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Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen myeloischen Zellen und CAR-T-Zellen in vitro und in vivo

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DOI:

10.3791/68013

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25. Juli 2025

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1T Cell Engineering, Mayo Clinic, 2Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, 3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, 4Division of Hematology, Mayo Clinic, 5Department of Immunology, Mayo Clinic

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Angesichts der begrenzten Xenotransplantat-Modelle, die zur Untersuchung von Interaktionen zwischen humanen CART- und myeloischen Zellen zur Verfügung stehen, haben wir in vitro und in vivo Modelle etabliert, um die Auswirkungen menschlicher Makrophagen auf CART-Zellen zu verstehen. Die Ergebnisse können möglicherweise verallgemeinert werden, um die Rolle von Makrophagen in der Tumormikroumgebung zu bewerten und Makrophagen-gezielte Immuntherapien zu testen.

Zusammenfassung

Die Therapie mit chimären Antigenrezeptor-T (CART)-Zellen hat zu bemerkenswerten klinischen Erfolgen bei der Behandlung hämatologischer Malignome geführt. Die meisten Patienten erleiden jedoch innerhalb von 1-2 Jahren einen Rückfall. Mehrere Mechanismen, die zu CART-Resistenz führen, wurden identifiziert, darunter die Hemmung von T-Zellen durch immunsuppressive myeloische Zellen. Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass Monozyten und Makrophagen in der Tumormikroumgebung (TME) zu einer schlechten CART-Leistung und schlechten klinischen Ergebnisse beitragen. Präklinische Modelle zur Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen menschlichen Makrophagen und CART-Zellen sind begrenzt. Hier diskutieren wir Ansätze, um die Auswirkungen menschlicher Makrophagen auf CART-Zellen sowohl in vitro als auch in vivo zu verstehen. Wir beschreiben in vitro Kokulturmodelle, um zu zeigen, dass immunsuppressive Makrophagen die CART-Funktionen hemmen. Darüber hinaus berichten wir über ein Xenotransplantat-Modell, bei dem humane Makrophagen und Tumorzellen subkutan in NSG-Mäuse transplantiert werden, um M2-ähnliche Makrophagen-Interaktionen mit CART-Zellen und Tumorzellen zu untersuchen. Diese Modelle können verwendet werden, um die Rolle von Makrophagen in der TME zu bewerten und Makrophagen-gezielte Krebsimmuntherapien zu testen.

Einleitung

Die autologe chimäre Antigenrezeptor-T-Zelltherapie (CART) hat klinische Erfolge bei der Behandlung von rezidivierten oder refraktären hämatologischen Malignomen erzielt, was zur Zulassung von sechs CART-Produkten durch die US-amerikanische FDA geführt hat, die auf CD19 oder das B-Zell-Reifungsantigen (BCMA)1 abzielen. Trotz der beeindruckenden anfänglichen Aktivität der CART-Zelltherapie erleiden die meisten Patienten innerhalb der ersten 1-2 Jahre nach der Behandlung einen Rückfall2. Es wurden mehrere Mechanismen der CART-Resistenz identifiziert, darunter eine suboptimale T-Zell-Fitness, Antigen-Escape und schlechte CART-Persistenz sowie eine Hemmung, die durch die immunsuppressive Tumormikroumgebung (TME) vermittelt wird2,3. Myeloische Zellen wie Monozyten und Makrophagen machen oft einen signifikanten Teil der TME aus und haben sich als wichtige Inhibitoren anderer Immunzellen, einschließlich T-Zellen, erwiesen 4,5. Die nachteiligen Wirkungen myeloischer Zellen im Rahmen der therapeutischen Wirksamkeit von CART-Zellen wurden in präklinischen Modellen und in klinischen Studien sowohl an hämatologischen als auch an soliden Tumoren berichtet 3,6. Eine myeloische Hemmung kann ab Beginn des CART-Herstellungsprozesses auftreten -- es wurde gezeigt, dass Monozyten im Startaphereseprodukt die ex vivo CART-Expansion hemmen 7,8. Angesichts der zunehmenden Beweise für eine myeloische CART-Hemmung haben viele Studien darauf abgezielt, CART-Zellen so zu entwickeln, dass sie immunsuppressive Makrophagen in TME angreifen und eliminieren, um eine bessere Immunantwort zu erzielen5. Die Mechanismen, die hinter den Wechselwirkungen zwischen CART-Zellen und immunsuppressiven Makrophagen stehen, sind jedoch noch nicht vollständig geklärt. Darüber hinaus gibt es nur begrenzte öffentlich zugängliche Xenotransplantat-Modelle dieser Interaktionen. Daher besteht ein dringender Bedarf an Modellen, die die Wechselwirkungen zwischen menschlichen Makrophagen und CART-Zellen sowohl in vitro als auch in Mausmodellen untersuchen.

Hier beschreiben wir eine Methode, bei der humane CD19-targeted CART (CART19) Zellen mit CD19+ Tumorzellen und ex vivo polarisierten M2-ähnlichen Makrophagen kokultiviert werden. Darüber hinaus berichten wir über ein Xenotransplantat-Mausmodell, in dem immundefiziente Mäuse sowohl mit Zielzellen als auch mit humanen Makrophagen subkutan transplantiert werden, was die Bewertung von Immuntherapien von Interesse in einem Setting mit immunsuppressiven Makrophagen ermöglicht. Insbesondere analysierten wir die CART-Antigen-spezifische Proliferation in Gegenwart oder Abwesenheit von immunsuppressiven Makrophagen in vitro und zeigten eine signifikante Hemmung der T-Zell-Expansion sowohl in Transwell- als auch in direkten Co-Kulturplatten. In unserem Xenotransplantat-Modell wurden NSG-Mäuse subkutan mit Tumorzellen und humanen Makrophagen transplantiert, die in Matrigel suspendiert waren, um das Therapie-Screening durchzuführen. In diesem Tiermodell konnte erfolgreich gezeigt werden, dass ex vivo differenzierte immunsuppressive humane Makrophagen in der Lage waren, die Tumorprogression in NSG-Mäusen zu fördern. Durch die Befolgung dieses Protokolls kann die Wirksamkeit von immunsuppressiven Makrophagen-zielgerichteten Therapeutika getestet werden, einschließlich der Wirksamkeit von niedermolekularen Arzneimitteln, Biologika und anderen zellbasierten Therapien. Aufgrund der Einschränkungen bei der Verwendung immundefizienter Mäuse zur Untersuchung der menschlichen TME eignen sich die vorgeschlagenen Modelle jedoch am besten für Proof-of-Concept-Studien.

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Protokoll

Das folgende Protokoll folgt den Richtlinien des Institutional Review Board (IRB) der Mayo Clinic, des Institutional Biosafety Committee (IBC) und des Department of Comparative Medicine im Rahmen des Protokolls A00001767 des Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Vorbereitung humaner klassischer Monozyten für die In-vitro-Studie

  1. Isolieren Sie mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) von gesunden Blutspendern, wie zuvor beschrieben9. Kurz gesagt, Vollblut mit 2 % FBS in PBS bei einem Volumenverhältnis von 1:1 verdünnen, gefolgt von einer PBMC-Isolierung in einem Dichtegradientenmedium.
  2. Isolierung humaner klassischer Monozyten (CD14+CD16-) aus geernteten PBMCs durch Auswahl negativer magnetischer Kügelchen gemäß den Anweisungen des Herstellers (Materialtabelle). Kurz gesagt, waschen Sie die entsprechende Anzahl von PBMCs mit Isolationspuffer und resuspendieren Sie die Zellen im angegebenen Volumen gemäß den Anweisungen des Herstellers. Markieren Sie Zellen mit Ausnahme klassischer Monozyten mit einem Antikörpercocktail und magnetischen Mikrokügelchen. Sammeln Sie klassische Monozyten aus dem Durchfluss, während Nicht-Monozyten in den Säulen verbleiben.
    HINWEIS: Nehmen Sie an, dass 5% der gesamten PBMCs klassische Monozyten sind, und passen Sie die Anzahl der Ausgangszellen der PBMCs entsprechend an. Bewahren Sie die verbleibenden PBMCs für die Reinheitsbestätigung der Monozytenpopulation in Schritt 1.7 auf. Klassische Monozyten sollten immer ohne vorherige Kryokonservierung aus frischen PBMCs isoliert werden.
  3. Zählen Sie die Anzahl der isolierten Monozyten mit einem Zellzähler (Table of Materials) und schleudern Sie die Zellen bei 300 x g bei 4 °C für 5 min. Resuspendieren Sie die Zellen in Zellisolationspuffer, um 1 x 106 Zellen/ml als Endkonzentration zu erreichen. Nehmen Sie 100 μl Zellsuspension und geben Sie sie auf eine 96-Well-Platte mit flachem Boden.
  4. 1 x 105 PBMC werden in dieselbe Platte wie bei einer negativen Gating-Kontrolle übertragen, um die Reinheit der klassischen Monozytenpopulation durch Durchflusszytometrie zu bestätigen. Die Zellen bei 300 x g bei 4 °C 3 min herunterschleudern. Bewahren Sie isolierte Monozyten während der Schritte 1.5-1.12 auf Eis auf.
  5. Waschen durch Resuspendieren der Zellen mit 200 μl FACS-Puffer und Schleudern der Zellen bei 300 x g bei 4 °C für 3 min. Überstände vorsichtig dekantieren.
  6. Bereiten Sie für jede Probe 50 μl FACS-Puffer vor, der 0,3 μl lebendes/totes Reagenz (Anregung bei 405 nm), 0,5 μl APC-konjugiertes Anti-Human-CD1410 (1 ng/μl) und 0,5 μL PE-konjugiertes Anti-Human-CD1611 (1 ng/μL; Tabelle der Materialien).
    HINWEIS: Um die Färbung konsistent zu halten, erstellen Sie einen Mastermix für mehrere Proben entsprechend der Gesamtzahl der Proben. Übertragen Sie 50 μl Färbelösung in jede Vertiefung.
  7. Geben Sie 50 μl Färbelösung in jede Vertiefung und mischen Sie die Zellen vorsichtig, um Blasen zu vermeiden. Inkubieren Sie die Zellen im Dunkeln bei Raumtemperatur für 15 min.
  8. Geben Sie 200 μl FACS-Puffer in jede Vertiefung und schleudern Sie die Zellen bei 300 x g bei 4 °C für 3 min. Überstände vorsichtig dekantieren.
  9. Waschen Sie, indem Sie 200 μl FACS-Puffer in jede Vertiefung geben und die Zellen 3 Minuten lang bei 300 x g bei 4 °C herunterschleudern. Die Überstände werden vorsichtig dekantiert und die Zellen in 200 μl FACS-Puffer resuspendiert. Führen Sie Proben auf einem Durchflusszytometer durch (Materialtabellen).
  10. Gate CD14+CD16- Population. Stellen Sie sicher, dass die CD14+CD16-Population über 90% der lebenden Zellen liegt, um eine ideale Reinheit zu gewährleisten. Gate CD14+CD16- Population lebender Singuletts.
    HINWEIS: Es wird davon ausgegangen, dass die Benutzer mit der Durchflusszytometrie-Analyse vertraut sind.

2. Differenzierung von M0-Makrophagen von humanen klassischen Monozyten

HINWEIS: Die Differenzierung von M2-ähnlichen Makrophagen aus humanen klassischen Monozyten basiert auf einer früheren Veröffentlichung12.

  1. Isolierte Monozyten bei 300 x g bei 4 °C für 5 min herunterschleudern und Überstände aspirieren. Resuspendieren Sie die Zellen in Zellkulturmedien, um eine Endkonzentration von 1 x 106 Zellen/ml zu erreichen.
  2. Humanes rekombinantes GM-CSF zugeben, um eine Endkonzentration von 10 ng/ml zu erreichen (Materialtabelle) und gut mischen. Übertragen Sie 100 μl Zellen in eine mit Gewebekulturen behandelte 48-Well-Platte und fügen Sie weitere 50 μl Zellkulturmedien hinzu. Stellen Sie sicher, dass jede Bedingung 3 Replikate für die endgültige Auslesung an Tag 11 hat.
    HINWEIS: Benutzer können entsprechend weitere Experimentgruppen hinzufügen. Dieses Protokoll umfasst nur experimentelle Kokulturen von Tumorzellen und T-Zellen mit oder ohne M2-ähnliche Makrophagen (Tabelle 1).
  3. Übertragen Sie 100 μl Zellen in eine weitere 48-Well-Platte und fügen Sie weitere 50 μl Zellkulturmedium für die Makrophagen-Phänotypisierung hinzu. Stellen Sie sicher, dass Sie eine Vertiefung für die Phänotypisierung von M0-Makrophagen und eine für die Phänotypisierung von M2-ähnlichen Makrophagen einschließen.
  4. Geben Sie 200 μl PBS in die umgebenden Vertiefungen, um eine Verdunstung der Zellkultur zu verhindern. Inkubieren Sie Monozyten 7 Tage lang bei 37 °C, um Zellen in M0-Makrophagen zu differenzieren.
  5. Um die Wechselwirkungen zwischen differenzierten Makrophagen und spenderangepassten CART19-Zellen zu untersuchen, isolieren Sie 1 x 107 T-Zellen aus den PBMCs desselben Spenders und generieren Sie CART19-Zellen nach einem 8-tägigen CART-Produktionsverfahren, wie zuvor beschrieben 9,13,14.
    HINWEIS: CART-Zellen, die mit der CD28-Signaldomäne costimuliert sind, werden aus 5 x 106 T-Zellen generiert, wie zuvor beschrieben 9,13,14. Parallel dazu werden nach dem gleichen Verfahren nicht transduzierte (UTD) T-Zellen erzeugt 9,13,14. UTD-T-Zellen werden als Negativkontrolle bei der T-Zellproliferation verwendet, um die allogene Proliferation zu kontrollieren.

3. M2-ähnliche Makrophagendifferenzierung von M0-Makrophagen durch Kokultur mit Zielzellen

  1. Nehmen Sie an Tag 7 die 48-Well-Platte mit M0-Makrophagen und inkubieren Sie sie mindestens 30 Minuten lang auf Eis. Pipettieren Sie die Zellen ständig kräftig, während Sie die Platte auf Eis halten.
    HINWEIS: Die Dauer der Eisinkubation hängt davon ab, wie adhärent die Makrophagen sind, die aufgrund der Varianz der Spender unterschiedlich sein können. Das erste Mischen dient dazu, lose anhaftende Makrophagen zu sammeln, so dass ein 5-minütiges Pipettieren ausreichen sollte.
  2. Übertragen Sie die abgelösten Zellen in ein frisches konisches 15-ml-Röhrchen (Tabelle der Materialien), das auf Eis vorgekühlt ist. Geben Sie 200 μl eiskaltes PBS in die Vertiefungen der 48-Well-Platte und pipettieren Sie die verbleibenden Zellen alle 10 Minuten kräftig, bis sich die meisten Makrophagen vom Boden gelöst haben. Überprüfen Sie die Zellen nach jedem Pipettieren unter einem Mikroskop und passen Sie die Inkubationszeit im Eis nach Bedarf an, mit längeren Inkubationszeiten für stärker adhärente Zellen.
  3. Übertragen Sie die restlichen abgelösten M0-Makrophagen in das konische 15-ml-Röhrchen auf Eis. Mischen Sie die Zellen vorsichtig und zählen Sie die Zellen auf einem Zellzähler.
  4. Die Zellen werden 5 min lang bei 300 x g bei 4 °C heruntergedreht und die Überstände aspiriert. Resuspendieren Sie in eiskaltem PBS, um eine Endkonzentration von 1 x 106 Zellen/ml zu erreichen.
  5. Übertragen Sie 200 μl Zellen auf eine 96-Well-Platte mit flachem Boden (Materialtabellen). Die Zellen bei 300 x g bei 4 °C 3 min herunterschleudern. Überstände vorsichtig dekantieren. Als Negativ-Gating-Kontrolle fügen Sie eine zusätzliche Vertiefung hinzu, die nur mit Markern der Elternpopulation gefärbt ist.
  6. Geben Sie 100 μl FACS-Puffer, ergänzt mit 1 μl Fc-Rezeptor-Blockierungslösung, zu jeder Probe. Inkubieren Sie die Zellen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Die Zellen bei 300 x g bei 4 °C 3 min herunterschleudern. Überstände vorsichtig dekantieren.
    HINWEIS: Es ist wichtig, Makrophagen vor der eigentlichen Markerfärbung mit Fc-Rezeptor-Blockierungspuffer vorzu inkubieren, um falsch-positive Ergebnisse zu vermeiden.
  7. Bereiten Sie für die Probenvertiefung 50 μl FACS-Puffer vor, der 0,3 μl lebendes/totes Reagenz (Anregung bei 405 nm), 0,5 μl APC-konjugiertes Anti-Human-CD1410 (1 ng/μl), 0,5 μl APC/Cy7-konjugiertes Anti-Human-CD20615 (2 ng/μL) und 0,5 μl PerCP-konjugiertes Anti-Human-CD16316 (2 ng/μL; Tabelle der Materialien). Für die Negativ-Gating-Kontrolle sind 50 μl FACS-Puffer vorzubereiten, der 0,3 μl lebendes/totes Reagenz und 0,5 μl APC-konjugiertes Anti-Human-CD14 enthält.
  8. Geben Sie 50 μl Färbelösung in jede Vertiefung und mischen Sie die Zellen vorsichtig, um Blasen zu vermeiden. Inkubieren Sie die Zellen im Dunkeln bei Raumtemperatur für 15 min.
  9. Geben Sie 200 μl FACS-Puffer in jede Vertiefung. Die Zellen bei 300 x g bei 4 °C 3 min herunterschleudern. Überstände vorsichtig dekantieren.
  10. Waschen Sie durch Zugabe von 200 μl FACS-Puffer. Die Zellen bei 300 x g bei 4 °C 3 min herunterschleudern. Die Überstände werden vorsichtig dekantiert und die Zellen in 200 μl FACS-Puffer resuspendiert.
  11. Führen Sie Proben auf einem Durchflusszytometer durch und untersuchen Sie die CD14+CD206+CD163+ Zellpopulation. Verwenden Sie die Expression von CD163 und CD206 auf M0-Makrophagen als Ausgangsbasis für M2-ähnliche Phänotypen. Bei M2-ähnlichen Makrophagen wird eine Populationsmigration von CD163niedrig, CD206niedrig zu CD163hoch oder CD206hoch erwartet. Das Ausmaß der Bevölkerungsverschiebung kann von den Spendern abhängen.
  12. Bereiten Sie die gewünschte Tumorzelllinie vor und zählen Sie auf einen Zellzähler.
    HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet die nicht-adhärente CD19+ -Mantelzell-Lymphom-Zelllinie JeKo-1 als Ziel. Andere Tumorzelllinien und ihre Fähigkeit, M0- zu M2-ähnliche Makrophagen zu differenzieren, können bei Bedarf getestet werden.
    1. Halten Sie JeKo-1-Zellen mit dem vom Anbieter empfohlenen Nährmedium (Materialtabelle) bei 1 x 106 Zellen/ml in einem Gewebekulturkolben. Mischen Sie die Tumorzellen in den Kolben und zählen Sie sie mit einem Zellzähler.
  13. Die Zielzellen werden bei 300 x g bei 4 °C für 3 min heruntergedreht und die Überstände aspiriert. Resuspendieren Sie die Zielzellen mit Zellkulturmedien, um eine Endkonzentration von 2 x 106 Zellen/ml zu erreichen.
    HINWEIS: Bereiten Sie die entsprechende Anzahl von Tumorzellen basierend auf der Anzahl der Versuchsgruppen vor. Stellen Sie sicher, dass für jede M2-ähnliche Makrophagen-Kokulturgruppe 2 x 105 Zielzellen vorhanden sind, einschließlich der M2-Phänotypisierungsplatte.
  14. Übertragen Sie 100 μl Tumorzellen in die an Tag 0 vorbereitete 48-Well-Platte in M2-ähnliche Makrophagen-Kokulturgruppen und pipettieren Sie sie vorsichtig, um sie zu mischen. Die Zellen werden weitere 24 Stunden bei 37 °C inkubiert.
    HINWEIS: Ein Verhältnis von JeKo-1: M0-Makrophagen von 2:1 wurde auf die Differenzierung des M2-ähnlichen Phänotyps getestet. Andere Kennzahlen können bei Bedarf getestet werden.
  15. Legen Sie am 8. Tag die M2-ähnliche Phänotypisierungsplatte auf Eis, lösen Sie die Zellen kräftig ab und bereiten Sie sich auf die Phänotypisierung vor, wie in den Schritten 3.4-3.11 beschrieben.
    HINWEIS: M2-ähnliche Makrophagen sind viel adhärenter als M0-Makrophagen, so dass eine längere Inkubation im Eis erforderlich ist. Dieses Protokoll verwendet nur Eis und eiskaltes PBS, um Makrophagen abzulösen und den Stress für die Zellen zu minimieren.
  16. Kombinieren Sie die Durchflusszytometrie-Dateien der M0-Phänotypisierung ab Tag 7 mit der M2-ähnlichen Phänotypisierung. Gate CD206 und CD163 der CD14+ Elternzellpopulation der M0-Makrophagenprobe und wenden Sie die gleiche Gating-Strategie auf die M2-ähnliche Makrophagenprobe an, um die Populationsverschiebung zu visualisieren.
  17. Um T-Zellen in die Kokulturen einzuführen, ernten Sie die in Schritt 2.5 erzeugten CART19- und UTD-T-Zellen am Tag 8 und überführen Sie die Zellen in konische 50-ml-Röhrchen. Mit einer Pipette gut mischen und mit einem Zellzähler zählen.
  18. Die Zellen bei 300 x g bei 4 °C 5 min lang herunterschleudern und die Überstände vorsichtig absaugen. Resuspendieren Sie CART- oder UTD-T-Zellen in Zellkulturmedien, um eine Endkonzentration von 2 x 106 Zellen/ml zu erreichen.
  19. Bereiten Sie die Tumorzelllinie vor und zählen Sie auf dem Zellzähler. Schleudern Sie die Zellen bei 300 x g bei 4 °C für 5 min herunter und aspirieren Sie die Überstände.
  20. Resuspendieren Sie Tumorzellen mit Zellkulturmedien, um eine Endkonzentration von 2 x 106 Zellen/ml zu erreichen. 100 μl Tumorzellen in Co-Kultur-Wells ohne M2-ähnliche Makrophagen überführen (Tabelle 1).
  21. Übertragen Sie 100 μl CART- oder UTD-T-Zellen in die entsprechenden Kokulturvertiefungen (Tabelle 1). Die endgültige Kokultur mit M2-ähnlichen Makrophagen sollte Tumorzellen, T-Zellen und Makrophagen in einem Verhältnis von 2:2:1 enthalten. Verwenden Sie Kokulturen ohne Makrophagen als Kontrollen.
  22. Um das endgültige Volumen über alle Gruppen hinweg konsistent zu halten, geben Sie weitere 100 μl Zellkulturmedien in Vertiefungen ohne Makrophagen. Inkubieren Sie die Zellen 3 Tage lang bei 37 °C.
    HINWEIS: Wenn allogene CART-Zellen verwendet werden, müssen Benutzer spenderangepasste UTD-T-Zellen in die Kokulturen aufnehmen, um eine durch Allogenität induzierte T-Zell-Expansion zu erkennen. In diesem Fall sollten kryokonservierte, zuvor erzeugte CART- und UTD-T-Zellen ordnungsgemäß aufgetaut und zurückgewonnen werden, gefolgt von einer Ruhezeit von mindestens 3-4 Stunden, bevor sie zu Kokulturen hinzugefügt werden.

4. Analyse der antigenspezifischen Proliferation von Kokulturen

  1. Stellen Sie am 11. Tag die Cokulturplatte auf Eis und pipettieren Sie die Zellen kräftig. Mischen Sie die Zellen gut und geben Sie die Zellen in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
    HINWEIS: Die primäre Auslesung der Kokulturen dient der Quantifizierung der T-Zell-Expansion, so dass das Ablösen von Makrophagen nicht erforderlich ist, es sei denn, der Benutzer plant, auch andere Marker auf Makrophagen im selben Panel zu analysieren.
  2. Geben Sie 200 μl eiskaltes PBS in die Probenvertiefungen und pipettieren Sie kräftig. Übertragen Sie die restliche Lösung in dieselben Mikrozentrifugenröhrchen.
  3. Überprüfen Sie die Vertiefungen unter dem Mikroskop (10x), um sicherzustellen, dass die Suspensionszellen vollständig geerntet werden. Die Zellen werden 5 min lang bei 300 x g bei 4 °C heruntergedreht und die Überstände aspiriert.
  4. Resuspendieren Sie die Zellen unter allen Bedingungen mit 200 μl FACS-Puffer und übertragen Sie sie auf eine 96-Well-Platte mit flachem Boden. Die Zellen bei 300 x g bei 4 °C 3 min herunterschleudern. Überstände vorsichtig dekantieren.
  5. Bereiten Sie 50 μl FACS-Puffer vor, der 0,3 μl lebendes/totes Reagenz (Anregung bei 405 nm) und 0,5 μl APC-konjugiertes Anti-Human-CD317 (1 ng/μl; Tabelle der Materialien) für jede Probenvertiefung. Geben Sie 50 μl Färbelösung in jede Vertiefung und mischen Sie die Zellen vorsichtig mit einer Pipette, um Blasen zu vermeiden.
    HINWEIS: In diesem Schritt gibt es großzellige Pellets. Um sicherzustellen, dass alle T-Zellen gefärbt werden, überprüfen Sie den Boden der Platte, um sicherzustellen, dass nach dem gründlichen Mischen keine Zellpellets mehr übrig sind.
  6. Inkubieren Sie die Zellen im Dunkeln bei Raumtemperatur für 15 min. Geben Sie 200 μl FACS-Puffer in jede Vertiefung. Die Zellen bei 300 x g bei 4 °C 3 min herunterschleudern. Überstände vorsichtig dekantieren.
  7. Waschen Sie durch Zugabe von 200 μl FACS-Puffer. Die Zellen bei 300 x g bei 4 °C 3 min herunterschleudern. Die Überstände werden vorsichtig dekantiert und die Zellen in 200 μl FACS-Puffer resuspendiert.
  8. Führen Sie Proben auf einem Durchflusszytometer durch. Gate CD3+ -Zellen und quantifizieren Sie die absolute Anzahl lebender CD3+ -Zellen wie folgt:
    figure-protocol-1
  9. Stellen Sie die absolute Anzahl der CD3+ -Zellen in jeder Bedingung mit GraphPad Prism grafisch dar.
    HINWEIS: Es wird erwartet, dass Kokulturen mit M2-ähnlichen Makrophagen eine viel geringere absolute Anzahl von CD3-T-Zellen aufweisen als unter Bedingungen in Abwesenheit von M2-ähnlichen Makrophagen.

5. Einfluss von M2-ähnlichen Makrophagen auf CART-Zellen in einem Transwell-System

HINWEIS: Transwell-Platten trennen M2-ähnliche Makrophagen physikalisch von stimulierten CART-Zellen und lassen nur lösliche Moleküle zwischen den Zelltypen verkehren, sodass Benutzer die Dynamik kontaktunabhängiger Wechselwirkungen zwischen Makrophagen und CART-Zellen untersuchen können (Abbildung 1).

  1. 1 x 106 humane klassische Monozyten isolieren und die Reinheit der Population durch Durchflusszytometrie bestätigen, wie in den Schritten 1.1-1.10 beschrieben. 1 x 106 Monozyten bei 300 x g bei 4 °C für 5 min herunterschleudern und Überstände aspirieren.
    HINWEIS: Benutzer können autologe CART- und spenderangepasste UTD-Zellen generieren, wie in Schritt 2.5 beschrieben.
  2. Resuspendieren Sie die Zellen in Zellkulturmedien, um eine Endkonzentration von 1 x 106 Zellen/ml zu erreichen. Humanes rekombinantes GM-CSF zugeben, um eine Endkonzentration von 10 ng/ml zu erreichen, und gut mischen.
  3. 200 μl resuspendierter Zellen werden mit 3 technischen Replikaten in die untere Vertiefung einer 24-Well-Transwell-Platte (0,4 μm) überführt. Geben Sie weitere 100 μl Zellkulturmedium in jede Vertiefung und stellen Sie sicher, dass der Vertiefungsboden vollständig bedeckt ist. Geben Sie 300 μl Zellkulturmedium in weitere 3 Vertiefungen für Bedingungen ohne Makrophagen (Positivkontrolle).
  4. Geben Sie 200 μl PBS in die umgebenden Vertiefungen, um eine Verdunstung der Zellkultur zu verhindern. Inkubieren Sie die Zellen 7 Tage lang bei 37 °C.
  5. An Tag 7 werden 1,4 x 106 JeKo-1 Tumorzellen präpariert und in ein konisches 15 mL Röhrchen überführt. Schleudern Sie die Zellen bei 300 x g bei 4 °C für 5 min herunter und aspirieren Sie die Überstände.
  6. Resuspendieren Sie Tumorzellen mit Zellkulturmedien, um eine Endkonzentration von 2 x 106 Zellen/ml zu erreichen. Geben Sie 200 μl Tumorzellen in die unteren Vertiefungen aller Probenbedingungen und mischen Sie sie gut. Die Zellen werden weitere 24 Stunden bei 37 °C inkubiert. Verwenden Sie Bodenvertiefungen mit nur JeKo-1 als Positivkontrolle.
  7. Ernten Sie an Tag 8 die in Schritt 5.1 erzeugten CART- und UTD-T-Zellen. und resuspendieren T-Zellen in Zellkulturmedien, um eine Endkonzentration von 1 x 106 Zellen/ml zu erreichen.
    HINWEIS: Wenn allogene CART-Zellen verwendet werden, müssen die Benutzer gespendete UTD-T-Zellen in die Kokulturen aufnehmen, wie in Schritt 3.22 beschrieben.
  8. 1,4 x 106 JeKo-1 Zellen zählen und vorbereiten. Übertragen Sie die Tumorzellen in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen und schleudern Sie die Zellen bei 300 x g bei 4 °C für 5 min.
  9. Überstände aspirieren und resuspendieren die Zellen in Zellkulturmedien, um eine Endkonzentration von 1 x 106 Zellen/ml zu erreichen. Übertragen Sie 100 μl vorbereitete T-Zellen und 100 μl Tumorzellen in jede obere Vertiefung für alle Probenbedingungen.
  10. Die Zellen in der oberen Vertiefung gründlich mischen und 3 Tage lang bei 37 °C inkubieren.
  11. An Tag 11 werden die Zellen in der oberen Kammer gemischt und in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen umgefüllt. Waschen Sie die oberen Vertiefungen mit 200 μl PBS und überführen Sie die verbleibenden Zellen in die Mikrozentrifugenröhrchen.
  12. Die Zellen werden 5 min lang bei 300 x g bei 4 °C heruntergedreht und die Überstände aspiriert. Führen Sie einen T-Zell-Proliferationstest wie in den Schritten 4.4 bis 4.9 beschrieben durch.
    HINWEIS: JeKo-1-polarisierte M2-ähnliche Makrophagen können die antigenspezifische T-Zell-Proliferation kontaktunabhängig unterdrücken. Bei Bedarf können auch andere Tumormodelle getestet werden.

6. Etablierung eines Xenotransplantat-Modells sowohl mit humanen Makrophagen als auch mit Tumoren in NSG-Mäusen

  1. 1 x 107 humane klassische Monozyten isolieren und die Reinheit durch Durchflusszytometrie bestätigen, wie in den Schritten 1.1-1.10 beschrieben. Verwenden Sie NSG-Mäuse, die nur mit JeKo-1 transplantiert wurden, als Kontrolle, um protumorale Effekte von M2-ähnlichen Makrophagen zu bestätigen, wie in Abbildung 2 dargestellt.
    HINWEIS: Dieses Protokoll transplantiert NSG-Mäuse mit 5 x 105 menschlichen Makrophagen subkutan. Die Makrophagenerholung nach der Ablösung an Tag 7 beträgt etwa 50%. Benutzer können die Zellzahlen entsprechend anpassen und sicherstellen, dass zusätzliche Zellen vorbereitet werden.
  2. Isolierte Monozyten bei 300 x g bei 4 °C für 5 min herunterschleudern und Überstände aspirieren. Resuspendieren Sie die Zellen in Zellkulturmedien, um eine Endkonzentration von 1 x 106 Zellen/ml zu erreichen.
  3. Humanes rekombinantes GM-CSF zugeben, um eine Endkonzentration von 10 ng/ml zu erreichen, und gut mischen. Die Monozyten werden in einen T25-Gewebekulturkolben überführt und die Zellen 7 Tage lang bei 37 °C inkubiert.
  4. Pipettieren Sie an Tag 7 alle 10 Minuten kräftig Zellen auf Eis und überprüfen Sie die Zellen unter einem Mikroskop, bis sich die meisten Makrophagen abgelöst haben. Die Zellen werden in ein konisches 15-ml-Röhrchen auf Eis überführt, der Kolben mit eiskaltem PBS gewaschen, um die verbleibenden Zellen zu lösen, und die Zellen in dem konischen Röhrchen kombiniert.
  5. Zählen Sie die Zellen auf dem Zellzähler. Die Zellen werden 5 min lang bei 300 x g bei 4 °C heruntergedreht und die Überstände aspiriert.
  6. Waschen und resuspendieren Sie die Zellen mit 5 mL eiskaltem PBS. Die Zellen werden 5 min lang bei 300 x g bei 4 °C heruntergedreht und die Überstände aspiriert.
  7. Resuspendieren Sie die Zellen in eiskaltem PBS, um eine Endkonzentration von 2 x 107 Zellen/ml zu erreichen. Füllen Sie die Zelllösung in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen um und halten Sie es auf Eis.
  8. Bereiten Sie 1,5 x 107 Luciferase + JeKo-1-Zellen vor und geben Sie die Zellen in ein konisches 15-ml-Röhrchen.
    HINWEIS: Aufgrund der geringen Anzahl injizierter Zellen ist eine Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) erforderlich, um die Tumorlast zu überwachen. Die Anzahl der Makrophagen und Tumorzellen für subkutane Injektionen kann bei Bedarf erhöht werden. Sind Tumore nach der Injektion sichtbar und per Messschieber zugänglich, können stattdessen Wildtyp-Tumorzellen verwendet werden.
  9. Die Zellen werden bei 300 x g bei 4 °C 5 Minuten lang heruntergeschleudert und die Überstände aspiriert. Resuspendieren Sie die Zellen in eiskaltem PBS, um eine Endkonzentration von 4 x 107/ml zu erreichen.
  10. Das gleiche Volumen an Makrophagen und Tumorzellen in ein weiteres frisches 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführen und gut mischen. Geben Sie das gleiche Volumen an gelöster Basalmembranmatrix in die gemischte Zelllösung und mischen Sie es gut auf Eis.
    HINWEIS: Die Basalmembranmatrix muss über Nacht auf Eis aufgetaut werden, um eine Verfestigung zu verhindern. Zu diesem Zeitpunkt sind pro 100 μl Zelllösung 5 x 105 Makrophagen und 1 x 106 JeKo-1 in der Basalmembranmatrix suspendiert, die das gleiche Zellzahlverhältnis verwendet, das im in vitro M2-ähnlichen Makrophagen-Differenzierungsprotokoll verwendet wird.
  11. Zur Kontrolle werden die verbleibenden vorbereiteten JeKo-1-Zellen mit dem gleichen Volumen an eiskaltem PBS in ein frisches 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt, das gleiche Volumen der Basalmembranmatrix zur Zelllösung hinzugefügt und auf Eis gut vermischt.
  12. Bereiten Sie 10 weibliche und männliche NOD-SCID-γ-/- (NSG) Mäuse (~20 g) (~20 g) für die Inhalationsanästhesie mit 2,5% Isofluran vor. Führen Sie eine Isofluran-Anästhesie mit einem Nagetier-Inhalationsanästhesiegerät ein. Das verdampfte Isofluran wird in eine Kammer und eine beheizte Bühne mit Nasenkegeln abgegeben.
  13. Legen Sie die Mäuse für 1-2 Minuten in die Anästhesiekammer. Übertragen Sie Mäuse auf die Nasenkegel auf dem beheizten Tisch, sobald die Haltungs- und Rechtsreflexe verloren gegangensind 18. Halten Sie die Mäuse während des gesamten Eingriffs auf der Heizstufe. Tragen Sie Augensalbe auf beide Augen der Mäuse auf, um Hornhautschäden durch den Verlust des Blinzelreflexes während der Anästhesie zu vermeiden.
  14. Rasieren Sie vorsichtig die rechte Flanke jeder Maus, um die Haut freizulegen, nachdem die Mäuse betäubt wurden. Laden Sie eine 0,5-ml-Spritze mit 100 μl JeKo-1-Makrophagen-Zellmischung und entfernen Sie vorsichtig Blasen in der Lösung.
  15. Heben Sie die freiliegende Haut vorsichtig mit der Hand an und führen Sie die Nadel in den angehobenen Bereich ein. Heben Sie die Haut mit der Nadel weiter an und drücken Sie mit einem Finger auf die Injektionsstelle. Versuchen Sie, die Nadel nach dem Einführen nicht zu bewegen, um versehentliche Einstiche und Zellleckagen zu vermeiden.
  16. Geben Sie die Zellen langsam in die Unterhautschicht ab und entfernen Sie vorsichtig die Nadel. Wiederholen Sie die subkutanen Injektionen für alle 10 NSG-Mäuse, wobei 5 Mäuse sowohl JeKo-1 als auch Makrophagen und 5 Mäuse JeKo-1 allein erhielten.
  17. Bereiten Sie D-Luciferin (Materialtabelle) in einer Konzentration von 15 mg/ml vor. Laden Sie eine 0,5-ml-Spritze mit 200 μl D-Luciferin und injizieren Sie sie intraperitoneal in jede Maus.
  18. Platzieren Sie anästhesierte Mäuse 10 Minuten nach der D-Luciferin-Injektion für BLI auf der Bühne. Führen Sie BLI für jede Maus durch und erfassen Sie die Tumorlast als Ausgangswert (Tag 0). Setzen Sie die Mäuse wieder in ihre Käfige.
    HINWEIS: Die Benutzer müssen sicherstellen, dass die anästhesierten Mäuse nicht unbeaufsichtigt bleiben, bis sie wieder das Bewusstsein erlangen, um die sternale Liege nach dem bildgebenden Verfahren aufrechtzuerhalten.
  19. Überwachen Sie die Tumorlast 2x pro Woche mit BLI, bis experimentelle oder humane Endpunkte erreicht sind. Der Endpunkt des Gesamtüberlebens ist erreicht, sobald das Tumorvolumen bei oder über 2000 mmliegt 3, berechnet nach der folgenden Formel:
    figure-protocol-2
    HINWEIS: Die Dauer der Tumorüberwachung kann je nach Zweck der Experimente und gewünschten Messwerten angepasst werden. Aufgrund der extrem kleinen Tumorgrößen in den ersten 2-3 Wochen wird die BLI für die Indikation der Tumorlast empfohlen. Sobald Tumore sichtbar und per Messschieber zugänglich sind, werden sowohl BLI- als auch Messschiebermessungen für eine genaue Tumoranalyse empfohlen.
  20. Um Wechselwirkungen zwischen transplantierten menschlichen Makrophagen und autologen CART19-Zellen in NSG-Mäusen zu untersuchen, generieren und transplantieren ex vivo differenzierte menschliche Makrophagen, wie in den Schritten 6.1 bis 6.16 beschrieben. Isolieren Sie autologe T-Zellen desselben Blutspenders in Schritt 6.1 nach dem 8-tägigen CART-Herstellungsprotokoll, wie zuvor beschrieben 9,13,14.
    HINWEIS: Jede NSG-Maus wird mit 2 x 106 CART19-Zellen behandelt. Benutzer sollten mindestens 2 x 107 CART-Zellen erzeugen, um 10 Mäuse zu behandeln. CART-Zellen werden am Tag 8 kryokonserviert und gelagert, bis JeKo-1/Makrophagen in die Mäuse transplantiert werden, 5 Tage nach subkutanen Injektionen.
  21. Nach 5-tägiger Tumor-/Makrophagen-Injektion randomisieren Sie Mäuse basierend auf BLI, wie in den Schritten 6.17-6.18 beschrieben. Tauen Sie die CART-Zellen auf und bereiten Sie sie vor, wie in Schritt 3.22 beschrieben. Waschen Sie die CART-Zellen mit PBS und schleudern Sie die Zellen bei 300 x g bei 4 °C für 5 min.
  22. Resuspendieren Sie CART-Zellen in PBS, um eine Endkonzentration von 2 x 107 Zellen/ml zu erreichen. Laden Sie eine 0,5-ml-Spritze mit 100 μl präparierten CART-Zellen und injizieren Sie sie intravenös durch die Schwanzvene in jede tumortransplantierte Maus.
  23. Überwachen Sie die Tumorlast durch BLI einmal pro Woche für 4 Wochen.
    HINWEIS: Aufgrund der immunsuppressiven Funktionen transplantierter humaner Makrophagen ist bei Mäusen, denen JeKo-1/Makrophagen injiziert wurden, eine beeinträchtigte CART-Antitumoraktivität und eine höhere Tumorlast zu erwarten.

7. Bestätigung des M2-ähnlichen Phänotyps in den transplantierten humanen Makrophagen durch Immunfluoreszenzfärbung

  1. Um den JeKo-1-induzierten M2-ähnlichen Phänotyp in transplantierten humanen Makrophagen, die in Schritt 6 beschrieben wurden, durch Immunfluoreszenzfärbung zu bestätigen, befolgen Sie die Schritte 6.1 bis 6.19 und skalieren Sie die Anzahl der injizierten Makrophagen und Luciferase+ JeKo-1 auf 5 x 106 Zellen bzw. 1 x 107 Zellen pro NSG-Maus hoch.
    HINWEIS: Benutzer sollten sicherstellen, dass das endgültige Injektionsvolumen für jede Maus 100 μl beträgt.
  2. Am Tag 7 euthanasieren Sie NSG-Mäuse durch CO2, führen Sie eine zervikale Dislokation durch und bestätigen Sie den Verlust der Hornhautreflexe, wie zuvor beschrieben19. Platzieren Sie Mäuse mit den Tumoren nach oben auf die Werkbank. Sprühen Sie 70%iges Ethanol auf die Tumorstellen und entnehmen Sie transplantierte Tumore vorsichtig mit Schere und Pinzette.
  3. Übertragen Sie das Tumorgewebe in konische 50-ml-Röhrchen, die mit 20-30 ml 4% Paraformaldehyd gefüllt sind, zur Fixierung, wie zuvor beschrieben20. Kryokonservierung und Kryosektion von Tumorgeweben für die Immunfluoreszenzfärbung nach einem zuvor veröffentlichten Protokoll20.
  4. Färben Sie Tumorgewebe-Objektträger mit Maus-Anti-Human-CD206-Antikörpern, konjugiert mit AF546 (1:50) und Kaninchen-Anti-Human-iNOS-Antikörpern, konjugiert mit AF647 (1:100), verdünnt in Immunfluoreszenz-Färbepuffer, gefolgt von der Zellkernfärbung und -konservierung wie zuvor beschrieben21.
    HINWEIS: Für optimale Färbeergebnisse sollten Anwender eine Antikörpertitration entsprechend durchführen, insbesondere wenn verschiedene Tumorzelllinien verwendet werden.
  5. Erfassen Sie Immunfluoreszenzbilder mit konfokaler Mikroskopie bei 40x. Um zu bestätigen, dass transplantierte humane Makrophagen einen M2-ähnlichen Phänotyp entwickeln, ist mit einer Expression von humanem CD206 und einer minimalen Expression von humanem iNOS zu rechnen.

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Ergebnisse

Das Ziel dieses Protokolls ist es, sowohl in vitro als auch in vivo Modelle zu etablieren, um die Wechselwirkungen zwischen humanen immunsuppressiven Makrophagen und CART-Zellen aufgrund der komplexen Natur und Dynamik der Wechselwirkungen und der begrenzten vorhandenen Xenotransplantatmodelle zu untersuchen. Nach dem Protokoll werden isolierte humane klassische Monozyten differenziert, um M2-ähnliche Phänotypen zu erwerben und funktionell immunsuppressiv zu werden.

Um die Re...

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Diskussion

Die CART-Zelltherapie hat zahlreiche klinische Erfolge bei der Behandlung von Untergruppen von Patienten mit hämatologischen Malignomen gezeigt, aber die meisten Patienten erleiden innerhalb von 1-2 Jahren nach der CART-Infusion einen Rückfall 1,2. Es wurden verschiedene potenzielle CART-Resistenzmechanismen identifiziert, und es wurde festgestellt, dass immunsuppressive myeloische Zellen eine wichtige Rolle bei der TME-Immunsupp...

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Offenlegungen

SSK ist ein Erfinder von Patenten auf dem Gebiet der CAR-Immuntherapie, die an Novartis (durch eine Vereinbarung zwischen der Mayo Clinic, der University of Pennsylvania und Novartis), MustangBio (über die Mayo Clinic) und Sendero (über die Mayo Clinic) lizenziert sind. RLS und SSK sind Erfinder von Patenten auf dem Gebiet der CAR-Immuntherapie, die an Humanigen (über die Mayo Clinic) lizenziert sind. KY, RLS, TH, BK, ES und SSK sind Erfinder von Patenten auf dem Gebiet der CAR-Immuntherapie, die an Immix lizenziert sind. SSK erhält Forschungsgelder von Kite, Gilead, Juno, BMS, Novartis, Humanigen, MorphoSys, Tolero, Sunesis/Viracta, LifEngine Animal Health Laboratories Inc., Incyte und Lentigen. SSK hat an Beratungsgesprächen mit Kite/Gilead, Humanigen, Juno/BMS, Capstan Bio und Novartis teilgenommen. SSK war bei Humanigen und Carisma im Ausschuss für Datensicherheit und -überwachung tätig. SSK war als Berater für Torque, Calibr, Novartis, Capstan Bio, Carisma und Humanigen tätig.

Danksagungen

Diese Studie wurde teilweise durch das Mayo Clinic Comprehensive Cancer Center (SSK), das Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (SSK), das Mayo Clinic Center for Regenerative Biotherapeutics (SSK), den National Institutes of Health Grant R37CA266344-01 (SSK) und den Department of Defense Grant CA201127 (SSK) finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,5 mL SpritzeFisher Scientific329461
1,5 mL MikrozentrifugenröhrchenEppendorf1415-2508 
Konisches 15-ml-RöhrchenCorning Biowissenschaften352097
24-Well-Transwell-Platte (0,4 μ m)Corning Biowissenschaften3397
Konisches 50-ml-RöhrchenCorning Biowissenschaften352098
APC/Cy7-konjugiertes Anti-Human-CD206Biolegende321119Flow-Antikörper
APC-konjugiertes Anti-Human-CD14Biolegende325607Flow-Antikörper
APC-konjugiertes Anti-Human-CD3Biolegende344811Flow-Antikörper
autoMACS SpüllösungMiltenyi Biotec130-091-222Klassischer Monozyten-Isolationspuffer 
Grundstoff-Membran-MatrixCorning BiowissenschaftenCLS356237Solubilisierte Basalmembran-Matrix
Zellkulturmedien10 % humanes AB-Serum, 1 % Penicillin-Streptomycin-Glutamin in X-VIVO 15 serumfreies hämatopoetisches Zellmedium
Klassisches Monozyten-Isolationskit, humanMiltenyi Biotec130-117-337
CytoFLEX System  B5-R3-V5Beckman CoulterNr. C04652Durchflusszytometer
D-LuciferinGold-BiotechnologieGLÜCK-1G
D-PBS (Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung)Gibco14190250 
AugensalbeThermoFisher19-090-832
FACS-Puffer2% FBS 1% Natriumazid in PBS
Fötales RinderserumCorning Biowissenschaften35-011-CV
96-Well-Platte mit flachem BodenCorning BiowissenschaftenCLS3997
Hitzeinaktiviertes gepooltes humanes AB-SerumInnovative Forschung4931
Humanes TruStain FcX (Fc-Rezeptor-Blockierungslösung)Biolegende422301
Isofluran flüssig   Piramal Pharma GmbH66794-017-10
IVIS Spectrum In-vivo-BildgebungssystemPerkinElmer124262
JeKo-1 Zelllinien-Kulturmedien10% FBS 1% Penicillin-Streptomycin-Glutamin in RPMI-1640 Medium
Lebend/tot Fixierbares Aqua Dead Cell Stain Kit, für 405 nm AnregungInvitrogenNr. L34966
LS-SäuleMiltenyi Biotec130-042-401Auswahl der negativen Raupe
LymphoprepStammzellen-Technologien07811Dichtegradient mittel
MACS BSA AktienlösungMiltenyi Biotec130-091-376Klassischer Monozyten-Isolationspuffer 
Maus-Anti-Human-CD206-Antikörper, konjugiert mit AF546 Santa Cruz BiotechnologieArtikel-Nr.: SC-376232
NICKEN. Cg-Prkdcscid  Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) MäuseJackson Laboratorium 5557
PE-konjugiertes Anti-Human-CD16Biolegende302007Flow-Antikörper
Penicillin-Streptomycin-Glutamin (100x), flüssigGibco10378-016
PerCP-konjugiertes Anti-Human-CD163Biolegende333625Flow-Antikörper
Kaninchen-Anti-Human-iNOS-Antikörper, konjugiert mit AF647 Proteintech-TechnologieNr. CL647-18985
Rekombinante humane GM-CSFStammzellen-Technologien78015
RPMI-1640 mittelGibco11875093
SepMate-50 IVDStammzellen-Technologien85450PBMC-Isolierung durch Dichtegradientenzentrifigation 
Natriumazid, 5% (w/v)Ricca Chemical7144.8-16
Mit Gewebekulturen behandelte 48-Well-PlatteCorning Biowissenschaften3548
Vi-cell XR Zellviabilitäts-AnalysatorBeckman CoulterZähler für Zellen
X-VIVO 15 Serumfreies hämatopoetisches ZellmediumLonza04-418Q

Referenzen

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