Entwicklung eines Modells für akute Lungenverletzungen bei Neonatalen Ferkeln, das die frühe Umgebung der Lunge von Frühgeborenen nachbildet

Extreme Frühgeburtlichkeit ist eine der Haupttodesursachen bei Kindern vor dem fünften Lebensjahr¹. Die häufigste schwere Komplikation einer Frühgeburt ist die bronchopulmonale Dysplasie (BPD), eine chronische Lungenerkrankung, zu der multifaktorielle Ursachen wie Entzündungen, oxidativer Stress durch Hyperoxie und beatmungsinduzierte Traumata^{gehören 2}. Diese Mikroumgebung führt zu einer Beeinträchtigung des Lungenwachstums, was sich langfristig auf das Wachstum und die Entwicklung von Frühgeborenen auswirken kann³. Derzeit gibt es keine Behandlung für BPS.

Eine kürzlich durchgeführte systematische Übersichtsarbeit über die Verwendung mesenchymaler Stromazellen als mögliche Behandlung von BPD ergab, dass präklinische Daten ausschließlich bei Nagetieren erhoben wurden⁴. Dieses Phänomen ist angesichts der breiten Verfügbarkeit, Benutzerfreundlichkeit und Wartung von Nagetiermodellen weit verbreitet. Die Reproduktion von Studien in Großtiermodellen ist jedoch entscheidend, um den Erfolg der translationalen Bemühungen für neue und kommende Therapien für Frühgeborene sicherzustellen. Viele klinische Studien scheitern aufgrund unzureichender präklinischer Studien⁵, was die Entwicklung der Behandlung für Patienten verlangsamt. Die Verwendung eines nicht-menschlichen Primatenmodells ist zwar ein bevorzugtes präklinisches Modell, um die Grundlage für klinische Studien am Menschen zu schaffen, aber es ist mühsam, kostspielig und nicht leicht zugänglich. Das Modell des Neugeborenenferkels ist vorteilhaft, da die Verwendung von Medikamenten und Geräten, die der Neugeborenenversorgung ähneln, die klinische Umgebung der Neugeborenen-Intensivpflege nachahmen, was zu einer verbesserten Machbarkeit für die klinische Umsetzung führt. Darüber hinaus ähnelt das Immunsystem der Schweinelunge stark dem des Menschen 6,7,8,9 und teilt mehr als 80 % der genetischen Varianz des Toll-like-Rezeptors 4 ¹⁰, wobei Makrophagen auf Lipopolysaccharide (LPS)^11,12 und die Produktion von Stickstoffmonoxid¹³ reagieren - potenzielle Mitverursacher von Entzündungen in der menschlichen Lunge¹⁴. Darüber hinaus ist aus Schweinen gewonnenes Lungentensid eine klinisch etablierte Behandlung bei akuten Lungenerkrankungen bei Frühgeborenen¹⁵.

Dieses Protokoll stellt die Generierung eines neuartigen eintägigen Großtiermodells für akute Lungenverletzungen (ALI) mit mehreren Treffern bei neugeborenen Ferkeln mit konsistenten, standardisierten und übersetzbaren Ergebnissen in Übereinstimmung mit den ALI-Kriterien 16,17,18 der American Thoracic Society vor. Wiederholte salzhaltige Lungenspülungen zur Depletion von Tensiden mit Hochdruckventilation und anschließender LPS- oder anderer toxischer Exposition wurden bei erwachsenen Schweinen angewendet, um Lungenschäden zu induzieren¹⁸. Ähnliche Modelle, die bei neonatalen Ferkeln verfügbar sind, sind jedoch rar^19,20. Dieses Protokoll beschreibt, wie eine Lungenschädigung mit einem angepassten Protokoll der Surfactant-Depletion-Lungenspülungen 21,22,23 unter hyperoxischer und Hochdruckbeatmung induziert werden kann, gefolgt von einem Entzündungsauslöser unter Verwendung von LPS, das direkt in die Lunge instilliert wird. Dieses Modell ist für die Verabreichung einer Behandlung der Wahl entweder lokal (intratracheal - IT) oder systemisch (intravenös - IV) nach der induzierten Lungenverletzung vorbereitet, wobei die Wirkung über 5 Stunden überwacht wird. Das Gesamtgerüst ahmt den Zustand der Lunge von Frühgeborenen sehr gut nach. Der Tensidmangel bildet das Atemnotsyndrom nach, das durch einen Mangel an Tensid bei der Geburt gekennzeichnet ist. Diese Erkrankung kann mit Barotrauma, Atelectotrauma und Sauerstoffproblemen verbunden sein, die einen hohen Sauerstoffgehalt und eine mechanische Beatmung erfordern. Schließlich werden die meisten Frühgeborenen aufgrund einer Chorioamnionitis oder Infektion in einem entzündlichen Milieu geboren, Merkmale, die durch LPS-Verabreichung in diesem Ferkelmodell zu replizieren versucht wurden. Dieses Multi-Hit-Modell der ALI erzeugt ähnliche klinische Stimuli, mit denen die menschliche Frühgeborenenlunge konfrontiert ist, und bietet unschätzbare Einblicke in frühe pathogene BPD-Prozesse und eine potenzielle Optimierung der Therapiedurchführung für eine effektive klinische Translation²⁴.

Alle Versuche werden von zertifiziertem Personal in Übereinstimmung mit den nationalen und institutionellen Vorschriften (https://ccac.ca/en/guidelines-and-policies/) nach Genehmigung durch den regionalen Tierpflegeausschuss und den Tierpflege- und Veterinärdienst (Protokoll OHRIe-3731) durchgeführt. Für dieses Modell wurden neugeborene Ferkel beiderlei Geschlechts im Alter von 0–3 Tagen mit einem Yorkshire-, Landrasse- und Duroc-Mischling verwendet. Eine detaillierte Beschreibung der Schritte (Schrittnummer in Klammern angegeben) für die Vorbereitung, die Anästhesie, das Flüssigkeits- und Medikationsmanagement und die Überwachung, die für die gesamte Dauer des Versuchs (1-3) verwendet wurden, die chirurgischen Eingriffe (4) einschließlich einer Stabilisierungsphase (5) vor der Einleitung der Multi-Hit-Lungenverletzung (7), mit der Beobachtung nach der Verletzung und der Erhaltungsbeatmung (6, 8), die mit der Euthanasie und dem Abschluss des Experiments (10) endet, werden bereitgestellt. Ein optionales standardisiertes Verfahren zur intratrachealen Behandlung (9) wird ebenfalls vorgestellt. Die Gesamtzeit vom Bauernhof bis zum Ende des Versuchs und der Entnahme der Proben beträgt ca. 12-15 Stunden. Die in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung der Versuche

1. Schalten Sie die Monitore und das Beatmungsgerät ein und kalibrieren Sie sie, bevor das Ferkel eintrifft. Stellen Sie sicher, dass Speicherkarten in den Monitor eingesetzt sind, damit die Daten während des Experiments kontinuierlich aufgezeichnet werden können.
2. Stellen Sie das Beatmungsgerät auf einen inspiratorischen Spitzendruck (PIP) von 15 cmH₂O, einen positiven Endexspirationsdruck (PEEP) von 6 cmH₂O, einen inspiratorischen Fluss von 8 l/min, eine Atemfrequenz (RR) von 30/min, eine inspiratorische Zeit (T_insp) von 0,4 s, einen Anteil des eingeatmeten Sauerstoffs (FiO₂) von 1,0 ein und schließen Sie einen neuen Beatmungskreislauf und einen neuen Luftbefeuchter an.
3. Bereiten Sie sterile OP-Packungen, Abdecktücher, Verbrauchsmaterialien (einschließlich Medikamente - siehe Materialtabelle), Katheter und den gedruckten CRF vor. Erhöhen Sie die Temperatur des Operationssaales auf 25 °C oder höher, wie vom Forschungsteam als notwendig erachtet. Schalten Sie die Wärmedecke/Wassermatratze auf 39 °C ein. Bereiten Sie ein Zwangslufterwärmungssystem vor, das einsatzbereit ist, wenn eine zusätzliche Temperaturregelung erforderlich ist.
4. Legen Sie 1 l Beutel mit normaler Kochsalzlösung in ein warmes Wasserbad (39 °C), um die Lungenspülungen vorzubereiten.
5. Richten Sie Infusionspumpen für Medikamente (Ketamin und Propofol) ein und fügen Sie den Flüssigkeitspumpen neue Beutel mit Laktated Ringers und Dextrose bei Raumtemperatur hinzu.
6. Das Ferkel bleibt bei der Sau auf dem örtlichen Bauernhof und hat freien Zugang zu ihr, bis sie von einem Mitglied des Forschungsteams abgeholt wird. Notieren Sie sich das Geschlecht, das Alter, die Größe des Wurfes und den Zeitpunkt der Geburt.
   HINWEIS: In einem zugelassenen Universitätstransportfahrzeug mit qualifiziertem Fahrer ist während des gesamten Transports ein erfahrenes Teammitglied anwesend. Das Ferkel wird in eine große, geschlossene weiche Transportbox gelegt, die es dem Ferkel ermöglicht, sich sicher, frei und uneingeschränkt zu bewegen (bei Bedarf mit einem in Decken eingewickelten Heißwasser-Gummi-Heizkissen). Dies stellt sicher, dass das Ferkel in dieser beruhigenden Umgebung ruhig bleibt (oft einschläft). Die Transportbox, in der sich das Ferkel befindet, wird mit dem Sicherheitsgurt gesichert. Das Teammitglied hat die Aufgabe, das Ferkel sanft zu beruhigen und laute Geräusche zu vermeiden, um den Stresspegel des Ferkels auf ein Minimum zu reduzieren.
7. Halten Sie bei Ihrer Ankunft in der Forschungseinrichtung den Lärm auf ein Minimum und halten Sie das Ferkel sanft, während Sie den Anästhesie-Nasenkonus auf sein Gesicht legen.

2. Vorbereitung der Tiere

HINWEIS: Dieser Abschnitt umfasst die Einleitung und Aufrechterhaltung der Anästhesie (gemäß den institutionell anerkannten Protokollen).

1. O₂ -Fluss ohne Isofluran einleiten, wenn der Nasenkonus eingesetzt wird. Wenn das Ferkel ruhig ist, initiieren Sie die Isofluranproduktion und erhöhen Sie, bis 3 % Isofluran verabreicht werden (ca. 60 s). Überwachen Sie die Atmung sorgfältig und passen Sie Isofluran entsprechend an.
2. Überprüfen Sie, ob das Ferkel nicht reagiert, indem Sie es fest in die Zehen kneifen.
3. Sobald das Ferkel nicht mehr ansprechbar ist, wiegen und messen Sie es für die richtige Dosierung der Medikamente.
4. Injizieren Sie Buprenorphin HCL (0,04 mg/kg) intramuskulär (IM) mit einer 25-G-Nadel in das Hinterbein zur Analgesie.
5. Befestigen Sie das Pulsoximeter am oberen rechten Huf (präduktal), an der nicht-invasiven Blutdruckmanschette (bis zur Kanülierung der Oberschenkelarterie) und an den EKG-Ableitungen.
6. 24 G Angiokathen in beide Ohren einführen. Befestigen Sie salzgespülte 6"-Erweiterungssätze mit 4-Wege-Absperrhähnen. Stützen Sie das Ohr mit einem Zungenspatel, um eine Positionsbehinderung zu vermeiden.
7. Entnehmen Sie Blut aus dem eingeführten Ohrkatheter zur Blutzuckermessung mit einem kalibrierten Blutzuckermessgerät gemäß den Anweisungen des Herstellers.
8. Beginnen Sie die intravenöse (IV) D5W-Infusion mit 5 ml/kg/h und passen Sie die Blutzuckerspiegel entsprechend an, um einen BZ-Wert von 4-5 mmol/l zu erreichen.
9. Verabreichen Sie Bolusinjektionen von Analgesie/Anästhesie in die zweite Ohrvene.
   HINWEIS: Für ihre optimale und sichere Anwendung ist ein kritisches Verständnis der Eigenschaften und Nebenwirkungen dieser Medikamente erforderlich.
   1. Verabreichen Sie einen Bolus von 2 mg/kg i.v. verdünntes Ketamin (10 mg/ml) und einen Bolus von 5 mg/kg i.v. Propofol (10 mg/ml, 1%) in mehreren Boli mit kleinerem Volumen. Hüten Sie sich vor der Möglichkeit, dass nach einem Bolus von Propofol Apnoe auftritt. Die vorsichtige Verabreichung von Propofol-Boli (insgesamt 5 mg/kg) wird fortgesetzt, bis das Ferkel nicht mehr auf den Hartzehen-Pinch-Test anspricht und die kontinuierliche Propofol-Infusion eingestellt ist.
   2. Brechen Sie das Isofluran ab (sobald die intravenöse Propofol-Infusion eingeleitet wurde) und fahren Sie mit der kontinuierlichen intravenösen Anästhesie für den Rest des Experiments fort.
10. Beginnen Sie mit der kontinuierlichen Infusion des folgenden Anästhesieschemas mit sorgfältiger Titration basierend auf Herzfrequenz und Blutdruck, einschließlich Entzugsreflex, um die stabile chirurgische Anästhesietiefe zu erreichen:
    1. Propofol (10 mg/ml) in einer Menge von 10-30 mg/kg/h (entspricht 1-3 ml/kg/h) i.v.
    2. Ketamin (100 mg/ml) in einer Menge von 5-10 mg/kg/h (entspricht 0,05-0,1 ml/kg/h) i.v.
       HINWEIS: Analgesie-/Anästhesieinfusionsleitungen werden an den kontralateralen Ohrkatheter der D5W-Infusion angeschlossen. Eine Anpassung der Gesamtflüssigkeitsaufnahme und der Umgebungstemperatur kann erforderlich sein, um eine angemessene Unterstützung und Homöostase zu gewährleisten.

3. Flüssigkeiten, Medikamente und Überwachung

HINWEIS: Dieser Abschnitt enthält Informationen darüber, wie Sie die Hydratation, die Glukoseversorgung, die Analgesie/Anästhesie aufrechterhalten und eine ordnungsgemäße Überprüfung von experimentellen Daten, Bedenken oder Problemen sicherstellen können.

1. Stellen Sie sicher, dass die IV-Infusionsrate der gesamten kombinierten Flüssigkeit (LRS und D5W) für die Homöostase im Allgemeinen 5-8 ml/kg/h beträgt.
   1. Verabreichen Sie D5W mit 5-10 ml/h in den Venenkatheter des Ohrs (stündlich angepasst auf der Grundlage der arteriellen Blutzuckerwerte (BG) - Ziel 4-5 mmol/l).
   2. Verabreichen Sie LRS durch den Femurvenenkatheter mit einer Rate von 1-6 ml/kg/h, um die Flüssigkeitshomöostase aufrechtzuerhalten. Um eine Gerinnung sowohl des arteriellen als auch des venösen Zugangs zu verhindern, befestigen Sie einen druckheparinisierten NS-Infusionsbeutel an den Schallkopf und halten Sie den Druck zwischen 250 und 300 psi.
   3. Stellen Sie während der gesamten Operation und vor Beginn der Stabilisierungsphase (Schritt 5.1) die richtige Vollnarkosetiefe und Analgesie sicher und leiten Sie die Muskelentspannung ein.
2. Überwachung der verschiedenen Parameter (Vollzeitstelle für eine Person während des gesamten Experiments).
   HINWEIS: Überwachung und Dokumentation von Vitalparametern, Beatmungsgeräteinstellungen, Eingriffen, entnommenen Proben, Medikamenten, mit Dosen und Zeitpunkten, in einem vorgefertigten gedruckten CFR (siehe Ergänzende Datei 1) während des gesamten Experiments. Die aufgezeichneten kontinuierlichen Daten des Druckmonitors und des Ventilators werden am Ende des Experiments für eine spätere Analyse gespeichert.
   1. Überwachen Sie die Sauerstoffsättigung (SpO₂) - stellen Sie das präduktale Pulsoximetersignal (rechter oberer Huf) sicher.
   2. Überwachen Sie die Herzfrequenz (HF) - befestigen Sie die EKG-Ableitungen am Ferkel.
   3. Um die Temperatur zu überwachen, führen Sie das geschmierte Rektumthermometer 3-4 cm tief ein und befestigen Sie es mit Klebeband am Schwanz. Halten Sie die Rektaltemperatur des Ferkels auf 38-39 °C, indem Sie das Heizkissen und die Umgebungstemperatur (25 °C) anpassen. Wenn Sie eine elektrische Heizquelle verwenden, stellen Sie sicher, dass eine zusätzliche Decke zwischen dem Ferkel und der Heizmatte platziert ist, um Verbrennungen zu vermeiden.
      HINWEIS: Verwenden Sie eine zusätzliche Erwärmungsquelle, wie z. B. ein Umluft-Erwärmungssystem (z. B. eine Decke, die über das Ferkel gelegt wird), wenn die Temperaturhomöostase nicht ausreichend erreicht wird.
   4. Führen Sie bis nach der Operation eine nicht-invasive Überwachung mit einer entsprechend großen Manschette durch, bestimmen Sie dann den invasiven Blutdruck, einschließlich des mittleren arteriellen Drucks (MAP) und des zentralvenösen Drucks (CVP), und dokumentieren Sie ihn auf dem CRF.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die arteriellen und venösen Schallkopfkuppeln auf Herzhöhe platziert und auf Null gesetzt werden, um genaue Messwerte zu erhalten.
   5. Führen Sie die Blutentnahme zu vorgegebenen Zeitpunkten über einen zentralen arteriellen oder venösen Katheter durch. Führen Sie eine Blutgasanalyse von 0,1 ml heparinisiertem arteriellem Blut mit einem tragbaren Blutanalysator durch (ein Gerät, das bei minimalem pH-Wert PCO₂, PO₂, HCO₃, BE, BG, Laktat, Kreatinin, Na, K, Cl - auf CRF zu vermerken ist) durchführen können, um die Ventilation und die Stoffwechselkontrolle während des gesamten Experiments zu steuern.
   6. Führen Sie biologische Probenahmen für zukünftige Experimente und Analysen durch: Sammeln Sie fortlaufend Vollblut, Plasma und Urin zu relevanten Zeitpunkten während des Versuchsprotokolls, wie es die Studienziele vorsehen. Es sind auch Endpunktproben zu entnehmen, einschließlich bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit (BALF), Lungengewebe und anderer Gewebe^16,17, soweit dies für die Studienziele relevant ist.
      1. Begrenzen Sie iatrogene Anämie und Hypovolämie:
         1. Entnehmen Sie langsam Blut (entspricht dem Dreifachen des Totraumvolumens) in einer Spritze, legen Sie es beiseite und entnehmen Sie genügend Volumen für zukünftige experimentelle Analysen (0,4-1,5 ml)²⁵ , wie z. B. Marker für entzündlichen und oxidativen Stress. Passen Sie das Probenvolumen an das Körpergewicht, den Hämoglobinspiegel und die Stabilität des Ferkels an.
            HINWEIS: Das Totraumblut wird dem Tier zurückgegeben und die Leitung wird mit Kochsalzlösung mit mindestens dem äquivalenten Volumen gespült, das für die Blutentnahme (Blutgas ± Blut für zukünftige Experimente) entnommen wurde, um die Blutlinie von Blut zu befreien und einen möglichen Verschluss aufgrund von Blutgerinnseln zu begrenzen.
   7. Erfassen Sie alle Vitalwerte und Beatmungsparameter in der CNI in regelmäßigen Abständen alle 15-30 Minuten, häufiger während der Einleitung der Anästhesie und der Operation oder wenn das Ferkel instabil ist.
   8. Notieren Sie Änderungen der Medikation ab Beginn der Anästhesie während des gesamten Experiments, indem Sie die Start- und Endzeit sowie Dosisänderungen notieren.
   9. Beurteilen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie die Zehen-/Koronarbandklemme für den Entzugsreflex zunächst in regelmäßiger Häufigkeit beurteilen. Sobald die vollständige Muskelentspannung erreicht ist, überwachen Sie die Herzfrequenz und den Blutdruck, um die Narkosetiefe weiter beurteilen zu können.
   10. Wenn nichts anderes angegeben ist, streben Sie während des gesamten Experiments Folgendes an: HR: 120-180 bpm, MAP: 50-80 mmHg, CVP: 3-10 cmH₂O, Körpertemperatur: 38-39 °C, BG: 4-5 mmol/L, PaCO₂: 35-45 mmHg, RR (max. 60 Atemzüge/min), Tidalvolumen (VT): 7 mL/kg, PIP einstellen.

4. Chirurgischer Eingriff (Zeit: ~30-40 min)

1. Halten Sie die Beatmung während der Operation aufrecht.
   1. Halten Sie die RR von 30 Atemzügen/min aufrecht, zielen Sie auf die exspiratorische VT auf 10 ml/kg ab, die durch PIP angepasst wird, einen konstanten PEEP von 6 cmH₂O, einen_T-Inspe von 0,4 s und einen FiO_2-Wert von 1,0.
2. Richten Sie ein steriles Feld ein, indem Sie ein bevorzugtes aseptisches Hautpeeling am Hals für die Tracheotomie und in der Leiste für den Zugang zu den Oberschenkelgefäßen unter Verwendung von Standard-Reinigungstechniken durchführen.
   1. Führen Sie den Schnitt am Hals durch.
      1. Führen Sie einen Hautschnitt am Hals mit einem Skalpell zwischen dem Krikoidknorpel und der sternalen Kerbe durch (ungefähre Größe von 10 cm). Verwenden Sie eine stumpfe Dissektion, um die Luftröhre zu isolieren.
      2. Fädeln Sie zwei 12-Zoll-Nabelbinder unter die Luftröhre.
      3. Machen Sie einen 5 mm großen Schnitt zwischen den Trachealringen und dem vordersten Teil der Luftröhre, direkt unter dem Krikoidknorpel. Führen Sie den Endotrachealtubus (ETT) ein. Binden Sie den ersten Knoten auf der Luftröhre, die dem Schnitt am nächsten ist.
      4. Pumpen Sie die ETT-Manschette auf und ziehen Sie die ETT vorsichtig zurück, bis die Manschette durch die Krawatte gestoppt wird. Ziehen Sie die erste Krawatte fest und befestigen Sie eine zweite Krawatte am ETT. Diese Methode stellt sicher, dass sich die Spitze über der Carina befindet, was durch die Auskultation von symmetrischen und bilateralen Atemklängen bestätigt wird.
         HINWEIS: Der Bronchus des kranialen rechten Lappens entspringt proximal der Bifurkation der Luftröhre. Seien Sie vorsichtig mit einer Verstopfung dieses Bronchus, wenn der ETT zu tief platziert wird. Wenn Probleme mit der Belüftung oder plötzliche Veränderungen auftreten, sollten Sie den Schlauch anpassen. Der Truncus varosympathisus und der Nervus laryngeus liegen in diesem Bereich des Halses. Es muss darauf geachtet werden, dass diese Nerven nicht stimuliert oder verletzt werden.
   2. Führen Sie den Leistenschnitt durch.
      1. Palpieren Sie die Oberschenkelarterie, führen Sie mit einem Skalpell einen oberflächlichen Hautschnitt an der rechten Leiste durch (ca. 8-10 cm).
      2. Verwenden Sie eine stumpfe Dissektion, um die Oberschenkelarterie und die Vene zu isolieren.
      3. Fädeln Sie je zwei Nähte (3,0 Seide) unter die Oberschenkelarterie und -vene, um sie zu isolieren²⁶. Bereiten Sie die Katheter vor, die eingeführt werden sollen.
         1. Für die Katheterisierung der rechten Oberschenkelvene heben Sie beide Nähte an, um den Blutfluss zu verschließen. Binden Sie die Oberschenkelvene distal an der vorgeschlagenen Einstichstelle ab.
            1. Führen Sie den Katheter vollständig ein, ziehen Sie das Mandrin leicht zurück und binden Sie den distalen Binder fest, um den Katheter an Ort und Stelle zu halten. Entfernen Sie das Mandrin und befestigen Sie das 6-Zoll-Erweiterungsset mit einem Drei-Wege-Absperrhahn, der mit Kochsalzlösung grundiert wurde.
            2. Bevor Sie den Katheter sichern, ziehen Sie eine kleine Menge Blut zurück, um die Durchgängigkeit zu gewährleisten. Befestigen Sie den Katheter mit dem proximalen Nahtbinder im Gefäß und verhindern Sie so ein Herausrutschen des Katheters.
            3. Befestigen Sie den sekundären Anschluss für die Abgabe von Erhaltungsflüssigkeit und die Infusion von Medikamenten. Befestigen Sie den primären Anschluss für den zentralvenösen Druck.
         2. Für die Katheterisierung der rechten Oberschenkelarterie sind an der Oberschenkelarterie die gleichen Schritte anzuwenden wie für die Vene, die in den Schritten 4.2.2.3.1.1 bis 4.2.2.3.1.3 beschrieben sind.
            1. Befestigen Sie den ersten Anschluss des 3-Wege-Absperrhahns für die invasive Blutdrucküberwachung und verlieren Sie Schnitte in der Leiste und am Hals mit chirurgischen Klammern.
   3. Führen Sie den suprapubischen Blasenkatheter für den Harnzugang durch.
      1. Die Blase befindet sich oberflächlich im Unterbauch, etwas links von der mittleren Sagittallinie. Reinigen Sie den Bauch mit aseptischer Technik.
      2. Führen Sie einen sterilen 18-G-Angiokatheter (2") parallel zur Bauchdecke ein, kranial zum untersten Brustwarzenpaar (5-6 cm unterhalb des Nabels), zum Nabel gerichtet, während Sie mit einer Hand leichten Druck auf beide Seiten der Blase ausüben, um sie zu stabilisieren und etwas zu vergrößern (das optionale Protokoll für die suprapubische Aspiration finden Sie an anderer Stelle²⁷).
      3. Sobald der Urinfluss bestätigt ist, kleben Sie den Katheter an den Bauch, um seine Position zu sichern. Befestigen Sie ein Verlängerungsset mit großer Bohrung am Katheter. Legen Sie das distale Ende in ein 50-ml-Röhrchen, das unter dem Tier platziert wird.

5. Stabilisierung und standardisierte postoperative Lungenrekrutierung (Zeit: ~30-60 min)

HINWEIS: Die Stabilisierung beginnt, wenn alle chirurgischen Eingriffe abgeschlossen sind. Eine ausreichende Analgesie-/Anästhesietiefe ist vor der Muskelentspannung unerlässlich, da sie sicherstellt, dass Vitalwerte wie MAP und HR im normalen Bereich liegen und keine Entzugsreflexe auftreten. MAP und HR werden während des gesamten Protokolls kontinuierlich überwacht, um die richtige Anästhesietiefe zu gewährleisten.

1. Verabreichen Sie Rocuronium (0,3 mg/kg) Bolus i.v. (über den D5W-Zugang der Ohrvene) und initiieren Sie eine kontinuierliche Infusion von Rocuronium (5,5 mg/kg/h) zur Muskelentspannung vor dem Lungenrekrutierungsmanöver. Diese Infusion wird für die Dauer des Experiments fortgesetzt, um das Spülverfahren zu standardisieren und eine Asynchronität mit dem Beatmungsgerät zu verhindern.
2. Führen Sie ein standardisiertes Lungenrekrutierungsmanöver durch.
   1. Schrittweise Erhöhung des PEEP: Beginnen Sie bei PEEP 6 cmH₂O und steigen Sie jede Minute um 1 cmH₂O, bis PEEP 10 cmH₂O erreicht ist. Passen Sie den PIP an, um VT 10 ml/kg zu halten.
   2. Bleiben Sie 2 Minuten lang bei PEEP 10 cmH₂O, bevor Sie auf umgekehrte Weise (wie in Schritt 5.2.1) zu einem PEEP 6 cmH₂O zurückkehren, während Sie VT 10 ml/kg beibehalten.
   3. Wenn stabil bei VT 10 ml/kg auf einem PEEP 6 cmH₂O, notieren Sie die Atemeinstellungen und physiologischen Parameter und nehmen Sie ein arterielles Blutgas (Zeitpunkt VT 10 ml/kg auf CRF).
      1. Stellen Sie sicher, dass PaO₂ >400 mmHg beträgt (erwartete Reaktion auf Hyperoxie bei einem Tier mit gesunder Lunge). FiO₂ 1.0 wird in der Anfangsphase des Experiments verwendet, um eine angemessene Reaktion auf Hyperoxie als Einschlusskriterium zu gewährleisten.
      2. Wenn dies nicht erreicht wird:
         1. Überprüfen Sie die Position des Endotrachealtubus, die Einstellungen des Beatmungsgeräts, die Sauerstoffzufuhr und die richtige Blutentnahmetechnik. Wiederholen Sie das Lungenrekrutierungsmanöver einmal, um eine ordnungsgemäße Rekrutierung sicherzustellen.
         2. Wenn sich die Besserung immer noch nicht erholt, schließen Sie das Tier aus und euthanasieren Sie es sofort (gemäß den institutionell anerkannten Protokollen) aufgrund des potenziellen intrinsischen Problems der Lunge (ungesunde Lunge durch frühere, nicht experimentelle Exposition - d. h. auf dem Bauernhof).
      3. Passen Sie das RR an, um PaCO₂ zwischen 35 und 45 mmHg zu halten.
      4. Senken Sie den PIP auf VT 7 ml/kg, wobei FiO₂ 1,0 und PEEP 6 cmH₂O beibehalten werden.
      5. Nach der Stabilisierung sind die Ausgangswerte für VT 7 ml/kg auf dem CRF-Blatt mit physiologischen Parametern und Proben, einschließlich arteriellem und venösem Blutgas, aufzuzeichnen. Die Stabilisierung umfasst Vitalparameter, wie in den Schritten 3.2.10, und Blutgaswerte von: PaO₂: 400-500 mmHg, PaCO₂: 35-45 mmHg, pH: 7,35-7,45, BG: 4-5 mmol/L.

6. Belüftung für Kontrolltiere

1. Verwenden Sie eine volumenkontrollierte Beatmung mit einem Tidalvolumen von 7 ml/kg, einem PEEP von 6 cmH₂O und einem FiO₂ von 1,0. Bei Kontrolltieren darf es nicht zu Lungenschäden kommen (d. h. es darf keine Tensidverarmung oder Endotoxin-Instillation durchgeführt werden).
2. Setzen Sie die Beatmung für etwa 90 Minuten fort, um der durchschnittlichen Dauer zu entsprechen, die erforderlich ist, um eine Lungenschädigung bei Versuchstieren zu induzieren (siehe Schritt 7 und Abbildung 1). Fahren Sie nach Ablauf dieses Zeitraums direkt mit Schritt 10 fort.

7. Induktion einer akuten Lungenschädigung (Multi-Hit-Modell)

1. Durchführung der Tensidverarmung (Zeit: 1-2 h)
   1. Schalten Sie vor Beginn der Lungenspülung das Absauggerät ein und stellen Sie sicher, dass es einsatzbereit ist. Stellen Sie den Spülauffangeimer in Position. Positionieren Sie saugfähige Pads unter dem Kopf des Tieres und unter dem Operationstisch, um die gesamte während der Spülung ausgetretene und zurückgewonnene Flüssigkeit aufzufangen.
      1. Wiegen Sie die Pads vor und nach der Spülung. Stellen Sie das Beatmungsgerät auf PEEP 5 cmH₂O, PIP 25 cmH₂O, RR 25/min und FiO₂ 1,0 ein. Behalten Sie diese druckgesteuerten Beatmungseinstellungen während des gesamten Spülvorgangs bei. Es ist zu erwarten, dass die VT während der vollständigen Spülung um etwa 35 % bis 45 % abnimmt.
   2. Trennen Sie den Beatmungskreislauf vom ETT und befestigen Sie das Spültrichtergerät (siehe Zusatzdatei 1).
   3. 30 ml/kg warme isotonische Kochsalzlösung (NS) in die Lunge inträufeln, indem NS vorsichtig in den Trichter gegossen wird, der etwa 30 cm über dem Ferkel gehalten wird.
   4. Massieren Sie den Brustkorb, indem Sie beidseitig auf den lateralen Aspekt drücken, um einen mechanischen "Druck" zu erzeugen. Helfen Sie, Salzlösung in die Lunge zu transportieren und sie im Spülapparat zirkulieren zu lassen. Lassen Sie 2-3 Sekunden zwischen den Massagen.
      HINWEIS: Vermeiden Sie eine zu schnelle oder zu langsame Massage, um eine unzureichende Entfernung des Tensids oder einen beeinträchtigten venösen Rückfluss zu vermeiden. 30 s pro Spülgang nicht überschreiten.
      1. Entfernen Sie die Spülflüssigkeit, indem Sie den Trichter unter das Ferkel absenken. Trennen Sie den Trichter leicht von der ETT, damit die Flüssigkeit in den Auffangbehälter auf dem Boden abfließen kann.
      2. Führen Sie eine aktive Absaugung für nicht länger als 10 s durch. Führen Sie den Absaugkatheter in den ETT ein, während Sie die Brustkorbmassage fortsetzen, um den Flüssigkeitsabfluss zu erleichtern. Überwachen Sie MAP und HR und schließen Sie die Beatmung frühzeitig wieder an, wenn einer der Parameter signifikant abfällt.
      3. Schließen Sie den Beatmungskreislauf wieder an. Wenn überschüssige Flüssigkeit im ETT verbleibt, führen Sie eine zweite Absaugung durch.
   5. Lassen Sie das Ferkel zwischen den Spülgängen mindestens 3 Minuten lang entspannen, um Stress und das Risiko einer Unverträglichkeit zu reduzieren.
   6. Starte die nächste Lava-Runde, sobald SpO₂ wieder auf 100 % ankommt. Wenn SpO₂ nicht auf 100 % zurückkehrt, überprüfen Sie PaO₂über Blutgas, sobald sich SpO₂ stabilisiert hat
      1. Wenn PaO₂ >100 mmHg - Wiederholen Sie die Lungenspülungen (Schritte 7.1.2-7.1.6).
      2. Wenn PaO₂ <100 mmHg - 15 Minuten warten, während die Einstellungen für die Spülbeatmung beibehalten werden, dann die Blutgasanalyse wiederholen.
      3. Wenn PaO₂ >100 mmHg - die Spülung fortsetzen und mit Schritt 7.1.6 fortfahren, um das Ausmaß der Verletzung erneut zu beurteilen.
   7. Bestätigen Sie, dass eine Tensidabbauschädigung erreicht wird, wenn PaO₂ 15 Minuten lang <100 mmHg bleibt. Stoppen Sie die Spülung und fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort.
2. Intratracheales Endotoxin einträufeln (Dauer: 15 min)
   1. Lipopolysaccharid (LPS) aus Escherichia coli (1,5 mg/kg) wird durch Verdünnung in NS auf ein Gesamtvolumen von 2 ml in einer 3-ml-Spritze hergestellt.
      HINWEIS: Wählen Sie den Stamm und die Dosis entsprechend aus, wobei mögliche stammabhängige Variationen der Wirkungen zu berücksichtigen sind.
   2. Warten Sie 15 Minuten nach der letzten Lungenspülung und inträufeln Sie dann LPS intratracheal (IT) mit dem Ferkel in Rückenlage.
   3. Verbessern Sie die homogene LPS-Verteilung in der atelektatischen Lunge mit den folgenden Schritten:
      1. Ersetzen Sie das Standard-ETT-Ende durch einen Y-Port-Adapter, um die gleichzeitige Beatmung und LPS-Verabreichung über einen Katheter durch den seitlichen Anschluss mit Ventil zu ermöglichen.
      2. PEEP von 10 cmH₂O für 1 min auftragen. Passen Sie den PIP an, um die VT bei 7 ml/kg zu halten, und stellen Sie die RR auf 40 Atemzüge/min ein.
      3. Führen Sie einen Katheter bis zu einer vorgemessenen Tiefe durch den seitlichen Anschluss in das ETT ein, sodass die Spitze 1-2 mm über das ETT hinausragt.
      4. Injizieren Sie das LPS durch den Katheter. Spülen Sie den Katheter mit 1 mL NS, gefolgt von einem 9 mL Luftbolus, um eine vollständige Verabreichung zu gewährleisten.
      5. Entfernen Sie den Katheter und schließen Sie den seitlichen Port.
      6. Setzen Sie die Beatmung mit PEEP 10 cmH₂O (PIP anpassen, um VT 7 ml/kg zu halten) für 3 Minuten nach der LPS-Verabreichung fort.
      7. Trennen Sie den Beatmungskreislauf für 30 s vom ETT, um eine unbeabsichtigte Rekrutierung von Lungengewebe rückgängig zu machen.
      8. Während der Trennung ist die Einstellung des Beatmungsgeräts auf FiO₂ 0,5, PEEP 6 cmH₂O, PIP zur Aufrechterhaltung des VT 7 ml/kg und Erhöhung des RR auf 40-60 Atemzüge/min zu erhöhen, um einen PaCO_2-Wert von 35-45 mmHg zu erreichen.
      9. Sobald die VT bei 7 ml/kg stabilisiert ist, zeichnen Sie die physiologischen Messungen zum Zeitpunkt 0 Stunden auf und füllen Sie das CRF-Blatt aus. Passen Sie die RR basierend auf PaCO₂ aus der Blutgasanalyse an.

8. Lüftung während des Beobachtungszeitraums (Zeit: ~6 h)

1. Wechseln Sie zu volumenkontrollierter Beatmung mit FiO₂ bei 0,5 und PEEP bei 6 cmH₂O. Passen Sie den PIP nach Bedarf an, um die VT bei 7 ml/kg zu halten (stellen Sie keinen maximalen PIP ein). Passen Sie die RR bis zu einem Maximum von 60 Atemzügen/min an, um den normalen PaCO_2-Wert aufrechtzuerhalten.
2. Verwenden Sie stündliche Blutgasmessungen, um die RR-Anpassungen für den Rest des Experiments zu steuern. Passen Sie den PIP kontinuierlich an, um die VT bei 7 ml/kg zu halten.
3. Diese Beatmungsparameter sind während des gesamten 6-stündigen Beobachtungszeitraums einheitlich sowohl auf Kontroll- als auch auf Mehrfachtreffertiere anzuwenden (siehe Abbildung 1).

9. Behandlungsablauf - optional (Zeit: ~10-20 min)

1. Bei potenziellen Interventionsstudien ist das Therapeutikum über einen klinisch relevanten Weg wie intratracheal (IT), intravenös (IV), subkutan, intramuskulär oder intranasal zu verabreichen. Wählen Sie den Zeitpunkt der Behandlung basierend auf dem Versuchsdesign aus. Wenn keine Behandlung verabreicht wird, fahren Sie mit Schritt 10 fort. Im Folgenden finden Sie ein Beispiel für die IT-Administration:
   1. Positionieren Sie das Ferkel in der rechten Seitenlage.
   2. Halten Sie den PEEP bei 6 cmH₂O. Passen Sie den PIP an, um einen VT von 7 ml/kg zu erreichen.
   3. Führen Sie den Katheter bis zur vorgegebenen Länge in den seitlichen Anschluss mit Ventil ein (wie in Schritt 7.2.3.3 beschrieben). Geben Sie die Hälfte der beabsichtigten Dosis oder des beabsichtigten Volumens der Intervention. Anschließend einen Bolus von 1 ml NS und 9 ml Luft einnehmen. Begrenzen Sie das Gesamtvolumen auf 2,5 ml/kg, um das Risiko eines Beatmungsverschlusses nach der Bolusinjektion zu minimieren.
   4. Verschließen Sie den seitlichen Anschluss mit Ventil mit der Kappe, um ein Austreten der Belüftung zu verhindern.
   5. Positionieren Sie das Ferkel wieder in die linke Seitenlage und wiederholen Sie die Schritte 9.1.3-9.1.4.
   6. Bringen Sie das Ferkel wieder in die Rückenlage. Passen Sie den PIP an, um die VT bei 7 ml/kg zu halten.
   7. Setzen Sie die Belüftung wie in Schritt 8 beschrieben fort.

10. Euthanasie und Abschluss des Versuchs

1. Führen Sie die abschließenden physiologischen Aufzeichnungen und Probenentnahmen nach 6 h Beatmung während des Beobachtungszeitraums durch (Schritt 8).
2. Euthanasieren Sie das Tier mit 120 mg/kg Pentobarbital-Natrium IV (240 mg/ml), das als Bolus verabreicht wird (gemäß institutionell anerkannten Protokollen).
3. Stellen Sie sicher, dass der Tod eines Tieres ohne Vitalzeichen (Herzschlag, Blutdruck und Atmung) vorhanden ist. Auskultieren für das Fehlen von Herzfrequenz- und Atemgeräuschen mit einem Stethoskop zur Bestätigung des Todes. Der Tod wird ferner durch eine terminale Gewebeentnahme des Herzens und der Lunge bestätigt.
4. Entnahme der Gewebeproben und Körperflüssigkeiten für weitere biochemische, molekulare und/oder histologische Analysen^14,17 für zukünftige Experimente.
5. Speichern Sie alle Daten in den Überwachungsgeräten und im Beatmungsgerät, stellen Sie sicher, dass Sicherungskopien auf das lokale Laufwerk und das freigegebene Laufwerk hochgeladen werden, und schalten Sie alle Geräte aus.
6. Entsorgen Sie alle scharfen/biologisch gefährlichen Materialien gemäß den örtlichen Richtlinien.
7. Reinigen Sie alle Oberflächen mit dem bevorzugten Antiseptikum.
8. Waschen Sie alle Instrumente und lassen Sie sie über Nacht trocknen.

Die Endpunkte dieses Modells orientieren sich an den Kriterien der American Thoracic Society für ALI (mindestens 3 von 4), zu denen physiologische, histologische, entzündliche und alveolär-kapillare Barriereveränderungen gehören16,17. Weitere Endpunkte können je nach Studie und nach Ermessen jeder Forschungsgruppe, die dieses Modell implementieren möchte, aufgenommen werden. Eine mittelschwere Lungenschädigung ist definiert als ein Verhältnis des partiellen Anteils des Sauerstoffs im arteriellen Blut zum Anteil des eingeatmeten Sauerstoffs (PaO2/FiO2, auch bekannt als P/F-Verhältnis) < 200 mmHg und der schwere < 100 mmHg17. Der Sauerstoffindex (OI) wird nach folgender Formel berechnet: OI = (mittlerer Atemwegsdruck (mAWP) * %O2)/PaO2, und Werte zwischen 8 und 16 werden als mittelschwere Verletzung eingestuft28. Im Vergleich zu Kontrolltieren zeigten Multi-Hit-Tiere aufgrund ihres beeinträchtigten Oxygenierungsindex, des P/F-Verhältnisses und der verminderten Compliance des Atmungssystems schwere bis mittelschwere Lungenschäden (Abbildung 2). Deutliche Anzeichen einer histologischen Schädigung zeigten sich bei einem 5-Modalitäten-Score für histologische Lungenschäden16,17 (Abbildung 3), mit Neutrophileneinstrom in den Alveolär- und Interstitialraum, proteinhaltigen Trümmern, die die Lufträume füllten, und einer Alveolarseptumverdickung. Der Neutrophileneinstrom im BALF gibt einen Hinweis auf Entzündungsprozesse neben einem erhöhten IL-6-Zytokin im Lungengewebe (Abbildung 4).

Abbildung 1: Flussdiagramm der akuten Lungenschädigung bei neonatalen Ferkeln. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Eine mittelschwere bis schwere ALI wird beobachtet, indem die in diesem Protokoll dargestellte Multi-Hit-Verletzung befolgt wird. (A,B) Ein erhöhter Oxygenierungsindex (zwischen 8-12) und ein niedriges PaO2/FiO2 (P/F)-Verhältnis werden in dem hier vorgestellten Multi-Hit-Modell (rote Linie) im Vergleich zur Kontrolle (blaue Linie) im Einklang mit einer mittelschweren bis schweren Lungenverletzung erzielt. (C) Die Lungenfunktion ist bei Multi-Hit-Tieren beeinträchtigt, was sich in einer Abnahme der Compliance des Atmungssystems um >50 % zeigt. Anzahl der Tiere (N): Kontrolle (N = 5) und Multi-Hit (LPS-Stamm O55:B5, 1,5 mg/kg) (N = 3). Alle verwendeten Werte beziehen sich auf ± SD. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Das Multi-Hit-ALI-Modell zeigt eine heterogene histologische Verletzung. (A,B) Es wird ein makroskopischer Nachweis einer fleckigen Lungenschädigung beobachtet, die bevorzugt den hinteren zentralen Aspekt der Multi-Hit-Lunge betrifft. (C,D) Repräsentative Bilder (100x) von Hämatoxylin- und Eosin (H&E)-gefärbten Lungenschnitten, die einen neutrophilen Einstrom im Alveolär- und Interstitialraum zeigen, mit Alveolär- und Septumverdickung in der Multi-Hit-Lunge. (E,F) Repräsentative Bilder (400x) von H&E-gefärbten Lungenschnitten zeigen die Beeinträchtigung der strukturellen Integrität, die neutrophile Infiltration und die Ablagerung von Trümmern im Alveolarraum der Multi-Hit-Lunge. Blaue Quadrate stellen den vergrößerten Bereich in (E,F) dar. Der schwarze Maßstabsbalken stellt 100 mm (C,D) und 50 mm (E,F) dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Das Multi-Hit-Modell zeigt eine Entzündungsreaktion nach ALI. (A) Neutrophileneinstrom mit Neutrophilen, die mehr als 75% des Anteils der Gesamtzellen in der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit (BALF) 6 h nach induzierter Lungenverletzung (Multi-Hit) erreichten, verglichen mit Kontrolltieren. (B) Das proinflammatorische Zytokin IL-6 ist in der bronchoalveolären Lavage-Flüssigkeit (BALF) und (C) im Lungengewebe 6 h nach induzierter ALI erhöht. Die Anzahl der Tiere (N) variiert aufgrund des zum Zeitpunkt der Analyse verfügbaren Materials. Für BALF (B) wurde ein enzymgebundener Immunsorbent-Assay verwendet, während für Lungengewebe (C) die Multiplex-Laserbead-Technologie durchgeführt wurde. Alle Werte sind als Mittelwert ± SD dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Datei 1: Fallüberwachungsformular für das Modell der akuten Lungenverletzung von Neugeborenenferkeln. Bitte klicken Sie hier, um diese Broschüre herunterzuladen.

Alle anderen Autoren haben keine konkurrierenden Interessen geltend zu machen.