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Methodenartikel

Ableitung eines Organoids des menschlichen Gehirns mit Mikroglia-Entwicklung

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DOI:

10.3791/67491

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17. Januar 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Translational Neuroscience Center, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 2Cancer Genetics and Comparative Genomics Branch, National Human Genome Research Institute, National Institutes of Health

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir stellen ein Protokoll zur Generierung eines menschlichen Gehirnorganoids mit residenten Mikroglia vor, indem von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) abgeleitete hämatopoetische Vorläuferzellen (HPCs) in die Organoidentwicklung integriert werden.

Zusammenfassung

Dreidimensionale (3D) Hirnorganoidkulturen, die aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) gewonnen werden, stellen ein wichtiges alternatives In-vitro-Werkzeug für die Untersuchung der Entwicklung des menschlichen Gehirns und der Pathogenese neurologischer Erkrankungen dar. Der fehlende Einbau von Mikroglia in die Organoide des menschlichen Gehirns ist jedoch immer noch eine große Hürde für 3D-Modelle der Neuroinflammation. Zu den aktuellen Ansätzen gehört entweder der Einbau vollständig differenzierter Mikroglia in reife Hirnorganoide oder die Induktion der Mikrogliadifferenzierung ab dem frühen Stadium von iPSC-abgeleiteten Embryoidkörpern (EBs). Der erste Ansatz übersieht das Stadium, in dem die Mikroglia-Differenzierung mit der angrenzenden neuronalen Umgebung interagiert, und der spätere Ansatz ist technisch herausfordernd, was zu Inkonsistenzen zwischen den endgültigen Organoiden in Bezug auf die Quantität und Qualität der Mikroglia führt. Um Gehirnorganoide mit Mikroglia zu modellieren, um die frühen Wechselwirkungen zwischen der Entwicklung von Mikroglia und Neuronen zu untersuchen, wurden hochreine hämatopoetische Vorläuferzellen (HPC), die von menschlichen iPSCs unterschieden wurden, in iPSC-abgeleitete EBs eingebaut, um Gehirnorganoide herzustellen. Mittels Immunfärbung und Einzelzell-RNA-Sequenzierung (sc-RNA-seq) konnten wir bestätigen, dass HPCs in die 3D-Organoide eingebaut wurden, die sich schließlich zu Gehirnorganoiden mit Mikroglia und Neuronen entwickelten. Im Vergleich zu Hirnorganoiden ohne HPCs führt dieser Ansatz zu einem signifikanten Einbau von Mikroglia in die Gehirnorganoide. Dieses neuartige 3D-Organoidmodell, das sowohl aus mikroglialen als auch aus neuronalen Entwicklungseigenschaften besteht, kann zur Untersuchung der frühen Wechselwirkungen zwischen der Entwicklung des angeborenen Immuns und des Nervensystems und möglicherweise als Modell für Neuroinflammation und neuroinfektiöse Erkrankungen verwendet werden.

Einleitung

Mikroglia sind stationäre Immunzellen im Gehirn, die sowohl bei der Gehirnentwicklung als auch bei der Homöostase eine entscheidende Rolle spielen 1,2. Die Aktivierung von Mikroglia führt zur Produktion von proinflammatorischen Faktoren, erhöhter Phagozytose und reaktivem oxidativem Stress, wodurch die eindringenden Krankheitserreger und geschwächten Zellen entfernt werden. Andererseits kann eine Überaktivierung oder eine verlängerte Aktivierung von Mikroglia als Mechanismus der Pathogenese bei vielen neurologischen Erkrankungen, einschließlich der Parkinson-Krankheit, eine Neurodegeneration verursachen 3,4. Es ist wichtig, dass Mikroglia in die relevanten Modelle zur Untersuchung menschlicher neurologischer Erkrankungen einbezogen werden. In den letzten Jahren wurden humane Stammzellen verwendet, um 3D-Organoide als In-vitro-Modelle als Alternative zu Tiermodellen und Studien am Menschen zu entwickeln5. Im Idealfall bestehen menschliche Organoide aus mehreren Zelltypen und Gewebestrukturen, die den entsprechenden menschlichen Organen ähneln und die menschliche Physiologie und Pathogenese besser repräsentieren als Tiermodelle, jedoch ohne die ethischen Bedenken, die bei Studien an menschlichen Individuen direkt auftreten. Sie könnten die Zukunft der Modellierung menschlicher Krankheiten für die Erforschung der Pathogenese und Arzneimittelentwicklung sowie für die Anleitung individualisierter Therapien darstellen6. So haben sich beispielsweise 3D-Organoide des menschlichen Gehirns, die aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) gewonnen wurden, im Bereich der neurowissenschaftlichen Forschung durchgesetzt, indem neuronale Infektionskrankheiten wie ZIKA, SARS-CoV-27 und neurodegenerative Erkrankungen wie Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) und Alzheimer modelliertwurden 8,9. Herkömmliche neuronale 3D-Organoide, die eine duale SMAD-Hemmung zur Induktion der neuronalen Differenzierung10 verwenden, produzieren jedoch Gehirnorganoide ohne Mikroglia, da sie von Vorläufern abstammen, die aus dem Blut rekrutiert wurden, anstatt von der Neuroektoderm-Linie, von der Neuronen abstammen 11,12. Ohne das Vorhandensein von Mikroglia sind die Organoide ungeeignet, um ZNS-Infektionen, Entzündungen und die damit verbundene Neurodegeneration zu modellieren.

Um diese kritische Frage anzugehen, wurden Versuche unternommen, differenzierte Mikroglia in die Gehirnorganoideeinzubauen 13 oder die Mikrogliadifferenzierung innerhalb von Organoiden von Anfang an zu induzieren, wobei alternative Ansätze anstelle der dualen SMAD-Hemmungverwendet wurden 13. Durch den Einbau differenzierter Mikroglia in die Gehirnorganoide werden jedoch die frühen Wechselwirkungen zwischen neuronaler und mikroglialer Entwicklung übersehen. Dies könnte für die Entwicklung des ZNS oder die Pathogenese neuroinfektiöser Erkrankungen wichtig sein, die auf die Entwicklung des Gehirns von Säuglingen abzielen, wie z. B. bei einer ZIKA-Virusinfektion14. Auf der anderen Seite ist die Differenzierung der angeborenen Mikroglia innerhalb von iPSC-abgeleiteten Hirnorganoiden ohne intermittierende Stadien mit einem verlängerten Prozess verbunden und weist eine höhere Variabilität innerhalb der Endprodukteauf 15. In diesem berichteten Protokoll haben wir die von iPSCs abgeleiteten hämatopoetischen Vorläuferzellen (HPCs) in die iPSCs eingebaut, um Embryoidkörper (EBs) herzustellen, die weiter zu 3D-Organoiden differenziert wurden, die sowohl Neuronen als auch Mikroglia umfassen.

Unser Protokoll bietet einen einfachen Ansatz, der zur Untersuchung des menschlichen Zentralnervensystems mit frühen Neuron-Mikroglia-Interaktionen und der Pathogenese von neuronalen Infektionsstörungen und Neuroinflammation mit Mikrogliaaktivierung angewendet werden kann.

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Protokoll

Die Originalblutproben von gesunden erwachsenen Spendern wurden in der Transfusionsmedizin Blutbank des NIH entnommen und in Übereinstimmung mit dem NIH Institutional Review Board unterschriebene Einverständniserklärungen eingeholt.

1. Herstellung von hämatopoetischen Vorläuferzellen (HPCs) aus humanen iPSCs

HINWEIS: Zur Erstellung der repräsentativen Ergebnisse wurden die humanen iPS-Zellen 510 und 507 verwendet. Die Methoden zur Erzeugung und Pflege der iPSCs sind in einer früheren Veröffentlichung16 zu finden.

  1. Tag 0: Beschichten Sie eine 12-Well-Zellplatte mit 500 μl/Well eiskalter Matrigel-Lösung (Basalmembranmatrix [BMM]), verdünnt in DMEM/F12-Medium und inkubieren Sie sie mindestens 30 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT).
  2. Entfernen Sie den Beschichtungsüberstand vollständig und ersetzen Sie ihn durch 1 mL E8 Flex Medium pro Well.
  3. Überprüfen Sie die iPS-Kultur in einer 6-Well-Platte unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die iPS-Zellen von hoher Qualität und ohne Anzeichen einer Differenzierung sind. Wählen Sie eine mittelgroße Kolonie, indem Sie sie mit einem Filzstift unter dem Boden der Platte markieren.
  4. Nehmen Sie das Medium aus der iPSC-Kultur und geben Sie 500 μl Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) iPSC-Dissoziationspuffer (0,5 mM EDTA, 0,45 g/l NaCl in DPBS) in die Vertiefung.
  5. Beobachten Sie unter dem Mikroskop auf Anzeichen von Zelldissoziation, wenn drei bis vier Reihen von Zellen an den Rändern der Kolonie zu schrumpfen beginnen und zwischen den Zellen ein leerer Raum entsteht. Dies dauert in der Regel 1-3 min.
  6. Entsorgen Sie die EDTA-Lösung vollständig. Entfernen Sie die markierte iPS-Kolonie, indem Sie 1 ml E8 Flex Medium kräftig und direkt darauf pipettieren. Stellen Sie sicher, dass sich die Kolonie nach 1-3 maligem Pipettieren vollständig in Zellpflaster mit jeweils 20-50 Zellen ablöst.
  7. Entnehmen Sie den Überstand mit den Zellpflastern und geben Sie ihn in die erste Vertiefung der beschichteten Vertiefungen in der 12-Well-Platte.
  8. Mischen Sie die Vertiefung, indem Sie ein- oder zweimal pipettieren und übertragen Sie 1 ml der Zellen in die zweite Vertiefung, die 1 ml Medium enthält.
  9. Wiederholen Sie Schritt 1.8 zweimal, um seriell verdünnte iPSC-Kulturen in insgesamt vier Vertiefungen herzustellen.
  10. Inkubieren Sie die Platte in einem 37 °C heißen Inkubator mit 5 % CO2.
  11. Nach 24 Stunden, an Tag 1, überprüfen Sie die Völker unter dem Mikroskop und zählen Sie die Anzahl der Völker, indem Sie kontinuierlich alle Felder in einem Brunnen durchgehen. Wählen Sie eine Vertiefung aus, die 10-20 iPS-Kolonien enthält.
  12. Ersetzen Sie das Medium durch 1 ml Medium A aus dem hämatopoetischen Kit. Legen Sie die Platte für 48 h zurück in den Inkubator.
  13. Entfernen Sie an Tag 3 500 μl verbrauchtes Medium und fügen Sie 500 μl frisches Medium A hinzu.
  14. Beobachten Sie an Tag 4 unter dem Mikroskop und bemerken Sie ein signifikantes Zellwachstum und eine Differenzierung von den iPS-Kolonien. Ersetzen Sie das Medium durch 1 mL Medium B.
  15. Überwachen Sie die Zelldifferenzierung unter dem Mikroskop und wechseln Sie jeden zweiten Tag die Hälfte des Mediums mit 500 μl Medium B. Die HPC-ähnlichen Zellen erscheinen an den Tagen 6-7.
  16. Beobachten Sie am 10. Tag unter dem Mikroskop helle, einzelne runde Zellen mit der Morphologie normaler HPCs, die im Medium schwimmen oder lose an der einzelnen unteren Schicht von flachen Zellen befestigt sind, mit einigen losen Zellaggregaten.
    HINWEIS: Die differenzierten HPCs sind bereit für die Entnahme zur Charakterisierung oder für weitere Experimente.
  17. Sammeln Sie alle differenzierten HPCs, indem Sie mit einer 1-ml-Pipettenspitze dreimal auf und ab pipettieren, um die Zellaggregate aufzubrechen und die HPCs von der Plattenoberfläche zu lösen.
  18. Geben Sie die Zellen in ein 15 mL Röhrchen und zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 mL Medium B.
  19. Zählen Sie die Zellen und stellen Sie die Konzentration auf 1 Million Zellen/ml ein. Zu diesem Zeitpunkt werden mehr als 1 Million HPCs generiert. Bei der Überprüfung mit Durchflusszytometrie ist sicherzustellen, dass die Reinheit mehr als 85 % der Zellen mit CD34+/CD43+ beträgt. Stellen Sie sicher, dass keine signifikanten abgestorbenen Zellen (mehr als 5%) bemerkt werden.

2. Entwicklung von Embryoidkörpern aus gemischten iPSCs und HPCs

  1. Stellen Sie sicher, dass eine iPS-Kultur am selben Tag, an dem die HPCs entnommen werden, auch in einer Vertiefung in einer 6-Well-Platte (oder zwei Vertiefungen in einer 12-Well-Platte) eine Konfluenz von 80 % erreicht.
  2. Behandeln Sie eine Vertiefung der Mikrotiterplatte für die EB-Bildung mit 500 μl Anti-Adhärenz-Spüllösung, indem Sie diese hinzufügen, um Blasenbildung zu minimieren.
  3. Drehen Sie die Platte 5 Minuten lang bei 2000 x g in einem schwingenden Schaufelrotor, der mit Plattenhaltern ausgestattet ist, um mögliche Blasen zu entfernen.
  4. Entfernen Sie die Spüllösung vollständig durch Pipettieren und waschen Sie die Vertiefungen zweimal mit 1 mL DPBS und dann mit 1 mL DMEM/F12, ohne Blasen zu bilden.
  5. Dissoziieren Sie die iPS-Zellen von der Platte, indem Sie die Zellen mit 1 ml Accutase-Lösung behandeln.
  6. Beobachten Sie unter dem Mikroskop, bis die Zellen Anzeichen einer Trennung zeigen, aber noch am Boden befestigt sind. Dies geschieht in der Regel innerhalb von 1-3 Minuten nach der Behandlung mit Accutase. Verdauen Sie die iPS-Zellen nicht zu sehr.
  7. Entfernen Sie die Accutase-Lösung vollständig, ohne die Zellen zu stören, und geben Sie 1 ml DMEM/F12-Medium in die Vertiefungen. Dissoziieren Sie die Zellen in einzelne Zellen, indem Sie mit einer 1-ml-Spitze ein paar Mal auf und ab pipettieren.
  8. Sammeln Sie die Zellen in ein 15-ml-Röhrchen und füllen Sie es auf 5 mL mit DMEM/F12-Medium. Die Zellen bei 300 x g 5 min drehen.
  9. Entfernen Sie den Überstand durch Pipettieren und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml E8 Flex Medium. Zählen Sie die Zellen und stellen Sie die Zellkonzentration auf 1 Million Zellen pro ml im E8 Flex-Medium ein.
  10. Mischen Sie iPSCs mit HPCs in einem Verhältnis von 2:1, indem Sie 1 Million iPSCs (1 ml) und eine halbe Million HPCs (500 μl) zusammen hinzufügen. Geben Sie alle gemischten Zellen in die zuvor behandelte Vertiefung der Mikrotiterkulturplatte.
  11. 1 μl des Rock-Inhibitors Y27632 Stammlösung (1 mM) pro 1 ml Medium in den Überstand geben. Schütteln Sie die Platte einige Male von einer Seite zur anderen, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen.
  12. Schleudern Sie die Mikrotiterkulturplatte bei 300 x g für 5 min in einem schwingenden Eimerrotor, der mit Plattenhaltern ausgestattet ist. Beobachten Sie unter dem Mikroskop, ob sich die Zellen in den Mikrovertiefungen niedergelassen haben. (Ergänzende Abbildung 1A).
  13. Stellen Sie die Platte, ohne die Zellen zu stören, in einen 37 °C, 5 % CO2 -Zellinkubator.
  14. Am Tag 2, 48 h später, beobachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop auf die Bildung von EBs. Wenn die EBs eindeutig gebildet sind, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort (Ergänzende Abbildung 1B).
  15. Behandeln Sie eine 24-Well-Zellkulturplatte 15 Minuten lang mit Anti-Adhärenz-Spülpuffer (500 μl), um eine Platte mit geringer Anhaftung herzustellen.
  16. Entfernen Sie den Spülpuffer vollständig und waschen Sie die Vertiefungen zweimal mit 1 mL DPBS, dann geben Sie 1 mL E8 Flex Medium in die Vertiefungen.
  17. Resuspendieren Sie die EBs in der Mikrotiterkulturplatte, indem Sie sie einige Male mit einer Pipettenspitze mit einer Breite von 1 ml Öffnung pipettieren.
  18. Für jede Vertiefung der mit geringer Adhärenz behandelten 24-Well-Platten werden 100 μl EB-haltiges Medium aufgefangen und hinzugefügt. Dies führt zu 10-20 EBs pro Bohrung. Fügen Sie dem alten Well E8 Flex-Medium hinzu, das die übrig gebliebenen EBs als Backups enthält.
  19. Inkubieren Sie die Platte in einem 37 °C heißen Inkubator mit 5 % CO2 -Zellen für 48 Stunden.

3. 3D Induktion, Proliferation und Reifung neuronaler Organoide

  1. Tauen Sie am Tag 2 nach der EB-Bildung die Aliquots von BMM mindestens 30 Minuten lang auf Eis auf.
  2. Verwenden Sie eine vorgekühlte 20-μl-Spitze und geben Sie 15 μl eiskalten BMM-Tropfen mit Bedacht auf das Medium, um die EBs zu beschichten. Dadurch entsteht eine Folie aus BMM, an die sich EBs anheften und auf der sie wachsen.
  3. Stellen Sie die Platte in einen Inkubator mit 37 °C und 5 % CO2 -Zellen.
  4. Entfernen Sie am 4. Tag nach der EB-Bildung vorsichtig 500 μl Medium, ohne EBs zu verwerfen, und wiederholen Sie die BMM-Beschichtung, indem Sie Schritt 3.2 befolgen.
  5. Starten Sie sofort die neuronale Induktion, indem Sie 500 μl PSC Neural Induction Medium auf die Zellen geben.
  6. Führen Sie an den Tagen 6 und 8 einen halben Mediumwechsel durch, indem Sie vorsichtig 500 μl Medium entfernen, ohne die Zellen zu berühren, und 500 μl neuronales Induktionsmedium hinzufügen.
  7. Führen Sie an den Tagen 10, 12 und 14 einen halben Mediumwechsel mit neuronalem Stammzellmedium (NSC) durch: Knockout DMEM/F12 + 1x Glutamax-Supplement + 1x Neural Supplement + bFGF + EGF.
  8. Übertragen Sie an Tag 15 die gesamte Vertiefung der Kugeln mit Medium auf eine neue 12-Well-Platte, die wie zuvor beschrieben mit einer Anti-Adhärenz-Spüllösung behandelt wurde. Geben Sie 500 μl neuronales Reifungsmedium (DMEM/F12 + 1x N2-Präparat + 1x B27-Präparat + 1x Antibiotika-Antimykotikum) auf die Kultur.
  9. Führen Sie jeden zweiten Tag einen halben Mediumwechsel mit neuronalem Reifungsmedium durch.
  10. Wenn es während der Reifungsphase Anzeichen einer Erschöpfung der Nährstoffe gibt, wie z. B. Farbveränderungen des Mediums, bringen Sie das Organoid auf 6-Well-Platten, die bis zu 3 ml Medium pro Well aufnehmen.
  11. Optional kann das Reifungsmedium 17 Tage nach der EB-Bildung 6 Tage lang mit Zytokinen (IL-34, M-CSF, TGF-β1, CD200, CX3CL1) ergänzt werden, um die Reifung der Mikroglia zu erleichtern.
  12. Sammeln Sie an Tag 23 die resultierenden neuronalen Organoide für die Charakterisierung oder weitere Experimente.

4. Clearance und Immunfärbung von neuronalen 3D-Organoiden

  1. Fixieren Sie bis zu 10 Organoide durch Eintauchen in 1 mL 4 % Paraformaldehyd (PFA) bei 4 °C für 24 h.
  2. Übertragen Sie die Organoide pro Vertiefung auf eine durchsichtige Bodenplatte mit 96 Vertiefungen und waschen Sie sie mit 200 μl DPBS 2 Mal für jeweils 1 Stunde unter leichtem Schütteln.
  3. Organoide permeabilisieren, indem sie einmal in 50 % Methanol in DPBS, 80 % Methanol in doppelt destilliertem (dd) Wasser und 100 % trockenem Methanol jeweils 10 Minuten lang bei 4 °C unter leichtem Schütteln gewaschen werden.
  4. Waschen Sie die Organoide nacheinander in 20 % DMSO/Methanol, 80 % Methanol in dd Wasser, 50 % Methanol in DPBS, in 100 % DPBS, dann in DPBS mit 0,2 % Triton X-100, jeweils 10 min bei 4 °C unter leichtem Schütteln. Bemühen Sie sich, den Restpuffer nach jedem Waschen vollständig zu entfernen.
  5. Inkubieren Sie in permeabilisierendem Puffer (DPBS mit 0,2 % Triton X100, 0,3 M Glycin und 20 % DMSO) unter leichtem Schütteln für 40 Minuten bei RT.
  6. Blockierungspuffer (DPBS mit 0,2 % Triton X100, 6 % Ziegenserum und 10 % DMSO) für 1 h bei 37 °C mit leichtem Schütteln auf einem Shaker bei 80 U/min einlagern.
  7. Inkubieren Sie mit Antikörpern in Antikörperverdünnungspuffer (IBA1 1:100, TREM2 1:100, βIII-Tubulin, 1:1000, 100 μL/Well in DPBS mit 0,2 % Tween 20, 100 μg/mL Heparin, 3 % Ziegenserum und 5 % DMSO) bei 37 °C für 2 h oder im Kühlraum mit leichtem Schütteln bei 80 U/min für 3 Tage.
  8. Mit DPBS mit 0,2 % Tween 20, 100 μg/mL Heparin 5 mal à 10 min bei RT waschen und auf einem Shaker bei 80 U/min sanft schütteln.
  9. Inkubieren Sie mit einem Sekundärantikörper (1:200 Ziegen-Anti-Maus Alexa488) bei 37 °C für 1 h, gefolgt von RT über Nacht mit leichtem Schütteln auf einem Shaker bei 80 U/min.
  10. Für die nukleare Kontrastfärbung führen Sie die DAPI-Färbung zusammen mit einer Antikörperinkubation oder in einem Waschpuffer durch.
  11. Waschen Sie die Organoide 10 Mal in Waschpuffer, jeweils 10 min bei 37 °C, unter leichtem Schütteln.
  12. Unter dem Mikroskop beobachten. Wenn der Hintergrund noch hoch ist, waschen Sie es 5 Mal.
  13. Entsorgen Sie den Überstand so weit wie möglich. Fügen Sie 200 μl Organoid-Clearing-Lösung hinzu und inkubieren Sie sie 5 Minuten lang, bevor Sie sie betrachten, und nehmen Sie Bilder mit einem konfokalen Mikroskop auf.

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Ergebnisse

Unser Protokoll folgt einem Schema, um HPCs von iPSCs zu unterscheiden und dann die HPCs mit iPSCs zu mischen, um EBs herzustellen, gefolgt von neuronaler Induktion, Differenzierung und Reifung (Abbildung 1). Eine hohe Qualität der HPC-Differenzierung ist entscheidend für den Erfolg der EB-Bildung und der späteren Organoid-Differenzierung. Eine serielle Verdünnungskulturtechnik wird verwendet, um die entsprechende Anzahl und Größe von iPS-Kolonien zu erzeugen...

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Diskussion

Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Herstellung von 3D-Neuronalen Organoiden vorgestellt, die angeborene Mikroglia aus EBs enthalten, die aus gemischten iPSCs und iPSC-differenzierten HPCs stammen. Es handelt sich um einen relativ kurzen und einfachen Ansatz, bei dem nur Zellkulturtechniken und -geräte verwendet werden, die in den meisten Labors allgemein verfügbar sind.

Der wichtigste Faktor für den Erfolg dieses Protokolls ist die Qualität der HPC-Diff...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Studie wird durch interne Forschungsgelder des NINDS unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
12-Well-ZellkulturplattenCorning #3512
24-Well-ZellkulturplatteSARSTEDT#83.3922
AccutaseThermoA1110501
Aggrewell 400Platte Stammzellentechnologien#34411Bezeichnet als Mikrotiterplatten 
Alexa Fluor 488 Ziegen-Anti-Maus-AntikörperLebenstechnologienA110011:400 Verdünnung
Alexa Fluor 594 Ziegen-Anti-Kaninchen-AntikörperLebenstechnologienA110121:400 Verdünnung
Allegra X-30R Zentrifuge mit Rotor S6069Beckman Couler
Anti-Adhärenz  SpüllösungStem Cell Technologies#07010
Anti-CD34-AntikörperStem Cell Technologies#600131:100 Verdünnung
Anti-Humaner CD43-AntikörperStem Cell Technologies#600851:100 Verdünnung
Anti-IBA1 Rabbbit-AntikörperFujifilm019-197412,5 &Mikro; g/mL
anti-TREM2  Ratte pAbRD Systemsmab172912.5 µ g/mL
Antibiotikum-AntimykotikumGibco15240-0621x
B27 SupplementLife Technologies17504-0441x
bFGFPeprotech100-18B20 ng/mL
CD200NovoproteinC311  100 ng/mL
CryoTube FläschchenThermo#368632
CX3CL1Peprotech300-31  100 ng/mL
DAPISigmaD95421 &Mikro; g/mL
DMEM/F12Life technologies12400-0241x
DMSOSigmaD2650
DPBSGibco#41901361x
E8 Flex Medium KitThermoA2858501
EDTAMediatech46-034-Cl 0,5 mM
EGFPeprotechAF-100-1520 ng/mL
EVOS FL AutomikroskopThermofluoreszenzmikroskopnbsp;
FastStart Universal SYBR Green PCR MastermixRoche#4913850001
GlutamaxGibco#35050079
ZiegenserumSigmaG90234%
IL-34Peprotech200-34  100 ng/ml
ImageXpress Mikrokonfokalemolekulare Bauelemente
Knockout DMEM/F12Gibco#10829018
M-CSFPeprotech300-25  25 ng/mL
MatrigelCorning#354277Basalmembran-Matrix (BMM)
Maus anti-β III-Tubulin AntikörperPromegaG712A1:1000 Verdünnung
Mr. Frosty BehälterThermo5100-0001
N2 ErgänzungLife Technologies17502-0481x
ParaformadehydeSigmaP61484%
PSC Neuronales InduktionsmediumGibcoA1647801
Gesteinsinhibitor Y27632Stammzelle technologies#723041 mM Lager
RT LTS 1000 ul PipettenspitzenRAININ#30389218  zur Übertragung von Organoiden
STEMdiff Cerebral Organoid KitStem Cell Technologies#08570
STEMdiff Hämatopoetisches KitStemCell Technologies#5310Bezeichnet als hämatopoetisches Kit
StemPro Neural SupplementGibcoA1050801Bezeichnet als neuronales Supplement
TGF-β 1Peprotech100-2150 ng/mL
Total RNA Purification Plus KitNorgen#48400
TritonX-100SigmaT92840,10%
Visikol Histo-Starter KitVisikolHSK-1Enthält Organoid-Clearing-Lösung HISTO-M, Waschpuffer
Zeiss LSM 510-META Konfokales MikroskopZeiss
&

Referenzen

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Hirn Organoideinduzierte pluripotente Stammzellenh matopoetische Vorl uferzellenEmbryoidk rperneurale InduktionMikroglia InkorporationEinzelzell RNA SequenzierungNeuroinflammationsmodellneuronale Reifung
Ableitung eines Organoids des menschlichen Gehirns mit Mikroglia-Entwicklung
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