Mikrostrukturierte magnetorheologische Elastomere zur Verbesserung der Kardiomyozytenausrichtung

Zusammenfassung

Wir präsentieren eine dynamische und reversible Steifigkeitsassay-Plattform, die aus einem ultraweichen Silikonelastomer (Polydimethylsiloxan, PDMS) mit eingebetteten Eisenpartikeln hergestellt wird. Dieser neuartige Assay eignet sich für die Untersuchung emergenter zeitabhängiger physikalischer Veränderungen in Zellphänotypen, einschließlich der Kontaktführung. Hier messen wir die Ausrichtung der Kardiomyozyten von neonatalen Ratten nach der Matrixversteifung mit Hilfe von Magneten.

Zusammenfassung

Substrat-assoziierte Hinweise, wie mechanische und topographische, beeinflussen die zelluläre Reaktion tiefgreifend. Ein Großteil der Grundlagenforschung verwendet jedoch statische oder isolierte Effekte. Die Richtung und der zeitliche Ablauf dieser mechanischen Effekte auf emergente zelluläre Reaktionen sind noch weitgehend unerforscht. Werkzeuge, um zu untersuchen, wie zeitlich veränderliche, substratassoziierte Reize physiologische und pathologische Prozesse steuern, können die nächste Stufe mechanobiologischer Erkenntnisse erschließen. Hier verwenden wir mikrostrukturierte magnetorheologische Elastomere (MREs), die sich als Reaktion auf ein externes Magnetfeld schnell versteifen und erweichen können, was eine genauere Untersuchung der Auswirkungen mechanischer (Steifigkeit) und kontaktgesteuerter (topographischer) Stimulation auf die Orientierung und Ausrichtung der Kardiomyozyten von Neugeborenen bei Ratten ermöglicht. Durch die Integration einer dynamischen Regelung der mechanischen Steifigkeit, die zeitlich abgestimmt und umgekehrt werden kann, können wir die Auswirkungen der Belastung rigoros testen, indem wir (1) unter identischen Bedingungen vorkonditionieren und (2) die In-vitro-Biomechanik akut verändern, um klinisch relevante Phänomenologie, wie z. B. den Myokardinfarkt, richtig nachzuahmen. Dieser Ansatz ermöglicht es uns, den Einfluss der Belastung auf zelluläre Reaktionen realistischer und kontrollierter zu untersuchen.

Einleitung

Die Fähigkeit des Herzens, Blut effizient zu pumpen, hängt von der Architektur und den mechanischen Eigenschaften (Steifigkeit) seines Myokards ab, wobei die präzise Organisation von Zellen und Gewebe für eine koordinierte Kontraktion und Gesamtfunktion unerlässlich ist. Das Myokard besteht hauptsächlich aus Kardiomyozyten (CMs), die bei Erwachsenen eine längliche, fast stäbchenartige Morphologie mit Sarkomeren (der kontraktilen Einheit der CMs) aufweisen, die entlang der Zelllänge ausgerichtet sind. Im Gegensatz dazu unterscheiden sich fetale oder induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC)-abgeleitete CMs signifikant von adulten CMs. Sie neigen dazu, eine rundere Form, einen einzelnen Kern, eine unorganisierte oder nicht ausgerichtete sarkomerische Struktur und eine unregelmäßige Schwebungsfrequenz zu haben. Die strukturelle Ähnlichkeit der In-vivo-Organisation des Myokards ermöglicht die Synchronität der Kontraktion und Kraftübertragung; Dies ist entscheidend und unerlässlich für die Rekapitulation des natürlichen Myokards durch ein In-vitro-Modell. Um CMs mit strukturellen Eigenschaften zu erzeugen, die denen des reifen Myokards ähneln, haben frühere Studien erfolgreiche Strategien zur Verbesserung der Reifung gezeigt, einschließlich der Manipulation der Substratsteifigkeit ^1,2, der Anwendung mechanischer Dehnung³, der Verwendung von Kontaktführung ^4,5 oder der Verwendung von elektrischer Stimulation ^6,7.

Es ist seit langem bekannt, dass die Steifheit der extrazellulären Umgebung die Zellen beeinflusst. Im gesamten menschlichen Körper gibt es eine große Vielfalt an Steifheit, die von Hunderten von Pascal (Pa) im Gehirn bis zu Dutzenden von Gigapascal (GPa) im Knochen reicht ^8,9,10. Es wurde festgestellt, dass sich die Steifigkeit des Gewebes während der Entwicklung ändert, und diese Veränderung reguliert die Differenzierung auf zellulärer Ebene und die Reifung in die adulten Phänotypen, die für eine normale Funktion erforderlich sind 11,12,13,14. Veränderungen der Steifigkeit wurden auch mit Krankheitszuständen und dem Fortschreiten bestimmter Pathologien in Verbindung gebracht 15,16,17,18. Insbesondere ändert sich die Steifigkeit des Myokards mit der Entwicklung und dem Fortschreiten der Krankheiten; Zum Beispiel hat ein gesundes Myokard einen Elastizitätsmodul von ~10 kPa im Gegensatz zu einem versagenden Herzen, das einen Elastizitätsmodul von 35-70 kPa oder mehr hat¹⁹. Darüber hinaus haben zahlreiche In-vitro-Studien berichtet, dass Kardiomyozyten, die auf einem Substrat kultiviert wurden, das der nativen Myokardsteifigkeit ähnelte, eine bessere Sarkomerorganisation^{aufwiesen 20}, eine optimale Kontraktion erzeugten ^1,19 und die längste potenzielle Wirkungsdauer^{aufwiesen 21}.

Darüber hinaus hat sich die Erkenntnis durchgesetzt, dass Zellen in vivo in ihrer Mikroumgebung einer komplexen Vielzahl topographischer Signale ausgesetzt sind, die Form und Funktion steuern. Diese topographischen Hinweise gibt es in verschiedenen Größen und Geometrien, von der zufälligen Anordnung von Integrinen auf molekularer Ebene bis hin zur Ausrichtung von Zellen im Muskelgewebe auf Mikrometerebene^22,23. Ähnlich wie bei anderen mechanischen Regulatoren ist die Topographie wichtig für die Zellmorphologie, wie z. B. Ausbreitung, Elongation, Ausrichtung, Motilität, Differenzierung und Apoptose 24,25,26. Mit der Einführung synthetischer Kultursubstrate wurden Verfahren entwickelt, um eine kontrollierte Oberflächentopographie für Zell- und Gewebekulturen zu erzeugen 27,28,29. Zum Beispiel wurden mikrostrukturierte Nano- und Mikrorillen verwendet, um Säugetierzellen eine Kontaktführung zu ermöglichen, damit die Zellen ihr Zytoskelett ausrichten und umgestalten können, um den topographischen Strukturen des Kultursubstrats zu folgen.

Hier stellen wir eine In-vitro-Kulturmethode vor, die sowohl strukturelle (Kontakthinweis) als auch mechanische (Steifigkeit) Führung unter Verwendung eines strukturierten magnetorheologischen Elastomers (MRE) Substrats integriert, einem abstimmbaren Material, das durch Einstellen der Stärke des Magnetfeldes versteift oder erweicht werden kann 17,30,31,32. Durch die Positionierung von Magneten in der Nähe des Kultursubstrats kann die Steifigkeit erhöht werden, wobei der Grad der Versteifung durch Variation des Abstands zwischen der Probe und dem Magneten geändert werden kann. Umgekehrt kann die Steifigkeit reduziert werden, indem der Magnet ganz entfernt wird. Dieser Ansatz bietet eine robuste, dynamische und kontrollierbare Methode, um die in vivo-ähnlichen mechanischen Bedingungen zu replizieren, während die Oberflächenmikrostrukturierung Anisotropie einführt und die Herstellung biomimetischerer 2D-Zellkultursubstrate ermöglicht.

Protokoll

1. Vorbereitung des gemusterten PDMS-Stempels

HINWEIS: Ein PDMS-Stempel ist aufgrund seiner Flexibilität unerlässlich und ermöglicht eine einfache Handhabung und einen präzisen Kontakt bei der Vorbereitung der strukturierten MRE-Oberfläche. Die flexible Natur des Stempels ermöglicht auch ein müheloses Entfernen von der MRE-PDMS-Schicht, ohne das Muster zu beschädigen, was sowohl eine genaue Musterübertragung als auch die Erhaltung der MRE-Oberfläche gewährleistet.

1. Bereiten Sie 10 g 10:1 (Basis: Härter) 184 PDMS vor.
2. 5 g des 184 PDMS in eine 35 mm Petrischale geben und in einem Exsikkator ~5-10 min entgasen, bis sich alle Blasen aufgelöst haben.
3. 184 PDMS 30 Min. im Ofen bei 60 °C teilweise aushärten lassen.
4. Wenn 5 Minuten verbleiben, bis das 184 PDMS teilweise ausgehärtet ist, fügen Sie eine dünne Schicht des zusätzlichen 184 PDMS zum Beugungsgitter hinzu und entgasen Sie es im Exsikkator für ~5 Minuten.
5. Nehmen Sie die 35-mm-Form mit den teilweise ausgehärteten 184 PDMS aus dem Ofen.
6. Drehen Sie das Beugungsgitter mit PDMS auf das teilweise ausgehärtete 184 PDMS in einer 35-mm-Schale.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Beugungsgitter nach unten in das teilweise ausgehärtete 184 PDMS in der 35-mm-Schale zeigt.
7. Drücken Sie das Beugungsgitter leicht, bis eine kleine Menge von 184 PDMS das Gitter umgibt.
8. Verwenden Sie die verbleibenden nicht ausgehärteten 184 PDMS, um die Schale um den Rost herum zu verfüllen, um sicherzustellen, dass sie während des Aushärtens an Ort und Stelle bleibt.
9. Die Form mit dem Beugungsgitter für 1,5 h in den auf 60 °C eingestellten Ofen stellen.
10. Nachdem das 184 PDMS vollständig ausgehärtet ist, nehmen Sie die 35-mm-Schale mit dem Beugungsgitter aus dem Ofen.
11. Mit einem Skalpell um das Beugungsgitter herum ritzen.
12. Tragen Sie eine kleine Menge Isopropylalkohol (IPA) auf, um unter das Beugungsgitter einzudringen.
13. Ziehen Sie das Gitter vom 184 PDMS in Richtung ab, die parallel zu den Mustern verläuft.
14. Entfernen Sie überschüssige 184 PDMS, sodass nur der gemusterte Abschnitt übrig bleibt.
15. Schneiden Sie den 184er PDMS-Stempel auf die gewünschte Größe zu.
    HINWEIS: In dieser Studie wird ein Stempel von 1 cm × 1 cm für die Geräte verwendet.

2. Oberflächenbeschichtung des PDMS-Stempels

HINWEIS: Eine Silanbehandlung erzeugt eine Oberflächenbeschichtung, die eine unerwünschte Adhäsion zwischen PDMS-Schichten während des Stanzens verhindert, eine reibungslose Trennung gewährleistet und die Qualität der Musterübertragung bewahrt.

1. Silanbehandlung (bevorzugte Methode)
   1. Legen Sie den hergestellten 184 PDMS-Stempel mit der gemusterten Oberfläche nach oben in einen O₂ -Plasmareiniger. Die PDMS-Oberfläche wird 30 s lang mit 45 W O₂ -Plasma behandelt.
      HINWEIS: Setzen Sie nach dem Entfernen aus dem Plasmareiniger sofort einen Deckel (oder eine Abdeckung) über die Stempel, um sicherzustellen, dass sich keine Ablagerungen auf den gereinigten Stempeln absetzen.
   2. Legen Sie 184 PDMS-Stempel in einen Exsikkator in einem Abzug.
   3. Reißen Sie den Deckel eines Mikrozentrifugenröhrchens ab.
   4. Platzieren Sie den Deckel des Mikrozentrifugenröhrchens neben den 184 PDMS-Stempeln im Exsikkator.
   5. Geben Sie 20 μl Trichlor(1H, 1H, 2H, 2H-Perfluoroctyl)silan in den Deckel des Mikrozentrifugenröhrchens.
      ACHTUNG: Diese Chemikalie ist gesundheitsschädlich und darf daher nur in einem chemischen Abzug verwendet werden.
   6. Schließen Sie den Exsikkator und ziehen Sie einen Staubsauger.
   7. Lassen Sie das Silan die Stempel von 1 h bis über Nacht einwirken.

3. Herstellung von magnetorheologischen Elastomeren

HINWEIS: Um abstimmbare und reversible MREs zu erzeugen, ermöglicht ein präzises Verhältnis von Carbonyleisenpartikeln und Elastomer in Kombination mit der Anwendung eines Magnetfelds die Einstellung der Steifigkeit über einen Bereich von Werten. Durch die Variation der Partikelfraktion, des Basiselastomermoduls und der Magnetfeldstärke kann die Steifigkeit des Materials fein abgestimmt werden, um spezifische Anforderungen zu erfüllen.

1. Weichere MRE-Vorbereitung im Dynamikbereich (siehe Tabelle 1 für Beispielgewichte)
   1. Messen Sie die gewünschte Menge Silikonverdünner und Eco-Elastomer Teil B ab und mischen Sie bei 2500 U/min in einem Drehzahlmischer für 1 min.
   2. Eco-Elastomer Teil A und Carbonyleisenpartikel zur Lösung geben und bei 2500 U/min in einem Drehzahlmischer 1 min mischen.
      HINWEIS: Die Reihenfolge des Mischens ist entscheidend, um den gewünschten Polymerisationszeitpunkt zu gewährleisten.
   3. Mit einer Transferpipette und abgeschnittener Spitze 5 g des MRE in eine neue 35-mm-Petrischale geben und in einem Exsikkator ~5 min lang entgasen, dann im Ofen bei 60 °C ~10 min teilweise aushärten lassen.
      HINWEIS: Die Sicherstellung, dass der Ofen und der Exsikkator richtig nivelliert sind, ist wichtig, um eine flache Probe zu erhalten, was für die einfache Bildgebung von entscheidender Bedeutung ist.
   4. Sobald noch 5 Minuten verbleiben, verwenden Sie eine Transferpipette, um zusätzliches ungehärtetes MRE hinzuzufügen, um nur die Oberfläche des 184 PDMS-Stempels zu beschichten. Legen Sie den beschichteten Stempel in den Exsikkator, um ihn 5 Minuten lang zu entgasen.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, nicht zu viel MRE zu verwenden, da es das Entfernen des Stempels nach dem vollständigen Aushärten des MRE erschwert, wenn es die Kanten des Stempels bedeckt. Achten Sie auch darauf, die Richtung des Musters bei jedem Schritt anzugeben, damit der Stempel beim Entfernen aus dem MRE in die Richtung parallel zu den Mustern gezogen werden kann.
   5. Nehmen Sie die MRE aus dem Ofen und verwenden Sie eine Pinzette, um den beschichteten Stempel vorsichtig zu bewegen. Drehen Sie es mit der Vorderseite nach unten auf das teilweise ausgehärtete MRE und drücken Sie es leicht an. Den MRE und den gestrichenen Stempel wieder für weitere 25 Min. bei 60 °C in den Ofen schieben.
   6. Sobald sie vollständig ausgehärtet ist, verwenden Sie ein Skalpell, um die MRE am unteren Rand des Stempels senkrecht zu den Mustern zu ritzen.
   7. Tragen Sie eine kleine Menge IPA auf die Schnittfläche um den Stempel herum auf.
      HINWEIS: Das IPA sollte in den Schnitt eindringen und sich unter dem Stempel zu bewegen beginnen.
   8. Ziehen Sie den Stempel mit einer Pinzette in Richtung parallel zu den Mustern vom MRE ab.
2. Steiferer Dynamikbereich MRE-Vorbereitung (Beispielgewichte siehe Tabelle)
   1. Vorbereiten von 30:1 184 PDMS.
      HINWEIS: Machen Sie extra, da einige am Mischbehälter kleben bleiben.
   2. Fügen Sie die gewünschte Menge von 527 PDMS Teil A und Teil B hinzu, dann Carbonyleisenpartikel und 30:1 184 PDMS in einem Verhältnis, das auf dem Beispiel in der Tabelle basiert.
   3. Mixen Sie es bei 2500 U/min in einem Geschwindigkeitsmixer für 1 min.
   4. Mit einer Transferpipette und abgeschnittener Spitze 5 g des MRE in eine neue 35-mm-Petrischale geben und in einem Exsikkator ~5 min entgasen, dann ~40 min bei 60 °C teilweise im Ofen aushärten lassen.
   5. Sobald 5 Minuten verbleiben, verwenden Sie eine Transferpipette, um zusätzliches ungehärtetes MRE hinzuzufügen, um nur die Oberfläche des PDMS-Stempels zu beschichten. Legen Sie den beschichteten Stempel in den Exsikkator, um ihn 5 Minuten lang zu entgasen.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, nicht zu viel MRE zu verwenden, da es das Entfernen des Stempels nach dem vollständigen Aushärten des MRE erschwert, wenn es die Kanten des Stempels bedeckt. Achten Sie auch darauf, die Richtung des Musters bei jedem Schritt anzugeben, damit der Stempel beim Entfernen aus dem MRE in die Richtung parallel zu den Mustern gezogen werden kann.
   6. Nehmen Sie das MRE aus dem Ofen.
   7. Bewegen Sie den beschichteten Stempel vorsichtig mit einer Pinzette, drehen Sie ihn mit der Vorderseite nach unten auf das teilweise ausgehärtete MRE und drücken Sie leicht.
   8. Den MRE mit dem gestrichenen Stempel auf der obersten Schiene über Nacht bei 60 °C in den Ofen schieben.
   9. Sobald er vollständig ausgehärtet ist, schneide den MRE mit einem Skalpell am unteren Rand des Stempels senkrecht zu den Mustern.
   10. Tragen Sie IPA auf die Schnittfläche um den Stempel auf.
       HINWEIS: Das IPA sollte in den Schnitt eindringen und sich unter dem Stempel zu bewegen beginnen.
   11. Ziehen Sie den Stempel mit einer Pinzette in Richtung parallel zu den Mustern vom MRE ab.

	Steifigkeitsbereich	Materialien	Beispiel Gewicht
Weicher	10–80 kPa	Öko (A+B)	11,25 g (A)	ca. 11,25 g (B)
		Silikon Verdünner	ca. 22,5 g
		Eisen-Partikel	45 Gramm
Steifer	60–120 kPa	527 PDMS (A+B)	18,75 g (A)	ca. 18,75 g (B)
		Eisen-Partikel	37,5 g
		184 PDMS (Basis+Aushärtung)	14,5 g (Basis)	0,5 g (Aushärten)

Tabelle 1: Beispielgewichte aller Materialien für die Herstellung von weicheren und steiferen MREs. Die Gewichte in der Tabelle sind für die Herstellung von insgesamt 90 g MRE-Material ausgelegt. Eine geringere Vorbereitung kann erreicht werden, indem alle Bestandteile im gleichen Verhältnis wie die Beispielgewichte in der Tabelle gemischt werden.

4. Vorbereitung der Zellkultur

HINWEIS: Die Vorbereitung von Zellkulturen umfasst die Auswahl der geeigneten Zelllinie, die Vorbereitung des Nährmediums mit den erforderlichen Nährstoffen und Wachstumsfaktoren und die Gewährleistung steriler Bedingungen, um eine Kontamination zu verhindern. Die Zellen werden in Kulturgefäßen plattiert und unter optimalen Bedingungen (in der Regel 37 °C mit kontrolliertem CO_{2 )} inkubiert. Regelmäßige Überwachung, Mediumwechsel und Passing werden durchgeführt, um ein gesundes Zellwachstum zu erhalten.

1. Sterilisieren Sie die Oberfläche des MRE, indem Sie es 3 Mal mit 70% Ethanol waschen und lassen Sie die dritte Wäsche 20 Minuten einwirken.
2. Waschen Sie die MRE-Oberfläche 3 Mal mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), indem Sie genügend Volumen hinzufügen, um das Gericht vollständig zu bedecken, und saugen Sie anschließend die gesamte Flüssigkeit ab.
3. Beschichten Sie die Oberfläche des MRE 1 h lang bei 37 °C mit Fibronektin (10 μg/ml) in PBS, um die Zelladhäsion am Gerät zu fördern.
4. Waschen Sie die MRE-Oberfläche 3 Mal mit PBS, ähnlich wie in Schritt 4.1.2.
5. Die Kardiomyozyten der neonatalen Ratte werden mit einer Dichte von 20.000 Zellen/^cm2 ausgesät.
6. Fügen Sie den Geräten vorübergehend Magnete hinzu, um die Matrix während der Zellkultur zu versteifen.
   HINWEIS: Seien Sie vorsichtig, wenn Sie Geräte mit Magneten in den Inkubator stellen. Die Geräte müssen weit voneinander entfernt platziert werden, um sicherzustellen, dass die Magnete nicht interagieren. Diese Studie empfiehlt die Verwendung von mit Edelstahl ausgekleideten Inkubatoren gegenüber mit Kupfer ausgekleideten Inkubatoren, da es weniger Wechselwirkungen gibt.

5. Färben und Bildgebung

1. Stationäre Zellbildgebung
   HINWEIS: Die Bildgebung stationärer Zellen umfasst mehrere wichtige Schritte, um bestimmte zelluläre Komponenten zu visualisieren. Zuerst werden die Zellen fixiert, um ihre Struktur zu erhalten. Als nächstes wird die Zellmembran permeabilisiert, um eine Färbungspenetration zu ermöglichen, gefolgt von einem Blockierungsschritt, um die unspezifische Bindung von Antikörpern oder Färbungen an unbeabsichtigte Stellen, wie z. B. andere Proteine oder Zelltrümmer, zu verhindern. Die Zellen werden dann mit Farbstoffen oder Antikörpern gefärbt, die auf bestimmte Moleküle abzielen, und überschüssige Flecken werden durch Waschen entfernt. Schließlich werden die gefärbten Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie abgebildet, um zelluläre Strukturen zu analysieren.
   1. Einmal mit 1x PBS waschen, indem Sie genug Volumen hinzufügen, um das Gericht vollständig zu bedecken, und anschließend die gesamte Flüssigkeit absaugen.
   2. Fixieren Sie die Zellen mit 4 % (v/v) Paraformaldehyd für 10 Minuten.
   3. Dreimal mit 1x PBS waschen (ähnlich wie in Schritt 5.1.1).
   4. 0,1% Triton X (in 1x PBS) zugeben und 5 Minuten inkubieren, um zu permeabilizieren.
   5. Dreimal mit 1x PBS waschen (ähnlich wie in Schritt 5.1.1).
   6. NH₄Cl (50 mM in 1x PBS) zugeben und 15 min zum Abschrecken inkubieren.
   7. Dreimal mit 1x PBS waschen (ähnlich wie in Schritt 5.1.1).
   8. Blockierungspuffer (5% BSA in 1x PBS) zugeben und 1 h bei Raumtemperatur (RT) inkubieren.
   9. Kombinieren Sie den primären Anti-α-Actinin-Primärantikörper im Verhältnis 1:200 mit 5 % BSA (in 1x PBS).
      HINWEIS: Mischen Sie den Antikörper gründlich.
   10. Geben Sie die primäre Antikörperlösung in die Probe.
       HINWEIS: Fügen Sie so viel hinzu, dass die gesamte Probe bedeckt ist.
   11. Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
       HINWEIS: Erwägen Sie, die Probe mit langsamer Geschwindigkeit auf die Wippe zu legen, damit sich die Lösungen besser vermischen können.
   12. Dreimal mit 1x PBS waschen (ähnlich wie in Schritt 5.1.1).
   13. Verdünnen Sie den Sekundärantikörper (555 Alexa Fluor Ziege Anti-Maus) in 1x PBS (1:2000).
       HINWEIS: Die Sekundärantikörper sind lichtempfindlich (Fluorophore). Wenn sie nicht direkt verwendet werden, stellen Sie sicher, dass sie abgedeckt und vor Licht geschützt sind.
   14. Geben Sie die Sekundärantikörperlösung in die Probe.
   15. 2 Stunden bei RT inkubieren.
   16. Dreimal mit 1x PBS waschen (ähnlich wie in Schritt 5.1.1).
   17. Fügen Sie DAPI (1 μg/mL in sterilisiertem, entionisiertem Wasser) hinzu und inkubieren Sie 5-10 Minuten im Dunkeln.
   18. Bilden Sie die Zellen mit einem aufrechten Mikroskop mit einer 20-fachen Tauchlinse ab.
   19. Nehmen Sie 50 Bilder pro Gerät auf.
   20. Verarbeiten Sie die Bilder mit einem ImageJ-Plugin namens Directionality.
       HINWEIS: Richtungsoptionen: In dieser Studie wurden n = 45 Bins im Bereich von 0° bis 176° verwendet, um einen Wrapping-Effekt zu vermeiden. Die verwendete Methode war die lokale Gradientenorientierung, und die Anzeigetabelle wurde ausgewählt. Die Richtungsausgabe entspricht dem mittleren Vektorwinkel (der den Ausrichtungswinkel angibt), während die Ausgabe der Güte die mittlere Vektorlänge (der den Grad der Ausrichtung angibt) darstellt.
2. Bildgebung von lebenden Zellen
   HINWEIS: Die Live-Zell-Bildgebung ermöglicht die Verfolgung dynamischer zellulärer Prozesse in Echtzeit, während die Zellen in ihrem natürlichen, lebendigen Zustand bleiben. Bei dieser Technik wird ein Fluoreszenzmikroskop verwendet, das mit einer Inkubationskammer ausgestattet ist, um hochauflösende Bilder oder Videos von Zellen aufzunehmen, während sie wachsen, sich teilen oder auf Reize reagieren. Dies ermöglicht die Untersuchung des zellulären Verhaltens und der Interaktionen im Laufe der Zeit und liefert wertvolle Einblicke in die zelluläre Funktion und Dynamik.
   1. Inkubieren Sie die Zellen mit SiR-Aktin im Verhältnis 1:1000 mit Kulturmedien für 1 h bei 37 °C.
   2. Aspirieren Sie das Medium und ersetzen Sie es durch 1:2000 (SiR-Aktin: Media).
      HINWEIS: Diese Verdünnung dient dazu, die Zelltoxizität für eine verlängerte Lebendbildgebung zu reduzieren.
   3. Sammeln Sie Immunfluoreszenzbilder alle 15 Minuten für 5 Stunden an einem aufrechten Mikroskop mit Inkubationskammer, automatisiertem Tisch und 20-facher Tauchlinse.
      HINWEIS: Für das Lebendzell-Imaging-Experiment wurde der Magnet hinzugefügt, sobald das MRE in das Live-Imaging-System eingesetzt wurde.

Ergebnisse

Ultraweiche magnetorheologische Elastomere (MREs) auf Silikonbasis verfügen über elastische Module, die durch Anlegen eines Magnetfeldes genau abgestimmt werden können. Dies ermöglicht schnelle, bidirektionale Anpassungen innerhalb eines physiologischen Bereichs mit präziser Kontrolle sowohl der Geschwindigkeit als auch des Ausmaßes der Veränderungen (Abbildung 1). Die Gelmechanik wurde durch Messung des Elastizitätsmoduls wie zuvor beschrieben bewertet, und...

Diskussion

Diese Technik wurde rigoros getestet, aber die sorgfältige Beachtung mehrerer Schritte ist für ein erfolgreiches Experiment unerlässlich.

In diesem Protokoll verwenden wir ein kommerzielles Beugungsgitter als Urform für die Strukturierung. Es können jedoch auch alternative gemusterte Formen - wie Silikon- oder SU8-Mikroformen - verwendet werden, um eine Vielzahl von Modellen in verschiedenen Größen^{zu erzeugen 33,35}

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
555 Alexa Fluor Ziegen-Antimaus-Sekundärantikörper	ThermoFisher Scientific	A-21422	https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Mouse-IgG-H-L-Cross-Adsorbed-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-21422
20x Dip-in-Objektiv	Zeiss	421452-9800-000	https://www.micro-shop.zeiss.com/zh/us/shop/objectives/421452-9800-000/Objective-W-Plan-Apochromat-20x-1.0-DIC-M27-75mm
35-mm-Schüsseln	ThermoFisher Scientific	130180	https://www.thermofisher.com/search/results?query=130180&focusarea=Search%20All
Anti-Alpha-Aktinin-Primärantikörper	abcam	EP2528Y	https://www.abcam.com/en-us/products/primary-antibodies/alpha-actinin-actn1-antibody-ep2528y-ab81265?srsltid=AfmBOoq4HwHixqCheQwwq VVbjJ3ogKUmZxa4GtG 3SyllFzWvb5XPnwgB
Carbonyl-Eisenpulver-Mikrosphären	chemicalstore.com	CIPMS	https://ironpowders.com/types-of-iron-powder/cipms-carbonyl-iron-powder/
DAPI-Fleck	ThermoFisher Scientific	D1306	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/D1306
Desiccator	Fisher Scientific	08-642-7	https://www.fishersci.com/shop/products/nalgene-transparent-polycarbonate-classic-design-desiccator/086427#?keyword=
Beugungsgitter	Thor Labs	GR2550-45031	https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=GR2550-45031
Ecoflex Gel Teil A & B	Smooth On	Ecoflex  GEL	https://www.smooth-on.com/products/ecoflex-gel/
Erweiterter Tabletop-Plasmareiniger	Sigma Aldrich	Z561657-1EA	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/z561657
Fibronektin aus Rinderplasma	Sigma Aldrich	F1141	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/f1141
Flacktek DAC150 SpeedMixer	Flacktek	DAC150	https://flacktek.com/products/small-flacktek/
ImageJ Software	NIH		https://imagej.net/ij/download.html
Isopropylalkohol	Amazonas		https://www.amazon.com/Isopropyl-Alcohol-Grade-Anhydrous-gallon/dp/B01M6YK5I4/ref=sr_1_1_sspa?dib=eyJ2IjoiMSJ9.xiBzaAiE5lSJqXz ZhS_JhDh8zEHgkMzrbsyosvyBpS Jjufk90Gt79vk1jOZxq_mG3GKeN8 KT1ulag3ZuMShbWoEOCQUy6txx uGz4709PyUY5YWyeR2GS0PBNx dbmEdWvgmCYiDBLf8E2prhImZW l98MoWlVDU4lg1BtcHTTSOwdg87 5l6Ia3YLPs_0alILBXFsizwwnJodR 8D60ZggK5AHBfCfPadXgfJ-9hUE7 uIto.V3Vf62Lnprtq2u5PRO SbUFHnPOj1FvD7np7uBge6NuU& dib_tag=se& hvadid=598724400239 & hvdev=c& hvlocphy=9007460& hvn etw=g& hvqmt=e& hvrand=1609157 209668794739& hvtargid=kwd-3203 62094308& hydadcr=5273_13 227703& Schlüsselwörter=isopropyl+Alkohol+ amazon& mCiD=9F9D3252906531 3EA89AB7766D9C244C& qid=1740 675756& sr=8-1-spons& sp_csd=d2l kZ2V0TmFtZT1zcF9hdGY& psc=1
Magnet	CMS-Magnetik	ND05578-45N	https://www.magnet4sale.com/n45-neodymium-disc-magnet-1-1-2x1-4-35-lb-pull-strong-magnet/
Nikon Eclipse 80i Standmikroskop	Nikon	Eclipse 80i
Ofen	Fisher Scientific	15-103-0503	https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-scientific-isotemp-general-purpose-heating-drying-ovens/p-4935382
Silikonverdünner	Smooth On	Silikonverdünner	https://www.smooth-on.com/products/silicone-thinner/
SiR Actin Stain	Zytoskelett	CY-SC001	https://www.cytoskeleton.com/sir-actin
Sylgard 184 PDMS (Basis + Härtemittel)	Ellsworth-Klebstoffe	2065622	https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-3.9-kg-kit/
Sylgard 527 PDMS Teil A & B	Ellsworth-Klebstoffe	1696742	https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-527-silicone-dielectric-gel-clear-0.9-kg-kit/
Transferpipetten	Fisher Scientific	13-711-5AMMD	https://www.fishersci.com/shop/products/transfer-pipette-32/137115AMMD?searchHijack=true&searchTerm=13 -711-5AMMD& searchType= RAPID& matchedCatNo=13 -711-5AMMD
Trichlor – (1H, 1H, 2H, 2H-Perfluoroctyl) Silan	Sigma Aldrich	448931	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/448931