Etablierung und Vergleich von fluoreszenzbasierten Methoden zur Detektion der T6SS-Aktivität bei Acinetobacter baumannii

Summary

Hier schlagen wir eine quantitative Nachweismethode vor, die auf Fluoreszenzmarkierung (insbesondere Luciferase) basiert, um die Aktivität von bakteriellem T6SS effizient und genau zu bestimmen, die für die Hochdurchsatzanalyse klinischer Stämme geeignet ist.

Abstract

Das Typ VI Sekretionssystem (T6SS) ist ein entscheidender Mechanismus, der interzelluläre Interaktionen in gramnegativen Bakterien, insbesondere bei pathogenen Spezies wie Acinetobacter baumannii, vermittelt. Frühere Studien haben gezeigt, dass das große Plasmid pAB3 im Stamm A . baumannii ATCC 17978 für ein TetR-ähnliches Protein kodiert, das die Expression von T6SS-Kerngenen hemmt. Im Gegensatz dazu kann der WT^R-Stamm , dem pAB3 fehlt, das T6SS-Effektorprotein Hcp stabil exprimieren und sezernieren und zeigt die Fähigkeit, E. coli abzutöten. Das tssM-Gen , eines der Kerngene von T6SS, ist essentiell für seine Aktivität; Seine Löschung führt direkt zur Inaktivierung von T6SS. Herkömmliche Methoden zum Nachweis der T6SS-Aktivität, wie z. B. Tötungsassays, leiden jedoch unter einem geringen Durchsatz und einer unzureichenden Sensitivität. Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir quantitative Nachweismethoden entwickelt, die auf Fluoreszenzmarkierung basieren.

Um die Detektion der T6SS-Aktivität zu verbessern, haben wir drei Fluoreszenzmarkierungsmethoden entwickelt: (1) Eine quantitative Nachweismethode, die auf der Luciferase-Markierung basiert und sich durch hohe Spezifität, Sensitivität und Reproduzierbarkeit auszeichnet und daher für die Hochdurchsatzanalyse geeignet ist; (2) ein Nachweisverfahren auf der Grundlage der Markierung von grün fluoreszierenden Proteinen (GFP), das zwar anfällig für Umwelteinflüsse ist, aber den Vorteil eines hohen Durchsatzes bietet; (3) Durchflusszytometrische Detektion, die die Lebensfähigkeit von Bakterien quantitativ beurteilen kann, aber operativ komplex und kostspielig ist. Nach einem umfassenden Vergleich erwies sich die Luziferase-basierte Markierungsmethode als die genaueste, sensitivste und benutzerfreundlichste. Bei der Anwendung auf 20 klinische Isolate von A. baumannii wurde bestätigt, dass diese Methode die T6SS-Aktivität schnell und genau bewerten kann.

Introduction

Das Typ-VI-Sekretionssystem (T6SS) ist ein wichtiges Proteinsekretionssystem in gramnegativen Bakterien, das an der bakteriellen Konkurrenz, dem Antagonismus gegen eukaryotische Wirte und der Regulation der Immunantwort des Wirts beteiligt ist ^1,2. Durch die Injektion toxischer Effektorproteine in benachbarte Bakterien oder eukaryotische Zellen hilft T6SS Bakterien, in komplexen Umgebungen einen Wettbewerbsvorteil zu erhalten. In den letzten Jahren hat die bedeutende Rolle von T6SS bei der bakteriellen Anpassungsfähigkeit, Pathogenität und mikrobiellen Wechselwirkungen es zu einem Forschungsschwerpunkt gemacht, insbesondere bei multiresistenten Krankheitserregern, wo seine Funktionen potenzielle Ziele für die Entwicklung neuer antibakterieller Strategien bieten ^3,4,5.

Acinetobacter baumannii (Ab) ist ein gramnegativer opportunistischer Erreger, der in Krankenhäusern weit verbreitet ist. Aufgrund seiner hohen Arzneimittelresistenz und seiner starken Anpassungsfähigkeit hat es sich weltweit zu einem wichtigen nosokomialen Krankheitserreger entwickelt ^6,7,8. Das Überleben von A. baumannii in komplexen mikrobiellen Umgebungen hängt von mehreren Sekretionssystemen ab, unter denen T6SS eine Schlüsselrolle in seiner Konkurrenz mit anderen Mikroben und der Interaktion mit dem Wirt spielt. Mit seinem hochkonservierten T6SS-Gencluster und seinen gut definierten Funktionen ist A. baumannii zu einem idealen Modell für die Untersuchung von T6SS-Mechanismen geworden. Darüber hinaus bietet die einzigartige Struktur des T6SS in A. baumannii eine unverwechselbare Perspektive, um die Vielfalt und Funktionen des T6SS weiter zu enthüllen.

Das T6SS-Gencluster von A. baumannii enthält 12 Kernproteingene (z. B. tssA-tssM, ohne tssJ) und mehrere Gene mit unbekannten Funktionen (z. B. tagX, tagN, tagF usw.)^2,9,10. Unter ihnen ist das Hämolysin-koregulierte Protein (Hcp) ein wichtiger Bestandteil von T6SS, und seine Sekretion gilt als Kennzeichen von funktionellem T6SS. Studien haben gezeigt, dass das große Plasmid pAB3 in A. baumannii die T6SS-Expression hemmt, indem es für ein TetR-ähnliches regulatorisches Protein kodiert. Im Gegensatz dazu können Stämme, die pAB3 verloren haben (wie WT^R-), stabil Hcp exprimieren und sezernieren, was eine signifikante T6SS-Aktivität aufweist¹¹. Das tssM-Gen ist eines der Kerngene von T6SS, und seine Deletion führt direkt zur Inaktivierung von T6SS.

Herkömmliche Methoden zum Nachweis der T6SS-Aktivität (z. B. Tötungsassays) weisen jedoch Einschränkungen auf, wie z. B. geringen Durchsatz, schlechte Reproduzierbarkeit und unzureichende Empfindlichkeit, die die eingehende Untersuchung und breite Anwendung von T6SS⁵ stark einschränken. Daher ist die Entwicklung effizienter und genauer Methoden zur Detektion der T6SS-Aktivität zu einem dringenden Bedarf in der aktuellen Forschung geworden. Ziel dieser Studie ist es, Methoden zur Detektion der T6SS-Aktivität auf der Grundlage der Fluoreszenzmarkierung zu etablieren und zu vergleichen, um die Unzulänglichkeiten traditioneller Methoden zu überwinden. Durch die Fluoreszenzmarkierungstechnologie haben wir eine quantitative Echtzeitüberwachung der T6SS-Aktivität erreicht und damit ein präziseres und zuverlässigeres Werkzeug für die Untersuchung bakterieller Wechselwirkungen bereitgestellt. Diese Studie hat die Wirksamkeit von Fluoreszenzmarkierungsmethoden validiert und durch den Vergleich der Vor- und Nachteile verschiedener Fluoreszenzmarkierungsstrategien neue Perspektiven und methodische Unterstützung für zukünftige Forschungen geliefert. Es bietet nicht nur neue technische Möglichkeiten für die T6SS-Forschung, sondern legt auch eine wissenschaftliche Grundlage für das Verständnis der komplexen Mechanismen bakterieller Wechselwirkungen und die Entwicklung neuer antibakterieller Therapiestrategien.

Protocol

1. Quellen von Stämmen und Plasmiden

1. Verwenden Sie A. baumannii Standardstamm ATCC 17978, E. coli (pZY01) und den klinischen Stamm von A. baumannii , isoliert aus der Abteilung für Labormedizin am Ersten Krankenhaus der Universität Jilin.
2. Verwenden Sie das Plasmid pZY01-GFP (mit einem Kanamycin-Resistenzgen, das in A. baumannii stabil exprimiert werden kann), das modifiziert und im Labor konserviert wurde, und das kommerziell erworbene Plasmid pGEN-luxCDABE (mit einem Ampicillin-Resistenzgen).
3. Kultur A. baumannii und E. coli in Luria-Bertani (LB) Medium oder einem Minimalmedium mit folgenden Inhalten: 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,4), 15 mM (NH₄)₂SO₄, 2 mM MgSO₄, 0,2 % (w/v) Natriumsuccinat als einzige Kohlenstoffquelle und 0,01 % (w/v) Hefeextrakt¹². Bei Bedarf Antibiotika in den folgenden Konzentrationen hinzufügen: E. coli: Ampicillin (100 μg/ml) und Kanamycin (50 μg/ml); A. baumannii: Streptomycin (100 μg/ml).
   HINWEIS: E. coli (pZY01) und E. coli (pZY01-GFP) weisen eine Kanamycin-Resistenz auf. E. coli (pZY01) hat keinen Fluoreszenzmarker, so dass es im folgenden Text als E. coli bezeichnet werden kann.

2. Vorbereitung der Bakterienstämme vor dem Versuch

1. Entnehmen Sie die Bakterienstämme 2 Tage vor dem Versuch aus dem -80 °C Gefrierschrank. Impfen Sie die Bakterienstämme auf LB-Agarplatten, die die entsprechenden Antibiotika enthalten. Die Platten über Nacht bei 37 °C inkubieren.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle Zellen die Plasmide zu Beginn des Experiments beibehalten.
2. Wählen Sie 1 Tag vor dem Experiment zwei unabhängige Einzelkolonien jedes Bakterienstamms aus. Jede Kolonie wird separat in zwei einzelne Röhrchen mit 5 ml flüssigem LB-Medium geimpft. Inkubieren Sie die Kulturen über Nacht bei 37 °C und schütteln Sie sie bei 200 U/min. Verwenden Sie diese Kulturen für nachfolgende Experimente.
   HINWEIS: Optimieren Sie die Inkubationszeit basierend auf der bakteriellen Wachstumsrate, um sicherzustellen, dass eine ausreichende Menge an bakterieller Biomasse erhalten wird.

3. Vorbereitung von E. coli (GFP)/ E. coli (Luciferase) Stämmen

1. Transformation
   1. 50 ng Plasmid-DNA (pZY01-GFP oder pGEN-luxCDABE, quantifiziert mittels NanoDrop bei A260/A280) in jeweils 100 μl E. coli DH5α-kompetente Zellen geben und vorsichtig mischen.
   2. 30 min auf Eis inkubieren, 60 s bei 42 °C einen Hitzeschock erleiden und sofort 30 s auf Eis legen.
   3. 700 μl antibiotikafreie LB-Bouillon zugeben und bei 37 °C unter Schütteln bei 180 U/min 2 h inkubieren.
2. Anrichten und Kultivieren
   1. Zentrifugieren Sie 2 Minuten lang bei 420 × g , verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 100 μl antibiotikafreier LB-Brühe.
   2. Verteilen Sie das Transformationsprodukt pZY01 (GFP) auf LB-Agarplatten, die 50 μg/ml Kanamycin enthalten.
   3. Verteilen Sie das pGEN-luxCDABE-Transformationsprodukt auf LB-Agarplatten, die 100 μg/ml Ampicillin enthalten. Über Nacht bei 37 °C inkubieren.
3. Verifizierung positiver Klone
   1. Wählen Sie einzelne Kolonien aus und extrahieren Sie die DNA am nächsten Tag als Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Vorlagen. Führen Sie eine PCR-Amplifikation durch und verifizieren Sie sie durch Agarose-Gelelektrophorese.
   2. Bestätigen Sie positive Stämme und kennzeichnen Sie sie als E. coli (GFP) und E. coli (Luciferase).
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Qualität der kompetenten Zellen für eine effiziente Transformation hoch ist. Vermeiden Sie übermäßige Bakterienflüssigkeit während der Beschichtung, um eine Beeinträchtigung der Isolierung einzelner Kolonien zu vermeiden.

4. Westliche Blotting

1. Probenvorbereitung
   1. Sammeln Sie Bakterienkulturen und zentrifugieren Sie sie (1500 × g, 10 min, 4 °C), um das Zellpellet und den Überstand zu trennen.
   2. Geben Sie sowohl dem Zellpellet als auch dem Überstand eine angemessene Menge Ladepuffer zu. Bei 100 °C im Metallbad 10 Min. kochen lassen. Zentrifugieren (1500 g, 10 min, 4 °C) und die Überstände als Proteinproben sammeln.
   3. Messen Sie die Proteinkonzentration mit der Bicinchoninsäure (BCA)- oder Bradford-Methode und stellen Sie sie auf die gleiche Konzentration ein.
2. Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
   1. Bereiten Sie SDS-PAGE-Gele in geeigneten Konzentrationen vor (z. B. 12 % Trenngel, 5 % Stapelgel)¹³.
   2. Laden Sie 20 μg Proteinproben zusammen mit einem 1-2 μl vorgefärbten Proteinmarker in die Gel-Wells. Führen Sie die Elektrophorese bei 100-120 V durch, bis der Bromphenolblau-Indikator den Boden des Gels erreicht.
      HINWEIS: Laufender Puffer: Tris 25 mM, Glycin 192 mM, SDS 0,1 % (w/v), destilliertes Wasser auf 1 l.
3. Übertragung (Western Blotting)
   1. Entfernen Sie das Gel von den Glasplatten und weichen Sie es in Transferpuffer ein. Bereiten Sie eine Polyvinylidendifluorid (PVDF)- oder Nitrocellulose (NC)-Membran vor, aktivieren Sie die PVDF-Membran mit Methanol und weichen Sie sie dann in Transferpuffer ein.
      HINWEIS: Transferpuffer: 25 mM Tris, 192 mM Glycin, 20% Methanol
   2. Montieren Sie die Transferapparatur in einer "Sandwich"-Struktur (Filterpapier-Gel-Membran-Filterpapier). Transfer bei 100 V für 60-90 min (Zeit basierend auf dem Molekulargewicht des Proteins anpassen; Wirtszellproteine (HCP) haben ein Molekulargewicht von ca. 17 kDa).
      HINWEIS: Stellen Sie den Transfertank in Eiswasser und fügen Sie Eisbeutel hinzu, um eine niedrige Temperatur aufrechtzuerhalten. Wenn die Transferzeit lang ist, ersetzen Sie die Eisbeutel auf halbem Weg.
4. Blockierend
   1. Legen Sie die Membran nach dem Transfer in eine 5%ige Magermilchblocklösung. Bei Raumtemperatur (RT) auf einem Shaker für 1 h oder über Nacht bei 4 °C blockieren.
5. Inkubation von Primärantikörpern
   1. Waschen Sie die Membran dreimal mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) mit 0,1 % Tween 20 (TBST)-Puffer, jeweils 5 Minuten. Die Membran wird mit verdünnten Primärantikörpern (Maus-Anti-Hcp-Antikörper, 1:1000 Verdünnung; Maus-Anti-Isocitrat-Dehydrogenase (ICDH)-Antikörper, 1:1000 Verdünnung) bei 4 °C über Nacht oder RT für 2 Stunden inkubiert.
6. Inkubation von sekundären Antikörpern
   1. Waschen Sie die Membran 3 Mal à 5 min mit TBST-Puffer. Inkubieren Sie die Membran mit einem verdünnten Sekundärantikörper (Meerrettichperoxidase [HRP]-konjugiertes Anti-Maus-IgG, 1:3000 Verdünnung) bei RT für 2 h.
7. Erkennung
   1. Waschen Sie die Membran 3 Mal à 5 min mit TBST-Puffer. Bereiten Sie das ECL-Chemilumineszenzsubstrat vor und tragen Sie es gleichmäßig auf die Membran auf.
   2. Detektieren Sie Signale mit einem Chemilumineszenz-Bildgebungssystem und erfassen Sie Bilder (HCP-Protein hat ein Molekulargewicht von ca. 17 kDa, ICDH ist ein zytoplasmatisches Stoffwechselenzym mit einem erwarteten Molekulargewicht von ca. 45 kDa in A. baumannii).
      HINWEIS: ICDH ist ein wichtiger Marker für die Qualitätskontrolle, der nur in der Zellpelletfraktion (mit intakten Bakterien) und nicht in der Überstandsfraktion (mit sezernierten Proteinen) nachgewiesen werden kann, was zeigt, dass während der Probenvorbereitung keine Zelllyse stattgefunden hat. Die Hcp-Sekretion (17 kDa) sollte nur in Überständen von T6SS-aktiven Stämmen sichtbar sein.

5. Vorbereitung von 96-Well-Platten mit LB-Agar-Medium

1. Geben Sie schnell autoklaviertes, antibiotikafreies LB-Agar-Medium, vorgewärmt, in eine sterile 96-Well-Platte, 50 μl pro Well. Lassen Sie die Platte mindestens 1 h bei RT stehen, um eine vollständige Verfestigung des Mediums zu gewährleisten.
2. Verwenden Sie schwarz wandige Platten mit transparentem Boden für die Detektion von GFP-Fluoreszenz.
3. Verwenden Sie lichtdichte 96-Well-Platten zum Nachweis von Luciferase-Fluoreszenz, um Cross-Well-Fluoreszenzinterferenzen zu vermeiden.
   HINWEIS: Vermeiden Sie die Bildung von Blasen bei der Zugabe des Mediums, um eine gleichmäßige Geldicke zu gewährleisten, die einen optimalen Bakterienkontakt und -wachstum fördert.

6. A. baumannii-Tötungsassay

1. Standard-Tötungsassay
   1. Kultivieren Sie WT^R- und ΔtssM-Mutantenstämme über Nacht bei 37 °C mit Schütteln in LB-Medium, das mit 100 μg/ml Streptomycin ergänzt wurde, und züchten Sie E. coli separat in LB-Medium, das 50 μg/ml Kanamycin enthält, unter identischen Bedingungen.
   2. Waschen Sie die Bakterienkulturen zweimal mit sterilem PBS und resuspendieren Sie sie in frischem, antibiotikafreiem LB-Medium. Passen Sie den OD₆₀₀ zur Standardisierung auf 1,0 an.
   3. Mischen Sie WT^R- und ΔtssM-Mutantenstämme mit E. coli im Verhältnis 1:1.
   4. 10 μl der gemischten Bakteriensuspension auf antibiotikafreie LB-Agarplatten geben und 6 h bei 37 °C inkubieren.
   5. Kratzen Sie die bakteriellen Flecken ab und resuspendieren Sie sie in 1 ml PBS. Führen Sie fünf 10-fache serielle Verdünnungen durch.
   6. 10 μl der verdünnten Bakteriensuspensionen auf Kanamycin-haltige LB-Platten geben und über Nacht bei 37 °C inkubieren.
   7. Analysieren Sie die T6SS-abhängige antibakterielle Aktivität von WT^R- und Δ tssM-Mutantenstämmen durch Koloniezählung.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Bakteriensuspensionen gründlich gemischt werden, um experimentelle Fehler zu vermeiden. Führen Sie mindestens drei unabhängige Replikate für jede Stichprobe durch, um die Zuverlässigkeit der Daten zu gewährleisten.
2. Quantitativer Nachweis der T6SS-Aktivität mittels Luciferase-Markierung
   1. Standardisieren Sie den OD₆₀₀ von E. coli (Luciferase), WT R-, ΔTSSM-Mutanten und anderen Stämmen (z. B. ATCC 17978, E. coli, Ab#40, Ab#170, Ab#180) auf 1.0. Geben Sie 5 μl Bakteriensuspension in eine 96-Well-Platte, die antibiotikafreien LB-Agar enthält. Messen Sie nach dem Trocknen an der Luft im Dunkeln die Luciferase-basierte Biolumineszenz, um die Lumineszenzspezifität von E. coli (Luciferase) zu überprüfen.
   2. Führen Sie eine 5-fache serielle Verdünnung von E. coli (Luciferase) durch. 10 μl der verdünnten Bakteriensuspension auf eine 96-Well-Platte mit LB-Agar und eine leere 96-Well-Platte (beide lichtdicht) geben. Messen Sie die Luciferase-basierte Biolumineszenz, um die Empfindlichkeit der Luciferase-basierten Nachweismethode zu bewerten und zu bestätigen, ob LB-Agar das Lumineszenzsignal stört.
   3. Mischen Sie E. coli (Luciferase) mit WT R-, ΔtssM-Mutanten und 20 klinischen Stämmen (OD₆₀₀ standardisiert auf 1,0) im Verhältnis 1:1. Verdünnen Sie die 10-fache, geben Sie 5 μl auf eine 96-Well-Platte und richten Sie drei technische Replikate ein.
   4. Nach dem Trocknen an der Luft im Dunkeln die Biolumineszenz messen. Bei 37 °C im Dunkeln 4-6 h inkubieren, dann erneut die Biolumineszenz messen (Emissionswellenlänge: 562 nm).
   5. Quantitative Bewertung der T6SS-abhängigen antibakteriellen Aktivität durch Vergleich der Biolumineszenzwerte vor und nach der Co-Kultur.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Bakteriensuspensionen gründlich gemischt werden, um experimentelle Fehler zu vermeiden. Führen Sie mindestens drei unabhängige Replikate für jede Stichprobe durch, um die Zuverlässigkeit der Daten zu gewährleisten. Verwenden Sie den Student's t-Test für die statistische Analyse.
3. Nachweis der T6SS-Aktivität mittels GFP-Markierung
   1. Befolgen Sie das gleiche Verfahren wie beim Luciferase-Markierungsexperiment (Anregungswellenlänge: 480 nm, Emissionswellenlänge: 509 nm).
   2. Mischen Sie E. coli (GFP) mit WT^R- und ΔtssM-Mutanten (OD₆₀₀ standardisiert auf 1,0) im Verhältnis 1:1. 10 μl auf antibiotikafreie LB-Agarplatten aufbringen. Nach der Lufttrocknung bei RT werden Bilder mit dem GFP-Fluoreszenzkanal (Programm Alex488, Anregung: 488 nm, Emission: 509 nm) eines multifunktionalen Bildgebungssystems aufgenommen.
   3. Bei 37 °C im Dunkeln 4-6 h inkubieren, dann erneut Bilder aufnehmen. Bewertung der T6SS-Aktivität basierend auf Änderungen der Fluoreszenzintensität von Bakterienflecken.
      HINWEIS: Führen Sie alle Schritte im Dunkeln durch, um Interferenzen mit Fluoreszenzsignalen zu vermeiden. Stellen Sie sicher, dass die Bakteriensuspensionen gründlich gemischt werden, um experimentelle Fehler zu vermeiden. Führen Sie mindestens drei unabhängige Replikate für jede Stichprobe durch, um die Zuverlässigkeit der Daten zu gewährleisten.
4. Nachweis durch Durchflusszytometrie
   1. Mischen Sie WT^R- mit E. coli (GFP) und ΔtssM-Mutanten mit E. coli (GFP) im Verhältnis 1:1. Nehmen Sie eine angemessene Menge der gemischten Bakteriensuspension und verdünnen Sie sie mit sterilem PBS oder 1×Puffer auf eine geeignete Konzentration (typischerweise OD₆₀₀ von 0,1-0,5).
      HINWEIS: 1× Puffer bezieht sich auf Durchflusszytometrie-Färbepuffer (1×), die Inhaltsstoffe umfassen: 1× PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1,8 mM KH₂PO₄, pH 7,4), ergänzt mit: 2-5 % (v/v) hitzeinaktiviertem FBS (oder 1 % BSA als Alternative), 2 mM EDTA.
   2. Die verdünnte gemischte Bakteriensuspension wird bei 300 x g 2 min lang zentrifugiert und der Überstand wird verworfen. Das Pellet in 1 ml sterilem PBS oder 1× Puffer resuspendieren und vorsichtig mischen. Die resuspendierte Lösung wird durch ein 35-μm-Zellsieb filtriert, um Aggregate zu entfernen und eine Einzelzellsuspension zu gewährleisten.
   3. Schalten Sie das Durchflusszytometer ein, heizen Sie den Laser vor und kalibrieren Sie das Gerät.
      1. Stellen Sie die Detektionsparameter ein: Verwenden Sie einen 488-nm-Laser, um GFP anzuregen. Detektionskanal: FL1 (typischerweise ein 530/30-nm-Filter für die GFP-Fluoreszenzdetektion). Legen Sie die Parameter für die Vorwärtsstreuung (FSC) und die Seitenstreuung (SSC) fest, um Bakterienzellen zu unterscheiden.
      2. Verwenden Sie unmarkierte E. coli als Negativkontrolle, passen Sie die Spannung und Verstärkung an und stellen Sie sicher, dass sich die GFP-negative Population auf der Grundlinie des Fluoreszenzsignals befindet.
   4. Mischen Sie die gefilterte Probe vorsichtig und geben Sie 100 μl in ein Durchflusszytometrieröhrchen.
      1. Analysieren Sie die Proben mit den folgenden Geräteeinstellungen: Stellen Sie den FSC-H-Schwellenwert auf 19.000 ein, um Schmutz auszuschließen, mit Verstärkungswerten von 100 (FSC), 110 (SSC) und 80 (FITC).
      2. Für das Gating schließen Sie zunächst Trümmer und Nicht-Zielsignale im Streudiagramm FSC-A vs. SSC-A aus, gefolgt von einer Populationsanalyse im FITC-Kanal. Erfassen Sie für jede Stichprobe mindestens 10.000 Ereignisse aus der Zielpopulation (definiert durch FSC/SSC-Merkmale).
   5. Analysieren Sie die Daten mit einer Durchflusszytometrie-Software (z. B. FlowJo, BD FACSDiva).
      1. Plotten Sie FSC- vs. SSC-Streudiagramme, um die Zielbakterienpopulation zu begrenzen. Darstellung von FL1-Fluoreszenzhistogrammen, um GFP-positive und GFP-negative Populationen zu unterscheiden.
      2. Berechnen Sie den prozentualen Anteil der GFP-positiven Zellen und die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI).
   6. Die restliche gemischte Bakteriensuspension bei 300 g für 2 min zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Das Pellet wird in 10 μl sterilem Wasser resuspendiert und auf antibiotikafreie LB-Agarplatten aufgetragen.
   7. Bei 37 °C im Dunkeln 5 h inkubieren, dann die Bakterienflecken abkratzen und in 500 μl 1× PBS resuspendieren. Nehmen Sie 100 μl der resuspendierten Lösung, verdünnen Sie sie entsprechend und führen Sie einen Durchflusszytometrie-Nachweis durch, indem Sie die Schritte 6.4.4 bis 6.4.5 wiederholen.
   8. Vergleichen Sie den Prozentsatz der GFP-positiven Zellen und die Fluoreszenzintensität vor und nach der Co-Kultur. Bewertung der abtötenden Wirkung von WT^R- und ΔtssM-Mutanten auf E. coli (GFP).
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass eine einzellige Suspension verwendet wird, um zu vermeiden, dass die Zellaggregation die Nachweisergebnisse beeinträchtigt. Kalibrieren Sie das Gerät vor der Detektion, um die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit von Fluoreszenzsignalen sicherzustellen. Vermeiden Sie es, die Proben während des Experiments starkem Licht auszusetzen, um eine GFP-Fluoreszenzlöschung zu verhindern. Führen Sie mindestens drei Replikate für jede Stichprobe durch, um die Zuverlässigkeit der Daten zu gewährleisten.

Results

Traditionelle Methoden zum Nachweis der T6SS-Aktivität beinhalten in der Regel die Co-Kultivierung von Räuber- und Zielstämmen auf antibiotikafreien LB-Agarplatten für 5 Stunden, gefolgt von dem Abkratzen der Bakterienflecken, ihrer Resuspendierung und der Durchführung serieller Verdünnungen. Die verdünnte Bakteriensuspension wird dann auf selektive Agarplatten getupft. Durch Zählen der Kolonien des Zielstammes auf den Platten am nächsten Tag kann die T6SS-Aktivität qualitativ beurteilt werden. Diese Methode hat jedoch E...

Discussion

Das Typ VI Secretion System (T6SS) ist eine komplexe Multiproteinmaschinerie, deren Funktionen hauptsächlich durch die Sekretion von Effektorproteinen realisiert werden. Diese Effektorproteine vermitteln die interbakterielle Konkurrenz, indem sie andere Bakterienarten abtöten oder hemmen und dem Wirtsbakterium dadurch einen Wettbewerbsvorteil in mikrobiellen Gemeinschaften verschaffen¹⁵. Neben seiner Rolle im Wettbewerb haben Studien gezeigt, dass T6SS an verschie...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10%, 15% SDS-PAGE Gel Vorbereitungskit	Epizyme	PG112-20
° C Gefrierschrank	Haier	HYCD-290
37 ° C Brutkasten	Bluepard	181254254
4 > C Kühlschrank	Haier	HYC390-80
° C Gefrierschrank	Haier	DW-86L726G(726L)
96-Well-Platte	JET	TCP010096
Agar	Biofrox	8211KG001
Ammoniumpersulfat (APS)	Thermo	7727-54-0
Biologische Sicherheitswerkbank	ESCO	AC2-4S1
Elektronische Waage	Sartorius AG	BSA124S-CW
Elektrophoresegerät	BIO-RAD	POWER
Scherbeneismaschine	GRANT	XB70
Durchflusszytometer	BECKMAN COULTER	AW38143
Durchflusszytometrie Färbepuffer	proteintech	PF00018
Gel Imaging System	BIO-RAD	Gel Doc 2000
Glycine	Zike	ZK-L2577
Hochgeschwindigkeitszentrifuge	Eppendorf	5405IN106358
HRP-konjugierter Kaninchen/Maus-Sekundärantikörper	proteintech	SA00001-2
LB Bouillon	Solarbio	L8291
Niedertemperatur-Hochgeschwindigkeitszentrifuge	Thermo	17R
Methanol	Thermo	R40121
Mikro-UV-Vis-Spektralphotometer	Thermo	Nanodrop one
Mikrozentrifuge	allsheng	Mini-6k
Mikrotiterplatten-Reader	Bio-Tek	H1M
NuPAGE LDS Probenpuffer	Thermo	NP0007
Phosphatpufferlösung (PBS)	Zike	ZK-L1649
Precision Plus Protein Dual Color Standards	Bio-Rad	1610374
SDS Probenladepuffer	Beyotime	poo15L
Magermilchpulver	Thermo	LP0033B
Natriumdodecylsulfat (SDS)	Zike	zk6885
Thermostatisches Wasserbad	JingHong	DK-420S
Transfergerät	Bio-Rad	PowerPac HC
Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris)	Zike	ZK-L2557
Vertikales Elektrophoresegerät	Bio-Rad	Mii-PROTEAN Tetra