Positionen A bzw. B ausgestattet, die parallel zu einem anderen Oroboros mit den Kammern sv und cV in den Positionen B bzw. A verwendet wurden.
4. Permeabilisierte Zellen: humane Fibroblasten
   1. Geben Sie die Zellen durch teilweisen Volumenaustausch auf eine nominale Zellkonzentration von 0,75 · 10⁶ x·^mL-1 in beiden Kammertypen und berechnen Sie die tatsächliche Konzentration (Schritt 4.1.3).
      HINWEIS: Es wurden verschiedene Oroboros-Instrumente parallel verwendet, die jeweils mit den Kammern sv oder cV ausgestattet waren.
5. Isolierte Mitochondrien: Mausherz
   1. Fügen Sie 15 μl mitochondriale Suspension zu 5985 μl mitochondrialem Atmungsmedium (MiR05) hinzu, was zu einer mitochondrialen Proteinkonzentration zwischen 0,013 und 0,026 mg∙^mL-1 führt.
   2. Geben Sie die mitochondriale Suspension durch vollständigen Volumenaustausch in die Oroboros-Kammern.
      ANMERKUNG: Ein Oroboros war mit den Kammern sV und cV in den Positionen A bzw. B ausgestattet, die parallel zu einem anderen Oroboros mit den Kammern sV und cV in den Positionen B bzw. A verwendet wurden.

Abbildung 2: Zugabe der Zellsuspension durch partiellen Volumenersatz. (A) Zugabe in der 0,5-ml-Kammer sV und (B) in der 2,0-ml-Kammer cV. (1) Geschlossene Kammer mit Volumina des Atmungsmediums V und gefüllter Stopfenkapillare V_stc zur Messung des instrumentellen Hintergrundflusses O_{2 J O2}°. (2) Stopfen entfernt, V_stc in die Kammer abgelassen, so dass ein Gesamtvolumen V' = V+V_stc entsteht. (3) Teilweise Entfernung des Mediums V_out = -V _J.i. In der Kammer verbleibt ein Volumen V''= V'+V_aus. (4) Pipettieren einer Teilprobe mit dem Volumen V _J.i der respirometrischen Stammzellensuspension in die Kammer, was zu einem Gesamtvolumen V^# = V+V_stc der verdünnten Zellsuspension führt. (5) Geschlossene Kammer mit gefüllter Stopfenkapillare (Totvolumen V_stc) zur Messung des volumenspezifischen O₂ -Flusses J_{V,O 2} in einem Versuchsvolumen V. Diese Abbildung wurde gegenüber Abbildung 2A in Zellzahl und Normalisierung in HRR⁴¹ modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

5. SUIT-Protokolle

1. Die Stammlösungen der in der Ergänzenden Tabelle 1 aufgeführten Chemikalien werden in die Kammern mit Hamilton-Mikrospritzen titriert, wobei die Titrationsvolumina so angepasst werden, dass in den Kammern sV und cV die gleichen experimentellen Konzentrationen erreicht werden (siehe Abbildungslegenden in den Abbildungen 6, 8, 10).
2. Wählen Sie das Protokoll SUIT-003_D018^32,33 (für Thrombozyten in der vorliegenden Studie).
3. Wählen Sie die Protokolle SUIT-001_D004 4,15,34,35 und SUIT-002_D007 4,15,35,36 (für Fibroblasten in der vorliegenden Studie).
4. Wählen Sie das Protokoll SUIT-002_D005 4,15,35,37 (für isolierte Mitochondrien in der vorliegenden Studie).

6. SUIT-Datenanalyse

1. Setzen Sie in DatLab Markierungen , um Schnitte ausgewählter Diagramme zu definieren.
2. Wählen Sie Flux/Slope im oberen Menü. Öffnen Sie das Fenster Flux/Slope . Wenden Sie die Titrationsvolumenkorrektur für die Verdünnung suspendierter Proben durch jede Titration im SUIT-Protokoll an.
3. Wählen Sie im oberen Menü Markierungen aus. Öffnen Sie die Markierungsstatistik , um den Median der markierten Datenpunkte anzuzeigen, die durch Subtraktion des Restsauerstoffverbrauchs (ROX) basiskorrigiert wurden.
4. Berechnen Sie den Schnittpunkt und die Steigung zwischen den gepaarten Ergebnissen, die in den Kammern sV und cV erhalten wurden, durch invertierte Regressionsanalyse^25,28 unter Verwendung einer Tabellenkalkulation.
5. Vergleichen Sie die Atemfrequenzen im rox-Zustand (minimale_O2-Flüsse) in den Kammern sV und cV durch einen gepaarten Student's t-Test mit der Software jamovi 2.3.13³⁸.
   HINWEIS: Da die beiden Kammern in einem Oroboro-Gerät funktional unabhängig sind (mit Ausnahme der Temperatur- und DatLab-Aufzeichnungsintervalle), können Messungen in jeder Kammer separat betrachtet werden, ähnlich wie bei der Verwendung verschiedener Instrumente. Die Endergebnisse können als Mediane oder Durchschnittswerte mehrerer Kammern mit Informationen über ihre Variabilität angegeben werden.

Ergebnisse

Es wird erwartet, dass die Rohsignale R1 [μA] der Sauerstoffsensoren (POS) unabhängig vom Volumen der wässrigen Phase im Gleichgewicht mit der Gasphase der Luft in der "offenen" Kammer sind, wie in Ergänzende Tabelle 2. In der geschlossenen Kammer hingegen ist der instrumentale Hintergrund O₂Strömung nahe der Luftsättigung J°₁[pmol∙s^-1∙mL^-1] hängt von der Lautstärke ab V (Ergänzende Tabelle 2). Das O₂Verbrauch des Sensors [pmol∙s^-1] kann aus dem gemessenen Elektronenfluss als nullkorrigiertes Rohsignal R1-R0 [μA], der Ladungszahl 4 e^-/O₂und die Faraday-Konstante F = 96 485,33 C∙mol^-1. 1 μA entspricht einem Elektronenfluss (e^-) von 10,36 pmol∙s^-1. Die Division durch die Ladungsnummer ergibt ein O₂Fluss^15,39 von 2.591 pmol∙s^-1μA^-1. Der aufgezeichnete Median von R1-R0 betrug 2,09 μA bzw. 1,98 μA in der 0,5-ml- bzw. 2,0-ml-Kammer (Ergänzende Tabelle 2; R0 = 0,006 ± 0,007 μA im sV und R0 = 0,004 ± 0,003 μA im cV Kammern), die theoretisch O₂Verbrauchsraten von 5,41 pmol∙s^-1und 5,13 pmol∙s^-1. Das O₂Die Strömung des Sensors wird in den erwarteten volumenspezifischen Fluss bei Luftsättigung (J°_R1) als 5,41 pmol∙s^-1/0,5 mL = 10,82 pmol∙s^-1∙mL^-1und 5,13 pmol∙s^-1/2,0 mL = 2,56 pmol∙s^-1∙mL^-1in der SV und cV Kammer. Bei der gleichen Art von polarographischen Sauerstoffsensoren in der 2,0-ml- und der 0,5-ml-Kammer kann die volumenspezifische Hintergrund-O₂Fluss - berechnet aus dem aktuellen R1-R0 (J°_R1) - erhöht sich theoretisch um das 4-fache im umgekehrten Verhältnis zum Kammervolumen. J°_Luft (bei Luftsättigung, wo die Rückdiffusion Null ist; vergleiche Tisch 2 und Ergänzende Tabelle 3) wurde für die O₂Konzentration bei Luftsättigung aus der linearen Regression des experimentellen Hintergrundtests (Abbildung 3). J°_Luft näherte sich den theoretisch zu erwartenden Werten J°_R1 für beide Kammern (Tisch 2). Das J°_Luft / J°_R1Das Verhältnis betrug 0,85 ± 0,04 und 0,92 ± 0,12 im SV und cV Kammer im Einklang mit einer unabhängigen Reihe von 52 Messungen in der 2,0-ml-Kammer, in der dieses Verhältnis 0,95 ± 0,12 (Ergänzende Tabelle 4). J°_Luft war in der 0,5-ml-Kammer 3,9-mal höher als in der 2,0-ml-Kammer. Das Netz O₂Rückdiffusion J°₅₀, berechnet bei 50 μM O₂aus der linearen Regression des experimentellen Hintergrundtests, war in der 0,5-ml-Kammer (Tisch 2). Die Variabilität des instrumentellen Hintergrunds O₂Die Flüsse waren in den beiden verschiedenen Kammervolumina nahezu identisch, mit einer Standardabweichung (SD) von 0,5 und 0,3 pmol∙s^-1∙mL^-1für J°_Luft und 0,9 und 0,8 pmol∙s^-1∙mL^-1 für J°₅₀in der SV und cV Kammer (Tisch 2). Trotz des höheren instrumentalen Hintergrunds O₂Neigungen in der 0,5-ml-Kammer, die Abhängigkeit des Hintergrunds O₂Flussmittel auf c_O2war in beiden Kammertypen sehr gut reproduzierbar (Abbildung 3D). Daraus ergeben sich niedrige Werte der Residuen <±1 pmol∙s^-1∙mL^-1für beide Kammern (Ergänzende Tabelle 5) im Einklang mit der Nachweisgrenze der Oroboros²⁸.

Wir quantifizierten den Einfluss der Rührgeschwindigkeit auf das Kalibrierrohsignal R1 des POS zwischen 350 U/min (5,8 Hz) und 950 U/min (15,8 Hz) in Schritten von 100 U/min (1,7 Hz), wobei sich die Kammer in der "offenen" Konfiguration befand. In dieser Konfiguration befindet sich das im Medium gelöste O₂ im Gleichgewicht mit der Gasphase; daher spiegeln Änderungen des Rohsignals (Mikroampere [μA]) in Abhängigkeit von der Rührgeschwindigkeit keine wahren Unterschiede in c_O2 wider. Die Sauerstoffsensoren reagierten auf eine Änderung der Rührgeschwindigkeit mit einer geringen Abweichung von R1 bei der Standarddrehzahl von 750 U/min, unabhängig vom Kammervolumen (Abbildung 4). In der "offenen" Konfiguration war das Rauschen der O 2-Flankensteilheit, definiert als SD für jeden Schritt nach der Stabilisierung des Signals, in beiden Kammertypen bei 850 U/min am geringsten und nahm zu, wenn die Rührgeschwindigkeit in beide Richtungen von diesem Wert abwich (Abbildung 5A). Unterhalb von 550 U/min überschreitet das Geräusch der Flankensteilheit O₂ den Schwellenwert von ±4 pmol∙^s-1∙^mL-1, der die minimale praktische Rührgeschwindigkeit definiert. Aufgrund technischer Einschränkungen wurde die obere Grenze nicht erreicht, so dass 950 U/min die maximal praktikable Rührdrehzahl war (Bild 5A). Innerhalb dieses Bereichs betrug die Abweichung des_O2-Signals von R1 <2,5 %. Das Schließen der Kammern veränderte das Verhältnis zwischen Geräusch und Rührgeschwindigkeit nicht (Abbildung 5B). Die exponentielle Zeitkonstante τ betrug 2,53 ± 0,05 s bei 550 U/min und 2,50 ± 0,05 s bei 750 U/min für die 0,5-ml-Kammer (Ergänzende Abbildung 3).

Das SUIT-003_D018-Protokoll, das auf Blutplättchen angewendet wird, umfasst bis zu 14 Titrationsschritte. Es wurde entwickelt, um die Kopplungskontrolle lebender Zellen, die Permeabilität der Ce- und Plasmamembran als Index für die Zellviabilität^{zu untersuchen 32}. Der in den beiden Kammertypen gemessene Sauerstofffluss (Abbildung 6) war in allen Atemzuständen eng abgestimmt (Abbildung 7). Intermittierende Reoxygenierungen sind erforderlich, um funktionelle Hypoxie zu vermeiden oder die experimentelle_{O2 -}Konzentration auf einen definierten Bereich zu beschränken. Die Reoxygenierung erfolgte durch Öffnen der Kammer in die "offene" Position nach Titration der Fäulnis. Nach dem Schließen der Kammer stabilisierte sich das_{O2-Flussmittel} innerhalb von 4 Minuten in der 2,0-ml-Kammer, aber in der 0,5-ml-Kammer waren etwa 10 Minuten erforderlich, bevor es stabilisiert und die neue Markierung gesetzt wurde (Abbildung 6 und ergänzende Abbildung 4). Die Reoxygenierung im rox-Zustand, wenn die_O2-Flüsse niedrig sind, vermeidet einen Abfall der_{O2-Konzentration} während der für die Stabilisierung erforderlichen Zeit. Die Rotenon-inhibierte rox betrug 0,9 ± 0,6 und 2,0 ± 0,6 pmol∙^s-1∙^mL-1 bei 98 ± 17 bzw. 94 ± 17 μM_{O 2} (mittlere ± SD) in der sV- bzw. cV-Kammer. Rox stieg nach Reoxygenierung um 3,1 ± 0,9 und 0,9 ± 0,4 pmol∙^s-1∙^mL-1 auf 159 ± 8 bzw. 147 ± 11 μM O₂ in der sV und cV Kammer. Die in Blutplättchen beobachtete Sauerstoffabhängigkeit von rox stimmt mit den Ergebnissen an menschlichen Fibroblasten und Endothelzellen der Nabelvene^{überein 40}.

Für die OXPHOS-Analyse in permeabilisierten Fibroblasten verwendeten wir zwei SUIT-Protokolle mit bis zu 17 bzw. 20 Titrationsschritten (SUIT-001 und SUIT-002 bzw.³⁵; Abbildung 8); Daher ist die Korrektur des Titrationsvolumens besonders wichtig, da die Verdünnung am Ende von SUIT-002 in ders-V- bzw.c-V-Kammer maximal 14 % bzw. 10,5 % betrug. Fibroblastenzellzahlen von 0,35·10⁶ x und 1,44,10⁶ x in den 0,5-ml- bzw. 2,0-ml-Kammern führten zu der gleichen Zellkonzentration von 0,75,10⁶ x∙^mL-1. Die Kombination von SUIT-001 und SUIT-002 adressierte 20 respiratorische Zustände, die alle in den Zweikammertypen eng korrelierten (r² = 0,950 für SUIT-001 und r² = 0,959 für SUIT-002). In beiden Protokollen wies Komplex IV eine relativ hohe Streuung auf (Abbildung 9). Eine Reoxygenierung war in SUIT-001 ab einem niedrigen volumenspezifischen_O2-Fluss von 18,7 ± 7,0 pmol∙^s-1∙^mL-1 im Routinezustand (mittlere ± SD) nicht erforderlich, so dass die_{O2-Konzentration} bis zum CIV-verknüpften Abschnitt des Protokolls auf 56 μM absinken konnte (Abbildung 8A; 8Ama). In SUIT-002 wurde jedoch eine Reoxygenierung vor Entkopplertitrationen durchgeführt, wodurch die_{O2-Konzentration} von 100 μM auf 180 μM erhöht wurde (Abbildung 8B; 6Gp). In Anbetracht der langen Zeit, die für die Stabilisierung des Flussmittels nach der Reoxygenierung benötigt wird, sollte eine Reoxygenierung während der Entkopplertitration vermieden werden.

Ein verkürztes SUIT-Protokoll wurde auf isolierte Mitochondrien angewendet (Abbildung 10). Die mitochondriale Proteinkonzentration wurde nach dem respirometrischen Assay bestimmt, so dass es unmöglich war, die genaue Probenkonzentration in der Kammer im Voraus zu bestimmen. Der volumenspezifische Atmungsfluss variiert in Abhängigkeit von der mitochondrialen Konzentration. Daher wurden die Daten als volumen- und proteinmassenspezifischer Fluss dargestellt (Abbildung 11). Beide Darstellungen zeigen die enge Korrelation zwischen den Messungen in der 0,5-ml- und der 2,0-ml-Kammer (Abbildung 11).

Der Restsauerstoffverbrauch rox, gemessen nach Hemmung von Komplex III durch Antimycin A, kann als Index für die instrumentelle Leistung bei sehr niedrigen Atemfrequenzen verwendet werden. In allen Versuchsreihen war die rox zwischen der 0,5-ml- und der 2,0-ml-Kammer vergleichbar (Thrombozyten: t₍₅₎ = -0,34, p = 0,74; Fibroblast: SUIT-001: t₍₁₀₎ = 20,00, p = 0,06; SUIT-002: t₍₁₀₎ = 11,00, p = 0,96; isolierte Mitochondrien: t₍₄₎ = -1,18, p = 0,27). Die Streuung der Daten entsprach weitgehend der instrumentellen Unsicherheit von ±1 pmol∙^s-1∙^{mL-1 13,28}, wie in Abbildung 12 dargestellt. Die Originaldateien stehen im Zenodo-Repositorium 10.5281/zenodo.11634408 zum Open Access zur Verfügung. 

Abbildung 3: Instrumenteller Hintergrund-O2-Fluss für die sV (0,5 mL; grün und schwarz) und cV-Kammer (2,0 mL; blau). O₂ Konzentrationsbereich von der Luftsättigung (ca. 180 μM) bis ca. 50 μM. Offene Symbole: O₂ Konzentrationen, die ohne Na-Dithionit erhalten wurden. Feste Symbole: O_{2-Konzentrationen}, die durch manuelle Titration von Na-Dithionit gesteuert werden. Schwarze Kreise: O_{2-Konzentrationen}, kontrolliert durch Titrationen von Na-Dithionit unter Verwendung des TIP2k in der 0,5-ml-Kammer (N = 8). Die Ergebnisse der instrumentellen Hintergrundtests wurden vor der Verwendung lebender Zellen (ce) aus (A) Serie 1 (sV: N = 2; cV: N = 2) gepoolt; (B) Serie 2 (sV: N = 38; cV: N = 50) vor Verwendung von permeabilisierten Zellen (pce); (C) Serie 3 (sV: N = 10; cV: N = 10) vor der Verwendung isolierter Mitochondrien (imt). (D) Überlagerte Daten aus den Feldern A-C. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Auswirkung der Rührdrehzahl auf das POS-Signal bei Luftsättigung ("offene" Kammer) in der 0,5-ml-Kammer (grün) und 2,0-ml-Kammer (blau). Ansprechverhalten [%] bezogen auf R0-korrigierte Luftkalibriersignale R1-R0 [μA] bei 750 U/min (sV: N = 4; cV: N = 4). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Geräusch der Steigung O₂ in Abhängigkeit von der Rührdrehzahl .Geräuschpegel, ausgedrückt als Standardabweichung in der "offenen" Kammer (A); (B) geschlossene Kammer (0,5 mL, grün; 2,0 mL, blau). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: O₂ Verbrauch von kryokonservierten menschlichen Blutplättchen in der 0,5-ml-Kammer. Repräsentative Spuren der_{O2-Konzentration} [μM] (blaue Linien) und des_O2-Flusses pro Zelle [amol∙^s-1∙^x-1], berechnet als_O2-Fluss [pmol∙^s-1∙^mL-1] dividiert durch die Zellkonzentration von 157∙10⁶ x∙^mL-1 (rote Linien, korrigiert um den instrumentellen Hintergrund-O2-Fluss; durch Titrationen verursachte Spikes wurden eliminiert). Die_{O2-Konzentration} wurde durch intermittierende Reoxygenierung (Luft, "offene" Kammer, blauer Schatten) über 50 μM gehalten. Abfolge der Atmungszustände (Titrationen und Raten; Protokoll SUIT-003_D018): ce1, routinemäßige Atmung R lebender Zellen. ce1P, Pyruvat 5 mM als äußeres Substrat. ce2Omy10 (Panel A), Omy-Titrationen in 5 nM-Schritten; Leck Atmung L. ce3U0,3 (Panel A) und ce3U0,1 (Panel B), Entkopplertitrationen auf eine optimale CCCP-Konzentration von 0,3 bzw. 0,1 μM; ET-Kapazität E. ce3Glc, Glukose 11 mM; E progressiv durch Entkoppler gehemmt. ce4Rot, Rotenon 0,5 μM hemmendes CI; Restsauerstoffverbrauch ROX. ce5S, Succinat 10 mM; Stimulierung von E in Plasmamembran-permeablen Zellen. 1Dig15 (Panel A) und 1Dig10 (Panel B), Digitonin-Titrationen in 5 μg·mL-1-Schritten auf optimale Konzentrationen von 15 bzw. 10 μg·^mL-1 für eine vollständige Plasmamembranpermeabilisierung; Succinat-Signalweg ET Kapazität S_E. 1c, Cytochrom c 10 μM; Test der Integrität der mitochondrialen Außenmembran. 2Ama, Antimycin A 2,5 μM, das CIII hemmt; ROX. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 7: Korrelation der Atmung von kryokonservierten menschlichen Blutplättchen, gemessen in der 0,5-ml- und der 2,0-ml-Kammer. Der Rox-korrigierte O2-Fluss wurde im Protokoll SUIT-003_D018 bewertet (Abbildung 6); N = 6. a) mit Oligomycin Omy, (B) ohne Omy. Mittlere Steigungen und Schnittpunkte der invertierten Regression der kleinsten Quadrate und Bestimmtheitskoeffizienten r², berechnet aus allen Daten. Gestrichelte schwarze Linien stellen die Linien der Identität dar. Rote Linien stellen die berechneten Regressionslinien dar. _O2-Flüsse im Zustand nach Zugabe von Glukose wurden ausgeschlossen (siehe Abbildung 6). Die Protokolle mit und ohne Oligomycin sind in die Panels A und B getrennt, um eine Überlappung der Datenpunkte zu vermeiden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 8: O₂ Verbrauch von Fibroblasten in der 0,5-ml-Kammer. Repräsentative Spuren von c_{O 2} (blaue Linien [μM]) und O₂ -Fluss pro Zelle, berechnet als O₂ -Fluss [pmol∙^s-1∙^mL-1] dividiert durch die Zellkonzentration (0,75·10⁶ x∙^mL-1), korrigiert um den instrumentellen Hintergrund-O₂ -Fluss (rote Linien, durch Titrationen verursachte Spikes wurden eliminiert). Die_{O2-Konzentration} wurde durch intermittierende Reoxygenierung (Luft, "offene" Kammer, blauer Schatten) über 50 μM gehalten. Abfolge der Atemzustände (Titrationen und Raten). A) Protokoll SUIT-001_D004: ce1, routinemäßige Beatmung R. +Dig, Digitonin 10 μg·^mL-1 (ce bis pce), verbleibende endogene Atmung ren. 1PM, Pyruvat 5 mM & Malat 2 mM; N-Signalweg, Leck, Atmung, N,_L. 2D, ADP 2,5 mM; N-Signalweg OXPHOS-Kapazität N_P. 2c, Cytochrom c 10 μM; Test der Integrität der mitochondrialen Außenmembran. 3U1.5, Entkopplertitrationen auf optimale CCCP-Konzentration 1,5 μM; NADH-verknüpfte ET-Kapazität N_E. 4G, Glutamat 10 mM; N(PGM)_E. 5S, Succinat 10 mM; NS-Signalweg ET Kapazität NS_E. 6Rot, Rotenon 0,5 μM; Succinat-Signalweg ET Kapazität S_E. 7Gp, Glycerophosphat 10 mM; SGp_E. 8Ama, Antimycin A 2,5 μM; ROX. 9AsTm, Ascorbat 2 mM & TMPD 0,5 mM; Substrate für die CIV-Stimulation; Die Kammer wurde 20 Minuten lang offen gehalten, um einen Redoxausgleich ohne Erschöpfung des Sauerstoffs^{zu ermöglichen 4}; O₂ Flussmittel außerhalb der Skala nach dem Schließen der Kammer (205 amol·^s-1·^x-1). 10Azd, Azid 100 mM; sauerstoffabhängiger chemischer Hintergrundfluss Chb. B) Protokoll SUIT-002_D007: ce1, R. +Graben, ren. +D, stimulierend ren. +M.1, Malat 0,1 mM und 1Oct, Octanoylcarnitin 0,5 mM; F-Signalweg OXPHOS-Kapazität F_P = J(1Oct)-J(+M.1). 1c. 2M2, Malat 2 mM zur Unterstützung des anaplerotischen N-Signalwegs; F(N)_P. 3P und 4G, progressive Aktivierung auf FN_P. 5S, FNS_P. 6Gp, FNSGp_P. 7U1.5, FNSGp_E. 8Rot, SGp_E. 9Ama, rox. 10AsTm O₂ Flussmittel außerhalb der Skala 207 amol·^s-1·^x-1. 11Azd, chb. Im Allgemeinen ist die Aktivität des Komplexes IV die Differenz der Raten J(AsTm)-J(Azd) bei eng übereinstimmenden_{O2-Konzentrationen}. Weitere Informationen finden Sie in Abbildung 6. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 9: Korrelation der Atmung von permeabilisierten Fibroblasten in der 0,5-ml- und 2,0-ml-Kammer. Rox-korrigierter _O2-Fluss in (A) SUIT-001_D004 und (B) SUIT-002_D007 (N = 6). Mittlere Steigung und Schnittpunkt der invertierten Regression der kleinsten Quadrate und Bestimmtheitskoeffizient r² , berechnet aus allen Daten. Die gestrichelte schwarze Linie stellt die Identitätslinie dar. Rote Linien stellen die berechneten Regressionslinien dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 10: O₂ Verbrauch von isolierten Herzmitochondrien der Maus in 0,5 ml (grün) und 2,0 ml (blau) Kammern. Repräsentative Spuren von (A) massenspezifischem_O2-Fluss bei einer mitochondrialen Proteinkonzentration von 0,023 mg∙^mL-1 (korrigiert um den instrumentellen Hintergrund-O2-Fluss, durch Titrationen verursachte Spikes wurden eliminiert) und (B)_{O2-Konzentration} [μM]. Abfolge der respiratorischen Zustände (Titrationen und Raten) nach dem Protokoll SUIT-002_D005: imt, restliche endogene Atmung ren. +D, ADP 2,5 mM; anregend ren. +M.1, Malat 0,1 mM und 1Oct, Octanoylcarnitin 0,5 mM; F-Signalweg OXPHOS-Kapazität F_P = J(1Oct)-J(+M.1). 1c, Cytochrom c 10 μM; Test der Integrität der mitochondrialen Außenmembran. 2M2, hoher Malatgehalt 2 mM, der den anaplerotischen N-Signalweg unterstützt; F(N)_P. 3P, Pyruvat 5 mM; FN_P. 4G, Glutamat 10 mM; FN_P. 5S, Succinat 10 mM; FNS_P. 6Gp, Glycerophosphat 10 mM; FNSGp_P. 7U0,5, Entkopplertitrationen bis zur optimalen CCCP-Konzentration 0,5 μM; FNSGp_E. 8Rot, Rotenon 0,5 μM hemmendes CI; SGp_E. 9Ama, Antimycin A 2,5 μM, das CIII hemmt; Restsauerstoffverbrauch ROX. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 11: Korrelation der Atmung isolierter kardialer Mitochondrien der Maus, gemessen in den 0,5-ml- und 2,0-ml-Kammern. O₂ Fluss in dem in Abbildung 10 gezeigten Protokoll (N = 4). (A) Volumenspezifisches_{O2-Flussmittel}. (B) Rox-korrigierter O2-Fluss dividiert durch die mitochondriale Proteinkonzentration (0,013 - 0,026 mg∙^mL-1). Mittlere Steigung und Schnittpunkt der invertierten Regression der kleinsten Quadrate und Bestimmtheitskoeffizient r², berechnet aus allen Daten. Gestrichelte schwarze Linien stellen die Identitätslinie dar. Rote Linien stellen die berechnete Regressionslinie dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 12: Restsauerstoffverbrauch rox in den 0,5-ml- und 2,0-ml-Kammern. Fluss pro Volumen, gemessen nach Zugabe von Antimycin A, kombiniert aus Experimenten mit lebenden Zellen (ce, Quadrate), permeabilisierten Zellen (pce, Kreise) und isolierten Mitochondrien (imt, Dreiecke). Mittlere Steigung und Schnittpunkt der invertierten Regression der kleinsten Quadrate. Gestrichelte Linie: Linie der Identität. Rote Linie: berechnete Regressionslinie. Schatten: instrumenteller Auflösungsbereich. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Modul	sV	cV
Experimentierkammer Volumen V	0,5 mL	2,0 mL
Innendurchmesser des Glaszylinders	ca. 12,0 mm	ca. 16,0 mm
Außendurchmesser des Glaszylinders	24,0 mm	24,0 mm
Dicke der Glaswand	6,0 mm	4,0 mm
PVDF-beschichteter Rührstab	11,5 x 6,2 mm	15,0 x 6,0 mm
Kapillardurchmesser des Stopfens	ca. 1,00 mm	1,30 mm
Kapillarquerschnittsfläche des Stoppers	0,79 mm2	1,33 mm2
Kapillarlänge des Stopfens	50,64 mm	48,86 mm
Kapillarvolumen des Stopfens	39,8 μl	64,9 μl
Stopfen Kapillar-Totvolumen Vstc einschließlich eines kleinen Tropfensa	0,04 mL	0,07 mL
Volumen V' für die Volumenkalibrierung	0,54 mL	2,07 mL

^einDer Abfall sollte 5 μl für die Kammer cV und nahe 0 μl für die Kammer sV betragen.
Tabelle 1: Abmessungen der Module mit kleinem Volumen (sV) und klassischem Volumen (cV) mit Stopfen aus Polyetheretherketon (PEEK).

	J°air / [pmol∙s-1∙mL-1]		J°50 / [pmol∙s-1∙mL-1]
Experimentierkammer Volumen V	0,5 mL	2,0 mL	0,5 mL	2,0 mL
Bedeuten	9.22	2.37	-3.17	-1.17
Median	9.25	2.36	-3.08	-1.04
Standardabweichung	0.49	0.34	0.93	0.83
Minimum	8.20	1.79	-5.11	-3.72
Maximum	10.41	3.42	-0.82	0.67

Tabelle 2: J°_air extrapoliert auf die Luftsättigung und J°₅₀ berechnet bei einer Konzentration von 50 μM_{O 2} . Gepoolte Daten von instrumentellen Hintergrundtests in den Serien 2 (pce) und 3 (imt) und vor TIP2k-Titrationen (0,5 mL: N = 48; TIP2k: N = 8; 2,0 ml: N = 60).

Ergänzende Datei 1: Probenvorbereitungen. Menschliche Blutplättchen, menschliche Fibroblasten und Mitochondrien, die aus Mäuseherzen isoliert wurden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 1: Instrumenteller O₂ -Hintergrundtest mit dem TIP2k. Repräsentative Spuren des Tests, der mit dem TIP2k durchgeführt wurde, um Na-Dithionit (2,5 mM) in der 0,5-ml-Kammer zu titrieren. Medium: MiR05, Temperatur: 37 °C, Rührgeschwindigkeit: 750 U/min. Durch Titrationen verursachte Spikes wurden eliminiert. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Instrumenteller Hintergrund O₂ -Fluss J°₁ in Abhängigkeit von der O₂ -Konzentration. Kammer sV (0,5 mL; grün, N = 48) und Kammer cV (2,0 mL; blau, N = 60) in den Reihen 2 (pce, Kreise) und 3 (imt, Dreiecke) und vor TIP2k-Titrationen in der 0,5-ml-Kammer (schwarze Kreise, N = 8). Rote Linien: Median ± SD. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 3: Exponentialzeitkonstante τ in Abhängigkeit von der Rührdrehzahl. Individuelle τ-Werte für die 0,5-ml-Kammer bei 37 °C (N = 2). In der 0,5-ml-Kammer betrug τ 2,53 ± 0,05 s bei 550 U/min, 2,50 ± 0,05 s bei 750 U/min und 2,47 ± 0,04 s bei 850 U/min. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 4: O₂ Verbrauch von kryokonservierten humanen Blutplättchen in der 2,0-ml-Kammer. Repräsentative Spur des Protokolls SUIT-003_D018, einschließlich Oligomycin-Titrationen (Omy). Der Fluss [pmol∙^s-1∙^mL-1] wurde um den instrumentellen Hintergrundfluss O₂ korrigiert und durch die Zellkonzentration dividiert (164∙10;⁶ x∙^mL-1). Durch Titrationen verursachte Spikes wurden eliminiert. c_O2 wurde durch intermittierende Reoxygenierung (Luft, "offene" Kammer, blauer Schatten) über 60 μM gehalten. Abfolge der Atmungszustände (Titrationen und Raten): ce1, routinemäßige Atmung R lebender Zellen. ce1P, Pyruvat als äußeres Substrat. ce2Omy10, Omy-Titrationen in 5 nM-Schritten; Leck Atmung L. ce3U2.0, Entkopplertitrationen auf optimale Konzentrationen von 2 μM; ET-Kapazität E. ce3Glc, Glukose 11 mM; E progressiv durch Entkoppler gehemmt. ce4Rot, Rotenon 0,5 μM inhibierendes CI; Restsauerstoffverbrauch ROX. ce5S, Succinat 10 mM; Stimulierung von E in Plasmamembran-permeablen Zellen. 1Dig20, Digitonin-Titrationen bis zu optimalen Konzentrationen von 20 μg·^mL-1, für eine vollständige Permeabilisierung der Plasmamembran; Succinat-Signalweg ET Kapazität S_E. 1c, Cytochrom c 10 μM; Test der Integrität der mitochondrialen Außenmembran. 2Ama, Antimycin A 2,5 μM, das CIII hemmt; ROX. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 1: Chemikalien, die in den SUIT-Protokollen (Substrate-Inhibitor-Uncoupler-Titration) verwendet werden. Abkürzungen und Stammlösungskonzentrationen für die Kammern sV und cV . Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 2: Vergleich von R1-R0 und J°₁ in den 0,5-ml- und 2,0-ml-Kammern. Gepoolte Daten von instrumentellen Hintergrundtests in den Serien 2 (pce) und 3 (imt) und vor TIP2k-Titrationen (0,5 mL: N = 48; TIP2k: N = 8; 2,0 ml: N = 60). Die Daten wurden nur aus den experimentellen Reihen 2 (pce) und 3 (imt) gemittelt, die bei einem durchschnittlichen Luftdruck von 94,9 kPa (Innsbruck, Österreich) durchgeführt wurden, ohne Daten aus der Reihe 1 (ce), die auf Meereshöhe aufgenommen wurden. In den 0,5-ml- und 2,0-ml-Kammern wurde derselbe Typ, aber mit unterschiedlichen individuellen POS verwendet. Daher muss die Variabilität zwischen den Sensoren beim Vergleich der Kammern sV und cV berücksichtigt werden. Während J°₁ = 2,26 ± experimentell erhaltene 0,41 pmol∙^s-1∙mL-1 für die 2,0-ml-Kammer eng mit dem berechneten Wert übereinstimmte, war der experimentelle J°₁ = 8,48 ± 0,53 pmol∙^s-1∙mL-1 für die 0,5-ml-Kammer niedriger als erwartet. Dies wurde durch die folgenden Beobachtungen erklärt. Nach dem Schließen der Kammer senkt der höhere Hintergrund-O2-Fluss in der 0,5-ml-Kammer_{die O2-Konzentrationen} an den Markierungen für J_°1, die in vergleichbaren Zeitintervallen festgelegt wurden (Abbildung 1). Die Sauerstoffkonzentration bei J°₁ lag im Durchschnitt 4,06 % bzw. 1,72 % unter der Luftsättigung in der 0,5-ml- bzw. 2,0-ml-Kammer (Ergänzende Abbildung 2, Ergänzende Tabelle 2). Bei niedrigerem c_O2 verringern der verringerte O₂ -Verbrauch des Sensors und etwas O₂ -Rückdiffusion den experimentell ermittelten J°₁. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 3: Sauerstoffkonzentration [μM], bei der die Kalibrierung (R1) und J°₁ durchgeführt wurde, und ihre prozentuale Differenz. Gepoolte Daten von instrumentellen Hintergrundtests in den Serien 2 (pce) und 3 (imt) und vor TIP2k-Titrationen (0,5 mL: N = 48; TIP2k: N = 8; 2,0 ml: N = 60). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 4: Gemessener und erwarteter J_°1 in der 2,0-ml-Kammer. Unabhängige Reihen von instrumentellen Hintergrundtests mit O2k Serie A (mit Titanstopfen¹³), V = 2,0 mL (37 °C, NaCl-Lösung mit O₂ Löslichkeitsfaktor 0,92; N = 52). n_O2/Q_e = 10⁶/(96485.33·4) = 2.591 pmol∙^μC-1 = 2.591 pmol∙^s-1∙^μA-1. Ausgehend von der Annahme, dass die Rückdiffusion von O₂ bei c_O2,1 vernachlässigbar ist, was nur bei c_O2,1 ~ c_O2* zutrifft. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 5: Lineare Regressionsresiduen (absolute Werte [pmol O₂∙^s-1∙^mL-1]), berechnet für jeden instrumentellen O₂ Hintergrundtest. Gepoolte Daten von instrumentellen Hintergrundtests in den Serien 2 (pce) und 3 (imt) und vor TIP2k-Titrationen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Die für die Respirometrie zur Verfügung stehende Probenmenge ist häufig begrenzt, z. B. bei Untersuchungen von Biopsien, Primärzellen oder langsam wachsenden Zellkulturen mit niedrigen Zellzahlen¹. Darüber hinaus sind die Atmungsaktivitäten aufgrund von mitochondrialen Verletzungen¹¹ oder bei der Untersuchung mitochondrialer Signalwege mit geringen Kapazitäten, wie z. B. der Fettsäureoxidation¹², beeinträchtigt. In diesen Fällen bietet ein geringes respirometrisches Kammervolumen Vorteile für die Auflösung des O₂ -Flusses. Instrumentelle_{Hintergrund-O2-Flüsse} nehmen jedoch bei niedrigeren Kammervolumina zu und induzieren Fehler, wenn sie nicht zuverlässig gemessen und nicht ordnungsgemäß in Abhängigkeit von der_{O2-Konzentration} korrigiert werden. Die Reproduzierbarkeit von instrumentellen O₂ -Hintergrundtests und Hintergrundkorrekturen sind besonders wichtig für niedrige Kammervolumina. Nahezu identische Werte des theoretischen (J°_R1) und experimentellen (J°_air) O₂ -Flusses belegen die Genauigkeit der polarographischen Messung mit 4 e^-/O₂ an der Kathodenreaktion des POS. Die Differenz zwischen J°_R1 und J°_air betrug 1,64 ± 0,43 und 0,22 ± 0,31 pmol∙^s-1∙mL-1 in ders-V- bzw. c-V-Kammer, was auf eine Genauigkeit der Messungen hinweist, die innerhalb der Nachweisgrenze der 2,0-ml-Kammer liegt (±1 pmol∙^s-1∙^mL-1)²⁸. Bei der gleichen Art von polarographischen Sauerstoffsensoren in der 2,0-ml- und der 0,5-ml-Kammer stieg der volumenspezifische Hintergrund-O2-Fluss im umgekehrten Verhältnis zum Kammervolumen um das 4-fache an, und die Variabilität war in den beiden Kammervolumina nahezu identisch, mit SD von 0,5 und 0,3 pmol∙^s-1∙^mL-1 für J°_air und 0,9 und 0,8 pmol∙^s-1∙mL-1 für J°₅₀ in der sV und cV (Tabelle 2). Bei minimalen Atmungsaktivitäten - für die die Kammer mit kleinem Volumen konzipiert wurde - werden selbst kleine Hintergrundeffekte signifikant (Ergänzende Tabelle 3; Ergänzende Abbildung 2). Daher ist eine routinemäßige Beurteilung des instrumentellen Hintergrund-O2-Flusses (Abbildung 1) erforderlich, um die richtige Korrektur^{anzuwenden 28}.

Ein hohes und konstantes Rühren des Mediums ist erforderlich, um ein homogenes System zu erhalten und ein stabiles Sauerstoffsignal zu gewährleisten. Für die 2,0-ml-Kammer ist die Rührgeschwindigkeit von 750 U/min festgelegt, in der 0,5-ml-Kammer war die optimale Drehzahl jedoch nicht bekannt. Die unterschiedlichen Geometrien von Glaskammer und Rührstab (Tabelle 2) erfordern eine eigenständige Bewertung der optimalen Rührgeschwindigkeit. Die Sauerstoffsensoren reagierten auf Änderungen der Rührdrehzahl zwischen 550 U/min und 950 U/min, mit einer geringen Abweichung vom O_2-Signal R1 bei 750 U/min, unabhängig vom Kammervolumen. Die exponentielle Zeitkonstante τ , die für die Kammer sV ausgewertet wurde, stimmte mit τ überein, die für die 2,0-ml-Kammer bei gleicher Rührgeschwindigkeit¹³ berichtet wurde. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das Rühren in beiden Kammergeometrien gleich effektiv ist und dass die Standard-Rührgeschwindigkeit von 750 U/min (2,0-ml-Kammer) auf die 0,5-ml-Kammer angewendet werden kann. Sowohl in der "offenen" als auch in der "geschlossenen" Kammerkonfiguration wies die 0,5-ml-Kammer ein höheres Signal-Rausch-Verhältnis auf, was auf eine höhere Genauigkeit als Vorteil der 0,5-ml-Kammer hindeutet (Abbildung 5), obwohl der Einfluss der individuellen POS-Variabilität nicht ausgeschlossen werden kann. Da das Geräusch beim Absenken der Rührdrehzahl von 750 U/min auf 550 U/min nicht zunahm, kann eine Reduzierung der Rührdrehzahl auf 550 U/min in der 0,5-ml-Kammer von Vorteil sein, um die Scherspannung zu minimieren, ohne das Signal-Rausch-Verhältnis zu beeinträchtigen.

Nahezu identische_{O2-Verbrauchsraten} wurden in den 0,5-ml- und 2,0-ml-Kammern in drei experimentellen Modellen gemessen, wenn die entsprechende Hintergrundkorrektur angewendet wurde. Die Ergebnisse, die mit kleinen Blutplättchen von 2 μm im Durchmesser⁴², lebenden und permeabilisierten Fibroblasten und isolierten Mitochondrien erzielt wurden, deuten darauf hin, dass in den 0,5-ml- und 2,0-ml-Kammern in einer Vielzahl von Zelltypen und mitochondrialen Präparaten konsistente Atemfrequenzen zu erwarten sind. Permeabilisierte Muskelfasern wurden in der vorliegenden Studie jedoch nicht getestet. Eine genaue Messung des Rox erfordert die Kontrolle des Sauerstoffgehalts⁴⁰ und eine hohe instrumentelle Auflösung¹. Der volumenspezifische_O2-Fluss von rox kann so niedrig wie die Nachweisgrenze sein. Reoxygenierungen sind nicht erforderlich, wenn in einem Experiment eine geringe Zellzahl oder generell geringe Probenmengen verwendet werden. Falls erforderlich, wird jedoch empfohlen, eine Reoxygenierung in respiratorischen Zuständen mit niedrigem_O2-Fluss durchzuführen, um einen schnellen Abfall der_{O2-Konzentration} während des Zeitraums zu vermeiden, der für die Stabilisierung des_O2-Flusses erforderlich ist. Die Stabilisierung des_O2-Flusses nach einer Reoxygenierung dauert in der 0,5-ml-Kammer länger.

Als Beitrag zur Qualitätskontrolle muss der Verdünnung der Probe in Suspension beim Teilvolumenaustausch besondere Aufmerksamkeit geschenkt werden. Nach Entfernung des vollständig eingesetzten Stopfens ergibt sich das Gesamtvolumen V' des Atmungsmediums in der Kammer aus dem Versuchsvolumen V und dem Kapillarvolumen V stc des Stopfens (Tabelle 2). Daher wird das Stammvolumen V _J.i in dem tatsächlichen Volumen V' verdünnt, das größer als V ist, was zu einem Verdünnungsfaktor V/V' von 0,5/0,54 = 0,926 und 2,0/2,07 = 0,966 in den 0,5-ml- bzw. 2,0-ml-Kammern führt (Abbildung 2). In den Experimenten mit Blutplättchen wurde ein Prototyp-Stopfen für die Kammer sV mit einem Kapillartotvolumen von 0,05 mL verwendet, was einem Verdünnungsfaktor von 0,909 entspricht.

In der 0,5-ml-Kammer sind bei identischen Probenkonzentrationen (Menge pro Volumen) fast viermal geringere Mengen an lebenden Zellen, permeabilisierten Zellen und isolierten Mitochondrien erforderlich als in der 2,0-ml-Kammer, was zu quantitativ vergleichbaren Ergebnissen des respiratorischen_{O2-Verbrauchs} führt, der für die Zellzahl oder die Proteinmasse normiert ist. Dies deutet darauf hin, dass die Kammer sV ein wertvolles Instrument für Studien ist, bei denen die Anzahl der verfügbaren Proben begrenzt ist. Andererseits erhöht die Applikation einer identischen Probenmenge in Kammer sV den volumenspezifischen_O2-Fluss und verringert somit die Messunsicherheit bei geringen Atmungsaktivitäten.

Das Sauerstoffregime in der vorliegenden Studie war auf den_O2-Bereich der Luftsättigung bis 30 μM beschränkt. Die Anwendbarkeit bei Sauerstoffwerten jenseits dieses Bereichs erfordert eine weitere Untersuchung, um die mitochondriale Funktion bei Gewebenormoxie oder Hypoxie⁴³ und permeabilisiertes Gewebe bei Hyperoxie⁹ zu untersuchen. Mehrere Multisensor-Konfigurationen der Oroboros NADH- und Q-Module; pH-, NO- und TPP⁺-Elektroden^10,44 - können nicht in der Kammer sV untergebracht werden und erfordern die 2,0-ml-Kammer.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Anaconda3	Anaconda Software Distribution	https://www.anaconda.com/	Software
ADP	Merck, Deutschland	117105
Antibiotika-Antimykotika 100x	Biosera, Frankreich	XC-A4110	VORSICHT H317 Kann allergische Hautreaktionen hervorrufen
Antimycin A	Sigma-Aldrich, USA	A8674	VORSICHT H300  Lebensgefahr beim Verschlucken, H400 kurzfristige (akute) Gefahr für das Wasser
Ascorbat	Sigma-Aldrich, USA	A7631
ATP	Sigma-Aldrich, USA	A 2383
BSA fettsäurefrei	Sigma-Aldrich, USA	A 6003	Rinderserumalbumin
CaCO3	Sigma-Aldrich, USA	C 4830
			Carbonylcyanid m-Chlorphenylhydrazon VORSICHT H301 + H311 + H331 Giftig bei Verschlucken, Hautkontakt oder Einatmen
Countess Automatisierter Zellzähler	Thermo Fisher Scientific, USA	AMQAX100
Cytochrom c	Sigma-Aldrich, USA	C7752
DatLab	Oroboros Instruments, Österreich	Version 7.4	Software zur Datenerfassung und -analyse
DatLab	Oroboros Instruments, Österreich	Version 8.1	Software zur Datenerfassung und -analyse
DC Protein Assay	Bio-Rad, USA	5000112	Protein Assay Kit; VORSICHT H314 Verursacht schwere Verbrennungen der Haut und schwere Augenschäden
Digitonin	Sigma-Aldrich, USA	D5628	VORSICHT H301 Giftig bei Verschlucken
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich, USA	D 0632	VORSICHT H318 Verursacht schwere Augenschäden
DMEM	Pan Biotech, Deutschland	P04-05551	Dulbecco' s modifizierter Eagle" s Medium
DMSO	Sigma-Aldrich, USA	D2650	Dimethylsulfoxid
DPBS	Lonza Bioscience, Schweiz	LONBE17-512F	Calciumfreies Dulbecco' s phosphatgepufferte Kochsalzlösung
EGTA	Sigma-Aldrich, USA	E 4378
FBS	Thermo Fisher Scientific, USA	A5256701	fötales Rinderserum
Glucose	Sigma-Aldrich, USA	G7528
Glutamat	Sigma-Aldrich, USA	G1626
Glycerophosphat	Santa Cruz Biotechnologie	sc-215789
Heraeus Multifuge 3s Large	Thermo Fisher Scientific, USA	HM3S	Zentrifuge
Hettich Rotina 380R	Andreas Hettich GmbH & Co. KG, Deutschland	1701	Zentrifuge
Imidazol	Honeywell Fluka, Österreich	56750	VORSICHT H302 Gesundheitsschädlich bei Verschlucken, H314 Verursacht schwere Hautverbrennungen und Augenschäden, H360D Kann das Kind im Mutterleib schädigen
jamovi	Die jamovi Projekt	Version 2.3.13	Software
K+-MES	Sigma-Aldrich, USA	M 8250
Leucosep Rohr	Greiner Bio-One GmbH, Österreich	Z642843-300EA	Zentrifugenröhrchen mit Polyethylen-Barriere
Malat	Sigma-Aldrich, USA	M1000	VORSICHT H319 Verursacht schwere Augenreizungen.
Mannitol	Sigma-Aldrich, USA	M 4125
MgCl2	Scharlau, Spanien	MA 0036
MiR05-Kit	Oroboros Instruments, Österreich	60101-01	mitochondriales Atmungsmedium
Mischer	Swelab Instruments, Schweden	440S	Schaukeltisch
Mr. Frosty Gefrierbehälter	Thermo Fisher Scientific, USA	5100-0001	Gefrierbehälter
Oroboros Oroboros	Instruments, Österreich		, der NextGen-O2k und der O2k werden gemeinsam mit dem Begriff " angesprochen. Oroboros'
Oroboros Chamber cV	Oroboros Instruments, Österreich	23100-01	klassische Volumenkammer
Oroboros Chamber sV	Oroboros Instruments, Österreich	33100-01	kleine Volumenkammer
Oroboros TIP2k-Modul	Oroboros Instruments, Österreich	11100-03	Titrations-Injektion microPump
O2-Zero Pulver	Oroboros Instruments, Österreich	26600-02	Na-Dithionit VORSICHT H251 Selbsterhitzung: kann Feuer fangen, H302 Gesundheitsschädlich bei Verschlucken, H319 Verursacht schwere Augenreizungen
Octanoylcarnitin	Biotrend - APExBIO Technology, Germany	B6371
Oligomycin	Sigma-Aldrich, USA	O4876
Phosphocreatin	Sigma-Aldrich, USA	P 7936
Pyruvat	Sigma-Aldrich, USA	P2256	VORSICHT H317 Kann allergische Hautreaktionen hervorrufen
Rotenon	Sigma-Aldrich, USA	R8875	VORSICHT H300 Lebensgefahr bei Verschlucken Fibroblasten-Zelllinien
in der Haut	ATCC, USA
Natriumazid	Sigma-Aldrich, USA	S2002	VORSICHT H300 + H310 + H330 Lebensgefahr bei Verschlucken, Hautkontakt oder Einatmen
Subtilisin A	Sigma-Aldrich, USA	P 5380	VORSICHT H318 - Verursacht schwere Augenschäden, H334 - Kann bei Einatmen Allergie- oder Asthmasymptome oder Atembeschwerden verursachen
Succinat	Sigma-Aldrich, USA	S2378
Saccharose	Sigma-Aldrich, USA	S 7903
Swelab Alfa Blutkörperchenzähler	Boule Diagnostics AB, Schweden	1420041
Taurin	Sigma-Aldrich, USA	T 0625
Tecan Infinite TM F200	Tecan, Schweiz		Spektralphotometer
TMPD	Sigma-Aldrich, USA	T3134	N,N,N',N'-Tetramethyl-p-phenylendiamin dihydrochlorid VORSICHT H315 Verursacht Hautreizungen, H319 Verursacht schwere Augenreizungen
Trypsin	Sigma-Aldrich, USA	T4799	ACHTUNG H334 Kann bei Einatmen Allergien, Asthmasymptome oder Atembeschwerden verursachen
Vacuette	Greiner Bio-One GmbH, Österreich	15452520