Methodenartikel

Echtzeit-Kraftmessung zwischen Emulsionströpfchen während des enzymatischen Abbaus

DOI:

10.3791/68182

⸱

27. Juni 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Quantum Precision Measurement, College of Physics, Zhejiang University of Technology, 2College of Optical and Electronic Technology, China Jiliang University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll verwendet eine optische Pinzette mit zwei Fallen, um die Kräfte zwischen den Tröpfchen während des enzymatischen Aufschlusses von Emulsionen in Echtzeit zu messen. Es erleichtert die Untersuchung der Emulsionsstabilität und der Tröpfchendynamik mit Anwendungen in der Lebensmittelwissenschaft und Pharmazie.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll stellt eine einzigartige Methodik zur Untersuchung der Stabilität von Emulsionen und des dynamischen Desintegrations von Emulsionströpfchen während des enzymatischen Aufschlusses mit einer optischen Pinzette mit zwei Fallen vor. Der Prozess umfasst die Vorbereitung der Emulsion, das Einbringen des Enzyms und die Konfiguration eines Kraftmesssystems, um die Kräfte zwischen den Tröpfchen in Echtzeit zu überwachen. Durch den Einsatz einer optischen Pinzette mit zwei Fallen ermöglicht die Methode die präzise Manipulation und Beobachtung von Emulsionströpfchen und erleichtert die Messung der Kräfte zwischen den Tröpfchen während des enzymatischen Desintegrations. Diese experimentelle Technik bietet wichtige Einblicke in die Wechselwirkungen und die Stabilität von Emulsionen während der Verdauung, mit besonderer Relevanz für die Forschung in der Lebensmittelwissenschaft, Pharmazie und anderen Industrien, die mit organischen Emulsionen zu tun haben. Die Methode ist anpassungsfähig und anwendbar auf verschiedene optische Pinzettenaufbauten und verschiedene Arten von Emulsionen oder Enzymen und dient als vielseitiges Werkzeug zur Erforschung mechanischer Eigenschaften und Desintegrationsprozesse in einer Reihe von Bereichen. Darüber hinaus bietet dieser visuelle Ansatz den Vorteil der Echtzeitüberwachung der Kraftdynamik und eröffnet neue Wege für die Untersuchung des Emulsionsverhaltens in verschiedenen Anwendungen.

Einleitung

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Emulsionen sind heterogene Systeme, die aus zwei nicht mischbaren Flüssigkeiten bestehen, wobei eine Flüssigkeit als Tröpfchen in der anderen dispergiert ist. Diese Systeme sind in verschiedenen Branchen allgegenwärtig, darunter Lebensmittel, Pharmazeutika1, Kosmetik und Petrochemie. Die Stabilität und Funktionalität von Emulsionen hängt entscheidend von den Wechselwirkungen zwischen den Tröpfchen ab, die durch verschiedene Faktoren wie die Oberflächenchemie, die Umgebungsbedingungen und das Vorhandensein von Enzymen beeinflusst werden können2.

In vielen Anwendungen, insbesondere in der Lebensmittelwissenschaft und bei der Verabreichung von Arzneimitteln, werden Emulsionen enzymatischen Umgebungen ausgesetzt 3,4. Im menschlichen Verdauungssystem treffen beispielsweise eingenommene Lebensmittel und Medikamente auf Emulsionsbasis auf verschiedene Enzyme, die ihre Struktur und Funktion verändern können. Das Verständnis der Dynamik der Tröpfchenwechselwirkungen während des enzymatischen Aufschlusses ist entscheidend für die Entwicklung stabiler und wirksamer emulsionsbasierter Produkte 5,6.

Herkömmliche Methoden zur Untersuchung der Emulsionsstabilität 2,7, wie z. B. Lichtstreuung oder rheologische Messungen, liefern wertvolle Volumeninformationen, können aber Wechselwirkungen zwischen einzelnen Tröpfchen nicht direkt beobachten und quantifizieren8. Diese Einschränkung hat das Verständnis der mikroskaligen Prozesse behindert, die bei der enzymatischen Verdauung von Emulsionen ablaufen.

Die optische Pinzette hat sich zu einem leistungsfähigen Werkzeug entwickelt, um mikroskopische Objekte zu manipulieren und Kräfte auf der Mikro- und Nanoskalazu messen 9. Durch die Nutzung des Impulses des Lichts kann eine optische Pinzette einzelne Tröpfchen mit außergewöhnlicher Präzision einfangen und bewegen. Diese Fähigkeit eröffnet neue Möglichkeiten zur Untersuchung von Tröpfchen-Tröpfchen-Wechselwirkungen in komplexen Umgebungen10,11.

Dieses Protokoll stellt eine einzigartige Methode dar, die eine duale optische Pinzette mit Echtzeit-Kraftmessungen kombiniert, um die Wechselwirkungen zwischen Emulsionströpfchen während des enzymatischen Aufschlusses zu untersuchen. Als repräsentatives Beispiel wird das Verfahren anhand eines Emulsionssystems demonstriert, das aus Rapsöl oder einem Fetttröpfchen besteht, das durch Molkenprotein stabilisiert ist und durch Trypsin verdaut wird. Dieses Modellsystem ist besonders relevant für die Lebensmittelwissenschaft und Ernährung, da es gängige Nahrungsemulsionen und deren Verhalten im Verdauungstrakt nachahmt12.

Der Ansatz ermöglicht die direkte Beobachtung und Quantifizierung der Kräfte zwischen einzelnen Tröpfchen während ihres enzymatischen Abbaus und bietet beispiellose Einblicke in die Dynamik der Emulsionsstabilität unter Verdauungsbedingungen. Die Methode verwendet das optische Pinzettensystem, eine hochmoderne optische Pinzette mit zwei Fallen, um Emulsionströpfchen zu manipulieren und die Kräfte zwischen den Tröpfchen mit hoher Präzision zu messen13.

Diese experimentelle Technik schließt die Lücke zwischen Bulk-Emulsionsstudien und Untersuchungen auf molekularer Ebene und bietet eine einzigartige Perspektive auf das Verhalten von Emulsionen während des enzymatischen Aufschlusses. Die aus dieser Methode gewonnenen Erkenntnisse haben weitreichende Auswirkungen auf verschiedene Bereiche, darunter Lebensmitteltechnik, pharmazeutische Formulierungen und die Grundlagenforschung von Kolloiden. Während ein spezifisches Öl-Protein-Enzym-System als Beispiel verwendet wird, kann die hier vorgestellte Methodik angepasst werden, um ein breites Spektrum an organischen Emulsionssystemen und Verdauungsenzymen in verschiedenen Branchen zu untersuchen.

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Protokoll

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Abbildung 1 zeigt ein Schema des Tröpfcheneinfangs einer optischen Pinzette mit zwei Fallen. Die in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Herstellung der Molkenproteindispersion

  1. Bereiten Sie eine 5%ige (w/v) Molkenproteindispersion in entionisiertem Wasser vor.
    1. Wiegen Sie mit einer elektronischen Waage 2,5 g Molkenproteinpulver genau ab.
    2. Messen Sie mit einem Messzylinder 47,5 ml entionisiertes Wasser.
  2. Kombinieren Sie die Zutaten.
    1. Das gewogene Proteinpulver und das abgemessene Wasser in ein Becherglas geben.
    2. Geben Sie einen magnetischen Rührstab in das Becherglas.
  3. Verschließen Sie den Becher.
    1. Decken Sie das Becherglas mit Siegelfolie ab, um Verdunstung und Kontamination zu verhindern.
  4. Mischen Sie die Dispersion.
    1. Stellen Sie den Becher auf einen Magnetrührer. Stellen Sie die Rührgeschwindigkeit auf 1500 U/min ein (Abbildung 2A), bis sich das Proteinpulver vollständig aufgelöst und die Lösung gleichmäßig verteilt hat.
  5. Hydratisieren Sie das Protein
    1. Um eine vollständige Hydratation des Molkenproteins zu gewährleisten und die Schaumbildung zu minimieren, bereiten Sie die Dispersion einen Tag vor der Emulsionsvorbereitung vor.
    2. Lassen Sie die 5%ige Molkenproteindispersion über Nacht bei Raumtemperatur mischen.
      ACHTUNG: Stellen Sie sicher, dass alle Gläser und Utensilien sauber und frei von Verunreinigungen sind, um eine Beeinträchtigung der Proteindispersion zu vermeiden.
      HINWEIS: Der Hydratationsschritt über Nacht ist entscheidend für eine optimale Proteinfunktionalität und Emulsionsstabilität. Das Überspringen dieses Schritts kann zu einer verringerten Emulgiereffizienz führen. In diesem Protokollabschnitt werden die ersten Schritte zur Herstellung der Molkenproteindispersion beschrieben, die zur Stabilisierung der Rapsöltröpfchen in der anschließenden Emulsionszubereitung verwendet wird. Die folgenden Schritte umfassen typischerweise die Herstellung der Öl-in-Wasser-Emulsion, die Einrichtung des optischen Pinzettenexperiments und die Einführung von Trypsin für Aufschlussstudien.

2. Herstellung von Öl-in-Wasser-Emulsionen

  1. Optimieren Sie die Formulierung.
    1. Bereiten Sie die Emulsion vor, indem Sie 15 % Öl mit 85 % Proteinlösung mischen, um ein Protein-Lipid-Massenverhältnis von 0,3 zu erreichen.
  2. Bereiten Sie die Lipidphase vor.
    1. Rapsöl ist bei Raumtemperatur flüssig. Geben Sie 30 mL Rapsöl in ein Zentrifugenröhrchen für die spätere Verwendung.
    2. Milchfett ist bei Raumtemperatur fest. Nehmen Sie etwa fünf Messlöffel Milchfett und geben Sie sie in ein Zentrifugenröhrchen.
    3. Legen Sie das Röhrchen in ein Becherglas und geben Sie ca. 40 ml entionisiertes Wasser in das Becherglas.
    4. Verwenden Sie eine digitale Heizplatte, um das Becherglas auf 42 °C zu erhitzen und diese Temperatur 30 Minuten lang zu halten, um ein vollständiges Schmelzen zu gewährleisten (Abbildung 2B).
      HINWEIS: Der Schmelzpunkt von Milchfett liegt bei ca. 30 °C bis 40 °C. Die Labortemperatur wird bei 26 °C gehalten. Geschmolzenes Milchfett kann für eine gewisse Zeit flüssig bleiben, verfestigt sich aber bei Raumtemperatur allmählich, wenn es stehen bleibt.
  3. Kombinieren Sie die Zutaten.
    1. In ein 5-ml-Zentrifugenröhrchen werden 0,6 mL Öl (Rapsöl oder geschmolzenes Milchfett) und 3,4 mL der vorbereiteten Molkenproteinlösung gegeben.
  4. Homogenisieren Sie die Emulsion.
    1. Verwenden Sie einen High-Shear-Mischer (HSM). Stellen Sie die Drehzahl auf 25.000 U/min ein und mischen Sie 5 Minuten lang (Abbildung 2C).
    2. Optional wird die grobe Emulsion durch einen Hochdruck-Homogenisator geleitet. Typische Bedingungen: 2-3 Durchgänge bei 500-1000 bar Druck.
  5. Verdünnen Sie die Emulsion.
    1. Bereiten Sie eine Verdünnung der Emulsion im Verhältnis 1:1000 vor. Messen Sie 4 μl der Originalemulsion mit einer Pipette. Fügen Sie dies zu 3996 μl deionisiertem Wasser hinzu. Gründlich mischen, um eine gleichmäßige Verdünnung zu gewährleisten.

3. Ersteinrichtung der optischen Pinzette

  1. Bereiten Sie die mikrofluidischen Durchflusszellen vor und reinigen Sie sie (siehe Materialtabelle).
    HINWEIS: Das Gerät ist mit sechs mikrofluidischen Kanälen ausgestattet. In diesem Experiment wird ein einzelner Kanal verwendet, wobei nur der Kanal ganz links in Abbildung 3B verwendet wird.
    1. Um den mikrofluidischen Kanal vorzubereiten, reinigen Sie alle notwendigen Geräte und Strömungskanäle. Spülen Sie alle Geräte gründlich mit entionisiertem Wasser ab, um sicherzustellen, dass keine Rückstände zurückbleiben.
    2. Zur Reinigung spülen Sie den gewünschten Kanal mit Ethanol. Stellen Sie die Durchflussmenge auf 1,0 bar ein und spülen Sie mit Ethanol. 1 h vor dem Versuch Rinderserumalbumin (BSA) in die Durchflusszelle spülen. BSA bildet eine "blockierende" Schicht auf Oberflächen, um die unspezifische Adsorption von Emulsionströpfchen oder anderen Biomolekülen zu reduzieren.
  2. Die vorbereitete Emulsion wird in den Versuchskanal geleitet.
  3. Bereiten Sie das Instrument vor dem Experiment vor.
    1. Öffnen Sie das optische Pinzetteninstrument.
    2. Geben Sie ca. 70 μl entionisiertes Wasser in die untere Objektivlinse.
    3. Setzen Sie die Probenkammer ein, bis ein "Klicken" zu hören ist.
    4. Geben Sie einen Tropfen Tauchöl auf die Probenkammer (Abbildung 3C).
    5. Senken Sie die Kondensorlinse vorsichtig ab, bis sie die Oberseite der Probenkammer leicht berührt.
    6. Schließen Sie die optische Pinzette, bevor Sie den Laser einschalten. Der Laser arbeitet bei 1064 nm.
  4. Suchen Sie die Z-Ebene, und passen Sie den Strahlengang an.
    1. Schalten Sie den Laser ein und stellen Sie die Leistung auf 100 % ein.
    2. Stellen Sie den unteren Knopf (Abbildung 3A) an der optischen Pinzette ein, um den Laserpunkt zu lokalisieren. Bewegen Sie sich von unten nach oben (Verstellung im Uhrzeigersinn) und beobachten Sie die Laserspots dreimal. Legen Sie die Z-Ebene zwischen dem zweiten und dritten Satz von Laserspots fest.
      HINWEIS: Die drei Sätze von Laserspots erscheinen, wenn der Laser auf die Unterseite der Durchflusszelle, die Oberseite des unteren Deckglases und die Unterseite des oberen Objektträgers fokussiert wird. Der Laser sollte zwischen der Oberseite des Deckglases und der Unterseite des Objektträgers fokussiert werden.
    3. Reduzieren Sie die Laserleistung auf 30 %.
    4. Vergewissern Sie sich, dass 7 bis 11 Interferenzstreifen auf dem Bildschirm angezeigt werden (Abbildung 3E). Wenn die Zahl zu hoch oder zu niedrig ist, stellen Sie den unteren Knopf ein.
      HINWEIS: Die Anzahl der Interferenzstreifen spiegelt die Optimierung des Abstands zwischen dem Kondensator und der Durchflusszelle wider. Im Bereich von 7 bis 11 Streifen fängt der Kondensator effektiv ausreichend Licht ein, um ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis für gemessene Signale, wie z. B. die mechanische Reaktion, zu gewährleisten. Dieser Abstand hält auch einen Sicherheitsabstand ein, um den Kontakt der Linse mit der Durchflusszelle zu vermeiden und optische Wegstreuung oder Reflexionsinterferenzen zu reduzieren.
  5. Passen Sie die Strömungskanäle an. Schließen Sie nicht benötigte Kanäle und stellen Sie sicher, dass nur der erforderliche experimentelle Kanal geöffnet ist.
  6. Stellen Sie die Laserleistung ein. Stellen Sie den Laser in der Regel auf 100 % ein, um Tröpfchen einzufangen, aber passen Sie ihn an die erforderliche Intensität für bestimmte experimentelle Bedingungen an.
  7. Richten Sie die Datenspeicherung ein. Konfigurieren Sie das Verzeichnis zum Speichern von Dateien, um eine sofortige Erfassung von experimentellen Daten zu gewährleisten.

4. Messung der Kraft-Weg-Kurve für die Emulsion

  1. Stellen Sie die Durchflussmenge auf 0,5 bar ein. Tröpfchen sollten ca. 5 s lang auf dem Bildschirm sichtbar sein. Stoppen Sie dann den Durchfluss, indem Sie Vakuum auswählen und das Kanalventil schließen.
  2. Fangen Sie die Tröpfchen ein.
    1. Verwenden Sie den Joystick, um zwei Tröpfchen ähnlicher Größe innerhalb des Kanals zu erfassen. Ein Schema der erfolgreich erfassten Tröpfchen ist in Abbildung 4 dargestellt.
    2. Stellen Sie den Abstand zwischen den beiden Tröpfchen auf ca. 10 μm ein. Bildet sich ein Seil, wird eine spürbare Kraftänderung beobachtet.
    3. Fixieren Sie die x- und y-Positionen der rechten optischen Falle und die y-Position der linken optischen Falle. Markieren Sie die beiden Tröpfchen mit magentafarbenen bzw. grünen Feldern.
  3. Messen Sie die spektrale Leistungsdichte (PSD).
    1. Navigieren Sie zum Menü Kalibrierung .
    2. Wählen Sie auf dem linken Bildschirm Messen aus. Wenn der Geräuschpegel zu hoch ist, wiederholen Sie die Messung, bis zufriedenstellende Ergebnisse erzielt werden.
    3. Wählen Sie Anwenden aus, um die Kalibrierung zu bestätigen.
  4. Löschen Sie die ursprünglichen Daten und messen Sie den Kraft-Weg.
    1. Zu diesem Zeitpunkt sollte der Joystick nur die linke optische Falle steuern. Bewegen Sie die linke Falle langsam mit konstanter Geschwindigkeit (1,0 μm/s) in Richtung des rechten Tröpfchens, bis der Abstand Null erreicht. Dieses Verfahren ergibt die erforderliche Kraft-Weg-Kurve.
  5. Wählen Sie die Daten aus und speichern Sie.
    1. Wählen Sie mit der linken Maustaste das gewünschte Datenintervall aus, beginnend mit einem Tröpfchenabstand von 10 μm bis hinunter zu 0 μm. Bei 0 μm Abstand erreicht die gemessene Kraft typischerweise ihren Maximalwert.
  6. Speichern Sie die markierten Daten.
    1. Klicken Sie mit der rechten Maustaste, um das ausgewählte Datensegment im ursprünglichen Ordnerverzeichnis zu speichern .

5. Herstellung der Tris-Pufferlösung und der Trypsin-Lösung

  1. Bereiten Sie die Tris-Pufferlösung mit der folgenden Zusammensetzung vor: 11,860 g/l Trisbase, 0,735 g/l Calciumchlorid-Dihydrat (CaCl 2,2H 2O) und 8,766 g/l Natriumchlorid (NaCl). Stellen Sie das endgültige Volumen auf 100 ml ein. Stellen Sie den pH-Wert zunächst mit Salzsäure (HCl) auf ca. 8,4 ein und bestätigen Sie den endgültigen pH-Wert mit pH-Teststreifen.
  2. Bereiten Sie die Trypsinlösung vor, indem Sie 100 mg Trypsin 1:250 (aus der Bauchspeicheldrüse des Schweins) in 1000 ml Tris-Puffer auflösen. Die Mischung mit einem Magnetrührer bei 4 °C und 500 U/min 15 min lang umrühren. Anschließend die Lösung 15 Minuten lang bei 4 °C zentrifugieren.

6. Trypsin-Wirkung und dynamisches Nachweisschema

  1. Fügen Sie der Emulsion Trypsinlösung hinzu.
    1. Mit einer Pipette mit einem Bereich von 0,5 μl bis 10 μl ziehen Sie 4 μl der Trypsinlösung und fügen Sie sie vorsichtig der vorbereiteten 4 ml-Emulsion hinzu.
  2. Führen Sie eine dynamische Überwachung in Echtzeit durch.
    1. Überwachen Sie nach der Zugabe der Trypsinlösung die Emulsionen dynamisch mit der optischen Pinzettentechnologie. Die Messungen werden alle 10 Minuten durchgeführt, wobei die erste Messung 10 Minuten nach der Zugabe der Trypsinlösung durchgeführt wird.

7. Datenverarbeitung

  1. Rufen Sie die experimentellen Daten im h5-Format ab, und führen Sie die erforderliche Formatkonvertierung mithilfe einer Datenverarbeitungsumgebung durch, um tabellarische Datendateien zu erstellen. Die konvertierten Dateien bestehen aus zwei Abschnitten, in denen die Kraft- bzw. Abstandsdaten aufgezeichnet werden.
  2. Passen Sie die Daten aus diesen beiden Schnitten mithilfe von Kurvenanpassungstechniken an, und stellen Sie die resultierenden angepassten Kurven für die weitere Analyse visuell dar.

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Ergebnisse

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In dieser Studie wurden Emulsionen, die Rapsöl und Molkenprotein sowie Milchfett und Molkenprotein enthielten, mit einer optischen Pinzette analysiert. Zunächst wurde das Kraft-Weg-Verhältnis zwischen den beiden Emulsionen gemessen, um Basisdaten zu ermitteln (Abbildung 5A-F). Dann wurde jeder Emulsion Trypsin zugesetzt, und das Kraft-Weg-Verhältnis wurde alle 10 Minuten neu gemessen.

Abbildung 5 zeig...

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Diskussion

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Die Kerninnovation dieser Methodik liegt im synchronisierten Betrieb von dualen optischen Fallen und mechanischer Echtzeit-Überwachungstechnologie (Abbildung 3A), die eine hochpräzise dynamische Analyse auf Einzeltröpfchenebene ermöglicht. Durch das unabhängige Einfangen von zwei Tröpfchen mit einer optischen Doppelpinzette und die präzise Regulierung ihres Abstands auf einen anfänglichen Abstand von 10 μm (siehe Schritt 4.2.2) überwindet die Methode die tra...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Forschung wurde durch das NATIONAL KEY RESEARCH AND DEVELOPMENT PROJECT OF CHINA, Grant No. 2023YFF0613603, und die NATIONAL NATURAL SCIENCE FOUNDATION OF CHINA, Grant No. 22202167, finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Bluelake-SoftwareLUMICKS, NiederlandeSoftware zur Steuerung von optischen Pinzetten
CaCl2.H4O2
Dome LED-Digitalheizplatten-RührwerkSCILOGEXSCI280-Pro 
Elektronische WaageShanghai Hengping Instrument Co., LTDFA1204
HCl
Hochgeschwindigkeits-HomogenisatorNingbo Kemai Instrument Co., LTDKM-S10
Immersionsöl
Lichtinduziertes WirbelmischgerätShanghai HUXI Industrial Co., LTDVortex-5S
Microsoft Office ExcelMicrosoft
MilchfettSM MlekovitaMaslo Klarowane
NaCl
Optische PinzettenplattformLUMICKS,Niederlandem-trap
Origin SoftwareOrigin Lab2024Zum Zeichnen einer Kraft- und Abstandsanpassungskurve
PipettenpistoleEppendorf10 μ L,100 μ L,1000 μ L
Rapsöl Bunge Polska Sp.z o.o. Kujawski
VersiegelungsfolieParafilm4IN*125FT
Tris
TrypsinSangon BiotechA100458-0010Trypsin 1:250, aus Schweinebauchspeicheldrüse
Molkenproteinkonzentrat SM MlekovitaWPC

Referenzen

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Emulsionsstabilit toptische Pinzettenenzymatischer AufschlussEchtzeit berwachungTr pfchenzerfallTrypsin VerdauIntertr pfchenkr fteLebensmittelemulsionen

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