Um die Reaktion der Chondrozytenverletzung auf eine mechanische Knorpelüberlastung besser zu verstehen, beschreibt das Protokoll die Entwicklung eines ex vivo Knorpelaufprallmodells, das 24 h lang subletal war.
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Methodenartikel
In vitro Impact-Modell zur Erzeugung subletaler Chondrozytenverletzungen in Rinderknorpel-Explantaten
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Posttraumatische Osteoarthritis (PTOA) ist eine weit verbreitete, degenerative und schmerzhafte fortschreitende Gelenkerkrankung, die typischerweise nach einem schweren Gelenktrauma auftritt und über 6 Millionen Amerikaner betrifft. Ein schlaginduziertes Knorpeltrauma führt zu einer Chondrozytenverletzungsreaktion, die in PTOA gipfelt. Das Verständnis der molekularen Ereignisse, die mit Chondrozytenverletzungen verbunden sind, ist notwendig, um Therapien zu entwickeln, um PTOA zu verhindern oder ihr Fortschreiten zu verlangsamen. Um dies zu erleichtern, wurde ein ex vivo Knorpelaufprallmodell entwickelt, das 24 h lang subletal war. Osteochondrale Explantate wurden aus den metacarpophalangealen Gelenken von Rindern geerntet, und ein Fallturm wurde verwendet, um die Aufpralllasten auf die Explantate abzugeben. Um sicherzustellen, dass die Belastung und der Aufprall relativ gleichmäßig auf den Gelenkknorpel aufgebracht wurden, wurden die Explantate mit der Knochenoberfläche nach oben positioniert und der Knochen von oben impaktiert. Ab einer Schlittenhöhe von 4,0 cm, 4,5 cm und 5,0 cm wurden unterschiedliche Lasten auf die Explantate aufgebracht, was zu durchschnittlichen Spitzenspannungen von 10,87 ± 1,84 MPa, 11,69 ± 0,67 MPa bzw. 12,98 ± 0,75 MPa führte. Die Studie analysierte die Rolle des subchondralen Knochenvorhandenseins im Knorpel während der Kultur nach dem Aufprall und die Wirkung der Verwendung eines angepassten oder losen Halters während des Aufpralls, um die Zellviabilität und Apoptose zu bewerten. Gelenkknorpel, der aus einer Entfernung von 4,5 cm impaktiert wurde, in Kombination mit einem angepassten Halter und sofortiger Knochenentfernung, bot das optimale Modell, um 24 Stunden nach dem Aufprall eine Knorpelverletzung mit minimalem Zelltod zu induzieren.
Einleitung
Posttraumatische Osteoarthritis (PTOA) ist eine schwächende Krankheit, von der über 5 Millionen Erwachsene in den Vereinigten Staaten betroffensind 1. Ein einziger traumatischer Aufprall auf den Knorpel kann eine Chondrozytenverletzungsreaktion auslösen, die zu früh einsetzenden Symptomen und einem lebenslangen Kampf mit Gelenkschmerzen und Funktionsstörungen führt2. Knorpel hat wenig bis gar keine intrinsische Reparaturfähigkeit, so dass ein ungedeckter Bedarf an der Entwicklung von Therapien besteht, um das Fortschreiten der Krankheit zu modifizieren3. Da die PTOA mit einem einzigen, klar definierten traumatischen Ereignis korreliert, besteht die Möglichkeit, einzugreifen, bevor die Krankheit fortschreitet. Die Entwicklung dieser Behandlungen wird jedoch durch die Wissenslücke über die molekulare Signalgebung behindert, die die Chondrozytenverletzungsreaktion reguliert und zu posttraumatischer Osteoarthritis führt 2,3,4. Ein besseres Verständnis der molekularen Ereignisse nach einer Chondrozytenverletzung könnte dazu beitragen, neue therapeutische Behandlungen zu entwickeln, die die Reaktion auf Chondrozytenverletzungen retten und die Entwicklung von PTOA verhindern oder verzögern 2,5,6.
Um die molekulare Signalübertragung von Chondrozytenverletzungen besser zu verstehen, wurden in der bisherigen Forschung Falltürme oder ähnliche Geräte verwendet, die mechanisch auf Knorpelexplantate aufprallen, so dass eine Verletzungsreaktion ausgelöst wird. Diese Studien haben versucht, viele Aspekte dieser Reaktion zu charakterisieren, einschließlich Veränderungen der mechanischen Eigenschaften und der Struktur 7,8, Matrixschäden und -synthese 6,9,10,11, mitochondriale Dysfunktion12,13,14,15, Ionentransportwege 16,17,18,19 und Genexpression 9,11,20,21,22,23. In vielen dieser Studien wurde die Zellviabilität jedoch entweder nicht berichtet oder war beeinträchtigt, wobei in einigen Studien eine Zellviabilität von 50 % oder weniger erreichtwurde 24,25,26. Verwirrende Effekte einer geringen Zellviabilität können es schwierig machen, die Verletzungsreaktion zu untersuchen. Der Tod von Chondrozyten, der unmittelbar auf ein Gelenktrauma folgt, ist irreversibel, aber Therapien zur Behandlung von Chondrozytenverletzungen mildern die nachfolgende PTOA27. Um molekulare Veränderungen zu identifizieren, die mit einer Schädigung der Chondrozyten und nicht mit einem Verlust lebensfähiger Zellen verbunden sind, ist ein Knorpelwirkungsmodell erforderlich, das die Lebensfähigkeit der Chondrozyten für einen bestimmten Zeitraum aufrechterhält. Darüber hinaus würde ein Knorpelaufprall, der eine Chondrozytenverletzungsreaktion erzeugt, die im gesamten Knorpelgewebe relativ gleichmäßig ist, die konsistentesten Ergebnisse bei der Analyse des Zellverhaltens liefern.
Das Ziel der Studie war es, ein kostengünstiges ex vivo Stoßverletzungsmodell für Gelenkknorpel zu entwickeln und zu charakterisieren, das die Fähigkeit zur Untersuchung von Signalwegen bewahrt, die der akuten Knorpelverletzungsreaktion inhärent sind. Darüber hinaus könnte ein solches Modell verwendet werden, um mögliche Behandlungen zur Rettung der Verletzungsreaktion zu bewerten. Um dies zu erreichen, entwickelten wir zunächst eine sterile Technik, um Knorpelexplantate aus Rindermetacarpophalangealgelenken von skelettreifen Tieren mit einem diamantbestückten Bohrbohrer, der an einer Bohrmaschine montiert war, zu ernten. Metacarpophalangealgelenke werden vom Schlachthof entsorgt, wenn die Tiere für den Verzehr verarbeitet werden, was dieses Gelenk zu einer leicht zugänglichen und kostengünstigen Gewebequelle macht. Als nächstes etablierten wir ein Aufprallverletzungsmodell, bei dem die osteochondrale Probe in einer Halterung unter einem Fallturmgerät platziert wurde. In diesem Modell wurden die osteochondralen Proben mit der Gelenkfläche nach unten auf eine hochglanzpolierte Edelstahloberfläche #8 gelegt, und der Knochen wurde einem Aufprall von oben ausgesetzt, wodurch das Knorpelgewebe relativ gleichmäßig belastet wurde. Es wurden Aufprallparameter bestimmt, die die Lebensfähigkeit der Chondrozyten für 24 Stunden nach dem Aufprall aufrechterhalten und gleichzeitig eine apoptotische molekulare Verletzungsreaktion auslösen. Halter, die unterschiedliche laterale Bewegungen der Probe während des Aufpralls zuließen, wurden auf ihre Wirkung auf die Zellviabilität und Apoptose untersucht; Schließlich wurde die Wirkung der Knorpelentfernung aus dem subchondralen Knochen nach dem Aufprall untersucht.
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Protokoll
Die Verwendung von Rindergliedmaßen, die aus einem örtlichen Schlachthof gewonnen wurden, bedurfte keiner ethischen Genehmigung, da die Gewebe post mortem von Tieren entnommen wurden, die für den Verzehr verarbeitet wurden.
1. Osteochondrale Explantat-Ernte
- Sterilisieren Sie die folgenden Materialien vor der Explantaternte mit einem Autoklaven: Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS; ca. 1 l pro Gelenk), Bohrkrone, Wasserdrehadapter, eine autoklavierbare Waschflasche, ein Skalpellgriff, zwei Pinzetten und ein Autopsiesägeblatt.
- Richten Sie die Gewebekulturhaube mit Bohrmaschine und Schraubstock in einem Becken ein, um PBS einzudämmen. Kernbohrer und Schwenkadapter in der Bohrmaschine montieren und die Schwenkadapterdüse mit einem Schlauch an eine mit sterilisiertem PBS gefüllte Ballonflasche anschließen. Bauen Sie die Autopsiesäge zusammen und setzen Sie sie in die Haube ein (Abbildung 1A-B).
- Verteilen Sie Einweg-Unterpolster in einem Stapel in der Gewebekulturhaube, eines für jedes Gelenk.
HINWEIS: Die Unterpolster absorbieren PBS und Synovialflüssigkeit, die beim Öffnen des Gelenks tropfen können. Das Stapeln mehrerer Unterpolster ermöglicht ein einfaches Entfernen der obersten Schicht, wenn sie zu nass wird, und bietet während des gesamten Eingriffs einen sauberen und trockenen Arbeitsbereich. - Bereiten Sie ein 50-ml-Reagenzglas mit 70 % Ethanol und ein weiteres 50-ml-Reagenzglas mit 0,13 % v/v Betadin in PBS vor und legen Sie sie in die Haube. Setzen Sie eine Pinzette und einen Skalpellgriff in das Ethanol-Reagenzglas ein, um die Sterilität während der Gewebehandhabung zu erhalten, und platzieren Sie eine sterile 6-Well-Zellkulturplatte an der Rückseite der Haube.
- Bereiten Sie 3 ml Zellkulturmedium pro erwarteter Probe vor. Die Nährmedien bestehen aus modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 0,9 mM Natriumpyruvat, Insulin, Transferrin und Selen (ITS), 50 mg/ml L-Ascorbinsäure, minimalem essentiellem Medium (MEM), nicht essentiellen Aminosäuren (MEM), Penicillin, Streptomycin und Amphotericin B. L-Ascorbinsäure und ITS am Tag der Anwendungzugeben 28.
- Besorge dir innerhalb von 6 Stunden nach der Schlachtung Rindervorderläufe von skelettreifen Tieren aus einem örtlichen Schlachthof. Halten Sie das Taschentuch während des Transports auf Eis.
- Isolieren Sie das Metacarpophalangealgelenk, indem Sie den Huf mit einer Fleischbandsäge entfernen, ohne die Gelenkkapsel zu öffnen. Entfernen Sie die Haut mit #22 Skalpellklingen, ohne die Gelenkkapsel zu durchstechen.
- Spülen Sie jedes Bein außerhalb der Biosicherheitswerkbank gründlich mit kaltem Wasser ab, um Schmutz zu entfernen, und beschichten Sie es zur Desinfektion mit Betadin.
- Öffnen Sie in der Gewebekulturhaube die Gelenkkapsel mit einer neuen Skalpellklinge #22. Isolieren Sie das distale Gelenk und halten Sie den Gelenkknorpel mit PBS aus einer Waschflasche hydratisiert (Abbildung 1C). Decken Sie den Gelenkknorpel mit steriler, mit PBS getränkter Gaze ab, um die Hydratation zu erhalten.
- Das distale Metacarpophalangealgelenk wird weiter isoliert, indem der Mittelfußknochen mit der Autopsiesäge durchtrennt wird (Abbildung 1D). Setzen Sie das distale Gelenk mit dem bedeckten Knorpel nach oben in den Schraubstock ein und ziehen Sie es fest, bis es fest sitzt. Befeuchten Sie während des gesamten Prozesses die Gaze auf dem Knorpel regelmäßig mit PBS.
- Falten Sie die Gaze von einem Kondylus weg und stellen Sie die Position des Schraubstocks so ein, dass sich der Bohrer über dem flachsten Bereich der Gelenkoberfläche befindet (Abbildung 1E).
- Öffnen Sie das Ballonventil, damit PBS durch den Bohrmeißel fließen kann. Verwenden Sie eine Waschflasche, um das Gewebe kontinuierlich mit PBS zu hydratisieren und die Proben während der Bohrung zu kühlen.
HINWEIS: PBS aus der Ballonflasche und der Waschflasche hat einen kühlenden Effekt während des Entkernungsprozesses. - Bohren Sie langsam in den Kondylus ein, indem Sie den Bohrer in die Oberfläche des Kondylus drücken. Lassen Sie den Druck häufig ab und lassen Sie die Wärme abführen. Fahren Sie fort, bis die Kerntiefe etwa 2 mm in den subchondralen Knochen eindringt. Wiederholen Sie den Vorgang für jede Seite (Abbildung 1E).
HINWEIS: Anzeichen einer Überhitzung sind schnelle Verdunstung der Flüssigkeit oder ein Brandgeruch. - Verwenden Sie die Autopsiesäge, um osteochondrale Kerne freizusetzen, indem Sie den Knochen parallel zur Gelenkknorpeloberfläche schneiden und während des Schneidens weiterhin PBS aus der Waschflasche an die Schnittstelle zwischen der Autopsiesäge und dem osteochondralen Knochen drücken. Halten Sie während dieses Schritts die angefeuchtete Gaze auf der Oberfläche des Gelenkknorpels, um eine Austrocknung zu vermeiden.
- Lagern Sie die osteochondralen Kerne (Abbildung 1F) in verdünnter Betadinlösung (siehe Schritt 1.3), bis alle Gelenke bearbeitet wurden.
- Spülen Sie die osteochondralen Kerne in PBS und überführen Sie die Proben in einzelne Vertiefungen einer sterilen 6-Well-Platte, die 3 ml vorgewärmtes Kulturmedium enthält (DMEM mit 0,9 mM Natriumpyruvat, Insulin-Transferrin-Selen (ITS), 50 mg/ml L-Ascorbinsäure, nichtessentielle Aminosäuren, Penicillin, Streptomycin und Amphotericin B)28. Die Proben werden in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 bis zum Aufprallverfahren am nächsten Tag aufbewahrt.
2. Wirkung der osteochondralen Explantat
- Fertigen Sie einen Schlaghalter aus Edelstahl mit einer hochglanzpolierten Schlagfläche (Ergänzende Abbildung 1 und Ergänzende Abbildung 2) und bohren Sie entsprechende Löcher in die Grundplatte des Fallturms (Ergänzende Abbildung 3).
- Folgende Materialien sind vor dem Schlagvorgang mit einem Autoklaven zu sterilisieren: Kugelimpaktorkopf aus Edelstahl mit 15 mm Durchmesser, Edelstahlhalter mit hochglanzpolierter Schlagfläche, 4 6/32 Schrauben, 4 Unterlegscheiben, Pinzette.
- Platzieren Sie einen Fallturm, der zuvor entworfen und hergestellt wurde29, in eine Biosicherheitswerkbank. Verwenden Sie für diese Studie einen Fallturm mit einem kugelförmigen Impaktorkopf mit einem Durchmesser von 15 mm, der auf einem Schlitten montiert ist, der mit einer Wägezelle und einem Beschleunigungsmesser ausgestattet ist (Abbildung 2A), mit einer Gesamtmasse des Schlittens von 358,4 g.
- Befestigen Sie den Halter mit vier autoklavierten Schrauben an der Grundplatte des Fallturms (Abbildung 2B). In dieser Studie wurden Halter mit kreisförmigen Öffnungen von 8,7 mm und 9,1 mm Durchmesser getestet.
- Platzieren Sie einen osteochondralen Kern in der Halterung (Ergänzende Abbildung 1, Ergänzende Abbildung 2, Ergänzende Abbildung 3) unter dem Schlagkopf des Fallturms mit dem Knochen nach oben.
HINWEIS: Für eine homogenere Belastung wurde die Platzierung des osteochondralen Kerns mit dem Knochen nach oben und der Gelenkfläche nach unten30 gewählt. - Stellen Sie den Fallturmschlitten auf die gewünschte Höhe relativ zur Oberseite des Knochens ein. Ermitteln Sie die ungefähre Fallturmhöhe aus Pilotstudien. In dieser Studie wurden Körpergrößen von 4,0, 4,5 und 5,0 cm untersucht.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Start in der Datenerfassungssoftware (Supplementary Coding File 1), kurz bevor Sie den Fallturmwagen freigeben, indem Sie den Spindelanschlag freigeben (Abbildung 2A) und den Impaktorkopf unter dem Gewicht der Schwerkraft auf die Probe fallen lassen. Heben Sie den Schlitten sofort an und legen Sie ihn auf den Spindelanschlag.
HINWEIS: Während des Aufpralls werden die Daten bei 100 kHz mit Hilfe einer Datenerfassungssoftware erfasst, die mit einem Datenerfassungsmodul verbunden ist, das Signale von einer Wägezelle, die zwischen dem Schlagkörper und dem Schlitten positioniert ist, sowie von einem Beschleunigungsmesser aufzeichnet. Obwohl wir den Schlitten so schnell wie möglich nach dem Aufprall anheben, verfügt er nicht über eine Rückprallschutzfunktion oder einen anderen Mechanismus, um einen zweiten Aufprall zu verhindern. - Legen Sie die von der Datenerfassungssoftware generierte .txt Datei im selben Ordner wie den Matlab-Datenanalysecode ab (Supplementary Coding File 2, auch unter https://github.com/sogol-younesi/cartilage-impact-analysis verfügbar) und führen Sie den Datenanalysecode aus, um Rohdaten zu filtern und Wirkungsparameter zu berechnen.
HINWEIS: Der Datenanalysecode verwendet eine Knorpeldicke von 0,563 mm, um die Aufprallenergie zu berechnen. Dies wurde bestimmt als die durchschnittliche Knorpeldicke, die von > 50 Stellen an jeder der fünf Proben in einer separaten Studie unter Verwendung der Nadelmethode31 und eines mechanischen Biomomentum Mach-1-Testers entnommen wurde. Die Auswirkungsparameter werden wie zuvor beschriebenberechnet 32. - Entferne den Knorpel vom Knochen mit einer #11 Skalpellklinge, falls zutreffend. Die Probe wird bis zur Bildgebung am nächsten Tag bei 37 °C mit 5 % CO2 in das Medium und den befeuchteten Inkubator zurückgebracht.
HINWEIS: In dieser Studie wurde die Wirkung der Entfernung von Knorpel aus dem Knochen unmittelbar nach dem Aufprall oder 24 Stunden nach dem Aufprall untersucht.
3. Charakterisierung der Zellviabilität in Knorpelproben
- Entfernen Sie bei Bedarf Knorpel aus dem Knochen. Schneiden Sie die Knorpelprobe mit einem scharfen Skalpell in zwei Hälften. Vermeiden Sie mehrfache Schnitte; Streben Sie einen einzigen Schnitt an, um eine glatte Kante zu gewährleisten.
- Tauchen Sie jede gewünschte Halbprobe in eine Lösung, die aus 5 μM Ethidium-Homodimer und 2,5 μM Calcien AM in PBS besteht. Vor Licht schützen und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, um die Lebendfärbung abzuschließen.
- Spülen Sie die Proben 2x mit PBS und bewahren Sie die Proben bis zur Bildgebung in PBS auf. Bild so bald wie möglich, nachdem die Färbung abgeschlossen ist.
- Stellen Sie die Knorpelprobe aufrecht auf ein paar Tropfen PBS in eine Mikroskopieschale, so dass der volle Halbkreis von der Vorderseite des Mikroskops aus sichtbar ist. Nehmen Sie Bilder mit einem inversen Konfokalmikroskop auf. Beugen Sie den Knorpel mit einer Pinzette leicht, wenn er nicht von alleine aufrecht steht.
- Unter Verwendung von FIJI, einer Distribution von ImageJ mit gebündelten Plugins33, konvertieren Sie das Bild zunächst in 8-Bit, indem Sie auf Image > Type > 8-Bit klicken. Legen Sie dann den Schwellenwert unter Bild > Schwellenwert >anpassen fest und klicken Sie auf Anwenden. Führen Sie als Nächstes die Funktion Watershed unter Process > Binary aus, und führen Sie Partikel analysieren... unter Analysieren für den grünen und den roten Kanal. Analysieren Sie Bilder, die mit einer konsistenten Z-Höhe für jede Probe aufgenommen wurden, um genaue Vergleiche zwischen den Gruppen zu ermöglichen.
- Berechnen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen, indem Sie die Anzahl der lebenden Zellen durch die Gesamtzahl der Zellen in der Probe dividieren.
4. Charakterisierung der Apoptose in Knorpelproben
- Tauchen Sie jede gewünschte Halbprobe in 8 μM Caspase-3/7 Green Detection Reagenz in PBS. Vor Licht schützen und bei 37 °C 30 min inkubieren.
- Waschen Sie die Proben mit PBS 3x. Fixieren Sie die gefärbten Proben, indem Sie sie 15 Minuten lang in 4 % Paraformaldehyd (PFA) inkubieren. Erneut mit PBS waschen und bis zur Bildgebung in PBS aufbewahren. Bild innerhalb von 24 Stunden nach der Färbung.
- Aufnahme mit konfokalem Mikroskop (siehe Schritt 3.4 oben). Für valide Vergleiche der Fluoreszenzintensität zwischen Gruppen sollten konsistente Bildgebungsparameter für alle Proben beibehalten werden, einschließlich Objektivlinse, Anregungslaserleistung, Verstärkung des Photomultiplier-Röhrendetektors, Lochgröße, Dicke der optischen Schicht, Scangeschwindigkeit, Zeilenmittelung und Bildauflösung.
- Wählen Sie mit der FIJI-Erweiterung von ImageJ im Menü "Analysieren > Messungen einstellen..." die Option "Mittlerer Grauwert" aus.
- Verwenden Sie das Werkzeug "Polygonschnitt", um den gesamten Bereich des in einem Bild gezeigten Beispiels zu umranden. Führen Sie die Funktion Messen im Menü Analysieren aus, und notieren Sie den mittleren Grauwert mit denselben Verarbeitungsparametern für alle Gruppen.
- Verwenden Sie das Werkzeug Polygonschnitt, um einen Bereich des Bildes auszuwählen, der das Muster nicht enthält, und führen Sie die Funktion "Messen" erneut aus. Notieren Sie dies als mittleren Grauwert des Hintergrunds.
- Berechnen Sie die Fluoreszenzintensität, indem Sie den mittleren Grauwert des Hintergrunds vom mittleren Grauwert der Probe subtrahieren.
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Ergebnisse
Die mechanische Aufprallbelastung der osteochondralen Explantate erfolgte mit Hilfe eines Fallturms mit Schlittenhöhen von 4,0 cm, 4,5 cm und 5,0 cm über dem Gewebe (n = 3 oder 4). Die Erhöhung des Schlittens vor dem Loslassen führte zu höheren Aufprallkräften, durchschnittlichen Spitzenspannungen, Belastungsraten und Aufprallenergien (Tabelle 1).
Wir versuchten, ein ex vivo Knorpelverletzungsmodell zu entwickeln, das 24 Stunden nach dem Aufprall subletal war. Die Cha...
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Diskussion
Das Ziel dieser Studie war es, ein Knorpelwirkungsmodell zu charakterisieren und zu optimieren, das die Lebensfähigkeit der Zellen für die Untersuchung molekularer Ereignisse nach einer Chondrozytenverletzung nicht beeinträchtigt, mit dem letztendlichen Ziel, eine Behandlung zu entwickeln, die die verletzten Zellen rettet, um das Fortschreiten der PTOA zu verhindern. Um dieses Ziel zu erreichen, wurde eine mechanische Belastung auf den Knochenanteil der osteochondralen Kerne abgegeben, d...
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Diese Studie wurde durch den NIH NIAMS Grant R21 AR080255 unterstützt. Die Autoren danken Kevin Carr dafür, dass er sein Know-how in der Bearbeitung und Fertigung in dieses Projekt eingebracht hat. Die Autoren danken dem Mooresville Butcher Shop (Mooresville, IN) für die Bereitstellung von Gewebe für diese Studie. Die Autoren danken den Mitarbeitern des Indiana Center for Biological Microscopy Core Facility für ihre Unterstützung bei der konfokalen Mikroskopie.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| #11 sterile Skalpellklinge | Thermo Fisher Scientific | 10-001-823 | Knorpel vom Knochen entfernen |
| #22 sterile Skalpellklinge | Thermo Fisher Scientific | 10-001-833 | Entfernen Sie die Haut vom Rindergewebe und öffnen Sie das Gelenk, indem Sie die Bänder durchtrennen |
| 10-1000 ul Pipettenspitzen | Thermo Fisher Scientific | 02-707-411 | Messen und übertragen PBS, Nährmedien und andere Lösungen |
| 200 proof Ethanol | Thermo Fisher Scientific | 03-007-647 | Wird zur Herstellung von 70% Ethanol als Sterilisationsmittel verwendet, um chirurgische Instrumente zu desinfizieren und eine sterile Umgebung während der Gewebevorbereitung und -verarbeitung aufrechtzuerhalten. |
| 50 mL Zentrifugenröhrchen (steril) | Thermo Fisher Scientific | 339652 | Zur Aufbewahrung von Medien und Proben |
| 5-Gallonen Ballonflasche | Thermo Fisher Scientific | 04-355-233 | Steriler PBS-Behälter, der über einen Schlauch mit dem schwenkbaren Adapter verbunden ist. |
| 6-Well-Platte (steril) | Thermo Fisher Scientific | 140685 | Zur vorübergehenden Lagerung von osteochondralen Kernen in einer sterilen Umgebung mit vorgewärmten Medien während der Entnahme, Inkubation vor Aufpralluntersuchungen und der Bildgebung |
| Beschleunigungsmesser | Kistler | 8743A5 | Zur Messung der Beschleunigung, die während eines Aufpralls entsteht |
| Apoptose-Färbekit (CellEvent) | Thermo Fisher Scientific | C10423 | Zur Erkennung und Visualisierung apoptotischer Zellen |
| Autoklavierbare Spritzflaschen | Nalgene | 2405-0500 | Füllen Sie mit sterilem PBS, um den Knorpel während der Gewebeentnahme mit Feuchtigkeit zu versorgen. |
| Autopsiesäge | Mopec | BD 810 | Entfernen Sie überschüssigen Knochen entweder nach dem Öffnen des Gelenks oder nach dem Ziehen des osteochondralen Kerns |
| Autopsie-Sägeblatt | Mopec | BD 101 | Wird zum Durchtrennen von Knochen verwendet, um osteochondrale Explantate zu isolieren und freizusetzen. |
| Betadine | Avrio Health L.P. | n/a | Wird zur Desinfektion des Äußeren von Rinderproben verwendet, bevor sie in die Haube verbracht und zur Desinfektion der osteochondralen Endproben verdünnt werden. |
| Klarer 4-Fuß-Schlauch | n/a | n/a | Wird verwendet, um die 5-Liter-Ballonflasche mit PBS an den Schwenkadapter der Bohrmaschine anzuschließen, um PBS zu transportieren. |
| Bohrer zum Bohren von Kernbohrern | UKAM Industrial Superhard Tools | 3EDCD7160 | Wird zum Extrahieren von osteochondralen Explantaten aus dem Knochen durch Bohren in den Gelenkknorpel und den subchondralen Knochen verwendet.- Durchmesser des Bohrers: 7/16" (galvanische Diamantkernbohrer) |
| Halbmondschlüssel | McMaster Carr | 5362A1 | Wird verwendet, um die Klemme (die die Verbindung an Ort und Stelle hält) festzuziehen und den Kernbohrer festzuziehen |
| Serologische Einwegpipetten | Thermo Fisher Scientific | 13-678-11 | Messen und Übertragen von PBS und Nährmedien |
| Einwegunterlage | Thermo Fisher Scientific | 23-666-062 | Wird verwendet, um den Arbeitsraum abzudecken, um Wasser und Flüssigkeiten während der Ernte für mehr Komfort und Hygiene |
| Einweg-Vakuumfiltereinheiten | Thermo Fisher Scientific | SCGP00525 | Filter PBS und andere Lösungen |
| Bohrmaschine | WEN | 433TV 3,25 Zoll | Kraftaufwand zum Bohren von osteochondralen Proben - WEN 433TV 3,25-Zoll-Tischbohrmaschine |
| Kippwinkel | WEN | TV434 | Fixiert osteochondrale Proben während des Kernbohrvorgangs in einer festen Position im gewünschten Winkel. |
| Fallturm | nach Maß n | /a | Wird verwendet, um die Proben zu beeinflussen |
| FIJI (ImageJ Extension) | n/a | n/a | Software für die Verarbeitung und Analyse von Mikroskopiebildern, einschließlich Zellviabilität und Apoptose-Quantifizierung |
| Pinzette | Fisherbrand | 12-000-163 | Wird zum Schneiden von Gewebe in der Haube, zum Öffnen des Gelenks und zum Übertragen der Proben |
| verwendet Gaze (steril) | Dukal | 6412 | Zur Hydratisierung des Gelenkknorpels nach dem Öffnen der Gelenkkapsel |
| Glas 1 Liter Medienflasche | Sigma Aldrich | CLS13951LHTC | Zur Aufbewahrung von sterilem PBS |
| Handschuhe | Thermo Fisher Scientific | 19-130-1597D | Zum Schutz des Entnahmeteams |
| Insulin-Transferrin-Selen (ITS) | Gibco | 41400-045 | Medienergänzung |
| LabVIEW Datenerfassungssoftware | National Instruments | n/a | Erfasst Daten von der Wägezelle und dem Beschleunigungsmesser während des Aufpralltests für die anschließende Analyse. |
| L-Ascorbinsäure | Merck | A4403 | Medienergänzung |
| Konfokales Laser-Rastermikroskop | Olympus FV1000D | Wird verwendet, um hochauflösende, dreidimensionale Bilder von gefärbten Gewebeproben aufzunehmen. | |
| Färbekit für lebende und tote Assays | Thermo Fisher Scientific | L3224 | Zur Unterscheidung zwischen lebenden und toten Zellen in Gewebeproben zur Beurteilung der Lebensfähigkeit der Zellen |
| Wägezelle | Kistler | 9712B5000 | Zur Messung der Kraft, die während eines Aufpralls ausgeübt wird. |
| MATLAB | Die MathWorks Inc. | n/a | |
| Fleischbandsäge | Skymsen | MSKLE | Entfernen von Karpalhufen aus Rinderproben |
| Mikropipette 10-100 uL | Thermo Fisher Scientific | FBE00100 | Messen und Übertragen PBS und Nährmedien |
| Minimales essentielles Medium (MEM) nicht-essentielle Aminosäurelösung | Gibco | 11140-050 | Medienergänzung |
| Modified Eagle' s Medium (DMEM) | Gibco | 10566-016 | Osteochondrale Explantatkultur. |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15-140-148 | Nahrungsergänzungsmittel |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung | Thermo Fischer Scientific | BP399-20 | Wird zum Spülen, Hydratisieren und Kühlen von Geweben verwendet, um physiologische Bedingungen aufrechtzuerhalten, Austrocknung zu verhindern und Färbelösungen herzustellen |
| Probenhalter auf Fallturm | Maß | n/a | Sichert den osteochondralen Kern während des Aufpralls. |
| Skalpell-Griff | Thermo Fisher Scientific | 16-100-107 | Wird zum präzisen Schneiden, Dissektionieren von Gewebe und Öffnen des Gelenks verwendet. |
| Schrauben (zum cad hinzufügen) | 6-32 Gewinde Größe-18-8 Innensechskantschrauben aus Edelstahl | ||
| Natriumpyruvat | Gibco | 11360-070 | Medienergänzung |
| Kugelförmiger Impaktorkopf | McMaster Carr | 9292K52 | Autoklav vor dem Aufprallverfahren |
| Chirurgische Masken | Filtermaske | 375101 | Zum Schutz des Sammelteams |
| Wasserdrehadapter | UKAM Industrial Superhard Tools | 7035812 | Verbindet sich mit dem Kernbohrer, um einen kontinuierlichen PBS-Fluss zur Kühlung während des Bohrvorgangs bereitzustellen. |
Referenzen
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