Methodenartikel

Fluoreszenzmarkierung zur Visualisierung niedrig exprimierter Proteine im Zebrafisch

DOI:

10.3791/67616

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24. Januar 2025

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1State Key Laboratory of Cellular Stress Biology, School of Life Sciences, Faculty of Medicine and Life Sciences, Xiamen University, 2Technology Center, Shanxi Xinghuacun Fenjiu Distillery Co., Ltd., 3Research Unit of Cellular Stress of CAMS, Cancer Research Center of Xiamen University, Xiang'an Hospital of Xiamen University, School of Medicine, Xiamen University, 4Laboratory Animal Center, Xiamen University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier stellen wir ein Protokoll zur Markierung von Proteinen mit einem Fluoreszenzprotein-Tag in Zebrafischlarven vor, ein neu entwickeltes und modifiziertes in vivo-System , das besonders nützlich für die Visualisierung von Proteinen mit geringer Abundanz im Zebrafisch ist.

Zusammenfassung

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Die CRISPR/Cas9-vermittelte Knock-in-Technologie (KI) ermöglicht eine einfachere Markierung von fluoreszierenden Proteinen im Zebrafisch (Danio rerio), einem bevorzugten Modellorganismus für die In-vivo-Bildgebung aufgrund seiner Transparenz in der frühen Entwicklungsphase. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Durchführung einer hocheffizienten Fluoreszenzgen-KI, ein schnelles Screening für KI-Gründer und eine geringe Proteinverfolgung in Zebrafischlarven zur Verfügung, das eine wichtige Grundlage für nachfolgende physiopathologische Studien an Zebrafischen bilden wird. Das aktuelle Protokoll umfasst vollständige Schritte für das sgRNA-Design für das interessierende Gen, die sgRNA-In-vitro-Transkription, die Cas9-mRNA-In-vitro-Transkription, das In-vivo-sgRNA-Screening für das Gen mit der höchsten Effizienz, das Design und die Konstruktion von Spenderplasmiden, die Mikroinjektion in Zebrafischlarven, das KI-Gründerscreening und die Live-Bildgebung von Zebrafischen. Kritische Schritte, Tipps zur Fehlerbehebung, Methoden zur Qualitätskontrolle sowie Vorteile und Anwendungen dieses Protokolls werden enthalten und diskutiert. Dieses Protokoll gewährleistet schnelle und genaue Ergebnisse zu geringen Kosten und wurde in mehreren Studien validiert.

Einleitung

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Als anerkannter Modellorganismus wird der Zebrafisch (Danio rerio) in der wissenschaftlichen Forschung über Entwicklung, Regeneration, Tumorgenese, Infektion und Immunität usw. häufig verwendet 1,2,3,4,5. Zebrafische eignen sich besonders für die In-vivo-Live-Bildgebung, wenn sie mit PTU (1-Phenyl-2-Thioharnstoff) behandelt werden, einer giftigen chemischen Verbindung, die die Melanogenese hemmt und Zebrafischlarven für einen relativ langen Zeitraum transparent macht6. Gentechnisch veränderte transparente Zebrafischstämme wie der Casper7 und der Crystal8 sind ebenfalls verfügbar und ermöglichen eine Live-Visualisierung und Abstammungsverfolgung bis ins Erwachsenenalter. Neben diesen Bemühungen, die Pigmentierung für eine bessere Lebendvisualisierung bei erwachsenen Fischen zu überwinden, konzentriert sich unsere Forschung auch auf die Entwicklung leistungsfähiger Gen-Editing-Strategien, um die Markierung von fluoreszierenden Proteinen effizienter und weniger künstlich zu gestalten.

Die auf CRISPR/Cas9 basierende KI-Technologie auf Basis von Mikrohomologie-vermittelten Endverbindungen (MMEJ) wird aufgrund ihrer relativ hohen KI-Effizienz heute häufig bei genetischen Modifikationen in mehreren Organismen, einschließlich Zebrafischen, eingesetzt 9,10,11,12. Um eine erfolgreiche In-vivo-Bildgebung zu erreichen, müssen zwei Herausforderungen angegangen werden. Eine davon sind die Indels oder Narben, die durch den Prozess der Rekombination entstehen; Die andere ist, dass einige Zielgene endogen auf einem niedrigen Niveau exprimiert werden, was zu schwachen Signalen des co-exprimierten Fluoreszenz-Tags und zum Versagen der in vivo-Detektion führt. Mit dem Ziel einer effizienten und genauen Proteinmarkierung und der Minimierung der Interferenz endogener Genexpressionsniveaus wurde in einer kürzlich veröffentlichten Arbeit eine optimierte Strategie vorgestellt, die eine fluoreszenzsignalverstärkende "VH"-Markierungsmethode und einen verfeinerten Keimbahn-Screening-Workflow13 kombiniert, die für die Fluoreszenzmarkierung niedrig exprimierter Gene besser geeignet und effizienter als frühere Methoden ist, indem sie das Spenderrückgrat optimiert und Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Fluoreszenznachweise kombiniert Implementierung eines Keimbahnscreenings mit geringstem Zeit- und Arbeitsaufwand. Hier präsentieren wir ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll für die beschriebene Methode, einschließlich der Schritte der Embryovorbereitung und Zebrafischhaltung, des sgRNA-Designs, der in vitro Transkription von sgRNAs, der in vitro Transkription von Cas9 mRNA, der Mikroinjektion von Zebrafischembryonen, des in vivo Screenings für sgRNAs mit der höchsten Effizienz, des Designs und der Konstruktion von Donorplasmiden, der KI-Zebrafisch-Genotypisierung, des KI-Keimbahnscreenings sowie der KI-Zebrafischbildgebung und -phänotypisierung. Dieses All-in-One-Protokoll, das eine hochmoderne Fluoreszenzmarkierungsmethode bietet, würde zweifellos Studien mit Zebrafischen in verschiedenen wissenschaftlichen Bereichen fördern und Lesern mit unterschiedlichem akademischem Hintergrund zugute kommen.

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Protokoll

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Alle Zebrafischzuchten und -versuche wurden von der Kommission für Labortiermanagement und Ethik der Universität Xiamen überprüft und genehmigt und standen in strikter Übereinstimmung mit der guten Tierpraxis, wie sie vom Labortierzentrum der Universität Xiamen definiert wurde. Die Studie entsprach allen relevanten ethischen Vorschriften für die Verwendung von Tieren.

HINWEIS: Alle adulten und larvalen Zebrafische wurden gemäß den Standardprotokollen bei 28,5 °C mit einem Hell-Dunkel-Zyklus von 13/11 h im Zebrafisch-Aquarium-System der Universität Xiamen gehalten. Die Embryonen wurden im Embryopuffer (Tabelle 1) in einem kontrollierten Inkubator (Temperatur, 28 ± 0,5 °C; hell, 13 h hell/11 h Dunkelzyklus) aufbewahrt. Die Fütterung und das allgemeine Monitoring aller Zebrafische wurden zweimal täglich (9 Uhr und 16 Uhr) durchgeführt. Der in dieser Studie verwendete Wildtyp-Stamm (WT) war Tübingen (Tü).

1. Auswahl der interessierenden Gene und Design der Guide-RNA

  1. Kennen Sie die Informationen des Gens, das Sie interessiert. Durchsuchen Sie die Datenbank (https://zfin.org/) und stellen Sie sicher, dass die Anzahl der Genvarianten bekannt ist. Entscheiden Sie, welche Variante bearbeitet werden soll, und laden Sie Zielgeninformationen von Ensembl (https://www.ensembl.org/) herunter, einschließlich Genomsequenz, cDNA-Sequenz und kodierende Sequenz (CDS). Markieren Sie Exons, Introns, UTRs, Start- und Stopp-Codons in den Sequenzen.
  2. Wählen Sie nicht mehr als 200 bp CDS stromaufwärts des Stopp-Codons (TAA, TAG oder TGA) des Zielgens als sgRNA-Zielregion.
    HINWEIS: Es ist besser, durch DNA-Sequenzierung sicherzustellen, dass diese Region keine Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) aufweist.
  3. Verwenden Sie die CRISPRscan-Website (https://www.crisprscan.org/), um sgRNA-Kandidaten innerhalb der gewählten Zielregion zu entwerfen und die Effizienz von sgRNAs vorherzusagen.
    1. Geben Sie die DNA-Sequenz in den Designrahmen ein.
    2. Wählen Sie die entsprechenden Informationen aus, einschließlich Spezies, max. Mismatch(s) in Off-Targets, Endonuklilease und Promotor. Wählen Sie in diesem Fall Zebrafisch-Danio rerio, No mismatch, Cas9-NGG und in vitro T7-Promotor.
    3. Klicken Sie auf sgRNAs abrufen , um einige sgRNAs zu erhalten. Wählen Sie 5-7 sgRNAs mit einem hohen CRISPRscan-Score und einem niedrigen Off-Target-Score für den In-vivo-Screen aus.
  4. Entwicklung von PCR-Primern, die die sgRNA-Zielstellen flankieren, deren Produkt etwa 500 bp wiegt, für die anschließende PCR-Amplifikation, den enzymatischen Verdautest und die Sequenzierung, um die Knockout-Effizienz nach der sgRNA/Cas9-Mikroinjektion zu überprüfen. Wählen Sie eine Sequenz von ca. 20 bp in vor- und nachgelagerten Bereichen und stellen Sie sicher, dass der GC-Gehalt etwa 50 % beträgt und der Tm-Wert zwischen 50 und 55 °C liegt.
    HINWEIS: Entwerfen Sie zwei vorgelagerte Primer und zwei nachgelagerte Primer, wenn Kombinationen erforderlich sind.

2. Herstellung von sgRNAs

HINWEIS: Die übliche sgRNA-Gerüstsequenz (Abbildung 1) wurde in ein Plasmid kloniert (Tabelle der Materialien).

  1. Die PCR-Amplifikation der T7-Promotor-sgRNA-Konjugatsequenz erfolgt unter Verwendung von Primern und PCR-Mix, die in Tabelle 2 bzw. Tabelle 3 gezeigt sind. Führen Sie das PCR-Programm in Tabelle 4 aus. Laufgelelektrophorese (Agarosegel, 1,2 % Agarose in TAE-Puffer; TAE-Puffer [Tabelle 1]; 200 V; ca. 5 min) mit 2 μL der PCR-Produkte, um sicherzustellen, dass die Produkte korrekt sind (die MW beträgt ca. 150 bp).
  2. Reinigen Sie die PCR-Produkte mit einem Aufreinigungskit (Table of Materials) oder anderen im Handel erhältlichen Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    HINWEIS: Von nun an sollten RNase-freie Reagenzien und Materialien verwendet werden, und die Verfahren sollten mit besonderer Vorsicht durchgeführt werden, um eine RNase-Kontamination zu vermeiden (siehe Diskussion).
    1. Geben Sie den Bindungspuffer in einem Volumenverhältnis von 5:1 zu den PCR-Produkten und mischen Sie. Tragen Sie die Mischung auf die Säule auf, die in ein 2-ml-Sammelröhrchen gegeben wird. Zentrifugieren Sie bei 17.900 × g für 1 min bei 25 °C. Entsorgen Sie den Durchfluss und setzen Sie die Säule wieder in dasselbe Auffangröhrchen ein.
    2. Geben Sie 750 μl des Waschpuffers in die Säule und zentrifugieren Sie bei 17.900 × g für 1 min bei 25 °C. Entsorgen Sie den Durchfluss und setzen Sie die Säule wieder in dasselbe Auffangröhrchen ein. Zentrifugieren Sie bei 17.900 × g für 2 min bei 25 °C. Legen Sie die Säule in ein sauberes 1,5-ml-Röhrchen.
    3. Geben Sie 20 μl nukleasefreies Wasser in die Säule, zentrifugieren Sie bei 17.900 × g für 2 min bei 25 °C, um die DNA zu eluieren und die Konzentration mit einem Spektralphotometer zu messen.
  3. Verwenden Sie das T7-RNA-Produktionssystem in der Materialtabelle oder gleichwertige Kits, um 250 ng der gereinigten DNA in vitro zu transkribieren. RNase-freie Abläufe und Bedingungen sind erforderlich.
    1. Bereiten Sie die Reaktion in PCR-Röhrchen (RNase-frei) gemäß Tabelle 3 vor und mischen Sie sie vorsichtig. Bei 37 °C in einem Metallbad für 2 h inkubieren.
    2. 0,5 μl DNase I (RNase-frei) zugeben und vorsichtig mischen. Bei 37 °C in einem Metallbad für 15-20 min inkubieren.
    3. Ethanol-Fällung
      1. Fügen Sie jeder Reaktion RNasefreies Wasser hinzu, um das endgültige Volumen auf 20 μl zu erhöhen, und übertragen Sie die Proben in 1,5-ml-Röhrchen.
      2. 50 μl 100 % Ethanol (2,5 V, RNase-frei) zugeben, gut mischen, die Mischung 10 min auf Eis legen und bei 21.000 × g für 15 min bei 4 °C zentrifugieren.
      3. Entsorgen Sie den Überstand, waschen Sie das Pellet mit 500 μl 75 % Ethanol (RNase-frei) und zentrifugieren Sie es bei 21.000 × g für 5 min bei 4 °C.
      4. Entsorgen Sie den Überstand, trocknen Sie das Pellet bei 45 °C in einem Metallbad und lösen Sie es mit 40 μl RNase-freiem Wasser auf.
        HINWEIS: Für KI müssen sgRNAs LiCl-präzipitiert werden (siehe unten), für KO ist dies jedoch nicht erforderlich.
    4. Run Agarose-Gele (Agarose-Gel: 1,2 % Agarose in TAE-Puffer; TAE-Puffer [Tabelle 1]; 200 V; ca. 5 min) mit 1-2 μL der RNA, um die Qualität abzuschätzen und dann die Konzentration mit einem Spektralphotometer zu messen.
      HINWEIS: sgRNAs können zur weiteren Verwendung bei -20 °Cor -80 °C gelagert werden.

3. Herstellung von Cas9-mRNA

  1. Führen Sie den enzymatischen Aufschluss des Cas9-Plasmids (Table of Materials) für mehr als 1,5 h mit XbaI gemäß den Anweisungen des Herstellers durch (zum Reaktionsgemisch siehe Tabelle 3). Test durch Gelelektrophorese (Agarose-Gel: 1,2 % Agarose in TAE-Puffer; TAE-Puffer [Tabelle 1]; 200 V; ca. 10 min) mit 1 μL, um zu überprüfen, ob der Aufschluss gründlich ist.
  2. Aufreinigung der Produkte auf die gleiche Weise wie sgRNA-PCR-Produkte (Schritte 2.2.1-2.2.3). Von hier an sind RNase-freie Materialien und Vorgänge erforderlich.
  3. Verwenden Sie das T3-Transkriptionskit (Table of Materials) oder gleichwertige Kits für die In-vitro-Transkription von Cas9-mRNA.
    1. Bereiten Sie die Reaktion in RNase-freien PCR-Röhrchen gemäß Tabelle 3 vor und mischen Sie vorsichtig. Inkubieren Sie bei 37 °C für mehr als 2,5 h.
    2. 1 μl RNase-freie Turbo-DNase zugeben und 15-20 min bei 37 °C inkubieren.
    3. LiCl-Fällung
      1. Übertragen Sie die Proben in 1,5-ml-Röhrchen, fügen Sie 30 μl LiCl (1,5 V) hinzu und mischen Sie vorsichtig.
      2. Gib die Mischung für ca. 30 min bei -20 °C und zentrifugiere sie dann bei 21.000 × g für 30 min bei 4 °C.
      3. Entsorgen Sie den Überstand, waschen Sie die Pellets mit 500 μl 75 % Ethanol (RNase-frei) und zentrifugieren Sie sie bei 21.000 × g für 5 min bei 4 °C.
      4. Entsorgen Sie den Überstand, trocknen Sie das Pellet bei 45 °C und lösen Sie es in 40 μl RNase-freiem Wasser auf.
  4. Messen Sie die Konzentration der Cas9-mRNA mit einem Spektralphotometer. Run Agarose-Gele (Agarose-Gel: 1,2 % Agarose in TAE-Puffer; TAE-Puffer [Tabelle 1]; 200 V; ca. 10 min) mit 1-2 μL der RNA zur Überprüfung der Konzentration und Qualität.
    HINWEIS: Ein OD 260/280 sollte über 2,0 liegen und die Konzentration sollte bei etwa oder höher als 1000 ng/μl liegen. Cas9-mRNA kann zur weiteren Verwendung bei -20 °Cor -80 °C gelagert werden.

4. Vorbereitung für die Mikroinjektion

  1. Bereiten Sie den Zebrafisch vor: Setzen Sie in der Nacht vor der Mikroinjektion einen gesunden weiblichen Zebrafisch und zwei gesunde männliche Zebrafische in ein Paarungsbecken und trennen Sie die Männchen und Weibchen mit einer Trennwand, um sie auf die Paarung vorzubereiten.
  2. Bereiten Sie 4 % Agarose, Lysepuffer und Embryopuffer (pH 8,0) vor (Tabelle 1).
  3. Bereiten Sie Kapillarglasnadeln für die Mikroinjektion vor (Materialtabelle).
  4. Bereiten Sie Mikroinjektionsplatten vor: Gießen Sie 35 ml der geschmolzenen 4%igen Agarose in eine 10 cm große Petrischale und legen Sie vorsichtig eine Kunststoffform, um keilförmige Tröge zu erzeugen. Vermeiden Sie Luftblasen, indem Sie vorsichtig auf die Form klopfen. Nachdem es fest geworden ist, fügen Sie etwas doppelt destilliertes Wasser (ddw) hinzu und stellen Sie die Platte für die spätere Verwendung auf 4 °C.

5. sgRNA-Effizienztest durch Mikroinjektion

  1. Bereiten Sie am Tag der Mikroinjektion die Mikroinjektionsmischung wie in Tabelle 5 auf Eis unter einer RNase-freien Umgebung zu.
  2. Laden Sie die Mikroinjektionslösung mit einer RNase-freien Pipettenspitze in die Nadel (Materialtabelle). Achten Sie darauf, keine Blasen mitzubringen.
  3. Legen Sie die geladene Nadel in einen Mikromanipulator, der an einem Mikroinjektor befestigt ist. Schneiden Sie die Spitze der Injektionsnadel unter dem Mikroskop mit der spitzen Pinzette ab und kneifen Sie vorsichtig in die Spitze der Nadel, um sie zu brechen. Passen Sie dann den Injektionsdruck an, bis die Nadel konsistent einen 1-nL-Tropfen ausstößt, der mit Hilfe eines Tischmikrometers und einer Kapillare quantifiziert wird.
  4. Entfernen Sie die Trennwand und lassen Sie den Fisch ca. 6 min lang brüten. Entnehmen Sie die Embryonen im 1-Zell-Stadium und übertragen Sie sie in eine Petrischale, die den Embryopuffer enthält.
    1. Untersuchen Sie die Gesundheit der Embryonen unter dem Lichtmikroskop und entfernen Sie unbefruchtete Eizellen oder Ablagerungen. Legen Sie 20 gesunde Embryonen als nicht injizierte Kontrollen in einer separaten Petrischale und auf einem separaten Etikett beiseite.
  5. Übertragen Sie gesunde Embryonen im 1-Zell-Stadium mit einem kleinen Pinsel auf die Rillen der Mikroinjektionsplatte, die auf Raumtemperatur (RT) erwärmt sind, und richten Sie sie vorsichtig aus. Überschüssigen Puffer entfernen.
  6. Führen Sie alle nachfolgenden Vorgänge unter einem Stereomikroskop durch. Stellen Sie mit der Nadelspitze die Position des Embryos vorsichtig so ein, dass der Tierstab zur Nadel zeigt. Injizieren Sie 1 nL der gemischten Lösung in den Tierstab.
  7. Für eine sgRNA ist etwa die Injektion von 100 Embryonen ausreichend. Spülen Sie die Embryonen nach der Injektion vorsichtig in eine Sechs-Well-Platte mit Embryopuffer. Stellen Sie das Gericht in einen 28,5 °C heißen Inkubator mit konstanter Temperatur. Etwa 10 h nach der Befruchtung (hpf) untersuchen Sie die Embryonalentwicklung unter einem Stereomikroskop und entfernen Sie tote Embryonen.
  8. Bei 24 hpf werden die Embryonen in 1,5-ml-Röhrchen für die Genotypisierung entnommen (3 Röhrchen pro sgRNA und 5 Embryonen pro Röhrchen). Entsorgen Sie überschüssiges Wasser vorsichtig mit einer Pipette, geben Sie 100 μl Lysepuffer mit Proteinase K (in einer Endkonzentration von 0,5 mg/ml) in jedes Röhrchen und inkubieren Sie es 1 h lang bei 56 °C und dann 15 Minuten lang bei 95 °C.
  9. 200 μl Ethanol (2 V) hinzufügen, gut mischen und 10 Minuten lang bei RT bei 19.000 × g zentrifugieren.
  10. Entsorgen Sie den Überstand, waschen Sie das Pellet mit 500 μl 70%igem Ethanol und zentrifugieren Sie es bei 19.000 × g für 3 min bei RT.
  11. Der Überstand wird verworfen, das Pellet bei RT getrocknet und mit 50 μl ddw aufgelöst. Verwenden Sie dann 1 μl der Extrakte, um den Reaktionsmix für die PCR vorzubereiten (Tabelle 3) (für PCR-Primer siehe Schritt 1.4).
  12. Run Agarose-Gele (Agarose-Gel: 1,2 % Agarose in TAE-Puffer; TAE-Puffer [Tabelle 1]; 200 V; ca. 10 min) mit 2 μL der PCR-Produkte, um den Erfolg der PCR zu bestätigen, und dann enzymatische Aufschlüsse durchführen (Tabelle 3), um die Effizienz der sgRNAs zu bestimmen. Mischen Sie die enzymatische Aufschlussmischung vorsichtig. Inkubieren Sie bei der vom Hersteller angegebenen Temperatur für den vom Hersteller angegebenen Zeitraum.
  13. Lauf-Agarose-Gele für die verdauten Produkte (Agarose-Gel: 1,2 % Agarose in TAE-Puffer; TAE-Puffer [Tabelle 1]; 200 V; ca. 10 min) mit den nicht verdauten PCR-Produkten als Kontrollen, um zu bestätigen, ob der Aufschluss stattfindet.
    HINWEIS: Die Cas9-Spaltstelle befindet sich etwa 3 bp stromaufwärts der PAM, so dass die Restriktionsenzym-Erkennungsstelle am besten geeignet ist, um 6 bp stromaufwärts der PAM abzudecken. Wenn die sgRNA-Effizienz hoch ist, führen Schneiden und Fehlreparaturen zu Indels, so dass die Wahrscheinlichkeit hoch ist, dass das Restriktionsenzym die Schnittstelle nicht mehr erkennen kann. Wenn die sgRNA ineffizient ist und die Erkennungsstelle des Restriktionsenzyms intakt ist, kann der enzymatische Verdau normal ablaufen. Durch die Agarose-Gelelektrophorese kann man unterscheiden, ob ein enzymatischer Verdau stattgefunden hat.
  14. Wenn es keine geeignete Restriktionsenzym-Erkennungsstelle gibt, sequenzieren Sie die PCR-Produkte und analysieren Sie die sgRNA-Effizienz mit TIDE (https://tide.nki.nl/). Denken Sie daran, PCR durchzuführen und auch WT-Genom-DNA als Kontrolle zu sequenzieren.
    1. Öffnen Sie die Website und klicken Sie auf TIDE starten. Geben Sie die Guide-Sequenz der sgRNA in den Frame unter Guide-Sequenz ein.
    2. Klicken Sie auf Durchsuchen unter Kontrollproben-Chromatogramm (.ab1 oder .scf), um das Sequenzierungsergebnis für das WT-Steuerelement einzugeben, und klicken Sie auf Durchsuchen unter Testbeispiel-Chromatogramm (.ab1 oder .scf), um das Sequenzierungsergebnis für die bearbeitete Probe einzugeben.
    3. Klicken Sie auf Ansicht aktualisieren. Auf der Website wird ein Prozentsatz der Differenz zwischen den beiden Sequenzen angegeben. Ein größerer Prozentsatz deutet auf eine höhere sgRNA-Effizienz hin. Eine sgRNA mit einer Knockout-Effizienz von über 80% eignet sich für nachfolgende KI-Verfahren.

6. Konstruktion von Donorplasmiden für die Markierung fluoreszierender Proteine

  1. Entwerfen Sie Sequenzen, die zuerst in das Plasmid kloniert und dann weiter in das Fischgenom eingefügt werden wie in Abbildung 2: Eine 25-bp-Sequenz stromaufwärts der vorhergesagten Cas9-Spaltstelle ist als linker Homologiearm konzipiert, und eine 25-bp-Sequenz stromabwärts der vorhergesagten Cas9-Spaltstelle ist der rechte Homologiearm. Führen Sie CDS zwischen der sgRNA-Zielstelle und dem Stoppcodon in den Donator ein, um die Integrität des endogenen Gens zu erhalten.
    HINWEIS: Die 5' des komplementären CDS (Element 4 in Abbildung 2) müssen synonym mutiert sein, um eine sekundäre Spaltung des rekombinanten Genoms durch den sgRNA/Cas9-Komplex zu vermeiden.
  2. Verwenden Sie die ligationsunabhängige Klonierung (LIC)14 unter Verwendung von Exonuklease III (Table of Materials) für die Konstruktion des Donorplasmids. Auch andere Methoden, wie z.B. die Gibson-Baugruppe, sind denkbar. Klonierungsprimer sind in Abbildung 2 dargestellt. Die Elemente "1", "2", "3" und "4" werden von den Primern getragen:
    1. Design Primer F1, der aus einer überlappenden Sequenz mit dem Vektor, dem Element "1" und einem Teil des Elements "2" besteht.
    2. Design Primer R2, der aus einem Teil des Elements "1", des Elements "2" und des Elements "3" besteht.
    3. Design Primer F2, der aus den Elementen "3", "4" und der 5'-Sequenz des CDS besteht, die der sgRNA-Zielstelle folgt.
    4. Design Primer R1, der aus der 3'-Sequenz des CDS des Gens und einer überlappenden Sequenz mit dem Vektor besteht.
    5. Verwenden Sie Zebrafisch-cDNA als Template und führen Sie PCRs mit den Primern durch.
      HINWEIS: Die empfohlene Überlappung zwischen den Primern oder zwischen dem Primer und dem Vektor beträgt 15-20 bp. Diese Primer sind zielgenspezifisch, und ein Beispiel für die Primer für cx39.9 und cx44.1 ist in Tabelle 2 aufgeführt. Dieses Design wurde erfolgreich angewendet, wie zuvor beschrieben13. Detaillierte Plasmidkarten sind in den Zusatzdateien 1 und 2 enthalten. Die designten DNA- und Proteinsequenzen von cx39.9 und cx44.1 sind in der Zusatzdatei 3 enthalten.
    6. Reinigen Sie die PCR-Produkte auf die gleiche Weise wie sgRNA-PCR-Produkte (Schritte 2.2.1-2.2.3).
  3. Verdauen Sie den Donorvektor (Abbildung 3 und Tabelle 6) durch geeignete Restriktionsenzyme. In diesem Beispiel sind die Enzyme PciI und Acc65I (Table of Materials). Führen Sie die gemäß den Anweisungen des Herstellers durch (Tabelle 3). Reinigen Sie den verdauten Donorvektor auf die gleiche Weise wie bei sgRNA-PCR-Produkten (Schritte 2.2.1-2.2.3).
  4. Quantifizierung der gereinigten PCR-Fragmente und des verdauten Donorvektors durch DNA-Gelelektrophorese (DNA-Gel: 1,2 % Agarose in TAE-Puffer; TAE-Puffer [Tabelle 1]; 200 V; ca. 10 min). Bereiten Sie das Reaktionsgemisch für LIC gemäß Tabelle 3 vor.
    HINWEIS: Alle Röhrchen und Komponenten der Reaktion sollten auf Eis gelegt werden, und die Reaktion und alle Manipulationen sollten auf Eis durchgeführt werden. Geben Sie 1 μl Exo III (20 Einheiten) als letzte Komponente in die Reaktion und pipettieren Sie dann sofort auf und ab, um alle Komponenten gut zu vermischen. Denken Sie daran, einen Reaktionsmix ohne PCR-Fragmente als Kontrolle einzuschließen, um das Potenzial der Selbstglühung des verdauten Vektors zu zeigen.
  5. Sofort die Reaktionsmischung auf Eis legen und 60 min inkubieren.
  6. 1 μl 0,5 M EDTA (pH 8,0) hinzufügen, um die Reaktion zu stoppen, auf und ab pipettieren, um gut zu mischen, und dann 5 Minuten lang bei 60 °C und dann 5 Minuten lang auf Eis inkubieren.
  7. Transformieren Sie kompetente Zellen, wie z. B. das DH5α, mit den LIC-Produkten und züchten Sie die Bakterien auf LB-Platten (Materialtabelle und Tabelle 1) mit geeigneten Antibiotika (in diesem Fall Ampicillin) für 16 Stunden.
  8. Stellen Sie sicher, dass es Größenordnungen Unterschiede zwischen der Anzahl der Kolonien auf den PCR-Fragment-haltigen Platten und der auf der Kontrollplatte gibt. Wählen Sie einzelne Kolonien aus den LIC-Platten für die enzymatische Verdauungsanalyse und DNA-Sequenzierung aus.
  9. Extrahieren und reinigen Sie korrekte Spenderplasmide mit einem Aufreinigungskit auf die gleiche Weise wie bei sgRNA-PCR-Produkten (Schritte 2.2.1-2.2.3). Stellen Sie sicher, dass die Endkonzentration über 300 ng/μL liegt.

7. Mikroinjektion von Zebrafischembryonen für das Gen KI

  1. Führen Sie alle oben beschriebenen Mikroinjektionsmanipulationen durch, mit Ausnahme der Zubereitung der Mikroinjektionslösung gemäß Tabelle 7.

8. Screening und Identifizierung von fluoreszierenden Protein-markierten Nachkommen

  1. Beobachten Sie die Fluoreszenz unter einem Stereofluoreszenzmikroskop 12-48 h nach der Mikroinjektion.
  2. Wenden Sie eine neu eingeführte Rastermethode13 an. Wenn eine offensichtliche Fluoreszenz beobachtet wird, wählen Sie die fluoreszierenden Larven aus und ziehen Sie sie auf. Wenn nur eine Spur von Fluoreszenz oder gar keine Fluoreszenz beobachtet wird, ziehen Sie alle injizierten Larven auf.
  3. Im Alter von 1 Monat wird der mikroinjizierte Zebrafisch mit 0,02 % Tricain anästhesiert (Tabelle 1). Sammeln Sie für jeden Zebrafisch ein kleines Stück der Schwanzflosse in ein beschriftetes PCR-Röhrchen und bewahren Sie den entsprechenden anästhesierten Zebrafisch in einer Vertiefung einer Sechs-Well-Platte auf, die UV-sterilisiertes gefiltertes Wasser (pH 7,2) mit demselben Etikett enthält.
  4. Für die genomische DNA-Extraktion ist die alkalische Lysemethode (Lysepuffer in Tabelle 1)15 zu verwenden, gefolgt von der 5'-Übergangs-PCR. Entwerfen Sie den vorderen Primer stromaufwärts des linken Homologiearms und den umgekehrten Primer auf dem Einsatz (Abbildung 4). Die Größe des PCR-Produkts liegt bei etwa 500 bp. Beispiele für die Grundierungen finden Sie in Tabelle 2.
    HINWEIS: Für den fluoreszierenden Zebrafisch wird diese PCR verwendet, um die Genauigkeit der KI zu überprüfen, sodass das PCR-Produkt dann einer Sequenzierung unterzogen wird. Bei Zebrafischen ohne Fluoreszenz wird diese PCR verwendet, um zu verifizieren, ob KI auftritt. Wählen Sie die PCR-positiven Fische aus und heben Sie sie als F0 zum Erwachsenenalter auf.
  5. Untersuchen Sie F1-Embryonen , die aus der Verpaarung des gescreenten F0 mit WT auf GFP-Expressionsmuster gewonnen und durch Junction-PCR genotypisiert wurden.
    HINWEIS: Wenn die Zielinsertion in F1 erfolgt (ob perfekt oder nicht), wird das entsprechende F0 als vererbbares F0 definiert, dessen PCR-Produkt dann sequenziert wird. Wenn das Einfügen genau ist, wird das entsprechende F0 als das gewünschte F0 definiert.
  6. Wenn das gewünschte F0 erreicht ist, verwenden Sie den Nachkommen für die Bildgebung, um das Zielprotein zu beobachten und zu verfolgen.

9. Bildgebung und Datenverarbeitung

  1. Bestimmen Sie das Entwicklungsstadium, das abgebildet werden soll. Bereiten Sie den Fisch im Voraus zu. Geben Sie verdünntes 1-Phenyl-2-thioharnstoff (PTU; 0,003 %, Materialtabelle) zu den Fischen, um die Pigmente bei Bedarf zu entfernen.
    HINWEIS: PTU wäre weniger wirksam, wenn sie nach 24 hpf angewendet wird. In diesem Beispiel wurde PTU vor 24 hpf zum Embryopuffer hinzugefügt und bis zu 48 hpf im Puffer gehalten, als die Zebrafischlarven für die Bildgebung verarbeitet wurden.
  2. 2 ml geschmolzene 4%ige Agarose (Tabelle 1) in eine 35-mm-Schale geben und zum Erstarren beiseite stellen. Den Fisch in den Embryopuffer mit 0,02 % Tricain überführen (Tabelle 1).
  3. 200 μl geschmolzene 4%ige Agarose in 1 mL ddw verdünnen. Übertragen Sie den anästhesierten Fisch mit einer 1-ml-Pipette in die verdünnte Agarose, wenn die Agarose abkühlt. Die in Schritt 9.2 zubereitete Agarose vorsichtig mischen und in die Schüssel mit verfestigtem 4%igem Agarosegel geben.
  4. Positionieren Sie den Fisch so, dass sich der interessierende Teil oben befindet.
  5. Verwenden Sie für die Bildgebung und Datenverarbeitung ein aufrechtes konfokales Fluoreszenzmikroskop gemäß den Anweisungen des Herstellers (Materialtabelle).

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Ergebnisse

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Gap Junctions, die aus polymeren Proteinen, den Connexinen, bestehen, sind essentiell für den Austausch von niedermolekularen Metaboliten und Ionen zwischen Kontaktzellen. Die oben beschriebene Methode zur Fluoreszenz-Proteinmarkierung wurde zur Markierung von Connexin 39.9 (Abbildung 5A) bzw. Connexin 44.1 (Abbildung 5B) verwendet. Die korrekte KI wurde durch Junction-PCRs verifiziert (Abbildung 6). In Übereinstim...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Um dieses Experiment reibungslos und erfolgreich durchzuführen, sollte man einigen wichtigen Aspekten mehr Aufmerksamkeit schenken. Das optimale Entwicklungsstadium des Zebrafisches für die Injektion sollte das Einzelzellstadium sein. Durch den Abschluss der Injektion in diesem Stadium kann sichergestellt werden, dass alle Zellen, die durch nachfolgende Teilung produziert werden, die notwendigen Komponenten für die KI enthalten, wodurch die Wahrscheinlichkeit des gleichzeitigen Auftreten...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle Autoren erklären in dieser Arbeit keine konkurrierenden Interessen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken Lu Zhou (Universität Xiamen) für das Korrekturlesen und Lektorat dieses Manuskripts. Diese Arbeit wurde unterstützt von der National Natural Science Foundation of China (Stipendium 82388201 an J.H.; Stipendium 31801158 an Y.Z.), dem National Key R&D Program of China (2020YFA0803500 an J.H.), dem CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (CIFMS) (2019-I2M-5-062 an J.H.), dem Fujian Province Central to Local Science and Technology Development Special Program (2022L3079 an J.H.), und das FuXia-Quan Zi-Chuang District Cooperation Program (3502ZCQXT2022003 an J.H.). Die Geldgeber spielten keine Rolle beim Studiendesign, bei der Datenerhebung und -analyse, bei der Veröffentlichungsentscheidung oder bei der Erstellung von Manuskripten.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1000 &Mikro; L  TippsJede MarkeN/AFür alle Manipulationen
1,5 mL RöhrchenJede MarkeN/AFür die Lagerung und Zentrifugation verschiedener Lösungen
1,5 mL Röhrchen (RNase-frei)Jede MarkeN/AFür die Lagerung und Zentrifugation von RNase-freien Lösungen
10 & Mikro; L SpitzenJede MarkeN/AFür alle Manipulationen
10 & Mikro; L-Spitzen (RNase-frei)Jede MarkeN/AFür RNase-freie Manipulationen
1000 & Mikro; L  Spitzen (RNase-frei)Jede MarkeN/AFür RNase-freie Manipulationen
1-Phenyl-2-thioharnstoff (PTU)SigmaP7629Zur Hemmung der Melanogenese und zur Transparenz der Larven
200 & Mikro; L SpitzenJede MarkeN/AFür alle Manipulationen
200 & Mikro; L-Spitzen (RNase-frei)JedeMarkeN/AFür RNase-freie Manipulationen
2x Taq Plus Master Mix II (Dye Plus)VazymeP213-03PCR für sgRNA-Effizienztests
35-mm-SchalenCorning430165Für die Bildgebung
von 6-Well-PlattenJede MarkeN/AFür die individuelle und vorübergehende Aufzucht von Zebrafischen
Acc65INEBR0599SFür enzymatischer Aufschluss
EssigsäureSigma695092Für die Herstellung von TAE-Puffern
AgarBiofroxx8211GR500Für LB-Platten
Ampicillin, NatriumsalzSangonA610028Für LB-Platten
CaCl2SigmaC5080Für die Vorbereitung von Embryopuffern
KapillarröhrchenHarvard Apparatus30-0016Für Geneating-Nadeln für Injektionskanülen
KapillarröhrchenBeliebigeMarkenkennung (Innendurchmesser) = 0,1 mmZur Quantifizierung eines 1-nL-Tröpfchens
CRISPRscanCRISPRscan  http://www.crisprscan.org/Für das sgRNA-Design
DH5αTIANGENCB101Für die Transformation
EDTASigmaE6758Für die Vorbereitung von Lysepuffer und TAE-Puffern
Ensembl Ensemblnbsp; https://asia.ensembl.org/Danio_rerio/Info/IndexUm Geninformationen zu finden
EthanolHUSHI64-17-5Für die DNA-Reinigung und -Extraktion
Exonuklease IIITakara2170ALIC
Gasbetriebener MikroinjektorWarner InstrumentsPLI-100AFür Mikroinjektion
GelelektrophoresesystemWIXWIX-EP3000Für Gel Elektrophorese
HandschuheJede MarkeN/AFür alle Manipulationen
Glukosesgdbio10010518Für LB-Platten
GlycerinSangonA501745Für LB-Platten
gRNA-pMD19-TChina Zebrafish Resource Center (CZRC)CZP3sgRNA-Plasmid mit sgRNA-Gerüst
KClSigmaP5405Für Embryo Puffervorbereitung
Lithiumchlorid-FällungslösungThermofisherAM9480Fällung von sgRNAs, RNase-frei
Agarose mit niedrigem SchmelzpunktSangonA600015Zur Herstellung von 4% Agarose-Gelen
Magnesiumsulfatsgdbio20025118Für LB-Platten
MetallbadJede MarkeN/AFür Inkubation bei konstanter Temperatur
MethylenblauSigmaM9140Für die Vorbereitung von Embryopuffern
MikroinektionsformHausgemachtN / AZum Generieren von Rillen zum Halten von Embryonen während der Mikroinjektion
Microloader, Spitze zum Befüllen von Femtotips und anderen Glasmikrokapillaren, steril, 0,5 – 20 & Mikro; L, 100 mm, hellgrau, 192 Stk. (2 Körbe & mal; 96 Stk.)Eppendorf5242956003Zum Laden der Mikroinjektionslösung in die Injektionsnadel, RNasefreier
MikropipettenabzieherSutter InstrumentP-97Zum Erzeugen von Injektionsnadeln
MikropipettenEppendorfN/AFür alle Manipulationen
MikrowelleJede MarkeN/AZum Gießen von Injektionsplatten und Agarosegelen
MinElute PCR Aufreinigungskit (50)QIAGEN28004Zur Aufreinigung von PCR-Produkten und Aufschlussprodukten, RNase-freie
mMESSAGE mMACHINE T3 TranskriptionskitInvitrogenAM1348In-vitro-Transkription von Cas9 mRNA, RNase-frei
N2Jede MarkeN/AFür Mikroinjektion
NaClSigmaS5886Für die Vorbereitung von Embryopuffer und Lysepuffern
NaHCO3SigmaS5761Für die Vorbereitung von Embryopuffern
NaOHSangonA100173Für die Vorbereitung von TAE-Puffern
Nukleasefreies WasserThermofisherR0581RNA-bezogene Manipulationen, RNase-freies
PciINEBR0655SFür enzymatische Aufschluss-PCR-Maschinen
Jede MarkeN/APCR-Amplifikation
PCR-StreifenröhrchenJede MarkeN/AFür PCR
PCR-RöhrchenFEITONGKANGblp-200Für PCR
PetrischaleJede MarkeN/AFür die Aufzucht von Zebrafischlarven usw.
PhenolrotSigmaP0290Für Mikroinjektionen, RNasefreier
PipettenhalterWarner InstrumentsPLI-PH1Für Mikroinjektionen
PrimeStar (Premix)TakaraDR040AFür die molekulare Klonierung
Proteinase KMerck539480Für die Extraktion genomischer DNA
pT3TS (T3:zCas9-UTRglobin)China Zebrafish Resource Center (CZRC)CZP11Cas9 Plasmid-Template
Gekühlte ZentrifugeJede MarkeN/AFür RNA-bezogene Zentrifugation
WaageSartoriusBCE124-1CCNZum Gießen von Injektionsplatten und Agarose-Gelen
SchereJede MarkeN/AZum Scheren von adulten Fischschwänzen
SDSSangon A600485Zur Vorbereitung
von LysepuffernKleine BürstenJede MarkeN/AFür sanft bewegte Embryonen auf Mikroinjektionsplatten
SpektralphotometerThermofisherNanoDrop 2000Für DNA/RNA-Konzentrationsmessungen
TischmikrometerJede MarkeDIV (Division) = 0,01 mmFür die Quantifizierung eines 1-nL-Tröpfchens
Stereo-FluoreszenzmikroskopOlympusSZX16Für die Beobachtung der Genexpression
StereomikroskopMoticSMZ-168Für Beobachtung und Mikroinjektion
T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production SystemPromegaP1320In-vitro-Transkription von sgRNAs, RNase-frei
Temperaturgesteuerter InkubatorJede MarkeN/AFür die Inkubation von Embryonen
TIDETIDE https://tide.nki.nl/sgRNA-Effizienz 
Tricain-MethansulfonatSigmaA5040Für die Zubereitung von Tricain-Lösungen
TrisSangonA600194Für Tricain-Lösung, Lysepuffer und TAE-Puffer-Zubereitung
TryptonOXOIDLP0042Für LB-Platten
PinzetteJede MarkeN/AZum Schneiden von Injektionsnadeln
XbaINEBR0145SFür enzymatische Aufschluss
HefeextraktOXOIDLP0021Für LB-Platten
Zebrafisch-AquariensystemESEN ESEN-AW-S1Für die Aufzucht von erwachsenen Fischen
Zebrafisch-Paarungsbecken (mit Trennwand)Jede MarkeN/AFür die Verpaarung der
Fische Zeiss LSM 900+Airyscan2ZEISSZeiss LSM900Für die konfokale Bildgebung von fluoreszenzmarkierten Fischen und die Datenanalyse
ZFIN-WebsiteZFINhttp://zfin.org/Um Geninformationen zu finden
& Für die Analyse der

Referenzen

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Zebrafisch ImagingCRISPR Knock inGen TaggingMikroinjektion beim ZebrafischsgRNA DesignKonstruktion von Donor PlasmidenLive Imaging beim ZebrafischProtein Tracing

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