Method Article

Längsschnitt-Mikro-Computertomographie-Bildanalyse für benutzerdefinierte Region of Interest bei Knochendefekten kritischer Größe

DOI:

10.3791/67904

⸱

June 24th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Rochester, 2Center for Musculoskeletal Research, Department of Orthopaedics, University of Rochester Medical Center, 3Department of Translational Biomedical Science, University of Rochester Medical Center, 4Department of Orthopaedics, University of Rochester Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir stellen eine Methode zur Analyse einer benutzerdefinierten Region of Interest (ROI) in einem longitudinalen in vivo Ratten-Radialdefektmodell vor. Diese Methode ermöglicht eine vergleichende Analyse zwischen verschiedenen Gerüsten, die zuvor durch Schwankungen des Sichtfelds des Scans mit Mikrocomputertomographie (μCT), der Probenorientierung und der Basislinienpräsenz des Gerüsts begrenzt waren.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die bildgebende Analyse des Knochenvolumens mit Mikro-Computertomographie (μCT) ist ein notwendiges quantitatives Instrument zur Untersuchung des Knochenregenerationspotenzials und der Ergebnisse im Rahmen von Längsschnitt-In-vivo-Studien . Etablierte Methoden zur Knochensegmentierung nutzen Visualisierungssoftware für die μCT-Segmentierung des gesamten Knochens und die Ausrichtung komplexer anatomischer Strukturen. Diese Segmentierungsprotokolle bieten eine robuste, hochgenaue Methode für die Segmentierung, Ausrichtung und Analyse, sind jedoch in ihren Möglichkeiten der benutzerdefinierten ROI-Analyse (Region of Interest) eingeschränkt. Wir stellen ein Protokoll vor, das diese Methoden erweitert, um eine benutzerdefinierte ROI-Knochenvolumenanalyse rund um einen Knochendefekt kritischer Größe zu ermöglichen. Der benutzerdefinierte ROI rund um den Defekt kann im Laufe der Zeit für in vivo Längsschnittstudien analysiert werden. In dieser Arbeit untersuchen wir μCT-Bilder von drei einzigartigen Rattenproben, denen jeweils ein Kontrollgerüst aus Polycaprolacton (PCL) implantiert wurde. Die Modelle werden von drei Benutzern (2 erfahrene und 1 Anfänger) zu Zeitpunkten von 0 und 6 Wochen analysiert, um die Fähigkeit zu veranschaulichen, einen ROI rund um einen Defekt kritischer Größe während einer Längsschnittstudie zu messen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Knochendefekte kritischer Größe stellen erhebliche klinische Herausforderungen für das orthopädische Behandlungsmanagement dar. Gemäß ASTM F2721 ist ein Defekt kritischer Größe als ein Defekt mit einer Länge von 1,5 bis 2 mal so groß wie der Durchmesser des interessierenden Knochens1. Die Reparatur dieser Defekte erfolgte traditionell durch den Einsatz von autologen und allogenen Transplantationen, die durch die Verfahrenskosten, die damit verbundenen Risiken sekundärer Operationen und das erforderliche Knochentransplantatvolumen begrenzt waren2. Aktuelle Knochenregenerationstechniken konzentrieren sich auf die Verwendung von allogenen und xenogenen Gerüsten, die entwickelt wurden, um sowohl osteokonduktive als auch osteoinduktive Effekte zu erzielen, indem ihre mechanischen Eigenschaften, ihre Biokompatibilität, Bioaktivität, ihr angiogenes Potenzial und ihre Abbauprofile optimiertwerden 3,4,5. Die untersuchten Biomaterialien reichen von Biokeramiken und Biopolymeren bis hin zu Metallen und anderen Verbundwerkstoffen6. Variationen dieser Biomaterialien werden sowohl in vitro als auch in vivo getestet, um ihr Potenzial als Knochenregenerationsgerüste zu untersuchen.

μCT ist der Goldstandard für nicht-invasive, hochpräzise Bildgebung zur Beurteilung der Knochenmorphologie, -struktur und -mikrostruktur in Nagetiermodellen 7,8,9. Diese bildgebende Modalität wurde beschrieben, um das longitudinale Fortschreiten der Knochenregeneration in vivo in Frakturheilungsmodellenzu beurteilen 10. Es wurden Methoden entwickelt, um die Quantifizierung von kortikalem und trabekulärem Knochen aus μCT-Scans zu standardisieren9. Unter Verwendung kommerziell erhältlicher Visualisierungssoftware wurden halbautomatische Segmentierungsworkflows für die Segmentierung des gesamten Knochens mit komplexen anatomischen Strukturen entwickelt11. Diese Methoden ermöglichen vereinfachte, zugängliche Methoden für Benutzer mit unterschiedlichen Erfahrungsstufen, um standardisierte, reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Diese Methoden sind jedoch nach wie vor begrenzt in ihren Möglichkeiten, den benutzerdefinierten ROI zu untersuchen.

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die aktuellen Methoden erweitert, um eine benutzerdefinierte ROI-Knochenvolumenanalyse rund um einen Knochendefekt kritischer Größe für longitudinale in vivo-Rattenmodelle mit Visualisierungssoftware zu ermöglichen. Die Etablierung einer konsistenten Alignment- und ROI-Auswahlmethode zwischen den Wochen der Längsschnittstudie war für die Entwicklung eines robusten Protokolls unerlässlich. Ein anfänglicher Zeitpunkt wird als Grundlage für die Ausrichtung der folgenden Wochen verwendet, um eine konsistente Ausrichtung der Volumenmodelle zu gewährleisten. Bei dieser Ausrichtung können entsprechende μCT-Bildschnitte aus den überlagerten Volumenmodellen ausgewählt werden, die den Defekt mit kritischer Größe umfassen. Der konsistente ROI wird nicht nur durch die Position der Scheiben überprüft, sondern auch durch den Vergleich der Anzahl der Scheiben innerhalb der Region. Der ausgewählte ROI aus dem Basismodell kann dann in den folgenden Wochen repliziert werden, was eine vergleichende, quantitative Analyse ermöglicht.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

μCT-Längsschnittbilder für diese Studie wurden in den Wochen 0 und 6 von 3 mm kritischen radialen Defekten bei erwachsenen weiblichen Charles River SASCO-SD-Ratten aufgenommen, die mit einem Polycaprolacton (PCL)-basierten Gerüst behandelt wurden. Die gesamte Verwendung von Tieren erfolgte in Übereinstimmung mit den Protokollen, die vom Committee on Animal Resources (UCAR) der Universität Rochester genehmigt wurden. Die μCT-Bildaufnahme wurde mit Scanco Medical VivaCT 40 durchgeführt.

HINWEIS: Die Hauptschritte in diesem Protokoll sind unterteilt in μCT-Bildsegmentierung, Ausrichtung, ROI-Auswahl und -Zuschneiden sowie Analyse und Visualisierung (Abbildung 1). Das Protokoll für die μCT-Bildsegmentierung wurde von Kenney et al. (2022)11 übernommen.

figure-protocol-1
Abbildung 1: Zusammenfassendes Workflow-Diagramm. Die Protokollschritte gliedern sich im Wesentlichen in Bildsegmentierung, Modellausrichtung, ROI-Auswahl und Volumenanalyse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

1. μCT-Bildsegmentierung

  1. Öffnen von Bildern innerhalb der Software
    1. Starten Sie die Amira-Software (im Folgenden als Visualisierungssoftware bezeichnet) und wählen Sie Open Data. Navigieren Sie im Popup-Fenster zum gewünschten Ordnerverzeichnis, um den Anfangszeitpunkt .dcm Dateien auszuwählen. Drücken Sie STRG+A , um alle Bilder auszuwählen, und klicken Sie auf Bilder öffnen.
    2. In einem Popup-Fenster werden Informationen über den geöffneten Bilddatensatz angezeigt. Klicken Sie auf OK , um fortzufahren.
    3. Eine Warnung zur Skalierung wird angezeigt. Klicken Sie auf In Gleitkommazahl konvertieren (die Standardoption), um fortzufahren.
    4. Das Datensatzsymbol wird im Abschnitt Projektansicht angezeigt. Um den Namen des Datensatzes zu ändern, klicken Sie einmal auf das Datensatzsymbol und drücken Sie F2. Sobald der gewünschte Name eingegeben wurde, klicken Sie auf OK. Legen Sie ein Benennungsmuster zur Identifizierung des Scans fest (z. B. "Knochengerüstmaterial" - "WKX").
  2. Filtern und Schwellenwerte für das μCT-Bild
    1. Wenn Bilder in den Abschnitt Projektansicht geladen sind, klicken Sie auf den Standard-2D-Viewer Ortho Slice , um 2D-Ausrichtungen und Schnitte anzuzeigen. Im Ansichtsfenster auf der rechten Seite wird eine 2D-Visualisierung angezeigt.
    2. Um die Bilder in 3D zu visualisieren, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Datensatz, suchen Sie nach Volumen-Rendering und wählen Sie aus. Passen Sie im Abschnitt "Eigenschaften " für das Volumen-Rendering den unteren Schwellenwert für die Farbzuordnung auf 2500 an, und drücken Sie die Eingabetaste.
      HINWEIS: 2D und 3D können ein- und ausgeschaltet werden, indem Sie auf das blaue Quadrat neben "Ortho-Slice" bzw. "Volumen-Rendering" klicken. Für das Anzeigefenster auf der rechten Seite stehen am oberen Rand der Leiste mehrere Ansichtsoptionen zur Verfügung. Dazu gehören verschiedene Werkzeuge zum Verschieben, Drehen oder Vergrößern/Verkleinern des Bildes; Werkzeuge zum Ändern der Bildausrichtung in XY-, XZ- und YZ-Ansichten sowie Werkzeuge für einfache Messungen.
    3. Bei Bedarf müssen bei einigen Datensätzen möglicherweise Artefakte oder Daten außerhalb des interessierenden Bereichs mithilfe einer Volumenbearbeitung entfernt werden. Um eine Volumenbearbeitung hinzuzufügen, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Datensatz, suchen Sie nach Volumenbearbeitung und wählen Sie aus.
    4. Klicken Sie im Abschnitt Projektansicht auf Volume Edit. Wählen Sie im Abschnitt Eigenschaften im ersten Dropdown-Fenster rechts neben Tool die Option TabBox aus.
    5. Wenn Sie die beizubehaltenden Bereiche auswählen, passen Sie die TabBox an, indem Sie mit dem Interaktionscursor (dem spitzen Cursorsymbol in der oberen Leiste des Anzeigefensters) auf die grünen Ecken klicken und diese ziehen. Zum Anpassen der TabBox müssen möglicherweise alternative Ansichten (XY, XZ oder YZ) verwendet werden, um die zu entfernenden Bereiche zu identifizieren.
    6. Sobald das TabBox-Objekt den beizubehaltenden Bereich umgibt, wählen Sie "Ausschneiden" aus, um das Artefakt oder die Daten außerhalb des TabBox-Objekts zu entfernen. In der Projektansicht wird ein neuer, geänderter Datensatz erzeugt.
    7. Klicken Sie auf die Zeichenfolge Volume Rendering, und ziehen Sie sie aus dem ursprünglichen Datensatz in den geänderten Datensatz. Dadurch wird das im Anzeigefenster angezeigte Bild in den geänderten Datensatz geändert. Passen Sie im Abschnitt "Eigenschaften " für das Volumen-Rendering den unteren Schwellenwert für die Farbzuordnung auf 2500 an, und drücken Sie die Eingabetaste.
    8. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die geänderten Daten, suchen Sie nach Median-Filter, und wählen Sie aus. Wählen Sie im Abschnitt Eigenschaften für den Medianfilter die Option 3D für Interpretation aus und klicken Sie auf Anwenden. Dadurch wird ein neuer gefilterter (.filtered) Datensatz im Abschnitt Projektansicht erstellt.
    9. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die gefilterten Daten, suchen Sie nach Interaktiver Schwellenwert, und wählen Sie aus. Wählen Sie im Abschnitt "Eigenschaften " für die interaktive Schwellenwertbestimmung die Option "3D" als Vorschautyp aus, passen Sie den niedrigeren Wert für den Intensitätsbereich auf 2500 an, und klicken Sie auf "Anwenden". Dadurch wird ein neuer Datensatz mit Schwellenwerten (.thresholded) im Abschnitt Projektansicht erstellt.
    10. Klicken Sie auf die Zeichenfolge Volume Rendering, und ziehen Sie sie aus dem geänderten Datensatz in den Datensatz mit Schwellenwert. Schalten Sie die interaktive Schwellenwerteinstellung aus und die Lautstärkeregelung ein (falls ausgeschaltet).
  3. Segmentierung des μCT-Bildes
    1. Klicken Sie auf den gefilterten Datensatz und wechseln Sie dann auf die Registerkarte Segmentierung , indem Sie unterhalb der Menüleiste auf Segmentierung klicken. Auf der Registerkarte Segmentierung ähneln die Steuerelemente denen auf der Registerkarte Projekt .
      HINWEIS: Es gibt einige zusätzliche Werkzeuge, die für das Anzeigefenster auf der Registerkarte Segmentierung relevant sind. In der oberen Ecke des Sichtfensters befindet sich eine +/- Zoom-Schaltfläche , mit der das Bild das Sichtfenster ausfüllt. Das Bild kann im Sichtfenster zentriert werden, indem die Bildlaufleiste nach links/rechts am unteren Rand des Sichtfensters verwendet wird. Oberhalb dieser Bildlaufleiste befindet sich eine zweite Bildlaufleiste, um sich durch die μCT-Datenscheiben zu bewegen.
    2. Um sicherzustellen, dass die Registerkarte Segmentierung ordnungsgemäß eingerichtet ist, wird im Abschnitt Segmentierungseditor das Bild auf den gefilterten Datensatz und das Feld Beschriftung auf den Datensatz mit Schwellenwert festgelegt. Doppelklicken Sie im Abschnitt "Materialien " auf das Material mit dem Namen "Material " und benennen Sie es in "Bone" um.
    3. Klicken Sie unter dem Segmentierungseditor auf Neu, um ein neues Beschriftungsfeld zu erstellen. Benennen Sie diese im Popup-Fenster mit einer ähnlichen Namenskonvention (z. B. "Knochengerüstmaterial" - "WKX" - Marker) wie zuvor und als Marker um und klicken Sie auf OK.
    4. Passen Sie das 2D-Ansichtsfenster mit alternativen Ansichten (XY, XZ oder YZ) an, um entweder eine sagittale oder eine koronale Ebenenansicht des Bildes anzuzeigen.
    5. Verwenden Sie Pinsel, Lasso, Zauberstab und Schwellenwert im Auswahlbereich , um die Interessenbereiche zu identifizieren. Wählen Sie für dieses Protokoll das Pinselwerkzeug aus. Passen Sie die Größe des Pinselwerkzeugs an. Im Allgemeinen funktioniert ein mittelgroßer Zeiger gut.
    6. Passen Sie den Bildstapel auf das erste Segment an, in dem der Radius-Bone sichtbar wird. Dies kann erfordern, dass Sie die Schichten mehrmals durchlaufen, um zu bestimmen, welche Volumina zum Radius und zur Ulna gehören und wann sie beginnen.
    7. Nachdem Sie das Segment identifiziert haben, können Sie mit dem Pinselcursor zeichnen, indem Sie auf dieses Knochensegment klicken und den Cursor ziehen. An der Stelle, an der der Cursor gezeichnet wurde, wird eine rote Linie angezeigt. Zeichnen Sie innerhalb des Knochenabschnitts, nicht außerhalb des Knochens; Dies wird die Visualisierungssoftware bei der Unterscheidung zwischen den beiden Knochen unterstützen.
    8. Fahren Sie mit dem Durchlaufen von Segmenten fort und zeichnen Sie um den Radius herum. Im Allgemeinen können Zeichnungen durch den mittleren Bereich des Bildstapels alle 20-30 Bildsegmente erstellt werden. Erstellen Sie entlang des Endes des Bildstapels oder um den Defekt mit kritischer Größe herum alle 5-10 Bildscheiben Zeichnungen, um die Visualisierungssoftware beim Ein- oder Ausblenden des Knochens zu unterstützen.
    9. Sobald die volle Länge des Radius erreicht ist, klicken Sie in der Dropdown-Liste der Menüleiste auf Auswahl, Füllen und dann auf Alle Segmente . Dadurch werden alle Zeichnungen gefüllt, die mit dem Pinselwerkzeug erstellt wurden. Diese werden jetzt rot schattiert und nicht mehr mit Umrissen angezeigt.
    10. Klicken Sie in der Dropdown-Liste der Menüleiste auf Auswahl und Interpolieren. Dadurch werden schattierte Bereiche des Radius-Bones über alle Segmente hinweg ausgefüllt, die auf den erstellten Zeichnungen basieren.
      HINWEIS: Dadurch werden gelegentlich einige Knochenabschnitte übersehen. Bevor Sie fortfahren, scrollen Sie durch alle Segmente, um sicherzustellen, dass der Knochen allgemein identifiziert wurde. Wenn ein Abschnitt des Knochens übersehen wurde, verwenden Sie das Pinselwerkzeug, um diesen Bereich auf einigen Scheiben um den fehlenden Abschnitt herum zu kreisen, und wiederholen Sie die beiden obigen Schritte (1.3.9 und 1.3.10).
    11. Wenn der Radius vollständig identifiziert wurde, doppelklicken Sie im Abschnitt Materialien auf das Material mit dem Namen Innen und benennen Sie es in Radius um.
    12. Klicken Sie auf das Symbol Hinzufügen (+) unter dem Abschnitt Auswahl , um dieses Material als Material hinzuzufügen. Der Radius wird nun im Ansichtsfenster umrandet. Klicken Sie auf das Schlosssymbol für das Material Radius im Abschnitt Materialien , bevor Sie fortfahren. Dadurch wird sichergestellt, dass keine Änderungen an diesem Material vorgenommen werden.
    13. Führen Sie den gleichen Vorgang für den Ulna-Knochen durch. Klicken Sie im Abschnitt Materialien auf Hinzufügen , um ein neues Material zu erstellen. Doppelklicken Sie auf das neue Material und benennen Sie es in Ulna um.
    14. Wiederholen Sie die Schritte 1.3.6 bis 1.3.12 für den Ulna-Knochen.
    15. Nachdem Sie die Schritte für den Radius- und den Ulna-Knochen ausgeführt haben, entsperren Sie den Radius, indem Sie im Abschnitt Materialien auf das Schlosssymbol für das Radius-Material klicken. Wechseln Sie auf die Registerkarte Projekt, indem Sie unterhalb der Menüleiste auf Projekt klicken. Es gibt jetzt einen Datensatz mit dem Namen Marker, der auf den gefilterten Datensatz im Abschnitt Projektansicht angewendet wurde.
    16. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den gefilterten Datensatz, suchen Sie nach Marker Based Watershed Inside Mark (Image Segmentation) und wählen Sie aus. Legen Sie im Abschnitt Eigenschaften durch Klicken auf die Dropdown-Menüs die Daten als gefilterten Datensatz, die Markierungen als Markierungsdatensatz und die Binärmaske als Datensatz mit Schwellenwert fest und klicken Sie auf Übernehmen.
    17. Eine .grown-Datei wird im Abschnitt Projektansicht generiert. Klicken Sie auf die Zeichenfolge Volume Rendering , und ziehen Sie sie aus dem Schwellenwert in den Datensatz .grown, um die Segmentierung des Radius und des Ulna-Knochens im Anzeigefenster zu visualisieren.
    18. Um die .grown-Datei in 8-Bit zu konvertieren, klicken Sie auf den .grown-Datensatz, suchen Sie nach Convert Image Type und wählen Sie aus. Die .grown-Datei wird von 16-Bit in 8-Bit konvertiert.

2. Ausrichtung

  1. Achsausrichtung und Extraktion von Radius und Ulna
    HINWEIS: Wenn das aktuelle Modell der Anfangszeitpunkt ist, müssen alle Schritte abgeschlossen sein. Andernfalls beginnen Sie diesen Abschnitt mit Schritt 2.1.4. Um einen Querschnitt des Radius zu ermöglichen, muss das anfängliche Zeitpunktmodell senkrecht zur Ortho-Schnittebene ausgerichtet werden. Dieses Modell wird als Grundlage für die Ausrichtung in den folgenden Wochen dienen.
    1. Aktivieren Sie im Abschnitt Projektansicht den Ortho-Slice (falls deaktiviert) und klicken Sie dann auf den Datensatz .grown. Klicken Sie im Abschnitt Eigenschaften auf das Symbol Transformationseditor . Passen Sie mit dem Interaktionscursor den Winkel des Radius und der Ulna an, indem Sie auf die Ausrichtungspunkte der grünen Achse klicken, sodass der Ortho-Schnitt einen Querschnitt durch den Radius erstellt.
    2. Sobald dies ausgerichtet ist, muss ein neuer Datensatz erstellt werden, um diese Transformation zu speichern. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Datensatz .grown, suchen Sie nach Resample Transformed Image und wählen Sie aus.
    3. Klicken Sie auf das transformierte Bild neu berechnen und setzen Sie im Abschnitt Eigenschaften die Daten auf den Datensatz .grown, Interpolation auf den nächsten Nachbarn, Modus auf erweitert, Auf Voxelgröße beibehalten und Padding-Wert auf 0. Klicken Sie auf Übernehmen, und ein neuer .transformed-Datensatz wird erstellt.
    4. Um den Radius und die Ulna aus dem kombinierten Segmentierungsmodell zu extrahieren, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den .transformated-Datensatz, suchen Sie nach Extract Label und wählen Sie aus.
    5. Klicken Sie auf das Extract Label, setzen Sie im Abschnitt Properties (Eigenschaften) die Labels auf das .transformed-dataset, die Label-ID auf 1 und die Option Export to binary (In Binärdatei exportieren). Klicken Sie auf Übernehmen, und ein Ergebnisdataset wird erstellt.
    6. Klicken Sie auf die Zeichenfolge Volume Rendering, und ziehen Sie sie aus dem Datensatz .grown in den Datensatz Result . Klicken Sie auf den Ergebnisdatensatz und drücken Sie F2 , um die Datei umzubenennen (z.B. 'Knochengerüstmaterial' - 'WKX' - Radius).
    7. Wiederholen Sie die Schritte 2.1.4 bis 2.1.6 für die Ulna, indem Sie die Beschriftungs-ID auf 2 setzen und die Ergebnisdatei für Ulna umbenennen.
  2. Speichern und Öffnen von Längsbildern
    HINWEIS: Wenn das aktuelle Modell der Anfangszeitpunkt ist, müssen alle Schritte abgeschlossen sein. Andernfalls beginnen Sie diesen Abschnitt mit Schritt 2.2.2.
    1. Um die Datei zum ersten Zeitpunkt zu speichern, klicken Sie in der Dropdown-Liste der Menüleiste auf Datei, Projekt speichern unter und Speicherort des Dateiverzeichnisses festlegen . Legen Sie den Speichertyp als Amira-Projekt- und Datendateidatei (pack & go) (*.hx) fest und benennen Sie die Datei als Master-Version (z. B. 'Bone Scaffold Material'_ 'WKX' MASTER).
    2. Öffnen Sie die ursprüngliche Masterdatei zum Zeitpunkt (falls noch nicht geöffnet) und speichern Sie eine Kopie, indem Sie in der Dropdown-Menüleiste auf Datei, Projekt speichern unter und Dateiverzeichnisspeicherort festlegen klicken. Legen Sie den Speichertyp als Amira-Projekt- und Datendateien-Datei (pack & go) (*.hx) fest und benennen Sie die Datei (z. B. 'Bone Scaffold Material'_ 'WK0' und 'WKX'). Diese Datei wird verwendet, um den ursprünglichen Zeitpunkt mit den folgenden Wochen zu vergleichen, ohne die Masterdatei zu überschreiben.
    3. Öffnen Sie in der neuen Vergleichsdatei die Bilder für den Vergleichszeitpunkt, indem Sie im Abschnitt Projektansicht auf Daten öffnen klicken. Navigieren Sie im Popup-Fenster zum gewünschten Ordnerverzeichnis, um den Anfangszeitpunkt .dcm Dateien auszuwählen. Drücken Sie STRG+A, um alle Bilder auszuwählen, und klicken Sie auf Bilder öffnen.
    4. Ein Pop-up-Fenster enthält Informationen über den geöffneten Bilddatensatz. Klicken Sie auf OK , um fortzufahren.
    5. Eine Warnung zur Skalierung wird angezeigt. Klicken Sie auf In Gleitkommazahl konvertieren (die Standardoption), um fortzufahren.
    6. Das Datensatzsymbol wird im Abschnitt Projektansicht angezeigt. Um den Namen des Datensatzes zu ändern, klicken Sie einmal auf das Datensatzsymbol und drücken Sie F2. Sobald der gewünschte Name eingegeben wurde, klicken Sie auf OK. Zur Identifizierung des Scans kann ein Benennungsmuster erstellt werden (z. B. 'Knochengerüstmaterial' - 'WKX').
  3. Ausrichtung des Modells
    HINWEIS: In diesem Prozess wird die Ausrichtung der Radius-Bone-Segmentierungen erläutert. Das gleiche Verfahren kann bei Bedarf auf die Elle angewendet werden. Richten Sie nicht beide Knochen gleichzeitig aus. Dies führt zu Problemen mit der richtigen Ausrichtung.
    1. Deaktivieren Sie das Volumen-Rendering zum ersten Zeitpunkt. Im Anzeigefenster wird nichts angezeigt.
    2. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Vergleichsdatensatz (nachfolgende Woche), suchen Sie nach Ortho Slice, und wählen Sie aus.
    3. Wiederholen Sie Abschnitt 1 (beginnend mit Schritt 1.2), Abschnitt 2 (Schritt 2.1) gemäß den zusätzlichen Hinweisen für die Schrittnummern. Wenn Sie diese Abschnitte abgeschlossen haben, fahren Sie mit Schritt 2.3.4 fort. Nach Abschluss dieser Abschnitte wird die Segmentierung des Datensatzes der folgenden Woche erstellt und die Radius- und Ellenknochen extrahiert.
    4. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Vergleichsdatensatz (nachfolgende Woche) für den extrahierten Radius-Bone, suchen Sie nach Bildregistrierungs-Assistent, und wählen Sie aus. Legen Sie im Abschnitt Eigenschaften Data als Datensatz der Vergleichswoche für den extrahierten Radius-Bone und Reference als anfänglichen Zeitpunkt-Datensatz für den extrahierten Radius-Bone fest.
    5. Klicken Sie im Abschnitt Aktionen des Bildregistrierungs-Assistenten auf Überspringen für Schritt 1 von 4. Passen Sie für Schritt 2 und 3 von 4 mit dem Interaktionscursor das TabBox an den gemeinsamen Bereich zwischen dem Anfangszeitpunkt und den Vergleichswochen-Datensätzen an, indem Sie nach jedem Schritt unter Aktion auf Anwenden klicken. Legen Sie für Schritt 4 von 4 die Option "Metrik" auf "Korrelation", "Transformation" auf "Starr" und "Vorausrichtung" auf "Hauptachsen ausrichten" fest, und klicken Sie unter "Aktion" auf "Anwenden".
    6. Sobald die Datensätze ausgerichtet sind, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Vergleichsdatensatz (nachfolgende Woche) für den extrahierten Radius-Bone, suchen Sie nach Resample Transformed Image, und wählen Sie aus. Legen Sie im Abschnitt Eigenschaften die Daten als Datensatz der Vergleichswoche für den extrahierten Radius-Bone, Interpolation to Nearest Neighbor, Mode (Erweitert), Preserve to Voxel Size (Voxelgröße beibehalten) und Padding Value (Abstandswert) auf 0 fest, und klicken Sie auf Apply. Für den Vergleichsdatensatz wird ein neuer .transformed-Datensatz erstellt.

3. ROI-Auswahl und Ernte

HINWEIS: Führen Sie zuerst den ROI-Zuschnitt aus, um die Schichtnummern um den Bruch mit kritischer Größe zu bestimmen. Sobald diese Schnittzahlen bestimmt sind, können diese bei Bedarf zum gleichen Zeitpunkt für die Ulna verwendet werden. Bei diesem Vorgang kann das Zuschneiden nach dem Anwenden auf das Modell nicht mehr rückgängig gemacht werden.

  1. Kulturpflanze für die Region von Interesse
    1. Klicken Sie auf und aktivieren Sie den Ortho-Schnitt für den Anfangszeitpunkt und setzen Sie die Daten auf den Anfangszeitpunkt-Datensatz für den extrahierten Radius. Legen Sie die Ausrichtung so fest, dass die Ebene einen Querschnitt durch den Radius-Bone ergibt.
    2. Ändern Sie mithilfe des Schiebereglers Schichtnummer im Abschnitt Eigenschaften die Schichtnummer, um die proximalen und distalen Schichtpositionen zu bestimmen, die den Defekt mit kritischer Größe umgeben. Bestimmen Sie für beide Schichten die Schnittscheibe, die am distalsten und proximalsten ist, wo die Fraktur auf die Diaphyse des Radiusknochens trifft. Dokumentieren Sie die Slice-Nummer; Diese Zahl variiert je nach Modell.
    3. Klicken Sie auf und aktivieren Sie den Ortho-Slice für die Vergleichswoche und setzen Sie die Daten auf den ursprünglichen Zeitpunktdatensatz für den extrahierten Radius. Legen Sie die Ausrichtung so fest, dass die Ebene einen Querschnitt durch den Radius-Bone ergibt.
    4. Ändern Sie mithilfe des Schiebereglers Schichtnummer im Abschnitt Eigenschaften und mit dem Anfangszeitpunktdatensatz, der den distalen Ortho-Slice anzeigt, die Slice-Nummer der Vergleichswoche so, dass sie mit dem distalen Slice des ursprünglichen Zeitpunkts ausgerichtet ist. Die Visualisierungssoftware ermöglicht eine visuelle Überprüfung der Ausrichtung; Wenn sich die Slices überlappen, werden sie als einzelnes Slice im Anzeigefenster angezeigt.
    5. Notieren Sie sich die Schichtnummer für die distale Schicht des Datensatzes der Vergleichswoche. Wiederholen Sie Schritt 3.1.4 für die proximale Schnitte.
      HINWEIS: Bestimmen Sie als zusätzliche Überprüfung die Differenz zwischen der proximalen und der distalen Schicht sowohl für die Datensätze der Anfangs- als auch für die Vergleichswoche. Diese Werte müssen gleichwertig sein und einen gleichbleibend hohen ROI veranschaulichen.
    6. Klicken Sie auf den Anfangszeitpunkt für den extrahierten Radius. Klicken Sie im Abschnitt Eigenschaften auf das Werkzeug Zuschneideeditor .
    7. Geben Sie im Popup-Fenster des Zuschneideeditors die minimalen und maximalen Werte in das entsprechende X-, Y- oder Z-Feld ein (im Anzeigefenster ändert sich der ROI, wenn diese eingegeben werden). Nachdem Sie die Werte eingegeben haben, klicken Sie auf OK. Der Datensatz wird auf den Eingabe-ROI zugeschnitten.
    8. Wiederholen Sie Schritt 3.1.7 für den Datensatz der Vergleichswoche.

4. Analyse und Visualisierung

  1. Volumen-Analyse
    1. Um das Volumen des Anfangszeitpunktdatensatzes zu bestimmen, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den transformierten Anfangszeitpunktdatensatz für den extrahierten Radius, suchen Sie nach Materialstatistik und wählen Sie aus. Legen Sie im Abschnitt Eigenschaften Daten als anfänglichen Zeitpunkt fest, der für den extrahierten Radius transformiert wurde, legen Sie Als Materialien auswählen fest, und klicken Sie auf Anwenden. Eine neue . Der Datensatz MaterialStatistics wird für den Datensatz zum ersten Zeitpunkt erstellt.
    2. Klicken Sie auf die . MaterialStatistics-Datensatz für den Anfangszeitpunkt für den extrahierten Radius und klicken Sie im Eigenschaftenfenster auf Tabellenkalkulation anzeigen. Klicken Sie auf die Registerkarte Tabellen über dem Eigenschaftenfenster. Auf dieser Registerkarte wird das Volumen für den abgeschnittenen Anfangszeitpunkt-Datensatz für den extrahierten Radius angezeigt.
    3. Wiederholen Sie die Schritte 4.1.1 und 4.1.2 für den Datensatz der Vergleichswoche für den extrahierten Radius. Auf der Registerkarte "Tabelle " gibt es für den Anfangszeitpunkt und die Vergleichswoche separate Registerkarten, in die geklickt werden kann.
  2. Visualisierung von Datensätzen
    1. Um die Änderung des Knochenvolumens zu visualisieren, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den in die Vergleichswoche transformierten Datensatz für den extrahierten Radius, suchen Sie nach Arithmetik, und wählen Sie aus. Klicken Sie auf Arithmetik und setzen Sie im Eigenschaftenfenster Eingabe A als den in die Vergleichswoche transformierten Datensatz für den extrahierten Radius, setzen Sie Eingabe B als Anfangszeitpunkt-Datensatz für den extrahierten Radius, setzen Sie Eingabe C auf NO SOURCE, setzen Sie den Ergebnistyp auf Eingabe A, lassen Sie Option deaktiviert, setzen Sie Ergebniskanäle wie Eingabe A, und legen Sie Expression auf A-B fest.
    2. Klicken Sie auf den Ergebnisdatensatz und drücken Sie F2 , um die Datei umzubenennen (z.B. 'Knochengerüstmaterial' - 'WKX' - Knochenveränderung). Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf diesen Datensatz, suchen Sie nach Oberfläche generieren, und wählen Sie aus. Klicken Sie auf Oberfläche generieren und klicken Sie im Eigenschaftenfenster auf Übernehmen, und klicken Sie im Popup-Fenster auf Weiter. Es wird ein neuer .surf-Datensatz erstellt.
    3. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Dataset .surf, suchen Sie nach Surface View, und wählen Sie es aus. Eine Oberflächenansicht des arithmetischen Ergebnisses wird im Ansichtsfenster angezeigt.
    4. Um die Farbe der Oberflächenansicht zu ändern, klicken Sie im Fenster Projektansicht auf die Oberflächenansicht, und klicken Sie dann im Eigenschaftenfenster auf die Dropdown-Liste für Farben, und wählen Sie Konstante aus. Klicken Sie auf die Colormap und weisen Sie die bevorzugte Farbe zu.
    5. Um die Änderung des Knochenvolumens im Datensatz der ersten Woche anzuzeigen, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Datensatz .transformed, suchen Sie nach Extract Label, und wählen Sie aus. Klicken Sie auf die Bezeichnung "Extrahieren" und setzen Sie im Abschnitt "Eigenschaften" die Beschriftungen auf den Datensatz ".transformed", die Beschriftungs-ID auf 1 und die Option "In Binärdatei exportieren". Klicken Sie auf Übernehmen, und ein Ergebnisdataset wird erstellt. Klicken Sie auf den Ergebnisdatensatz und drücken Sie F2, um die Datei umzubenennen (z. B. 'Knochengerüstmaterial' - 'WKX' - Voll - Radius).
    6. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf diesen Datensatz, suchen Sie nach Oberfläche generieren, und wählen Sie aus. Klicken Sie auf Oberfläche generieren, und klicken Sie im Eigenschaftenfenster auf Übernehmen , und klicken Sie im Popup-Fenster auf Weiter. Es wird ein neuer .surf-Datensatz erstellt.
    7. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Dataset .surf, suchen Sie nach Surface View, und wählen Sie es aus. Eine Oberflächenansicht des arithmetischen Ergebnisses wird im Ansichtsfenster angezeigt.
    8. Um die Farbe der Oberflächenansicht zu ändern, klicken Sie im Fenster Projektansicht auf die Oberflächenansicht, und klicken Sie dann im Eigenschaftenfenster auf die Dropdown-Liste für Farben, und wählen Sie Konstante aus. Klicken Sie auf die Colormap und weisen Sie die bevorzugte Farbe zu.
    9. Um mit weiteren Wochen fortzufahren, kehren Sie zu Schritt 2.2.2 zurück.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

μCT-Bilder von drei einzigartigen Rattenmodellen, die jeweils mit einem Polycaprolacton (PCL)-Gerüst behandelt wurden, wurden untersucht, um positive Ergebnisse zu veranschaulichen. Die Analyse einer Längsschnittstudie über Zeitpunkte hinweg erfordert, dass die gesammelten Volumenmodelle vor der Auswahl und dem Zuschneiden auf einen ROI ausgerichtet werden. Um diese Fähigkeit über mehrere Wochen hinweg zu veranschaulichen, wurden Volumenmodelle, die in den Wochen 0 und 6 gesammelt wurden, anhand gemeinsamer Regionen ausg...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Quantifizierung der Knochenvolumenveränderung ist für die Untersuchung des Knochenregenerationspotenzials und der Ergebnisse in longitudinalen In-vivo-Studien unerlässlich. Dieses Protokoll baut auf etablierten μCT-Bildsegmentierungsmethoden11 auf und bietet einen systematischen Ansatz zur Spezifizierung eines benutzerdefinierten Region of Interest (ROI). Diese Technik war entscheidend bei der Analyse der Wirksamkeit von Knochengerüstimplantaten für <...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt offenzulegen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken Mark Kenney für die Schulung zu aktuellen Prozessen und Diskussionen bei der Entwicklung dieses Prozesses sowie Lindsay Schnur vom Biomechanics and Multimodal Tissue Imaging Core an der University of Rochester. Diese Studie wurde durch Zuschüsse von NIH/NIAMS unterstützt: H.A.A. (R01AR07061, P50AR072000 und P30AR069655) und V.Z.Z (T32GM007356, T32GM152318 und T32AR076950).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Amira 3DFEI SAS, ein Teil von Thermo Fisher Scientificv2024.1Programm zur Segmentierung von microCT-Bildern.
Graph Pad PrismaGraphPad Software GmbHv10.0.3 (217)Programm, das für die Entwicklung von Graphen verwendet wird.
R Statistische SoftwareDie R Foundation für statistisches Rechnenv4.4.0 (24.04.2024)Programm zur Durchführung der ICC-Analyse.
Scanco Medical VivaCT 40Scanco MedizinNAmicroCT-Scanner zur Erfassung von microCT-Bildern.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. ASTM Standard F-2721-09. Standard Guide for Pre-clinical in vivo Evaluation in Critical Size Segmental Bone Defects. , ASTM International. West Conshohocken, PA. (2023).
  2. Amini, A. R., Laurencin, C. T., Nukavarapu, S. P. Bone tissue engineering: recent advances and challenges. Crit Rev Biomed Eng. 40 (5), 363-408 (2012).
  3. Ghassemi, T., et al. Current concepts in scaffolding for bone tissue engineering. Arch Bone Jt Surg. 6 (2), 90-99 (2018).
  4. Tang, G., et al. Recent trends in the development of bone regenerative biomaterials. Front Cell Dev Biol. 9, 665813(2021).
  5. Battafarano, G., et al. Strategies for bone regeneration: from graft to tissue engineering. Int J Mol Sci. 22 (3), 1128(2021).
  6. Ghelich, P., et al. (Bio)manufactured solutions for treatment of bone defects with emphasis on US-FDA regulatory science perspective. Adv Nanobiomed Res. 2 (4), 2100073(2022).
  7. Kim, Y., Brodt, M. D., Tang, S. Y., Silva, M. J. MicroCT for scanning and analysis of mouse bones. Methods Mol Biol. 2230, 169-198 (2021).
  8. Wang, F., et al. Methods for bone quality assessment in human bone tissue: a systematic review. J Orthop Surg Res. 17, 174(2022).
  9. Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. J Bone Miner Res. 25, 1468-1486 (2010).
  10. Wee, H., Khajuria, D. K., Kamal, F., Lewis, G. S., Elbarbary, R. A. Assessment of bone fracture healing using micro-computed tomography. J Vis Exp. (190), e64262(2022).
  11. Kenney, H. M., et al. A high-throughput semi-automated bone segmentation workflow for murine hindpaw micro-CT datasets. Bone Rep. 16, 101167(2022).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Micro Computed TomographyBone Volume AnalysisLongitudinal ImagingRegion Of InterestCritical Sized DefectBone RegenerationImage RegistrationPolycaprolactone ScaffoldVolume QuantificationRat Bone Model

Related Articles