Methodenartikel

Multimodale optische Bildgebungsplattform zur Untersuchung des zellulären Stoffwechsels

DOI:

10.3791/67906

⸱

6. Juni 2025

 ,  ,  , 
1Shu Chien-Gene Lay Department of Bioengineering, University of California San Diego, 2Aiiso Yufeng Li Family Department of Chemical and Nano Engineering, University of California San Diego, 3Department of Electrical and Computer Engineering, University of California San Diego, 4Institute of Engineering in Medicine, University of California San Diego, 5Synthetic Biology Institute, University of California San Diego

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Unter Verwendung einer multimodalen Plattform, die markierungsfreie optische Bildgebungsmodalitäten kombiniert, haben wir ein Protokoll zur Visualisierung und Quantifizierung der zellulären Dynamik und des Stoffwechsels entwickelt. Durch Bildgebung mittels Multiphotonenfluoreszenz, Erzeugung der zweiten Harmonischen und stimulierte Raman-Streumikroskopie können wir einen ganzheitlichen Überblick über die zelluläre und molekulare Umgebung erhalten.

Zusammenfassung

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Optische Bildgebungstechnologien sind in biomedizinischen Studien von entscheidender Bedeutung, da sie sowohl morphologische als auch funktionelle Informationen aus biologischen Proben mit hoher räumlicher Auflösung erhalten können. Diese optischen Prozesse nutzen verschiedene Licht-Molekül-Wechselwirkungen wie Streuung, Absorption, Emission und harmonische Erzeugung zwischen Photonen und den Molekülen in Zellen, Geweben oder Organen. Während sich die konventionelle biomedizinische Bildgebung in der Vergangenheit auf die Anwendung einer einzigen Modalität konzentriert hat, haben neuere Forschungen gezeigt, dass diese verschiedenen Techniken komplementäre Erkenntnisse liefern und ihre kombinierten Ergebnisse ein umfassenderes Verständnis der molekularen Veränderungen in Alterungsprozessen und der Krankheitsentwicklung sowie der Grundlagen der Zellbiologie bieten.

In den letzten Jahrzehnten haben sich markierungsfreie optische Bildgebungsverfahren weiterentwickelt, die eine detaillierte Erforschung zellulärer und subzellulärer Umgebungen ermöglichen. So ermöglicht die Multiphotonenfluoreszenz (MPF) nicht nur die gezielte Bildgebung von Proteinen, sondern quantifiziert auch die Stoffwechselaktivität durch autofluoreszierende Coenzyme, wodurch eine hohe Eindringtiefe und räumliche Auflösung erreicht wird. Die zweite harmonische Erzeugung (SHG) wird verwendet, um Strukturen wie Kollagen in der extrazellulären Matrix abzubilden, während die stimulierte Raman-Streuung (SRS) chemische Bindungen und molekulare Zusammensetzung in situ mit subzellulärer Auflösung abbildet.

Wir haben eine multimodale Bildgebungsplattform entwickelt, die MPF-, SHG- und SRS-Modalitäten kombiniert. Die Integration dieser Modalitäten in eine einzige Plattform ermöglicht die Erfassung facettenreicher Informationen aus derselben Lokalisation in Zellen, Geweben, Organen oder sogar Körpern und ermöglicht so eine detailliertere Erforschung der komplizierten Beziehungen zwischen dem Zellstoffwechsel, der extrazellulären Matrixstruktur und der molekularen Zusammensetzung. Dieses multimodale System bietet subzelluläre Auflösung, tiefe Gewebepenetration, In-situ-Bildgebung von lebenden Zellen/Geweben sowie markierungsfreie Detektion und sofortige Koregistrierung, ohne dass Positionsanpassungen, Gerätewechsel oder Ausrichtung nach der Analyse erforderlich sind. Hier stellen wir ein Protokoll für die markierungsfreie Bildgebung mit dieser multimodalen Plattform vor und demonstrieren seine Anwendung bei der Charakterisierung des zellulären Stoffwechsels und der molekularen Heterogenität in Zellen und Geweben zur Untersuchung von Alterung und Krankheiten.

Einleitung

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Die optische biomedizinische Bildgebung hat entscheidend dazu beigetragen, unser Verständnis der biologischen Struktur und Funktion zu verbessern. Die Bilder werden durch die Modulation von Anregungslicht und die Detektion von Signalen aus Licht-Gewebe-Wechselwirkungen erzeugt. Das erste zusammengesetzte Mikroskop, das um 1590 von Hans und Zacharias Janssen entwickelt wurde, verwendete zwei konvexe Linsen in einem Tubus, die eine Vergrößerung von bis zu 30x1 ermöglichten. Moderne optische Mikroskope können nach jahrhundertelangen Fortschritten heute Auflösungen von bis zu 1-3 nmerreichen 2,3. Fortschrittliche Bildgebungssysteme bieten nicht nur eine hohe Auflösung, sondern bieten jetzt auch eine tiefere Gewebepenetration, eine höhere Effizienz und minimale Probenschäden, wodurch sie sich besonders für die Bildgebung von lebenden Zellen und Geweben eignen. Die markierungsfreie Bildgebung ist besonders vorteilhaft, da sie Informationen erfasst, ohne intrazelluläre Prozesse zu stören oder die Probenintegrität zu beeinträchtigen.

Die Multiphotonen-Fluoreszenzmikroskopie (MPF), insbesondere die Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie, wird in großem Umfang für die markierungsfreie Bildgebung eingesetzt. Im Gegensatz zur herkömmlichen Fluoreszenzmikroskopie, die auf linearer Einzelphotonenabsorption und -emission beruht, beinhaltet die MPF-Anregung die gleichzeitige Absorption mehrerer Photonen, deren kombinierte Energie ein einzelnes Fluorophormolekülanregt 4,5. Diese Photonen, typischerweise im Infrarotspektrum, besitzen die Hälfte oder weniger der Energie, die für die Einzelphotonenanregung erforderlich ist. Die längeren Wellenlängen und die lokalisierte Anregung im Brennpunkt dieses nichtlinearen Prozesses führen zu einer geringeren Streuung, einer tieferen Gewebepenetration und einer verringerten Phototoxizität.

Zelluläre Stoffwechselinformationen können durch markierungsfreie MPF-Mikroskopie durch den Nachweis von Autofluoreszenzsignalen von endogenen Stoffwechselsubstraten wie reduziertem Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NADH) und Flavinadenin-Dinukleotid (FAD) erfasst werden. Diese Coenzyme weisen unterschiedliche Anregungs- und Emissionsspektren auf, und ihr Fluoreszenzintensitätsverhältnis, das als Redoxverhältnis (NADH/FAD) bekannt ist, spiegelt den oxidativen Zustand der Zelle wider. Seit Britton Chance 1979 das Konzept des Redox-Verhältnisses erstmals eingeführt hat, wurden zusätzliche Verhältnisse, darunter NAD(P)H/FAD, NAD(P)H/(FAD + NAD(P)H) und FAD/(FAD + NAD(P)H), vorgeschlagen 6,7,8,9. Die Quantifizierung dieser optischen Redoxverhältnisse mittels MPF-Bildgebung liefert wertvolle Einblicke in die Stoffwechseldynamik. Zum Beispiel kann die MPF-Bildgebung Krebszellen von normalen Zellen anhand ihres veränderten Stoffwechsels unterscheiden, was ihr Potenzial für die Krebsdiagnose demonstriert 10,11,12. Die MPF-basierte Autofluoreszenzdetektion hat jedoch Grenzen. Andere intrinsische Fluorophore, wie z. B. Keratin, können zur Fluoreszenzintensität beitragen, was zu spektralem Übersprechen und ungenauer Signalinterpretation führt13. Darüber hinaus spiegelt das Redoxverhältnis nur die gesamten zellulären Oxidations-Reduktionsänderungen wider und unterscheidet nicht zwischen NADH aus verschiedenen Quellen (z. B. zytoplasmatisch oder mitochondrial) oder zwischen NADH und NAD(P)H, da beide ähnliche spektrale Peaks bei 450 nm aufweisen, was zu gemischten Intensitätssignalen führt14.

Second Harmonic Generation (SHG), ein nichtlineares optisches Verfahren, das erstmals in den 1980er Jahren im biomedizinischen Bereich demonstriert wurde, wurde in großem Umfang für die markierungsfreie Abbildung zellulärer Strukturen eingesetzt15,16. Ähnlich wie bei der MPF werden bei der SHG zwei Photonen gleicher Energie von einem ultraschnell gepulsten Laser absorbiert. Diese Photonen werden rekombiniert, um ein neues Photon mit der doppelten Frequenz des einfallenden Lichts zu emittieren, was zur Detektion des Signals der zweiten Harmonischen führt. Diese nichtlineare optische Wechselwirkung tritt ausschließlich in nicht-zentrosymmetrischen Materialien auf, die eine Suszeptibilität ungleich Null zweiter Ordnung aufweisen, eine Polarisation zur Erzeugung des zweiten harmonischen Signals zu induzieren17,18. Dies macht SHG besonders effektiv für die Abbildung von filamentösen Proteinen und fibrillären Strukturen, wie Kollagen, Myosin und Tubulin, ohne dass exogene Fluoreszenzfarbstoffe erforderlich sind 15,17,19,20. Die Anomalie in Bezug auf Abundanz, Steifigkeit, Ausrichtung und Struktur von Fibrose und Kollagen ist bei vielen Erkrankungen wie Entzündungen und Krebs weit verbreitet, was SHG zu einem vielversprechenden Werkzeug für die effiziente und nicht-invasive Erkennung bestimmter Krankheitszustände macht 21,22,23. Die weit verbreitete Anwendung der SHG-Bildgebung in der onkologischen Forschung, einschließlich Studien zu Brust-, Eierstock- und Hautkrebs, hat ihre entscheidende Rolle sowohl in der Grundlagenforschung als auch in potenziellen klinischen Anwendungen hervorgehoben 24,25,26,27.

Verschiedene Moleküle weisen unterschiedliche Schwingungsenergieniveaus auf, die bei Anregung durch einfallendes Licht unterschiedliche Grade an inelastischer Streuung hervorrufen - ein Phänomen, das erstmals 1928 von C. V. Raman charakterisiertwurde. Der Raman-Effekt wird seither in der optischen Mikroskopie ausgiebig genutzt, um Molekül- und Gewebezusammensetzungen ohne exogene Markierung nachzuweisen. Sowohl die stimulierte Raman-Streuung (SRS) als auch die kohärente Anti-Stokes-Raman-Streuung (CARS) regen molekulare Schwingungen kohärent an und nutzen die nichtlineare Wechselwirkung des Lichts, um ein stärkeres Signal im Vergleich zur herkömmlichen spontanen Raman-Spektroskopie zu erzeugen. Das SRS-Phänomen wurde erstmals 1962 berichtet29. Im Jahr 2008 wurde dieser Mechanismus in die dreidimensionale Multiphotonen-Bildgebung integriert, was eine selektive Detektion von Chemikalien auf der Grundlage von Intensitätsänderungen in den Pump- und Stokes-Strahlen aufgrund molekularer Schwingungsübergängeermöglicht 30. Diese Methode minimiert nicht-resonante Hintergrundinterferenzen und erzeugt ein sauberes Intensitätssignal, das das von CARS übertrifft. Die SRS-Bildgebung zeichnet sich durch Multiplex- und Hyperspektralbildgebung aus, die den gleichzeitigen Nachweis mehrerer chemischer Bindungen ermöglicht und eine hochauflösende Visualisierung der molekularen Zusammensetzung in Proben mit beträchtlicher Eindringtiefe ermöglicht. Obwohl es sich um eine relativ neue Technik handelt, hat sich die SRS-Bildgebung sowohl in der klinischen Diagnostik als auch in der Stoffwechselforschung sowohl in vivo als auch in vitro als wirksam erwiesen 30,31,32,33,34,35,36. Zum Beispiel kann SRS Hirntumor-infiltriertes Gewebe von der Hirnrinde und der weißen Substanz unterscheiden, indem es das Lipid-Protein-Verhältnis quantifiziert, was die Abgrenzung von Tumorrändern auf markierungsfreie, nicht-invasive Weise ermöglicht37,38. Darüber hinaus können metabolische Veränderungen, die oft als Kennzeichen altersbedingter und krebsassoziierter Krankheiten angesehen werden, mit Hilfe von SRS quantitativ bewertet werden, indem Kohlenstoff-Deuterium-Bindungen in Proben nachgewiesen werden, die mit schwerem Wasser (D2O) behandelt wurden, was eine quantitative Messung der Proteinsynthese, der Lipogenese und anderer makromolekularer Stoffwechselprozesse ermöglicht 31,33,34,35,36. Die Fähigkeit, Metaboliten mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung zu verfolgen, positioniert SRS als vielversprechendes Werkzeug für die Erforschung und Diagnose von Krankheiten mit Potenzial für breitere klinische Anwendungen.

Die multimodale Bildgebung hat sich zu einem leistungsstarken Ansatz in der biomedizinischen Forschung entwickelt, bei dem zwei oder mehr Bildgebungsmodalitäten integriert werden, um ein umfassenderes Verständnis komplexer biologischer Systeme innerhalb derselben Probe zu erlangen. Im Jahr 2018 wurde eine markierungsfreie Autofluoreszenz-Multiharmonische (SLAM)-Mikroskopietechnik eingeführt, die Zwei-Photonen-Fluoreszenz (2PF), Drei-Photonen-Fluoreszenz (3PF), SHG und dritte Harmonische (THG) integriert39. Dieser Ansatz ermöglicht die gleichzeitige Visualisierung von zellulären Interaktionen, dynamischen Prozessen und einzelnen Komponenten innerhalb der Tumormikroumgebung. Die SLAM-Mikroskopie bietet minimale Störungen und reduzierte Anforderungen an die Laserleistung der Probe, ermöglicht eine tiefe Gewebeprofilierung und bietet eine sicherere Methode für das intravitale Monitoring40. Eine weitere multimodale Modalität, die intrinsische Fluoreszenzspektroskopie, diffuse Reflexionsspektroskopie und Raman-Spektroskopie kombiniert, wurde für die In-situ-Krebserkennung bei chirurgischen Eingriffen entwickelt41. Darüber hinaus hat ein kürzlich entwickeltes multimodales nichtlineares Endoskopiesystem, das CARS, SHG und Zwei-Photonen-Fluoreszenz (TPF) integriert, die Fähigkeit demonstriert, biologische Proben mit räumlicher Auflösung im Submikrometer- und subzellulären Bereich abzubilden42. Die kombinierte 2PF- und SRS-Mikroskopie wurde in ähnlicher Weise für die hochauflösende In-vivo-Bildgebung von Geweben, Zellen und Organellen eingesetzt 42,43,44,45. Diese aufkommenden multimodalen Bildgebungsverfahren nutzen die Stärken einzelner Modalitäten, was zu einer verbesserten Auflösung, Eindringtiefe und Bildaufnahmeeffizienz führt und somit ein erhebliches Potenzial für klinische und chirurgische Anwendungen aufweist.

Dieser multimodale Ansatz wird zunehmend gegenüber der einzelmodalen Bildgebung bevorzugt, da er ein breiteres Spektrum an Messungen bietet und gleichzeitig die mit einzelnen Techniken verbundenen Einschränkungen abschwächt. Wie bereits erwähnt, misst MPF die endogene Fluoreszenz, um metabolische Veränderungen widerzuspiegeln, SHG kann nicht-zentrosymmetrische Strukturen wie Kollagen in biologischen Proben abbilden, und SRS erkennt aufgrund der hohen Dichte chemischer Bindungen, die aufgrund ihrer Schwingungsmoden unterschiedliche Raman-Signale erzeugen, überwiegend Proteine und Lipide. Aufgrund ihrer kohärenten Eigenschaften und des gemeinsamen Prinzips nichtlinearer optischer Eigenschaften können diese Bildgebungsmodalitäten unter Verwendung von ultrakurzgepulsten Lasern in einen einzigen Mikroskopaufbau integriert werden, was die Erfassung verschiedener Biomarker in lokalisierten Regionen ermöglicht, um ein vollständigeres Bild der biologischen Prozesse zu erhalten44,45. In diesem Artikel wird ein Protokoll für die Implementierung einer multimodalen Bildgebungsplattform vorgestellt, die MPF, SHG und SRS für biomedizinische Forschungsanwendungen integriert.

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Protokoll

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1. Markierungsfreie multimodale Bildgebungsexperimente

HINWEIS: Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Einrichtung und das Erfassungsverfahren der markierungsfreien multimodalen Bildgebung.

  1. Aufbau des multimodalen Mikroskops (Abbildung 1A) und Systemkalibrierung
    1. Den Laser aufwärmen und ca. 15-20 Minuten warten.
    2. Schalten Sie die Steuergeräte und Monitore in der folgenden Reihenfolge ein: Schaltkasten | Touchpanel-Steuerung | Netzteil für die Haupt-Laser-Fernbedienung Netzteil für die Sub-Laser-Fernbedienung.
    3. Schalten Sie den Si-Fotodiodendetektor und den Lock-in-Verstärker ein.
    4. Konfigurieren Sie die Pumplaserstrahlen und den Stokes-Strahl. Richten Sie das Lasersystem mit einem Pumpstrahl ein, der von 780 nm bis 990 nm abstimmbar ist, einer Pulsbreite von 5 bis 6 ps und einer Wiederholrate von 80 MHz. Der Stokes-Laserstrahl hat eine feste Wellenlänge von 1.031 nm mit einem Puls von 6 ps und einer Wiederholrate von 80 MHz . Stellen Sie sicher, dass sowohl die Pumpen- als auch die Stokes-Strahlen eine geringe Leistung (mindestens 20 mW) haben, damit sie auf der Ausrichtungsplatte sichtbar sind.
    5. Platzieren Sie eine Ausrichtungsplatte im Strahlengang (direkt nach der Laserbox), um die räumliche Überlappung der Pumpen und Stokes-Strahlen zu überprüfen, und stellen Sie den Spiegel so ein, dass sich beide Punkte in der Mitte der Ausrichtungsplatte überlappen.
      HINWEIS: Obwohl sich die Pumpen und Stokes-Strahlen grob überlappen, kann durch Feinabstimmung der räumlichen Überlappung zweier Laserstrahlen das optimale SRS-Signal erreicht werden.
    6. Nach der räumlichen Überlappung nehmen Sie die Feinabstimmung mit dem PSD (Position Sensitive Detector) vor, indem Sie zuerst auf die OPO-Steuerungssoftware klicken. Verwenden Sie die Hexadezimaltaste , um den optischen Spiegel 1 (OM1) vorsichtig einzustellen, und beobachten Sie die PSD-Anzeige auf die Änderung der X-Y-Position, um die minimale Abweichung von der Mitte zu erreichen. Um genauere Einstellungen vorzunehmen, verwenden Sie dann den Inbusschlüssel am optischen Spiegel 2 (OM2), bis die Positionsanzeige auf dem PSD-Display zentriert ist.
      HINWEIS: OM1 und OM2 sind zwei Spiegel im OPO-Kopf, um die Laserausrichtung einzustellen.
    7. Zentrieren Sie abschließend den Kondensor, indem Sie die beiden Zentrierschrauben des Kondensors drehen, um das Bild der Irisblende in die Mitte des Sichtfelds zu verschieben.
      HINWEIS: Die Feldblende kann den Durchmesser des in das Objektiv eintretenden Lichtstrahls begrenzen und so Fremdlicht ausschließen, wodurch der Bildkontrast verbessert wird.
  2. Markierungsfreie multimodale Bildgebungsschritte
    1. Tragen Sie Öl auf den Ölkondensator mit hoher numerischer Apertur (1,4 NA) auf und montieren Sie den Objektträger auf den geölten Kondensor. Zum Schluss legen Sie einen großen Wassertropfen auf den Objektträger für das 25x Wasserobjektiv. Stellen Sie sicher, dass das Mikroskop sicher montiert und unbeweglich ist, und stellen Sie dann den Z-Tisch so ein, dass der Fokus eingestellt wird, bis das Hellfeldbild der biologischen Probe unter dem 25-fach-Wasserobjektiv zu sehen ist.
    2. Beginnen Sie den Bildgebungsprozess in der richtigen Reihenfolge: MPF, SHG und SRS, um Photobleaching zu vermeiden, das sich auf die Bildqualität und die präzise Analyse von MPF auswirkt. Um schnell zwischen MPF und SHG zu wechseln, wechseln Sie vom Pumpbalken auf den festen Stokes-Strahl.
      HINWEIS: Das Einstellen des Pumplasers von 800 nm (NADH- und FAD-Autofluoreszenz) auf 791,3 nm (CH3 Raman-Verschiebung) kann 1-2 Minuten dauern.
    3. Wählen Sie für jede Modalität die Bildauflösung (512 x 512 Pixel) und die passende Verweilzeit aus. Verwenden Sie 8 μs/Pixel für MPF und SHG mit einem durchschnittlichen Frame über 3. Verwenden Sie 40 μs/Pixel mit einem durchschnittlichen Frame 2 für die SRS-Modalität.
      HINWEIS: Der durchschnittliche Rahmen bezeichnet die Anzahl der Bilder, die vor dem Speichern gemittelt werden sollen.
    4. Um Autofluoreszenz mit MPF zu erhalten, schalten Sie den Stokes-Laserstrahl aus und stimmen Sie den Pumplaser auf 800 nm ab, um NADH und Flavin anzuregen. Bauen Sie den FVOPT-Filterwürfel mit 460 ± 10 nm bzw. 515 ± 10 nm für NADH bzw. Flavin in den Strahlengang ein. Die Leistung der Probe beträgt somit ca. 15 mW.
    5. Erfassen Sie das Kollagenfasersignal mit SHG. Schalten Sie den Pumplaserstrahl aus, verwenden Sie nur den Stokes-Laserstrahl und stellen Sie die Leistung auf 500 mW ein. Erfassen Sie nur den Kanal, der sich auf den 515-nm-Filter bezieht.
    6. Erhalten Sie die räumliche Verteilung von Proteinen und Lipiden mit SRS. Lassen Sie beide Laserstrahlen eingeschaltet und passen Sie die Frequenz des Laserstrahls an den spezifischen Schwingungsmodus für jedes Molekül an.
      HINWEIS: Typischerweise wird 791,3 nm für CH3, 797 nm für CH2, 787 nm für ungesättigte Lipide und 794,6 nm für gesättigte Lipide verwendet. Die Leistung der Probe beträgt somit ca. 40 mW.
    7. Um die hyperspektralen SRS-Bilddatensätze zu erfassen, öffnen Sie die OPO-Steuerungssoftware, um Sweep auszuwählen, den Wellenlängenbereich von 780 nm bis 806,5 nm einzustellen und eine Stack-Nummer von mindestens 60 auszuwählen. Erfassen Sie dann den hyperspektralen Bildstapel.
      HINWEIS: Der resultierende Datensatz enthält 60 Bilder, die jeweils die räumliche Verteilung bei einer bestimmten Raman-Verschiebung (von 2.700 cm-1 bis 3.150 cm-1) darstellen. Die Zeit für die hyperspektrale Erfassung hängt vom Sichtfeld (FOV) des Bildes und der Scanzeit ab, liegt jedoch bei einem Bild mit 512 x 512 Pixeln etwa zwischen 5 und 8 Minuten. Bei größeren Bildern sollte darauf geachtet werden, die Dauer unter dem Laser zu minimieren, um Lichtschäden zu vermeiden, die nach 2 Stunden auftreten können (abhängig von der Dicke der Probe und der FOV-Größe).
    8. Speichern Sie alle Bilder derselben Regions of Interest (ROIs) im selben Ordner. Das Bildformat ist die Olympus .oir-Datei.

2. Bildanalyse

  1. Verwenden Sie eine Bildbearbeitungssoftware, um alle gespeicherten Rohbilder zu öffnen, die Farbe zuzuweisen und die Maßstabsleiste für die Bildanzeige hinzuzufügen. Verwenden Sie es auch, um die binäre Maske von NADH- und Sättigungsfettsäuren (SFAs, 2.880 cm-1) für die Analyse des optischen Redoxverhältnisses und der Lipidunsättigung zu erstellen.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Maskenintensität nur 0 und 1 hat.
  2. Verwenden Sie das selbst erstellte Python-Skript, um nachgelagerte Analysen durchzuführen (der Code ist unter https://github.com/lingyanshi2020/HSI_Analysis verfügbar).
    HINWEIS: Dieses Skript wurde entwickelt, um mehrere Regionen von Interesse (Regions of Interest, ROIs) sowohl aus Kontroll- als auch aus Krebsproben zu verarbeiten. Die Hauptfunktion des Skripts benötigt nur zwei Eingaben: die Dateipfade für die Ordner control und cancer image.
    1. Durchlaufen Sie die Ordner und ordnen Sie Bilder mit demselben Basisnamen zu (z. B. "roi_1_flavin.tif", "roi_1_nadh.tif", "roi1_mask.tif").
    2. Lassen Sie das Skript für jeden Satz übereinstimmender Bilder eine ratiometrische Analyse durchführen und basierend auf diesen Berechnungen neue ratiometrische Bilder generieren.
      Das optische Redoxverhältnis wird als Flavin / (NADH + Flavin) berechnet.
      Die Lipidunsättigung wird wie folgt berechnet: USFAs / (SFAs + USFAs), wobei USFAs ungesättigte Fettsäuren darstellen.
    3. Alle ratiometrischen Werte aus den Bildern werden dann in einem Pandas DataFrame gespeichert, um sie leicht bearbeiten zu können. Führen Sie eine unidirektionale ANOVA durch und verwenden Sie matplotlib mit styple "ggplot" oder seaborn, um den Barplot oder Boxplot zur Quantifizierung durchzuführen.
    4. Verwenden Sie die Bilder 2.930 cm-1 (3CH) und 2.850 cm-1 (2CH), um ein subtrahiertes Bild (3 bis 2CH) zu erzeugen. Mischen Sie dann das CH2-Bild CH3 - CH2-Bild im RGB-Farbraum mit einer benutzerdefinierten LUT, die die H&E-Färbung nachahmt, um das digitale Histologiebild46 zu erzeugen.
  3. Verwenden Sie nach der Erfassung von hyperspektralen SRS-Bildern das selbst erstellte Python-Skript, um das k-Means-Clustering durchzuführen und die Bilder basierend auf spektralen Ähnlichkeiten zu segmentieren (der Code ist unter https://github.com/lingyanshi2020/HSI_Analysis verfügbar).
    1. Laden Sie die .tiff Bildstapel mit dem tifffile-Paket. Formen Sie den hyperspektralen SRS-Bildstapel (x, y, Spektren) in ein 2D-Array (Pixel, Spektren) um.
    2. Verwenden Sie das scikit-learn-Paket, um den k-means-Algorithmus mit der definierten Anzahl von Clustern für dieses 2D-Array bereitzustellen.
    3. Passen Sie die resultierenden Cluster-Beschriftungen wieder in die ursprünglichen Bildabmessungen an, und erstellen Sie eine Segmentierungskarte.
    4. Weisen Sie jedem Cluster eindeutige Farben zu und erzeugen Sie ein Falschfarbenbild, das unterschiedliche biochemische Zusammensetzungen im Gewebe darstellt.
    5. Verwenden Sie matplotlib, um die Spektren jedes Clusters mit Mittelwert (durchgezogene Linie) und Standardabweichung (Schattenbereich) darzustellen
    6. Befolgen Sie das Protokoll des PRM-SRS-Protokolls (Penalized Reference Matching SRS) unter Verwendung von MATLAB, um die räumliche markierungsfreie Lipid-Subtyp-Detektion mit SRS-hyperspektralen Bilddatensätzenzu erstellen 47.
    7. Organisieren Sie die Bilder und speichern Sie sie in einem .tif-Format mit 300 dpi.

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Ergebnisse

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Die Bilder in Abbildung 2 sind repräsentativ für die Ergebnisse, die aus der Befolgung des Protokolls zur Erfassung der Autofluoreszenz von FAD und NADH sowie der vier SRS-Kanäle für Protein, Gesamtlipide, ungesättigte Lipide und gesättigte Lipide erzielt wurden. Auch hier erzeugen wir ein pseudo-histologisches Bild, wie es im Protokoll durch RGB-Farbmischung beschrieben ist. Die Erfassung der MPF- und SRS-Kanäle liefert die Bilddateien, die später in der ratiometrischen Analyse verwendet we...

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Diskussion

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Dieses multimodale System ist eine leistungsstarke Bildgebungsplattform für die Erfassung einer ganzheitlichen Visualisierung der molekularen Umgebung von Proben über ein breites Spektrum biologischer Herkunft und pathologischer Zustände hinweg. Der Vorteil der Nutzung verschiedener markierungsfreier Modalitäten liegt in der Fähigkeit, komplementäre Informationen zu erhalten und spezifische Analyten zu adressieren, die sonst mit einer einzigen markierungsfreien Bildgebungstechnik schwier...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.

Danksagungen

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Wir danken Dr. Gloria Pryhuber und ihren HuBMAP-Teammitgliedern für die Bereitstellung von menschlichen Lungengewebeschnitten. Wir danken Dr. Kun Zhang für die Bereitstellung von menschlichem Gehirngewebe. Wir danken auch Dr. Gen-Sheng Feng für die Bereitstellung von Leberproben von Mäusen. Wir danken der Unterstützung durch NIHU54DK134301, NIH R01GM149976, NIH U01AI167892, NIH R01HL170107, NIH 5R01NS111039, NIH R21NS125395, NIH U54CA132378, UCSD Startup Funds, Sloan Research Fellow Award und CZI DAF2023-328667 Award.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
460 nm FilterCube OlympusOCT-ET 460/50M32
BandpassfilterKR ElectronicsKR27248 MHz
BNC 50 Ohm TerminatorMini CircuitsSTRM-50
DC NetzteilTopWard6302D
Dichroitische MontierungThorlabsKM100CL
FIJI ImageJImageJ
Ölkondensator mit hohem NA-GehaltOlympus6-U130
Kurzpassfilter mit hohem AußendurchmesserThorlabs950 nm
Inverses Laser-Scanning-MikroskopOlympusFV1200MPE
Lock-in-VerstärkerZurich Instruments
picoEmerald Laser SystemAngewandte Physik & Elektronik, Inc.  Synchronisierter gepulster Pumpbalken (einstellbar 720– 990&dünnsp; nm Wellenlänge, 5– 6&dünnsp; ps Pulsbreite und 80  MHz Wiederholrate) und Stokes (Wellenlänge bei 1032  nm, 6  ps Pulsbreite und 80  MHz Wiederholrate)
SI Photodiode DetektorSelbstgebauter
ControllerOlympus
VF-300 Kompresstom Präzise
Touch Panel

Referenzen

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