Method Article

Standardisierte modulare Assemblierung von polycistronischen Operons mit modularem Klonieren (MoClo) unter Verwendung des In-Cloning-Toolkits

DOI:

10.3791/68103

⸱

September 2nd, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Systems and Synthetic Biology (SSB), Wageningen University and Research, Agrotechnology and Food Sciences, 2Max Planck Institute for Terrestrial Microbiology, 3Center for Molecular Biology of Heidelberg University (ZMBH), 4Center for Synthetic Microbiology, Philipps-University Marburg

In This Article

Summary

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In diesem Artikel wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll vorgestellt, das zeigt, wie Modular Cloning (MoClo) für die Klonierung von polycistronischen Operonen angepasst werden kann.

Abstract

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Modular Cloning (MoClo) Toolkits ermöglichen die schnelle Assemblierung von Multigen-Konstrukten. Sie basieren auf der Golden-Gate-Klonierung, bei der Typ-IIS-Restriktionsenzyme verwendet werden, die außerhalb ihrer Erkennungsstelle schneiden. Da Erkennung und Schnittsequenz entkoppelt sind, können Überhänge, die durch Typ-IIS-Restriktionsenzyme erzeugt werden, bewusst gewählt werden, und Klonierungsstrategien verhindern in der Regel das Schneiden von korrekt verbundenen DNA-Fragmenten. Dies ermöglicht eine hocheffiziente Assemblierung mehrerer DNA-Fragmente in einer einzigen Reaktion. In MoClo werden einzelnen funktionellen DNA-Teilen wie Promotoren, ribosomalen Bindungsstellen, kodierenden Sequenzen und Terminatoren sowie Anordnungen höherer Ordnung standardisierte Überhänge zugewiesen, so dass wiederverwendbare Bauteilbibliotheken erstellt werden können. Die meisten bakteriellen MoClo-Toolkits sind für die Klonierung monocistronischer Transkriptionseinheiten konzipiert und bieten keinen strukturierten Pfad für die Assemblierung polycistronischer Operons. Dieses Protokoll demonstriert die Assemblierung von polycistronischen Transkriptionseinheiten mit dem In- & Out-Cloning Toolkit. Der gleiche Ansatz ist auf andere MoClo-Toolkits übertragbar.

Introduction

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Die molekulare Klonierung, das Einbringen von rekombinanter DNA in ein Replikon wie ein Plasmid, ist eine grundlegende Methode der Molekularbiologie. Die Konstruktions- und Montagemethoden der DNA sind in den letzten Jahrzehnten immer ausgefeilter geworden. Inzwischen können Forscher ganze synthetische Chromosomen und sogar Genome aus synthetisierter DNAaufbauen 1. Die traditionelle molekulare Klonierung beruht oft auf Ad-hoc-Klonierungsstrategien und kann für große Multi-Gen-Konstrukte mühsam und teuer sein2. In den letzten Jahren haben sich die Golden Gate (GG)-Klonierung und die Toolkits für abgeleitete hierarchische modulare Klonierung (MoClo) 2,3 zu beliebten Lösungen entwickelt, um eine zeit- und kosteneffiziente DNA-Assemblierung zu ermöglichen.

Typ-IIS-Restriktionsenzyme sind Endonukleasen, die eine gerichtete (nicht-palindromische) Sequenz erkennen und außerhalb dieser Erkennungssequenz spalten4. Infolgedessen sind Überhangsequenzen, die durch Spaltung entstehen, nicht von der Erkennungsstelle abhängig, sondern können gewählt werden4. Weiterhin können funktionelle DNA-Fragmente, hier als "Teile" bezeichnet, so gestaltet sein, dass durch die Spaltung die Erkennungsstelle an den Enden der zu verbindenden Teile2 entfernt wird. GG-Klonierungsstrategien nutzen dies, um effiziente mehrteilige DNA-Assemblierungen in Eintopfreaktionen zu ermöglichen5. MoClo-Toolkits basieren auf der GG-Klonierung und zielen darauf ab, einen modularen und hierarchischen Weg für die Assemblierung von Multi-Gen-Konstrukten bereitzustellen. Überhänge, die für die Montage von Teilen verwendet werden, sind standardisiert, was die Erstellung wiederverwendbarer und austauschbarer Teilebibliotheken ermöglicht. MoClo-Toolkits basieren auf Akzeptorplasmiden, die so konstruiert sind, dass sie mehrere DNA-Sequenzen aufnehmen und das zusammengesetzte Produkt freisetzen. Jedes Akzeptorplasmid enthält zwei Erkennungsstellen von zwei verschiedenen Typ-IIS-Enzymen, von denen eines zur Aufnahme von DNA-Fracht und das andere zur Freisetzung von zusammengesetzter DNA verwendet wird 3,6. Eine Veranschaulichung dieses Prinzips ist in Abbildung 1 für die Klonierung eines einzelnen Teils, eines Terminators, in ein MoClo-Akzeptorplasmid (Stufe 0) dargestellt. Sowohl das Akzeptorplasmid als auch das Insert werden durch das Restriktionsenzym BbsI so geschnitten, dass kompatible Überhänge übrig bleiben und die BbsI-Erkennungsstellen entfernt werden. Korrekt ligierte Plasmide werden daher nicht mehr mit BbsI geschnitten. Durch das Schneiden des resultierenden Plasmids mit dem Typ-IIS-Enzym SapI wird das zuvor eingefügte Fragment im nächsten Assemblierungsschritt (Level 1) freigesetzt.

In diesem Protokoll wird die MoClo-Toolbox In- und Out-Cloning verwendet7. Hier enthalten Level 0 Plasmide definierte fundamentale genetische Teile wie Promotoren mit 5' untranslatierten Regionen (UTRs), kodierende Sequenzen und Terminatoren mit 3'UTRs, Abbildung 1 zeigt einen schematischen Überblick von Level 0. Auf Level 1 werden mehrere Teile zu einer Transkriptionseinheit (TU) zusammengefügt, Abbildung 2 zeigt einen schematischen Überblick über Level-1-Teile und das Klonen. In- und Out-Cloning MoClo wurde für die narbenfreie Assemblierung von Transkriptionseinheiten in Level 1 entwickelt, indem ein Typ-IIS-Enzym verwendet wird, das 3-Nukleotid-Überhänge erzeugt. Auf diese Weise können Überhänge vollständig innerhalb des Codon-Rasters der Codierungssequenz liegen, wobei die ATG-Start- und die TGA-Stopp-Codons für die Assemblierung verwendet werden. Die Stufen M und P werden für die Assemblierung mehrerer Transkriptionseinheiten verwendet, die von Plasmiden der Stufe 1freigesetzt werden 3,8. Abbildung 3 zeigt einen schematischen Überblick über die Teile für die Klonierung in Level M und P sowie den Zusammenbau eines bicistronischen Operons in Level M (ein bicistronisches Operon ist eine transkriptionelle Einheit, die mehrere kodierende Sequenzen (CDSs) exprimiert)). Die Stufen P und M sind so konzipiert, dass sie einen iterativen Zyklus von einem zum anderen ermöglichen, so dass es keine theoretische Begrenzung für die Anzahl der Teile gibt, die zusammengebaut werden können, dies wird jedoch in diesem Protokoll nicht beschrieben, da das Hauptaugenmerk dieses Protokolls darauf liegt, den Zusammenbau eines biztronischen Operons zu zeigen. Obwohl es keine Begrenzung für die Anzahl der Teile gibt, die zusammengebaut werden können, gibt es eine Begrenzung für die Größe eines Konstrukts, das zusammengebaut werden kann. Bis zu 100.000 bp wurden mit einem MoClo-Kit9 bestückt. Darüber hinaus können große Konstrukte oder Konstrukte, die toxische Gene enthalten, eine Belastung für die Zelle darstellen; Für diese Fälle wurden geänderte Protokolle veröffentlicht10.

In- und Out-Cloning beschrieb zunächst kein Schema für den Zusammenbau von polycistronischen Transkriptionseinheiten. Polycistronische Operone sind ein sehr häufiger Genorganisationsmodus in Bakterien 11,12,13, und daher besteht ein bemerkenswertes Interesse an ihrer modularen Bottom-up-Assemblierung14. In dieser Arbeit wird ein strukturiertes Schema für die Assemblierung polycistronischer Operons mittels In- und Out-Klonierung beschrieben. Das vorgestellte Schema ermöglicht einen einfachen Austausch der Position von kodierenden Sequenzen innerhalb polyzisstrischer Transkriptionseinheiten sowie von Anordnungen, die sowohl aus mono- als auch polycistronischer Transkription bestehen.

Das folgende Schritt-für-Schritt-Protokoll zeigt das Design und die Klonierung eines polycistronischen Operons mittels In- und Out-Klonierung. Die vorgestellte Strategie zur Klonierung polycistronischer Transkriptionseinheiten kann leicht an andere MoClo-Toolkits angepasst werden.

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Protocol

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HINWEIS: Dieses Protokoll beschreibt das Design und die Assemblierung eines polycistronischen Operons über drei Stufen des In-Cloning-Standards (0, 1 und M). Das hier aufgebaute polycistronische Operon beginnt mit einem Promotor, gefolgt von einer ribosomalen Bindungsstelle (RBS), einer kodierenden Sequenz (CDS), einem zweiten RBS, einem zweiten CDS und schließlich einem Terminator (Abbildung S1). Es wird dringend empfohlen, molekulare Klonierungssoftware zu verwenden, um die Klonierung in silico zu simulieren, um sicherzustellen, dass die entworfene Klonierungsstrategie korrekt ist. Ein Beispiel für das Assemblieren eines Promotors als Level-0-Teil, das Assemblieren eines RBS mit einer Codierungssequenz und einem Terminator zu einer Level-1-Transkriptionseinheit und das Assemblieren eines bicistronischen Operons in Level M wird hier beschrieben, und eine schematische Übersicht der gesamten Assemblierung ist in Figur S1 dargestellt.

1. Stufe 0: Domestizierung von Teilen

HINWEIS: Der Begriff "Domestizierung" wird verwendet, um anzuzeigen, dass ein molekulares Bauteil in eine MoClo-Bauteilbibliothek integriert wurde und in allen Ebenen des MoClo-Kits zusammengesetzt werden kann. Typischerweise werden alle Erkennungsstellen von Typ-IIS-Restriktionsenzymen, die innerhalb des Kits verwendet werden, aus dem zu domestizierenden Teil entfernt, z. B. durch synonyme Rekodierung.

  1. Gestaltung des Einsatzes
    1. Wählen Sie die molekularen Teile aus, z. B. Promotor, CDS und Terminator, die im Operon zusammengesetzt werden sollen.
      HINWEIS: In diesem Protokoll beginnt das Operon mit dem PromotorP LuxB, der durch das Protein LuxR in Gegenwart der Induktorverbindung N-(β-Ketocaproyl)-L-homoserinlacton (OC6)17 aktiviert werden kann. GFP ist das erste CDS des Operons; sein RBS ist iGEM BBa_B0064. Auf GFP folgt ein nicht-terminaler Linker, die "Terminator-Brücke". Das zweite CDS ist mTurquoise. Sein RBS wurde mit einem RBS-Rechner18 entworfen. Schließlich endet das Operon mit dem Terminator L3S2P2119.
    2. Wählen Sie die Position, in der das Teil montiert werden soll, eine Übersicht ist in Abbildung 1 dargestellt. Wählen Sie basierend auf der Position das Akzeptorplasmid aus, das in der GG verwendet werden soll.
      HINWEIS: Die Teile können für den späteren Gebrauch in verschiedenen Positionen domestiziert werden. Zum Beispiel kann ein Promotor später als einzelnes Teil montiert werden, indem er mit einem 5'UTR-Teil (pSL252) verbunden wird, oder er kann mit einem bereits enthaltenen 5'UTR domestiziert werden (pSL099). Ein CDS kann in vier Akzeptorplasmiden aufgebaut sein, die ohne Tag (pSL102), mit einem N-Terminal-Tag (pSL104), mit einem C-Terminal-Tag (pSL101) oder sowohl mit einem N-Terminal-Tag als auch mit einem C-Terminal-Tag (pSL103) bestückt werden können. In dem gegebenen Beispiel wird der Promotor in pSL252 domestiziert, das erste RBS wird in pSL253 domestiziert, das erste CDS wird in pSL102 domestiziert, die Terminatorbrücke wird in pSL106 domestiziert, das zweite RBS wird in pSL099 domestiziert, das zweite CDS wird in pSL102 domestiziert und der Terminator wird in pSL106 domestiziert.
    3. Fügen Sie dem entworfenen Einsatz Erweiterungen hinzu, die auf dem gewählten Akzeptorplasmid basieren. Tabelle 1 gibt einen Überblick über die für die GG-Assemblierung erforderliche Erweiterung pro Akzeptorplasmid. Diese Erweiterungen sollten während des Designs der Primer für die PCR, des Designs der Oligos im Falle des Annealings von zwei Oligos zur Konstruktion eines Teils oder während der Gensynthese hinzugefügt werden.
      HINWEIS: Damit ein Teil domestiziert werden kann, muss sichergestellt werden, dass das Teil selbst keine Erkennungsstellen der im Kit verwendeten Typ-IIS-Enzyme SapI (5'-GCTCTTC-3'), BbsI (5'-GAAGAC-3') und BsaI (5'-GGTCTC-3') enthält. Das Vorhandensein von Erkennungsstellen in Teilen reduziert die Effizienz der korrekten Montage drastisch, da das Endprodukt mit dem verwendeten Typ-IIS-Enzym geschnitten werden kann (siehe Abbildung 1).
  2. GG-Reaktion
    1. Für die GG-Reaktion fügen Sie 50 fmol des gewünschten Inserts, 50 fmol des Akzeptorplasmids, 1 μl 10x T4-DNA-Ligase-Puffer, 1 μl T4-Ligase und 1 μl BbsI hinzu. Fügen Sie nukleasefreies Wasser zu einem Gesamtvolumen von 10 μl hinzu und fügen Sie zusätzlich eine Negativkontrolle mit der gleichen Reaktion ohne den gewünschten Einsatz hinzu.
    2. Führen Sie das folgende Programm in einem Thermocycler durch: 25 Zyklen mit 37 °C für 3 min (37 °C ist die optimale Temperatur des Restriktionsenzyms) und 16 °C für 4 min (16 °C ist die optimale Temperatur der T4-Ligase), gefolgt von einem abschließenden Aufschluss bei 50 °C für 20 min (bei 50 °C zeigt die T4-Ligase sehr geringe bis gar keine Aktivität, während das Restriktionsenzym noch in der Lage ist, zu funktionieren, wodurch die Menge an ungeschnittenem Akzeptorplasmid im Endprodukt begrenzt wird) und eine Hitzeinaktivierung der Enzyme bei 80 °C für 20 min (bei 80 °C werden alle Enzyme hitzeinaktiviert und die Reaktion wird beendet)6.
    3. Transformieren Sie die GG-Reaktion durch Zugabe von 5 μl der GG-Reaktion in 50 μl chemisch kompetenter E. coli-Zellen und führen Sie eine Hitzeschocktransformation mit einem Erholungsschritt durch, wie in einem zuvor veröffentlichten Protokollbeschrieben 15.
    4. 100 μl des Transformationsauswuchses werden auf eine Luria-Bertani (LB)-Agarplatte mit 100 μg/ml Spectinomycin verteilt. Die Platte über Nacht bei 37 °C inkubieren.
    5. Vergleichen Sie die Transformationseffizienz der Negativkontrolle mit der der gesamten Baugruppe, indem Sie die Anzahl der weißen Kolonien auf beiden Platten zählen. Fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort, wenn die Assemblierung etwa 10-mal (oder mehr) weiße Kolonien als die Negativkontrolle aufweist.
      HINWEIS: Die Mehrheit der resultierenden Kolonien sollte weiß sein, mit nur einem kleinen Bruchteil der roten Kolonien. Akzeptorplasmide im In-Klonierungs-Toolkit verfügen über eine Dual-Selektionskassette, die entweder mCherry (Level 0 und Level 1) oder LacZα (Level M und Level P) enthält, sowie ein ccdB-Gen, das für einen Gyraseinhibitor kodiert. Die Transformation der GG-Reaktion wird in ccdB-empfindlichen E. coli-Zellen durchgeführt, so dass nur Zellen wachsen können, die das assemblierte Plasmid haben, während das ursprüngliche Akzeptorplasmid nicht vermehrt werden kann. Beispiele für ccdB-empfindliche Stämme sind DH5α und TOP10. Das mCherry/LacZα ermöglicht die visuelle Identifizierung von Zellen, die dem ccdB-Mechanismus entkommen16.
    6. Für jede Assemblierung kultivieren Sie zwei weiße Kolonien, indem Sie mit einer Pipettenspitze etwas Material der Kolonie aufnehmen und in 5 mL LB-Medium mit je 100 μg/ml Spectinomycin resuspendieren und über Nacht bei 37 °C in einem Schüttelinkubator bei 250 U/min inkubieren. Führen Sie eine säulenbasierte Plasmidextraktion gemäß den Anweisungen des Herstellers durch. Stellen Sie sicher, dass das extrahierte Plasmid die erwartete Sequenz aufweist, indem Sie die Sanger-Sequenz verwenden.

2. Stufe 1: Festlegung der Positionen

HINWEIS: Stufe 1 ist die Ebene zwischen dem Domestizieren von Teilen und dem Zusammenbau eines polycistronischen Operons (Abbildung 2). Hier werden die Positionen von Zwischenbaugruppen im finalen Konstrukt bestimmt. Die Position einer Level-1-Anordnung innerhalb des Operons kann durch die Verwendung eines anderen Level-1-Akzeptorplasmids geändert werden. Das gegebene Beispiel beschreibt den Zusammenbau einer bicistronischen Einheit, aber das gegebene Schema kann leicht für den Zusammenbau von bis zu sechs Codiersequenzen (mit jeweils einem RBS) angepasst werden. Das Assemblieren mehrerer Codiersequenzen erfordert zusätzlich einen Wechsel zwischen Level P und M. Beim iterativen Zyklus zwischen Level P und M gibt es keine feste Obergrenze für die Anzahl der Codierungssequenzen, die zu einem einzigen Operon zusammengesetzt werden können.

  1. Auswahl der Teile und Akzeptorplasmide
    1. Wählen Sie die Teile der Ebene 0 aus, die zu einer Transkriptionseinheit zusammengesetzt werden sollen. Diese müssen mindestens einen Promotor, einen CDS und einen Terminator enthalten.
    2. Wählen Sie die Position, an der die Transkriptionseinheit im Operon montiert werden soll. Wählen Sie auf der Grundlage dieser Position das geeignete Akzeptorplasmid aus. Eine Übersicht ist in Abbildung 2 dargestellt.
      HINWEIS: Die als Beispiel gezeigten 7 DNA-Fragmente für den Aufbau des bicistronischen Operons werden zu zwei Level 1 Konstrukten zusammengesetzt. Der Promotor, das erste RBS, das erste CDS und die Terminatorbrücke werden in pSL68 eingebaut; Das zweite RBS, das zweite CDS und das Abschlusszeichen werden in pSL69 eingebaut.
  2. GG-Reaktion
    1. Für die GG-Reaktion fügen Sie 50 fmol von jedem der gewünschten Inserts, 50 fmol des Akzeptorplasmids, 1 μl 10x T4-DNA-Ligase-Puffer, 1 μl T4-Ligase und 1 μl SapI hinzu. Fügen Sie nukleasefreies Wasser zu einem Gesamtvolumen von 10 μl hinzu.
    2. Führen Sie das folgende Programm in einem Thermocycler durch: 25 Zyklen mit 37 °C für 3 min und 16 °C für 4 min, gefolgt von einem abschließenden Aufschluss bei 50 °C für 20 min und einer Hitzeinaktivierung der Enzyme bei 80 °C für 20 min6.
    3. Optional: 0,5 μl SapI zur GG-Reaktion geben und 1 h bei 37 °C inkubieren.
      HINWEIS: SapI ist nicht so stabil wie die anderen verwendeten Typ-IIS-Restriktionsenzyme. Es wurde festgestellt, dass ein Verdauungsschritt mit SapI nach der GG-Reaktion die Anzahl der Kolonien reduziert, die das religierte Akzeptorplasmid tragen. SapI hat ein Isoschizomer, BspQI, das diesen letzten Verdauungsschritt möglicherweise nicht benötigt.
    4. 5 μl der GG-Reaktion werden in 50 μl chemisch kompetenter E. coli-Zellen umgewandelt und eine Hitzeschockumwandlung durchgeführt, vorzugsweise mit einem Wiederherstellungsschritt, wie in Schritt 1.2.3 durchgeführt.
    5. Platte 100 μL des Transformationsauswuchses auf einer LB-Agarplatte mit 100 μg/mL Ampicillin. Die Platte über Nacht bei 37 °C inkubieren.
    6. Kultivieren Sie jeweils zwei weiße Kolonien, indem Sie mit einer Pipettenspitze etwas Material der Kolonie aufnehmen und es in 5 ml LB-Medium mit jeweils 100 μg/ml Ampicillin resuspendieren. Über Nacht bei 37 °C in einem Schüttelinkubator bei 250 U/min inkubieren. Führen Sie eine säulenbasierte Plasmidextraktion gemäß den Anweisungen des Herstellers durch.
    7. Bestätigen Sie den korrekten Zusammenbau durch einen Restriktionsdigest mit BbsI, und überprüfen Sie, ob die Größe des Ausschnitts mit der erwarteten Größe des Einsatzes übereinstimmt. 1000 ng Plasmid-DNA werden durch Zugabe von 1 μl des entsprechenden 10-fachen Aufschlusspuffers und 1 μl BbsI verdaut. Nukleasefreies Wasser auf ein Gesamtvolumen von 10 μl zugeben. Die Reaktion bei 37 °C für 15 min inkubieren.
    8. Führen Sie eine Gelelektrophorese durch, indem Sie das verdaute Plasmid auf ein 1%iges Agarosegel laden und das Gel 35 Minuten lang bei 100 V laufen lassen.
      HINWEIS: Ein In-silico-Aufschluss des erwarteten Plasmids kann durchgeführt werden, um ein Agarosegel zu simulieren und das Ergebnis vorherzusagen.

3. Stufe M: Aufbau eines polycistronischen Operons

HINWEIS: In diesem Schritt wird das polycistronische Operon zusammengebaut. Im vorliegenden Fall eines bicistronischen Operons werden zwei Level 1 Inserts in den Positionen 1 und 2 montiert. Dementsprechend wird das Akzeptorplasmid pMA60 gewählt. Des Weiteren ist ein Endlinker erforderlich. Alle Akzeptorplasmide der Stufen M und P haben als zweiten Überhang den Überhang GGGA. Endlinker bilden eine Brücke zwischen dem Insert- und dem Akzeptorplasmid und ermöglichen die Assemblierung eines Level-P-Konstrukts in das Level-M-Konstrukt und umgekehrt. Für eine Level-P-Bestückung von zwei Level-1-Einsätzen wird der Endlinker pMA668 verwendet, der die dritte und letzte Position einnimmt. Eine Übersicht über die Ebenen M und P sowie eine Visualisierung des Klonierungsschritts sind in Abbildung 3 dargestellt. Da die Assemblierung ausschließlich auf Level M (oder P) erfolgt, können Operons von bis zu 6 Codiersequenzen kloniert werden (Positionen 1-6). Position 7 wird vom Endlinker eingenommen. Das Assemblieren einer höheren Anzahl von Codierungssequenzen in einem Operon ist möglich, erfordert jedoch einen Wechsel zu Level M (oder P), der in diesem Protokoll nicht beschrieben wird.

  1. Für die GG-Reaktion fügen Sie 50 fmol von jedem gewünschten Insert, 50 fmol des Akzeptorplasmids, 1 μl 10x T4-DNA-Ligase-Puffer, 1 μl T4-Ligase und 1 μl BbsI hinzu. Fügen Sie nukleasefreies Wasser zu einem Gesamtvolumen von 10 μl hinzu.
  2. Führen Sie das folgende Programm in einem Thermocycler durch: 50 Zyklen mit 37 °C für 3 min und 16 °C für 4 min, gefolgt von einem abschließenden Aufschluss bei 50 °C für 20 min und einer Hitzeinaktivierung der Enzyme bei 80 °C für 20 min6.
  3. 5 μl der GG-Reaktion werden in 50 μl chemisch kompetenter E. coli-Zellen transformiert und eine Hitzeschockumwandlung mit einem Rückgewinnungsschritt durchgeführt, wie in Schritt 1.2.3 durchgeführt.
  4. 100 μL des Transformationsauswuchses werden auf einer LB-Agarplatte mit 100 μg/ml Spectinomycin verteilt. Die Platte wird über Nacht bei 37 °C oder bei 30 °C inkubiert, wenn eine metabolische Belastung oder Toxizität der Anordnung zu erwarten ist.
  5. Erstellen Sie für jede Assembly eine Kultur aus zwei weißen Kolonien. Tauchen Sie dazu eine Pipettenspitze in die Kolonie und beimpfen Sie damit 5 mL LB mit 100 μg/ml Spectinomycin. Über Nacht bei 37 °C oder 30 °C in einem Schüttelinkubator bei 250 U/min inkubieren. Führen Sie eine säulenbasierte Plasmidextraktion gemäß den Anweisungen des Herstellers durch.
  6. Bestätigen Sie den korrekten Zusammenbau durch einen Restriktionsdigest mit BsaI und überprüfen Sie, ob die Größe des Ausschnitts mit der erwarteten Größe des Einsatzes übereinstimmt, wie in Schritt 2.2.7 ausgeführt.
    HINWEIS: Das Konstrukt kann zu lang sein, um zur Bestätigung durch die Sanger-Sequenzierung abgedeckt zu werden. Sie kann dann durch eine Ganzplasmid-Sequenzierung bestätigt werden, die als kommerzielle Dienstleistung von mehreren Sequenzierdienstleistern angeboten wird.

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Results

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Hier sind die Ergebnisse einer Bottom-up-Assemblierung eines polycistronischen Operons von Level 0 nach Level M dargestellt (Abbildung S1). Das Operon beginnt mit dem PromotorP LuxB, der durch das Protein LuxR in Gegenwart der Induktorverbindung N-(β-Ketocaproyl)-L-homoserinlacton (OC6)17 aktiviert werden kann. GFP ist das erste CDS des Operons, sein RBS ist iGEM BBa_B0064. Auf GFP folgt ein nicht-terminaler Linker, die "Terminator-Brüc...

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Discussion

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Die molekulare Klonierung kann zeitaufwändig und umständlich sein, insbesondere bei Ad-hoc-Klonierungsstrategien. MoClo-Toolkits können die molekulare Klonierung durch ihre Modularität, hierarchische Anordnung und hocheffiziente Eintopfreaktionen verbessern. Sie beruhen auf der DNA-Assemblierung durch Golden-Gate-Reaktionen. Dank standardisierter Überhänge können Bibliotheken von molekularen Teilen wiederverwendet und mit anderen geteilt werden 3,6

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Disclosures

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgements

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TAL, STdV und DS wurden von der Max-Planck-Gesellschaft im Rahmen des MaxGENESYS-Projekts gefördert.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AmpicillinMerck Life ScienceA9518
Bakterieller AgarFisher Scientific P0011B
BbsI-HFNew England BiolabsR3539
BsaI-HF V2New England BiolabsR3733
E. coli DH5α Kompetente Zellen
Eppendorf  Mastercycler  Nexus-ThermalzyklerEppendorf6333000014
EzDrop 1000 Mikrovolumen-SpektrophotometerBlue-Ray BiotechBRED-1000
GeneJET-Plasmid-Miniprep-KitThermowissenschaftlichK0503
In- & Aus – Klon-Toolkit
LigasepufferNew England BiolabsB0216
NaClFisher Scientific BP358
New Brunswick Innova®   42/42R – Stapelbarer Inkubator-ShakerEppendorfM1335-0080
PhenoBooth+SängerinstrumentePHB-007
SapINew England BiolabsR0569
SpectinomycinMerck Life ScienceS4014
Standard-Laborgeräte
T4-DNA-LigaseNew England BiolabsM0202
Thermomix MMB. Braun Biotech International
TryptonFisher Scientific LP0042B
HefeextraktFisher Scientific LP0021B

References

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  1. James, J. S., Dai, J., Chew, W. L., Cai, Y. The design and engineering of synthetic genomes. Nat Rev Genet. 1, 1-22 (2024).
  2. Weber, E., Engler, C., Gruetzner, R., Werner, S., Marillonnet, S. A modular cloning system for standardized assembly of multigene constructs. PLoS One. 6 (2), e16765(2011).
  3. Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS One. 3 (11), e3647(2008).
  4. Pingoud, A., Jeltsch, A. Structure and function of type II restriction endonucleases. Nucleic Acids Res. 29 (18), 3705-3727 (2001).
  5. Engler, C., Gruetzner, R., Kandzia, R., Marillonnet, S. Golden Gate shuffling: A one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes. PLoS One. 4 (5), e5553(2009).
  6. de Vries, S. T., Kley, L., Schindler, D. Use of a Golden Gate plasmid set enabling scarless MoClo-compatible transcription unit assembly. Golden Gate Cloning: Methods Protoc. 2850, 105-132 (2024).
  7. de Vries, S. T., Köbel, T. S., Sanal, A., Schindler, D. In-& Out-Cloning: Plasmid toolboxes for scarless transcription unit and modular Golden Gate acceptor plasmid assembly. Synth Biol. 9 (1), ysae016(2024).
  8. Schindler, D., Milbredt, S., Sperlea, T., Waldminghaus, T. Design and assembly of DNA sequence libraries for chromosomal insertion in bacteria based on a set of modified MoClo vectors. ACS Synth Biol. 5 (12), 1362-1368 (2016).
  9. Zumkeller, C., Schindler, D., Felder, J., Waldminghaus, T. Modular assembly of synthetic secondary chromosomes. Bacterial Chromatin: Methods Protoc. 2819, 157-187 (2024).
  10. Hoffmann, S. A. YeastFab cloning of toxic genes and protein expression optimization in yeast. Golden Gate Cloning: Methods and Protocols. , Springer, New York. (2025).
  11. Sun, G., et al. Cross-evaluation of E. coli's operon structures via a whole-cell model suggests alternative cellular benefits for low- versus high-expressing operons. Cell Syst. 15 (3), 227-245.e7 (2024).
  12. Zhao, J., et al. Multifaceted stoichiometry control of bacterial operons revealed by deep proteome quantification. Front Genet. 10, 1-12 (2019).
  13. Müntjes, K., et al. Establishing polycistronic expression in the model microorganism Ustilago maydis. Front Microbiol. 11, 1-10 (2020).
  14. Behrendt, G., Frohwitter, J., Vlachonikolou, M., Klamt, S., Bettenbrock, K. Zymo-Parts: A Golden Gate modular cloning toolbox for heterologous gene expression in Zymomonas mobilis. ACS Synth Biol. 11 (11), 3855-3864 (2022).
  15. Green, R., Rogers, E. J. Chemical transformation of E. coli. Methods Enzymol. 529, 329-336 (2013).
  16. Köbel, T. S., et al. An easy-to-use plasmid toolset for efficient generation and benchmarking of synthetic small RNAs in bacteria. ACS Synth Biol. 11 (9), 2989-3003 (2022).
  17. Meyer, A. J., Segall-Shapiro, T. H., Glassey, E., Zhang, J., Voigt, C. A. Escherichia coli "Marionette" strains with 12 highly optimized small-molecule sensors. Nat Chem Biol. 15 (2), 196-204 (2019).
  18. Salis, H. M., Mirsky, E. A., Voigt, C. A. Automated design of synthetic ribosome binding sites to control protein expression. Nat Biotechnol. 27 (10), 946-950 (2009).
  19. Chen, Y. J., et al. Characterization of 582 natural and synthetic terminators and quantification of their design constraints. Nat Methods. 10 (7), 659-664 (2013).
  20. Togna, A. P., Shuler, M. L., Wilson, D. B. Effects of plasmid copy number and runaway plasmid replication on overproduction and excretion of beta-lactamase from Escherichia coli. Biotechnol Prog. 9 (1), 31-39 (1993).
  21. Messerschmidt, S. J., et al. Optimization and characterization of the synthetic secondary chromosome synVicII in Escherichia coli. Front Bioeng Biotechnol. 4, 1-9 (2016).

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