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Methodenartikel

Nachweis einer Helicobacter pylori-Infektion und Antibiotikaresistenz mittels Stuhl-Quantitativer Polymerase-Kettenreaktionsanalyse

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DOI:

10.3791/67710

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16. Mai 2025

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1Guangdong Provincial People's Hospital (Guangdong Academy of Medical Sciences), Southern Medical University, 2Medical Technology School, Xuzhou Medical University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das Protokoll verwendet eine nicht-invasive Stuhlprobenahme in Kombination mit einer quantitativen Polymerase-Kettenreaktion, um eine bequeme und schnelle Diagnosemethode für eine Helicobacter-pylori-Infektion und ihre Resistenz gegen Clarithromycin und Chinolone zu bieten.

Zusammenfassung

Helicobacter pylori (H. pylori) ist weltweit weit verbreitet, wobei etwa 50 % der Weltbevölkerung eine Vorgeschichte von H. pylori-Infektionen haben . In China liegt die Infektionsrate zwischen 40 und 70 Prozent. H. pylori wird hauptsächlich mit Magen-Darm-Erkrankungen wie chronischer Gastritis, Magengeschwüren und Zwölffingerdarmgeschwüren in Verbindung gebracht. Derzeit umfasst die klinische Behandlung einer H. pylori-Infektion entweder eine Dreifach- oder eine Vierfachtherapie. Der umfangreiche Einsatz von Antibiotika hat jedoch zur Entwicklung von Antibiotikaresistenzen bei H. pylori geführt. Daher ist der Nachweis sowohl von H. pylori als auch seiner Antibiotikaresistenz entscheidend für die klinische Behandlung.

Zu den diagnostischen Methoden für H. pylori gehören der Harnstoff-Atemtest (UBT), der Antigentest, der serologische Antikörpertest, die Endoskopie, der Urease-Schnelltest (RUT) und die Bakterienkultur. Die ersten drei Methoden sind zwar nicht-invasiv, ermöglichen jedoch keine bakterielle Erholung und können daher nicht für Resistenztests verwendet werden. Die drei letztgenannten Methoden sind invasiv, teuer, erfordern ein hohes technisches Know-how und können den Patienten schaden.

Daher ist eine nicht-invasive, schnelle Methode zum gleichzeitigen Nachweis einer H. pylori-Infektion und einer Antibiotikaresistenz von größter klinischer Bedeutung für die effektive Eradikation von H. pylori. Ziel dieser Arbeit ist es, ein spezifisches Protokoll vorzustellen, das die quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) mit der TaqMan-Fluoreszenzsondentechnologie kombiniert, um eine H. pylori-Infektion und Antibiotikaresistenz schnell nachzuweisen. Diese Methode bietet im Gegensatz zu herkömmlichen Bakterienkulturen und anderen Techniken eine bequeme, schnelle und nicht-invasive Methode zur Diagnose von H . pylori-Infektionen und -Resistenzen. Die qPCR wird verwendet, um die Infektion zu identifizieren und Mutationen in den Genen 23S rRNA und gyrA nachzuweisen, die mit einer Resistenz gegen Clarithromycin bzw. Chinolone verbunden sind. Im Vergleich zu herkömmlichen Kulturtechniken bietet dieser Ansatz eine nicht-invasive, kostengünstige und zeiteffiziente Methode zum Nachweis einer Helicobacter pylori-Infektion und zur Bestimmung ihrer Antibiotikaresistenz.

Einleitung

Helicobacter pylori ist ein gramnegatives, spiralförmiges Bakterium, das das menschliche Magenepithel persistent infizieren kann1. Im Jahr 1994 stufte die Weltgesundheitsorganisation H. pylori als Karzinogen der Gruppe 1 für Magenkrebs ein, wobei ~3% der infizierten Personen letztendlich die Krankheitentwickelten 2. Eine kürzlich veröffentlichte systematische Übersichtsarbeit hat gezeigt, dass in den letzten zehn Jahren ein allgemeiner Trend zu einer erhöhten Antibiotikaresistenzrate von H. pylori beobachtet wurde, die weltweit ein alarmierendes Niveau erreicht hat, insbesondere die Clarithromycin-Resistenz3. In China zeigten die neuesten Umfragedaten, dass die Gesamtprävalenz von H. pylori unter städtischen Chinesen 27,08 % beträgt; Die Resistenzraten für Clarithromycin und Levofloxacin lagen bei 50,83 % und 47,17 %4 und sind damit höher als in den Vereinigten Staaten (Levofloxacin 37,6 %, Clarithromycin 31,5 %)5und Europa (Levofloxacin 15,8 % und Clarithromycin 21,4 %)6. Daher ist eine frühzeitige und genaue Diagnose und Behandlung von entscheidender Bedeutung. Die zunehmende Antibiotikaresistenz von H. pylori verringert jedoch die Wirksamkeit der Behandlung erheblich, was den dringenden Bedarf an kontinuierlicher Forschung zu Diagnose und Behandlung unterstreicht.

Die diagnostischen Methoden von H. pylori werden in invasive und nicht-invasive Techniken eingeteilt7. Zu den invasiven Methoden gehören die histopathologische Untersuchung, der Urease-Schnelltest (RUT) und die Bakterienkultur8. Die histopathologische Untersuchung beruht auf der Verarbeitung und mikroskopischen Beobachtung von Biopsieproben, wobei die Genauigkeit durch histologische Vorbereitung und pathologische Expertise begrenzt ist9. RUT weist H. pylori durch die Aktivität von Urease nach, die Harnstoff zu Ammoniak hydrolysiert, was zu einer alkalischen Verschiebung des Reagenzes führt, was auf das Vorhandensein des Bakteriumshinweist 9. Es ist einfach und kostengünstig. Bakterienkulturen, die als "Goldstandard" gelten, haben aufgrund der einzigartigen physiologischen Eigenschaften von H. pylori10 oft eine Erfolgsquote von unter 50 %.

Zu den nicht-invasiven Methoden gehören der 13C/14C-Harnstoff-Atemtest (UBT), die serologische Diagnostik und der Stuhlantigen-Test (SAT)11. Der Atemtest funktioniert nach einem ähnlichen Prinzip wie der RUT und weist isotopenmarkiertes CO2 in der Ausatemluft nach, um eine Infektion zu bestätigen12. In der serologischen Diagnose werden Antikörper nachgewiesen, die nach der bakteriellen Eradikation bestehen bleiben können, was die Beurteilung der Wirksamkeit der Behandlung erschwert13. Stuhlantigentests weisen H. pylori-spezifische Antigene in Stuhlproben nach und bieten eine zuverlässige nicht-invasive Methode mit einer geringeren Rate falsch positiver Ergebnisse und einer guten Genauigkeit bei der Diagnose aktiver Infektionen14.

Jedes Diagnoseverfahren hat seine Vor- und Nachteile15. Abgesehen von der Bakterienkultur haben andere Methoden Schwierigkeiten, Antibiotikaresistenzen nachzuweisen, während die Kultur durch niedrige Erfolgsraten behindert wird16. In jüngster Zeit werden molekulardiagnostische Methoden wie die quantitative Echtzeit-PCR (qPCR) in großem Umfang für den mikrobiellen Nachweis eingesetzt17. Die qPCR kann H. pylori genau nachweisen und Resistenzgenmutationen analysieren, was einen umfassenderen Überblick über die Infektion bietet18.

Fluoreszierende Sonden sind so konzipiert, dass sie während des qPCR-Prozesses spezifisch an eine Zielsequenz in der DNA binden. Diese Sonden sind in der Regel mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert, der ein Signal aussendet, wenn die Sonde an ihr Ziel bindet und während der Amplifikation von der Polymerase gespalten wird. Dies ermöglicht eine Echtzeit-Messung des PCR-Prozesses. Fluoreszierende Sonden sind bekannt für ihre hohe Spezifität aufgrund des einzigartigen Designs der Sonde, das sicherstellt, dass nur die Ziel-DNA-Sequenz nachgewiesen wird, wodurch die Wahrscheinlichkeit einer unspezifischen Bindung verringert und die Assay-Spezifität verbessert wird. Dies macht die Fluoreszenzsondentechnologie besonders nützlich für den Nachweis von Zielen mit geringer Abundanz, wie z. B. Helicobacter pylori-DNA in Stuhlproben. Obwohl SYBR Green ein häufig verwendeter DNA-bindender Farbstoff in der PCR ist, kann er an jede doppelsträngige DNA binden, was zu unspezifischer Amplifikation und falsch positiven Ergebnissen führen kann.

Die Kultivierung von Helicobacter pylori aus klinischen Proben liefert keine direkten Daten zur Antibiotikaresistenz. Im Gegensatz dazu ist die auf Fluoreszenzsonden basierende qPCR schneller, bequemer und kann für den gleichzeitigen Nachweis von H. pylori und Antibiotikaresistenzmarkern angepasst werden. Diese Methode liefert nicht nur schnellere Ergebnisse als herkömmliche Kultivierungsmethoden, sondern ermöglicht auch den gleichzeitigen Nachweis von Antibiotikaresistenzgenen, was die Nachweiseffizienz und den Komfort erheblich verbessert. Diese Methode bietet im Gegensatz zu herkömmlichen Bakterienkulturen und anderen Techniken eine bequeme, schnelle und nicht-invasive Methode zur Diagnose von H . pylori-Infektionen und -Resistenzen.

Es gibt zwei entscheidende Aspekte, die bei der Antibiotikaresistenz von H. pylori berücksichtigt werden müssen: i) die Konsistenz von Genotyp und Phänotyp, ii) die Multiresistenz. Eine groß angelegte multizentrische Studie in China ergab, dass die dualen Resistenzmuster für Clarithromycin/Levofloxacin 26,1 % betrugen. Clarithromycin- und Levofloxacin-resistente H-pylori-Phänotypen und -Genotypen zeigten eine zufriedenstellende Übereinstimmung (Kappa-Koeffizient = 0,810 bzw. 0,782)19. Daher ist es möglich, die qPCR-Methode zum Nachweis einer H. pylori-Infektion und Arzneimittelresistenz zu verwenden. Stuhlantigen-Test (SAT) und qPCR-Methoden werden aufgrund der Bequemlichkeit der Probenahme zunehmend eingesetzt. Die Sensitivität, Spezifität und Genauigkeit der Methoden zum Nachweis von H. pylori sind wie folgt: qPCR > UBT > SAT > RUT> CagA IgG > Kultur20. Alle nicht-invasiven Methoden sind für das Primärscreening geeignet. Da qPCR zusätzlich Arzneimittelresistenzgene nachweisen kann, sind qPCR und Kultur besser geeignet, um die Behandlung zu steuern.

Andere innovative Ansätze, wie z.B. Algorithmen der künstlichen Intelligenz (KI) in Kombination mit endoskopischen Bildern21, digitale Mikrofluidik22 und RPA-CRISPR/Cas12a23, zeigen theoretisch eine gute diagnostische Effizienz und vielversprechende Anwendungsperspektiven. Die qPCR ist jedoch derzeit die ausgefeilteste molekularbiologische Technik mit dem Potenzial, eine überlegene Lösung für die Diagnose und Behandlung von H. pylori-Infektionen zu bieten.

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Protokoll

Diese Studie hält sich an die ethischen Richtlinien, die von der Ethikkommission des Volkskrankenhauses der Provinz Guangdong der Southern Medical University, Guangzhou, China, festgelegt wurden (Zulassungsnummer: KY2024-445-01). Detaillierte Informationen zu den in dieser Forschung verwendeten Materialien (Reagenzien, Chemikalien, Geräte und Software) finden Sie in der Materialtabelle.

1. Auswahl der Teilnehmer

  1. Wählen Sie Teilnehmer im Alter von 18 bis 60 Jahren.
  2. Wählen Sie Teilnehmer aus, die sich einem Helicobacter-pylori-Infektionsscreening unterziehen können, wie z. B. Patienten mit Symptomen wie Gastritis, Magengeschwüren oder Dyspepsie, sowie asymptomatische Personen.
  3. Schließen Sie Patienten aus der Studie aus, die innerhalb des letzten Monats Antibiotika, Wismut-haltige Mittel (wie Kalium-Wimutcitrat-Kapseln, kolloidale Wismut-Pektin-Kapseln oder Wismut-Aluminium-Verbindungstabletten) oder antimikrobielle chinesische Arzneimittel eingenommen haben, oder Patienten, die innerhalb der letzten 2 Wochen Protonenpumpenhemmer oder H2-Rezeptorantagonisten (wie Omeprazol, Pantoprazol, Rabeprazol, Cimetidin oder Nizatidin) eingenommen haben. Schließen Sie auch Frauen während ihrer Menstruation von der Studie aus.

2. Entnahme von Kotproben

HINWEIS: Geben Sie den Teilnehmern Abschnitt 2 als Anweisungen.

  1. Vergewissern Sie sich, dass die Außenverpackung des Probenahmekits unbeschädigt ist und das Verfallsdatum abgelaufen ist. Entfernen Sie die Materialien aus dem Kit.
  2. Legen Sie ein weißes Kotauffangpapier in die Toilettenschüssel und entleeren Sie den Stuhl (um eine Kontamination mit Urin zu vermeiden).
  3. Mit einem Spatel eine Portion Kot in der Größe einer Saubohne (~5 g) auffangen und in den Probenbehälter umfüllen.
  4. Legen Sie den Probenahmespatel zusammen mit der Kotprobe in das Entnahmeröhrchen und stellen Sie sicher, dass der Flüssigkeitsstand in die Nähe der auf dem Röhrchen angegebenen Probenahmelinie ansteigt.
  5. Ziehen Sie die Tubenkappe fest an. Drehen Sie das Röhrchen mehrmals um, um eine gründliche Durchmischung der Probe mit der Konservierungslösung zu gewährleisten.
  6. Lagern Sie die Probe bis zur Übergabe an das klinische Labor im Kühlschrank, um die anschließende Identifizierung von H. pylori und die Bewertung von Antibiotikaresistenzprofilen mittels qPCR durchzuführen.

3. Nukleinsäure-Extraktion

HINWEIS: Führen Sie alle Verfahren in einer Biosicherheitswerkbank durch, um eine Kontamination zu vermeiden.

  1. Drehen Sie das Konservierungsröhrchen um und mischen Sie es gründlich. Übertragen Sie 1,0 mL der Stuhlprobenlösung in ein Mikrozentrifugenröhrchen.
  2. Nach dem Mischen werden die Zentrifugenröhrchen 10 Minuten lang bei 80 °C in ein Metallbad gelegt, wobei in der fünften Minute 30 s lang intermittierend gemischt wird. Sobald die Röhrchen auf Raumtemperatur abgekühlt sind, zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei 10.000 × g und sammeln den Überstand für die weitere Verarbeitung.
  3. Drehen Sie die 96-Well-Platte mehrmals um, um die magnetischen Beads wieder zu resuspendieren. Entfernen Sie vorsichtig die Versiegelung der Aluminiumfolie und achten Sie darauf, dass sie nicht wackelt, um ein Verschütten zu verhindern.
  4. 200 μl der vorbereiteten Probe (aus Schritt 3.2) in jede Vertiefung der 96-Well-Platte mit Lysepuffer geben, wobei darauf zu achten ist, dass jede Vertiefung einer einzelnen Probe entspricht. Setzen Sie die 96-Well-Platte zur automatischen Extraktion in das dafür vorgesehene Probenfach des Nukleinsäure-Extraktionsgeräts ein.
  5. Lagern Sie alle verbleibenden Proben und die extrahierten Nukleinsäureproben bei -20 °C für die Langzeitkonservierung und zukünftige Verwendung.

4. qPCR: Nachweis von Helicobacter pylori-Nukleinsäuren und Resistenzmutationen gegen Clarithromycin und Chinolone

  1. Entnehmen Sie die Reagenzien aus dem Reagenzienlager und tauen Sie sie bei Raumtemperatur auf.
    HINWEIS: Dieses Kit wurde für den qualitativen Nachweis von H. pylori-Nukleinsäuren verwendet, einschließlich Mutationen im 23S rRNA-Gen (A2143G, A2143C, A2144G) und im gyrA-Gen (261A, 261G, 260T, 271A, 271T, 272G). Die Primer, die Sonden, das Taq-Enzym, das UNG-Enzym und die dNTPs waren im Kit verfügbar. Die Zielgene von H. pylori und humanem β-Aktin wurden in die positive Qualitätskontrolle einbezogen. Als interne Qualitätskontrolle wurde das humane β-Aktin-Gen gewählt.
  2. Basierend auf der Anzahl der zu testenden Proben verwenden Sie N + 2 Kopien des lyophilisierten Reagenzes, wobei N für die Anzahl der zu testenden Proben und 2 für die negativen und positiven QCs steht.
  3. Kurz zentrifugieren, um sicherzustellen, dass sich das lyophilisierte Pulver am Boden der Röhrchen absetzt. Öffnen Sie den Deckel des lyophilisierten Reagenzes (achten Sie darauf, dass das Pulver nicht verschüttet wird) und fügen Sie 25 μl der extrahierten Nukleinsäuren aus den zu testenden Proben sowie der Positiv- und Negativkontrolle pro Vertiefung hinzu. Verschließen Sie die Tuben fest.
  4. Die PCR-Reagenzien 8-10 s lang vortexen, dann 3-5 s kurz zentrifugieren, um Blasenbildung zu vermeiden.
  5. Setzen Sie die 96-Well-qPCR-Platte auf das qPCR-Gerät ein. Stellen Sie das Zyklusprogramm wie folgt ein: Inkubieren Sie zuerst das Reaktionsgemisch (mit Primern, Sonden, Taq-Polymerase, UNG-Enzym, dNTPs usw.) bei 42 °C und 95 °C (beide Schritte in einem Zyklus) für 2 Minuten; dann 10x mit 10 s bei 95 °C und 45 s bei 65 °C durchdrehen; Zum Schluss wird der 35-fache Zyklus mit 10 s bei 95 °C und 45 s bei 58 °C zum Denaturieren, Glühen und Verlängern durchgeführt.
  6. Stellen Sie die Parameter für die Detektion von Fluoreszenzsignalen wie folgt ein: ROX-Fluoreszenzmarkierung von H. pylori-konservierten Genen; FAM-Fluoreszenzmarkierung von H. pylori-Clarithromycin-Resistenzgenen; HEX-Fluoreszenzmarkierung von H. pylori-Chinolon-Resistenzgenen; und die CY5-Fluoreszenzmarkierung des menschlichen β-Aktin-Gens wurden als interne Kontrolle des Kits verwendet. Erfassen Sie Daten bei 58 °C. Stellen Sie nach Abschluss der Reaktion sicher, dass die Daten für zukünftige Analysen gespeichert werden.
  7. Analysieren Sie die Daten mit qPCR-spezifischer Software, da das Gerät automatisch den Ausgangsschwellenwert auswählt. Alle diagnostischen Kriterien, einschließlich des Vorhandenseins einer Helicobacter-pylori-Infektion oder -Resistenz, werden auf einen CT-Wert ≤30 festgelegt. bestätigen, dass sie eine charakteristische S-förmige Kurve aufweisen.

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Ergebnisse

Anwendung der qPCR zum Nachweis von Helicobacter pylori-Infektionen und Antibiotikaresistenzen in Stuhlproben
Wir haben Primer und Sonden entwickelt, die auf Punktmutationen in den konservierten Genen von Helicobacter pylori sowie im 23S rRNA-Gen und im gyrA-Gen basieren. Diese Primer und Sonden wurden mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen markiert und dann für den qPCR-Nachweis verwendet. Die Ergebnisse d...

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Diskussion

In den letzten Jahren wurden molekulare Nachweismethoden in großem Umfang auf dem Gebiet der Mikrobiologie eingesetzt, wodurch sich die klinische Behandlung mehrerer Infektionskrankheiten erheblich verändert hat. Diese Methoden arbeiten auf genetischer Ebene und ermöglichen nicht nur die Bestätigung des Vorhandenseins von Bakterien, sondern auch die Gentypisierung und Antibiotikaresistenztests. Die quantitative Real-Time-Fluoreszenz-PCR (qPCR) wird aufgrund ihrer kurzen Verarbeitungszeit...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Danksagungen

Diese Studie wurde von der Research Foundation for Advanced Talents des Guangdong Provincial People's Hospital finanziert [Grant No. KY012023293]. Diese Arbeit wurde von Jiangsu Mole Bioscience Co. unterstützt. Die Geldgeber spielten keine Rolle beim Studiendesign, bei der Datenerhebung und -analyse, bei der Entscheidung über die Veröffentlichung oder bei der Erstellung des Manuskripts.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
BSC-1500IIA2-XBIOBASESEDABiosicherheitswerkbank
Einweg-Fäkaliensammel- und AufbewahrungsröhrchenMaulwurfSammeln von Kotproben
E-ZentrifugeWEALTECZentrifugieren Sie die Restflüssigkeit von der Wand des Röhrchens
Helicobacter pylori-Nukleinsäure, Clarithromycin und Chinolon-Resistenz-MutationsnachweiskitMaulwurfNachweis einer Helicobacter pylori-Infektion und Antibiotikaresistenz; gefriergetrocknetes H. pylori-Reagenz (enthält Primer, Sonden, Taq-Polymerase, UNG-Enzym, dNTPs usw.), eine Positivkontrolle für H. pylori (enthält Helicobacter pylori und humane β-Aktin-Zielgene) und eine Negativkontrolle für H. pylori (enthält humane β-Aktin-Zielgene)
Mole 96M automatisierter NukleinsäureextraktorMolFür die DNA-Extraktion
Nukleinsäure-ExtraktionskitMolZur Extraktion von Nukleinsäuren; enthält Lysepuffer (Guanidinsalz, Trishydroxymethylaminomethan, Tween-20, Natriumchlorid), Waschpuffer 1 (Natriumchlorid), Waschpuffer 2 (Trishydroxymethylaminomethan, Tween-20), Waschpuffer 3 (magnetische Kügelchen, Tween-20), Waschpuffer 4 (nukleasefreies Wasser) und Elutionspuffer (Trishydroxymethylaminomethan) sowie ein magnetisches Rack
SLAN Vollautomatisches medizinisches PCR-AnalysesystemHONGSHIDatenanalyse
SLAN-96S Echtzeit-PCR-GerätHONGSHIFluoreszierende quantitative PCR-Amplifikation
Ultratiefkühlschränke (DW-YL450)MELINGSEDA20172220091-20 &Grad; C zum Aufbewahren von Reagenzien
Vortex-5Kylin-bellZum Mischen von Reagenzien
20143222263

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