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Im lebenden Organismus Die Bildgebung deckt das Wanderverhalten der Leukozyten in den Gelenken auf

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DOI:

10.3791/68091

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9. Dezember 2025

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1Department of Frontier Medicine, Institute of Medical Science, St. Marianna University School of Medicine, 2Unit for Bioimaging, Institute of Medical Science, St. Marianna University School of Medicine, 3Department of Immunology and Parasitology, St. Marianna University School of Medicine, 4Nikon Solutions Co., Ltd

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die In-vivo-Bildgebung der Gelenke ist eine wertvolle Technik, um das Migrationsverhalten der Leukozyten und die molekulare Dynamik in den entzündeten Gelenken aufzudecken. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die in vivo Bildgebende der Gelenke mit einem Mausmodell der Typ-II-Kollagen-induzierten Arthritis (CIA) vor.

Zusammenfassung

Leukozyten sind blutübertragene Zellen, die aus dem Knochenmark stammen und in Gewebe wandern müssen, um Entzündungen zu vermitteln. Die Kontrolle dieser Migration stellt daher einen entscheidenden Punkt für die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien zur Abschwächung von Entzündungen dar. Traditionelle Endpunktstudien haben es uns nicht ermöglicht, das Migrationsverhalten von Leukozyten in vivo vollständig zu analysieren. Jüngste Fortschritte in der Bildgebungstechnologie haben jedoch beispiellose Einblicke in die Migration von Immunzellen bei lebenden Tieren geliefert und unser Verständnis der molekularen Regulation des Immunzelltransports erheblich verbessert.

Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll für die In-vivo-Bildgebung der Gelenke mittels eines Maus-Typ-II-Kollagen-induzierten Arthritis-Modells (CIA). Mäuse werden mit Typ-II-Kollagen in vollständigem Freund-Adjuvans emulgiert, und das Fortschreiten der Arthritis wird durch klinische Wertung und Pfotendickenmessungen überwacht. Auf dem Höhepunkt der Arthritis werden Leukozyten in vivo mittels konfokaler Mikroskopie in transgenen Mäusen mit fluoreszierenden Proteinen oder bei Wildtyp-Mäusen nach intravenöser Injektion fluoreszenzmarkierter Antikörper und hochmolekularer Dextran zur Gefäßfärbung visualisiert. Sorgfältige chirurgische Exposition des Gelenks, Anwendung von Agarose und korrekte Position des Beins ermöglichen eine stabile Langzeitbildgebung, die typischerweise mehrere Stunden dauert. Dieser Ansatz ermöglicht eine Echtzeitanalyse von Leukozytenstillstand, Krabbeln und transendothelialer Migration in entzündeten Gelenken.

Dieses Protokoll wird für Forschungsgruppen wertvoll sein, die den Leukozytentransport bei Arthritis und anderen entzündlichen Erkrankungen untersuchen. Es kann auch als Plattform für die präklinische Bewertung von Therapien dienen, die auf die Migration von Immunzellen abzielen.

Einleitung

Da Leukozyten blutübertragene Zellen sind, die aus dem Knochenmark stammen, müssen sie in Gewebe eindringen, um eine Entzündungzu verursachen. Die Kontrolle dieses Prozesses stellt einen Schlüsselpunkt dar, an dem neue Therapeutika entwickelt werden könnten, um Entzündungenabzuschwächen. Im Allgemeinen erfolgt der Leukozytentransport in entzündete Gewebe in postkapillaren Venulen und folgt der Adhäsionskaskade, beginnend mit dem Einfangen frei fließender Leukozyten durch die Gefäßwand. Darüber hinaus wird der Prozess von Leukozyten gefolgt, die entlang der Gefäßwand in Richtung des Flusses rollen, Leukozytenstopp am Endothel abnehmen, sich aus der Adhäsion lösen und in alle Richtungen auf der Gefäßoberfläche kriechen, um eine rezeptive Stelle für die transendotheliale Migration (TEM) an eine bestimmte Stelle im Gewebezu finden 1,3.

Diese unterschiedlichen Schritte werden durch eine Kombination molekularer Signale reguliert, darunter die Selectine (für Rollen), Integrine (für Arrest, Kriechen) und Chemoattractanten (CAs) (für Stopp, möglicherweise Crawling und TEM)3. CAs aktivieren Leukozyten über sieben transmembranüberspannende G-Protein-gekoppelte Chemoattractant-Rezeptoren (CARs) und spielen eine entscheidende Rolle in der Adhäsionskaskade, indem sie die Integrinaffinität hochregulieren (was zum Stillstand führt) und TEM induzieren. Die genauen Mechanismen von TEM sind jedoch nicht vollständig verstanden. Traditionelle Endpunktstudien und In-vitro-Experimente haben keinen Einblick darin geliefert, wie CA-CAR-Signalübertragung dynamisch das Migrationsverhalten von Leukozyten in vivo reguliert.

Jüngste Fortschritte in der Bildgebungstechnologie haben beispiellose Einblicke in die Migration von Immunzellen bei lebenden Tieren ermöglicht und unser Verständnis der molekularen Regulation des Immunzelltransports in vivo erheblich verbessert 4,5,6. So hat diese Technologie beispielsweise die molekulare Kontrolle des Neutrophilentransports zu Stellen von Gewebeentzündungen aufgeklärt, wie thermische Leberverletzung7 und Laser-Hautverletzung8. Daher haben wir die molekularen Mechanismen untersucht, die den Neutrophililtransport zu den Stellen der Gelenkentzündung9 steuern. Die hier beschriebene in-vivo-Gelenkbildgebung zeigte, dass die Komplementkomponente C5a-Rezeptor 1 (C5aR1) entscheidend ist, um die Neutrophilenadhäsion am Gelenkendothel einzuleiten und Entzündungen in den Gelenken auszulösen. C5aR1 erleichterte den integrinabhängigen Neutrofilstillstand und -spread, gefolgt von TEM, vermittelt vom Leukotrien-B4-Rezeptor, und von CC-Chemokinrezeptor 1 (CCR1) gesteuertem Krabbeln. Der CXC-Chemokinrezeptor 2 (CXCR2) spielte eine Rolle in den späteren Stadien des neutrophilen TEM in den entzündeten Gelenken10. Darüber hinaus zeigte die in vivo Gelenkbildgebung ein neues Paradigma bei Typ-III-Überempfindlichkeitsreaktionen im Gelenk, bei dem C5a als Auslöser der Entzündung wirkt, während geweberesidente Zellen eine bedeutendere Rolle bei der Entzündung im aktuellen Paradigma der Typ-III-Überempfindlichkeitsreaktionen spielen.

Zusätzlich haben wir eine in vivo Bildgebung des Gelenks angewendet, um die molekulare Dynamik von C5a im Gelenk zu untersuchen. C5a, das bei Wildtypmäusen auf das Gelenkgewebe geladen wurde, wurde schnell in das Gefäßlumen transportiert, während bei C5aR2-defizienten Mäusen C5a vollständig im Synovialgewebe12 verblieb. Diese Daten zeigen, dass C5aR2, exprimiert im Gelenkendothel, C5a in das Gefäßlumen transportiert – ein Prozess, der für die C5aR1-abhängige Neutrophilenadhäsion in den Gelenken13 notwendig ist.

Die In-vivo-Bildgebung der Gelenke ist auf alle Modelle entzündlicher Arthritis anwendbar und ermöglicht eine langfristige Beobachtung (meist ein paar Stunden), wobei die Visualisierung des Tiefengewebes (>1 mm) je nach verwendetem Mikroskop eingeschränkt sein kann. Zusammengenommen bietet diese Technik ein wirkungsvolles Werkzeug, um das Migrationsverhalten der Leukozyten und die molekulare Dynamik in den entzündeten Gelenken zu untersuchen. Wir teilen dieses Protokoll für die in vivo Gelenkbildgeben, um Forschungsgruppen zu unterstützen, die diesen Prozess in entzündeten Gelenken untersuchen.

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Protokoll

Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der St. Marianna University School of Medicine genehmigt (Genehmigungsnummer TG240926-2 und TG250801-2) und werden gemäß institutionellen und nationalen Richtlinien durchgeführt.

1. Vorbereitung eines Mausmodells der Arthritis

HINWEIS: Tiermodelle der Arthritis haben wertvolle Werkzeuge bereitgestellt, um die Pathogenese der Krankheit zu verstehen und neue Therapien zu entwickeln14. Während mehrere Mausmodelle der Arthritis einzigartige Vorteile und Einschränkungen haben, wurde die Typ-II-Kollagen-induzierte Arthritis (CIA) in Studien zur Pathogenese der rheumatoiden Arthritis (RA)14 weit verbreitet eingesetzt. In diesem Abschnitt beschreiben wir das Protokoll der CIA-Modelle der Arthritis (Vorräte und Instrumente sind in Abbildung 1 dargestellt).

  1. Bereiten Sie eine Verdünnung von Rinderkollagen Typ II in 0,05 M Essigsäure (Endkonzentration 4 mg/mL) vor, indem Sie über Nacht bei 4 °C schütteln.
  2. Um die Emulsion herzustellen, mischen Sie die Kollagenverdünnung (4 mg/ml in 0,05 M Essigsäure) mit vollständigem Freund-Adjuvant (CFA) im Verhältnis 1:1 in einer Glasspritze. Dies ergibt eine endgültige Kollagenkonzentration von 2 mg/mL in der Emulsion. Etwa 20 Minuten lang kräftig von Hand verrühren. Dieser Prozess erzeugt Wärme, sodass die Glasspritze mit der Emulsion auf Eis abgekühlt wird. Verwenden Sie einen Becher, um während der Vorbereitung die Konsistenz der Emulsion zu überprüfen.
    ANMERKUNG. Lagern Sie die verbleibende Kollagenverdünnung bei -80 °C. Dies kann für die zweite Impfung verwendet werden.
  3. Übertragen Sie die Emulsion auf eine 1-mL Glasspritze mit einer 26 x 1/2 G Nadel und lassen Sie sie bis zur Immunisierung auf Eis.
  4. Betäuben Sie 8 Wochen alte DBA1/J-Mäuse (männlich oder weiblich) mit intraperitonealen Injektionen von Medetomidin (0,3 mg/kg), Midazolam (4 mg/kg) und Vetorphale (5 mg/kg).
    ANMERKUNG. Transgene Mäuse haben oft einen C57BL6-Hintergrund. Hühnerkollagen wird typischerweise für CIA bei C57BL6-Mäusen verwendet; jedoch sind die Häufigkeit und Schwere von CIA bei C57BL6-Mäusen geringer als bei DBA/1J-Mäusen. Wenn transgene Mäuse mit C57BL6-Hintergrund verwendet werden, sollten Sie eine Pilotstudie durchführen, um die CIA-Inzidenz und -Schwere zu bewerten.
  5. Rasieren Sie die Haare um den Schwanz mit einer Haarschneider, um sich auf die Impfung vorzubereiten.
  6. Injizieren Sie langsam 100 μL Volumen der Emulsion (mit 200 μg Kollagen) in den subkutanen Raum entlang des Kaudaldorsums (nahe der Basis des Schwanzes) (Abbildung 2).
  7. Wiederholen Sie die Schritte 1.2 bis 1.6 am Tag 21 für die zweite Impfung (Abbildung 2).

2. Bewertung des klinischen Arthritis-Scores und Messung der Pfotendicke

HINWEIS: Die klinische Bewertung der Arthritis und die Messung der Pfotendicke sind für die Beurteilung der Krankheitsaktivität unerlässlich. Typischerweise werden klinische Wertungen bei Arthritis und Pfotendickenmessungen alle 1–3 Tage nach der ersten Impfung durchgeführt.

  1. Arthritis-Klinikpunkt: Erfassen Sie die Summe der Werte für alle vier Pfoten jeder Maus. Verwenden Sie folgendes Bewertungssystem:
    0 = Normal
    1 = Erythema und Schwellung einer Ziffer
    2 = Erythema und Schwellung von zwei Fingern oder Erythema und Schwellung des Sprunggelenks
    3 = Erythem und Schwellung von mehr als drei Fingern oder Schwellung von zwei Fingern und Sprunggelenken
    4 = Erythem und starke Schwellung von Knöchel, Fuß und Fingern mit Deformität.
    ANMERKUNG. Ein geschwollenes Sprunggelenk ist definiert als eine Pfotendicke von mehr als 4 mm.
  2. Messung der Pfotendicke: Messen Sie die Dicke jeder Pfote mit digitalen Schieberschiebern. Verwenden Sie die durchschnittliche Pfotendicke über alle vier Pfoten jeder Maus.

3. In-vivo-Bildgebung der Gelenke

HINWEIS: Die In-vivo-Bildgebung von Gelenken ermöglicht es uns, die Migration der Leukozyten in die Gelenke zu beobachten und ihr Verhalten im Gewebe lebender Mäuse zu analysieren. Zur Visualisierung von Zellen werden transgene Mäuse verwendet, die genetisch so manipuliert wurden, dass sie fluoreszierende Proteine in bestimmten Zellen exprimieren, sowie Mäuse, die intravenös mit Antizellmarker-Antikörpern injiziert werden. Die verwendeten Materialien sind in Abbildung 3 dargestellt.

  1. Betäuben arthritogene Mäuse intraperitoneal mit Medetomidin (0,3 mg/kg), Midazolam (4 mg/kg) und Vetorphale (5 mg/kg).
  2. Rasieren Sie das Mausbein mit dem Haarschneider und verwenden Sie Haarentfernungscreme (<60 S), um restliche Haare zu entfernen. Vermeiden Sie längere Anwendungen, um Hautreizungen zu vermeiden.
  3. Entfernen Sie die Creme mit feuchter Mullbinde (Abbildung 4A). Stellen Sie sicher, dass alle Haare entfernt werden, um unerwünschte Autofluoreszenz im Bildgebungsbereich zu vermeiden. Wiederholen Sie dies bei Bedarf wieder.
  4. Tragen Sie während der Anästhesie steriles Hornhautgleitmittel auf beide Augen auf, um Hornhautaustrocknung oder Geschwüre zu verhindern.
  5. Unter einem chirurgischen Mikroskop wird mit einer Mikroschere ein 1 cm langer Schnitt entlang der Haut gemacht (Abbildung 4B).
    ANMERKUNG. Dieser Schritt ist entscheidend. Eine Operation kann die Rekrutierung von Leukozyten (insbesondere Neutrophilen) auslösen. Vermeiden Sie jegliche Schäden, die Artefakte verursachen könnten. Durch Angiogenese in arthritischen Gelenken sind diese Gelenke anfällig für Blutungen. Für eine erfolgreiche Operation können mehrere Übungseinheiten erforderlich sein.
  6. Positioniere die arthritischen Gelenke auf der Kunststoffplatte (Abbildung 4C).
    ANMERKUNG. Gewebekleber kann verwendet werden, um das Bein der Maus zu fixieren. In dieser Studie wird Ton verwendet, um einen Glasträger an einer Plastikplatte zu befestigen.
  7. Decken Sie den Bildgebungsbereich mit etwa 1 ml 1,5 % Agarose mit phosphatgepuffertem Kochsalzlösungslösungsmittel (PBS) ab (Abbildung 4D).
    ANMERKUNG. Stellen Sie sicher, dass die Agarose abgekühlt ist, um Gewebeschäden zu verhindern, die die Leukozytenrekrutierung im bildgebenden Bereich fördern können.
  8. Setzen Sie die Bühne auf das Mikroskop.
    ANMERKUNG. Verwenden Sie ein Heizkissen, um die Körpertemperatur der Maus während längerer Bildgebungssitzungen aufrechtzuerhalten.
  9. Passen Sie die Konfokalmikroskop-Einstellungen an (Laserleistung, Verstärkung, Offset, Position usw.). Hier werden die Bildgebung mit einem Konfokalmikroskop mit einem 25-Wasserimmersionsobjektiv, NA 1.1, durchgeführt. Stellen Sie die Laseranregung auf 488 nm, 561 nm und 640 nm ein und sammeln Sie die Emission bei 488,0 nm, 561,6 nm und 638,5 nm.
    1. Überprüfe die Abtastrate des Mikroskops. Verwenden Sie eine Pixelauflösung von 512 x 512, mit 5 optischen Schnitten, einem Z-Stack von 4 μm und einer Zykluszeit von 15 s, um eine Analyse einzelner beweglicher Zellen über genügend Zeit zu ermöglichen, um aussagekräftige Daten zu erhalten.
  10. Sobald ein geeigneter Ort gefunden ist, beginnen Sie mit der Bildaufnahme.
    ANMERKUNG. Wenn Antizellmarker-Antikörper zur Markierung der Leukozyten verwendet werden, sollten die Antikörper 3 Minuten vor Beginn der Bildaufnahme intravenös injiziert werden. Zur Visualisierung der Blutgefäße injizieren Sie gleichzeitig Qdots, CD31-Antikörper oder Dextran. Zum Beispiel werden etwa 2 μg Antikörper pro Maus Ly6G für Neutrophile und CD4 für T-Zellen injiziert, zusammen mit etwa 80 μg 680–250k Dextran pro Maus zur Blutgefäßfärbung. Antikörper und Dextran werden üblicherweise in 100 μL sterilem PBS gelöst. Seien Sie sich bewusst, dass einige Antikörper Leukozyten abbauen können, daher sollten Sie sicherstellen, dass die ausgewählten Antikörper die Leukozytenzahl nicht senken.
  11. Verarbeiten Sie die ND2-Dateibilder, die mit dem konfokalen Mikroskop aufgenommen wurden, mit dem General Analysis 3 (GA3)-Modul der NIS-Elements Bildanalysesoftware (Version 6.20.00). Führen Sie die Extraktion von Gefäßregionen und Hintergrundsubtraktion durch. Nach der Verarbeitung aller Zeitframes exportieren Sie die Bilder als Video.
    ANMERKUNG. Im Rahmen der Analyse zählen Sie die Anzahl der klebten und extravasierten Zellen.
  12. Nach Abschluss der Bildgebung sollte das Tier entweder als Überlebensmaßnahme genesen oder es je nach experimenteller Experimentalplan humanisiert werden. Wenn Überleben beabsichtigt ist, schließen Sie die Operationsstelle vorsichtig und bieten Sie eine angemessene postoperative Versorgung gemäß den institutionellen Tierpflegerichtlinien durch.
    HINWEIS: In dieser Studie wurden alle Tiere unmittelbar nach der Bildgebung human eingeschläfert, entsprechend institutionellen und nationalen Richtlinien.

4. Statistische Analyse

  1. Präsentieren Sie die Daten als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM). Führen Sie statistische Analysen mit dem Student's t-Test für Zweigruppenvergleiche oder Einweg-ANOVA für mehrere Gruppen durch, gefolgt vom Tukey-Post-hoc-Test. Betrachten Sie einen p-Wert < 0,05 als statistisch signifikant.
    HINWEIS: Alle Analysen wurden mit GraphPad Prism Version 10 durchgeführt.

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Ergebnisse

Hier werden 8 Wochen alte männliche DBA/1J-Mäuse mit einer Emulsion geimpft, die Rinderkollagen Typ II und CFA im Verhältnis 1:1 am Tag 0 und Tag 21 enthält. Klinische Wertung bei Arthritis und Pfotendickenmessungen werden alle 1 bis 3 Tage zwischen Tag 0 und 42 durchgeführt. Typischerweise wird der Beginn der Arthritis etwa am 28. Tag beobachtet, wobei der klinische Arthritis-Wert und die Pfotendicke um Tag 35 ihren Höhepunkt erreichen (Abbildung 5A-C

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Diskussion

Die In-vivo-Bildgebung der Gelenke bietet im Gegensatz zu traditionellen Endpunktstudien beispiellose Einblicke in dynamische biologische Prozesse bei lebenden Mäusen. So ermöglicht uns diese Technik beispielsweise zu verstehen, wie vier verschiedene Chemoattractionsrezeptoren – C5aR1, BLT1, CCR1 und CXCR2 – zusammenarbeiten, um die Neutrophilil-Rekrutierung in entzündeten Gelenken bei Arthritis10,11 einzuleiten. Darüber...

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Offenlegungen

Y.M. erhielt Förder- und Forschungsunterstützung von Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.

Danksagungen

Die Arbeit des Y.M. wird von der Japanischen Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaft (JSPS) KAKENHI [Fördernummer JP22K08531, JP25K02574]; Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) [Fördernummer 25bm1423033]; Die Mochida Memorial Foundation für medizinische und pharmazeutische Forschung; Das JCR-Stipendium zur Förderung der Forschung für FRONTIER und die Mitsubishi Foundation.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
29 G x 1/2"TerumoSS-10M2913
0,1 M EssigsäureFujifilm016-18835
1 ml KunststoffspritzeNach oben19531
1 mm Spritze für FettTerumoSS-01T
18 G x 1 1/2"TerumoNN-1838R
26 G x 1/2"TerumoNN-2613S
680-250 kDa DextranBiotium80135
AgaroseInvitrogen16520-100
Rinderkollagen Typ-II-KollagenKollagenforschungszentrumK42
TonDebika93186
Vollkommener Freund' s Adjuvant (CFA)Chondrex7001
KonfokalmikroskopNikonA1
DeckglasMatsunami Glass IND., LtdC024401
Digitaler SchlittensättelMitsutoyo500-180-30
Falcon-Röhre (15 mL)CorningNA
Falcon-Röhre (50 mL)CorningNA
FITC-konjugierter Antimaus-Ly6G-AntikörperBiolegende127606
PinzetteRobozRS-5070
PinzetteNAPOXMA-48-2
Glasspritze und SteckverbinderTsubasa Industry Co., Ltd S7P
GreaseToray Dow Corning SilikonNA
HaarschneiderWahlWA5109
HaarschneiderWahl9966
Haarentfernung Crè IchKracieN/A
MedetomidinMeijiN/A
Mikro-SchereRobozRS-5610
Mikro-SchereRobozRS-5630
MidazolamSandozN/A
Feuchter GazeNippon Paper Crecia Co., LtdS-200
NIS-Elements-Bildanalyse 6.20.00NikonNA
PBS in Falcon-Röhre (50 mL)Shimadzu Diagnostics Corporation5913
PE-konjugierter Antimaus-CD4-AntikörperBiolegende100408
KunststoffplatteCorning351029
Prism 10.3.1GraphPadNA
RutschglasMuto Pure Chemicals Co., Ltd5115
Chirurgischer SpiegelOlympusVMZ
Gewebebindung3M1469SB
Vetorphale MeijiN/A

Referenzen

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Schlagwörter

LeukozytenmigrationGelenkentz ndungKonfokalmikroskopieKollageninduzierte ArthritisImmunzelltraffickingNeutrophilenmigrationtransendotheliale MigrationArthritis MausmodellLeukozyten Trafficking

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