Hochdurchsatz-Serielltomographie mit einem automatisierten probenverändernden Roboter

Summary

Die Implementierungsdetails und das Datenerfassungsverfahren für die synchrotronbasierte Röntgentomographie mit dem automatisierten probenverändernden Roboter der Diamond Light Source (DLS) I13-2 Imaging-Strahlenlinie werden hier vorgestellt und diskutiert. Dies verbessert den Durchsatz und die Datenerfassungseffizienz der Strahllinie drastisch.

Abstract

Dieses Manuskript beschreibt einen Workflow für die automatisierte Datenerhebung, der einen Roboterarm für den Probenaustausch nutzt, was die Effizienz der Datenerhebung erheblich verbessert. Das Setup, das für die Synchrotron-Röntgenbildgebung an der Diamond Light Source (DLS) I13-2 Imaging Beamline implementiert ist, nutzt einen Roboter, um Hochdurchsatz-Serielltomographie (3D) oder Bildgebung (2D) zu erreichen. Derzeit ist bei vielen Experimenten die Zeit für den manuellen Probenaustausch und -ausrichtung vergleichbar oder sogar übersteigt die Dauer des Tomographie-Scans selbst. Um die effiziente Nutzung der verfügbaren Strahlzeit zu maximieren und den experimentellen Durchsatz zu erhöhen, ist die Automatisierung des Probenaustauschs und der Ausrichtung unerlässlich. Die Verwendung des Roboters als Sample-Changer kann den Durchsatz im Vergleich zu manuellen Verfahren im Vergleich zu manuellen Verfahren um mindestens das 4- bis 10-fache erhöhen. Mit der Diamond II-Maschine und den I13L-Strahllinien Operando Coherent TO-Mographie und Ptychographic IMaging (OCTOPI)-Upgrades wird der erhöhte Röntgenfluss die experimentellen Scanzeiten weiter verkürzen und das System noch effizienter machen. Darüber hinaus ermöglicht die Automatisierung die Fernerfassung von Daten, einschließlich eines optionalen E-Mail-Dienstes für Nutzer. Automatisierte Probenzentrierung ermöglicht ein vollständig unbeaufsichtigtes Scannen, das aus der Ferne durchgeführt werden kann. Dies stellt ein einzigartiges und innovatives Merkmal des Systems dar. Dieses Manuskript beschreibt den vollständigen Vorgang, einschließlich Probenvorbereitung, Montage an speziellen Haltern, Transport zur Strahllinie und Platzierung auf den speziellen Tabletts für den robotischen Probenaustausch. Das Verfahren zur automatisierten Probenzentrierung und die anschließende Tomographie-Rekonstruktionspipeline werden vorgestellt.

Introduction

Automatisierung wird seit Jahrzehnten in der Schwerindustrie weit verbreitet eingesetzt ^1,2,3. Die Entwicklung von robotischer Hardware und Software ist jedoch so weit ausgereift, dass sie sehr heikle Aufgaben wie Genomsequenzierung, medizinische Operationen in Krankenhäusern oder die Unterstützung bei chemischen Experimenten 4,5,6,7 übernehmen kann. Automatisierung beseitigt nicht nur menschliche Fehler, sondern verbessert auch den Durchsatz und die Effizienz⁴.

Eine Synchrotron-Röntgenquelle erzeugt extrem helle und hochkohärente elektromagnetische Strahlung im breiten Spektralbereich von Infrarot bis zu harten Röntgenstrahlen. Diese Quellen ermöglichen Hochdurchsatz- und hochauflösende Bildversuche mit sehr kurzen Scanzeiten und hohen Statistiken. Die partielle Kohärenz kann genutzt werden, um einen besseren Kontrast für schwach absorbierende weiche Materialien wie Polymere oder Gewebeproben ^8,9,10 im Vergleich zu laborbasierten Röntgenquellen zu erzielen. Ein vollständiger Röntgentomographie-Datensatz – der die Visualisierung eines Objekts in echtem 3D ermöglicht – erfordert die Erfassung von Projektionen der Probe aus verschiedenen Winkeln. Fortschritte bei Quellhelligkeit, experimenteller Hardware und Steuerung ermöglichen Datenerfassungszeiten im Bereich von zig Sekunden bis Minuten⁸. Dadurch sind das Laden und die Ausrichtung der Proben zeitaufwändiger geworden als der Tomographie-Scan^{selbst 11,12}. Es ist wichtig zu beachten, dass der manuelle Probenwechsel in einem Synchrotrontomographie-Experiment eine erhebliche Zeit in Anspruch nehmen kann (im Vergleich zur Scanzeit), da beim Betreten und Schließen des Versuchsschranks ein Strahlenschutzverfahren eingehalten werden muss. Dieser Eingriff dauert in der Regel mehrere Minuten. Außerdem kann die Probenausrichtung auch einige Minuten in Anspruch nehmen.

Wenn dieser Prozess der Probenänderung und Probenausrichtung automatisiert wird, wird eine erhebliche Zeitreserve eingespart. Daher wurde ein Probenwechselroboter an der I13-2 Imaging-Strahllinie der DLS-Synchrotronanlage implementiert. Dieses Manuskript beschreibt das vollständige Protokoll zur Durchführung eines Synchrotron-Röntgen-Mikrotomographie-Experiments mit mehreren Proben unter Verwendung eines Probenwechselroboters an der I13-2-Bildstrahllinie ^11,12. Diese Implementierung verbessert nicht nur die Effizienz der experimentellen Zeit, sondern ermöglicht auch die Durchführung von Experimenten aus der Ferne. Die Alternative ist manueller oder halbautomatischer Betrieb, die beide deutlich langsamer sind. Hier bedeutet halbautomatisiert, dass der Roboter nur für den Probenaustausch ohne Probenausrichtung eingesetzt wird.

Die Bedeutung der Automatisierung wird durch Automatisierungsprojekte an anderen Synchrotronbildgebungsstrahlen unterstrichen, mit den ähnlichsten Projekten an der 2BM-Strahllinie von APS¹³, der SLS TOMCAT-Strahllinie¹⁴, der EMBL P14-Strahllinie auf PETRA III¹⁵ und der IMAGE-Strahllinie am Karlsruher Institut für Technologie (KIT) Light^{Source 16}. Im 2-BM APS sind die Proben, die mit einem Roboter gescannt werden müssen, auf einer standardmäßigen kinematischen Halterung montiert, die in einem Probenwechsler mit maximaler Kapazität von 60 Proben gleichzeitig platziert wird. Ein Greifarm nimmt dann die Probe und montiert sie auf der Rotationsbühne. Die Sample-Ausrichtung erfolgt jedoch offline mit einem Stereoskop. Ein ähnliches System wurde in der TOMCAT-Strahllinie in SLS installiert, wobei der Prozess hier vollständig automatisiert ist, der Probenlastentlastung, Ausrichtung, Scannen eines korrekten Interessenbereichs und Rekonstruktion durchführen kann. Die Gesamtzahl der Proben, die gleichzeitig gescannt werden können, beträgt 60. Kürzlich hat die P14-Strahllinie auf PETRA III¹⁵ ein Probenwechselsystem installiert, das weiche biologische Proben von etwa 1 mm Größe verarbeiten kann. Positionierung und Zentrierung erfolgen durch das Drei-Klick-Zentrierungsverfahren. An der IMAGE-Strahllinie am KIT ermöglicht eine Hochdurchsatz-Bild- und Tomographie-Endstation die Messung von bis zu 1.500 Proben innerhalb von zwei Tagen¹⁶. Im Gegensatz zu den oben genannten Robotersystemen kann das I13-2 Imaging Beamline-System derzeit Proben bis zu 8 mm Durchmesser verarbeiten und innerhalb einer achtstündigen Schicht bis zu 112 Proben messen, ohne menschliches Eingreifen, einschließlich automatischer Probenzentrierung.

Die aktuelle Tomographie-Einrichtung bei I13-2, Diamond-Manchester Imaging Beamline, wurde in der erwähnten^{Publikation 17} berichtet. Zur Vollständigkeit werden hier die wichtigsten Aspekte der Tomographie-Experimente zusammengefasst; bitte siehe auch Abbildung 1. Der Tomographie-Stufenstapel besteht aus einem Hexapod (PI miCos) zur Probenbearbeitung sowie zur Ausrichtung der Drehachse zur Neigung. Eine luftlagerfähige Rotationsstufe ist auf dem Hexapod montiert. Die Rotationsstufe weist ausgezeichnete Wackelbewegungen (<2,4 μrad) und axialen Fehler (<100 nm) auf. Das Tomographiedetektorsystem ist mit vier verschiedenen Vergrößerungen (oder Sichtfeld) ausgestattet. Für die aktuelle Studie wurden 1,25× (2,6 μm effektive Pixelgröße mit 6,7 mm x 5,6 mm Sichtfeld) und 4× (0,81 μm effektive Pixelgröße mit 2,1 mm x 1,8 mm Sichtfeld) Objektive verwendet. Das 1,25× Objektiv hatte einen 500 μm LuAg:Ce-Szintillator, während das 4x-Objektiv einen 100 μm LuAg:Ce-Szintillator (Crytur) hatte. Ein sCMOS-Detektor (pco.edge 5.5) zeichnet das vergrößerte Szintillationsbildschirmbild über ein zusätzliches 2x-Fotookular auf (alle Mikroskopoptiken stammen von Olympus). Die effektiven Pixel liegen zwischen 2,6 μm und 0,33 μm, mit etwa 1 μm Auflösung bei der höchsten verwendeten Vergrößerung. Der Detektorchip besteht aus 2560 x 2160 Pixeln mit einer Pixelgröße von 6,5 μm, und die maximale Ausleserate des Pixelarrays beträgt 100 Hz.

Protocol

HINWEIS: Diese Studie verwendet Insektenexemplare des Natural History Museum (NHM) in London für vergleichende phänotypische Analysen. Die Exemplare waren vom Naturhistorischen Museum erworben worden, wobei standardisierte Erwerbsverfahren durchgeführt wurden, um sicherzustellen, dass die Exemplare legal gesammelt und gespendet wurden.

1. Planung des Experiments

1. Überprüfen Sie die Machbarkeit der Durchführung von Tomographie- oder Bildversuchsexperimenten mit der interessierenden Probe an der I13-2-Strahllinie, indem Sie das Strahlleitungspersonal über den folgenden Link kontaktieren: https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Imaging-and-Microscopy/I13-2/Staff.html .
2. Reichen Sie einen Vorschlag ein, um einen Zeitfenster für die Durchführung des geplanten Experiments über den folgenden Link zu erhalten: https://www.diamond.ac.uk/Users.html.
3. Besprechen Sie die Probenvorbereitung und den Probenmessprozess mit dem Beamline-Personal, sobald der Vorschlag angenommen und das Experiment geplant ist. Experimente, die mit dem Roboter durchgeführt werden, haben bestimmte Anforderungen, die im nächsten Abschnitt (Abschnitt 2) aufgeführt sind.
4. Besprechen Sie die Abmessungen und die Zusammensetzung der Proben mit dem Beamline-Personal, um zu überprüfen, dass das Experiment an der Strahllinie erfolgreich durchgeführt werden kann.
5. Beginnen Sie rechtzeitig mit den Vorbereitungen für den experimentellen Besuch, indem Sie den Anweisungen auf der Website (https://www.diamond.ac.uk/Users.html) folgen.
6. Absolvieren Sie die Sicherheitsschulung vor der experimentellen Sitzung.

2. Probenvorbereitung (für Roboterexperimente)

1. Bereiten Sie SPINE-kompatible Sample Bases¹⁸ für die Probenmontage vor. Jede Probe wird auf eine SPINE-ähnliche Standard-Sample-Basis montiert, die mit einem Data-Matrix-Barcode ausgestattet ist, um eine automatisierte Probenverfolgung zu ermöglichen.
2. Fügen Sie die Probe mit einer von zwei Konfigurationen an die Basis an. Stiftmontage: Fixieren Sie die Probe auf einem SPINE-ähnlichen Probenstift (siehe Abbildung 1C, Einlage). Behälter oder Direktmontage: Platzieren Sie die Probe in einen kompatiblen Behälter, wie z. B. ein Mikrozentrifugenrohr/Polyimidröhrchen, oder direkt auf die Probenbasis.
3. Überprüfe die Maßverträglichkeit mit dem Robotergreifer, indem überprüft wird, ob die montierte Probe innerhalb der zulässigen Größengrenzen liegt, um sicheres robotisches Handling zu gewährleisten (siehe Abbildung 2):
   Option A: Passt in einen 8 mm Durchmesser x 20 mm hohen Zylinder.
   Option B: Passt in einen 3,5 mm Durchmesser x 33 mm hohen Zylinder.
4. Stellen Sie sicher, dass beide Konfigurationen auf der Sample-Basis zentriert sind. Stellen Sie sicher, dass die Gesamthöhe (Probe + Halterung + Sockel) je nach gewählter Konfiguration nicht 27 mm oder 40 mm überschreitet.
5. Wenn Sie Proben auf SPINE-Probenstifte montieren, stellen Sie sicher, dass die Probe auf dem Pin liegt, ohne dass ein Teil davon von der Stiftwelle verdeckt wird. Die Probe muss vertikal und zentral an der Stiftbasis montiert werden, um Kontakt mit dem Roboter-Greifer zu verhindern. Dies ist besonders wichtig für die in Protokollabschnitt 2.3 beschriebene Option-B-Montage sowie für verlängerte Proben, die auf den Probenstiften montiert sind.
6. Beim Einbau in Behältern oder Röhrchen sichern Sie die Probe fest im Behälter, damit sie sich beim Transport oder beim robotischen Umgang nicht verschiebt. Stellen Sie sicher, dass der Behälter selbst vertikal auf der Probenbasis ausgerichtet bleibt.
7. Befestigen Sie das gewählte Befestigungselement (Stift oder Behälter) sicher und vertikal auf der Probenbasis, um während des gesamten Experiments die Positionsstabilität zu gewährleisten.
8. Verwenden Sie eine zuverlässige Klebe- oder Sicherungsmethode, um Ablösungen während des Transports und automatisierte Manipulation zu verhindern, da beide Prozesse mechanische Belastungen verursachen können.
   HINWEIS: Gängige Klebstoffe sind Cyanoacrylat (Sekundenkleber), Paraffinwachs und Heißschmelzkleber. Konsultieren Sie das Beamline-Personal, wenn Sie unsicher bezüglich der Materialkompatibilität sind.
9. Überprüfen Sie, dass alle Proben in einer gleichmäßigen Höhe von der oberen Kante des Behälters oder auf dem Probenstift positioniert sind. Bei Proben, die in Behältern montiert sind, sollte der seitliche Abstand zur Behälterwand über alle Proben hinweg gleich sein.
   HINWEIS: Eine gleichmäßige Positionierung ist für eine zuverlässige automatische Ausrichtung unerlässlich. Kleinere Proben relativ zum Sichtfeld ermöglichen eine größere Toleranz.
10. Dokumentieren Sie den Datenmatrix-Code, der jeder Probe zugeordnet ist, um eine korrekte Stichprobenidentifikation während der Datenanalyse sicherzustellen.
11. Generiere eine samples.csv Datei, um jeden Probennamen mit dem Basisdatenmatrixcode der Sample-Datenbank zu verknüpfen und die für die Durchführung von Tomographie-Scans relevanten Parameter weiterzugeben.

3. Musterverpackung und Lieferung

1. Spätestens 15 Werktage vor der experimentellen Sitzung reichen Sie die experimentelle Risikobewertung (ERA) ein und melden Sie dort alle Proben. Diese ERA muss von der DLS-Gesundheits- und Sicherheitsgruppe (HSE) genehmigt werden, bevor Proben verschifft oder auf die Baustelle gebracht werden dürfen.
2. Verwenden Sie die universelle Sample-Basis mit dem proben-pin-montierten Kombinationsspeicher und/oder Versandcontainer, auch Uni-puck genannt. Das ist ziemlich wichtig, wenn man per Post versendet.
3. Wenn Proben nicht in die in Schritt 3.2 genannten Probenschlitzen des Aufbewahrungsbehälters passen, treffen Sie bitte alternative Montageanordnungen vor, z. B. durch magnetische Schutzkappen, die auf die Probenbasis passen, und bringen die Proben direkt zur Messung.

4. Versuchsaufbau

1. Passen Sie die Röntgenquellenparameter an, um den Kontrast in der Probe zu maximieren. Um dies zu erreichen, verschieben Sie das Vollspektrum und/oder filtern Sie das Röntgenspektrum.
2. Optimieren Sie die Kamera auf Abtastdistanz basierend auf dem Röntgenspektrum und dem gewünschten Phasenkontrast für eine gegebene Probe.
3. Wählen Sie die Vergrößerung des Mikroskops basierend auf der Stichprobengröße und dem erforderlichen Sichtfeld und wählen Sie das entsprechende Mikroskopobjektiv.
4. Richten Sie die horizontale Position der Kamera (X-Achse im Labor) in Bezug auf den Röntgenstrahl aus.

5. Probenlade- und Ausrichtung

1. Überprüfen Sie zu Beginn jeder Versuchssitzung die Proben und die Montage gründlich auf beschädigte oder lose montierte Proben. Informieren Sie die Nutzer über solche Stichproben.
   HINWEIS: Derzeit ist die Strahllinie mit Halterungen für bis zu 7 Pucks ausgestattet, und jeder Puck kann bis zu 16 Proben aufnehmen. Insgesamt können während eines einzelnen Roboterlaufs 112 Proben gemessen werden. Bitte siehe ergänzende Abbildung 2, die zeigt, wie man die Positionen des Puck-Slots (Pins) identifiziert.
2. Montiere Samples auf die jeweiligen Puck- und Puck-Slots (Pins), wie sie in der samples.csv-Datei identifiziert sind. Führen Sie einen Trockenlauf des Probenaustauschverfahrens des Roboters an einigen Proben durch, um die Funktionsweise des Roboters zu testen und sicherzustellen, dass die Proben den erforderlichen Spezifikationen entsprechen.
3. Verwenden Sie eine Probenbasis mit einem Probenpin (ohne Probe), um die Rotationsachse der Rotationsstufe in horizontaler Richtung mit dem Mittelpunkt des Detektors auszurichten.
4. Bewegen Sie die Oberseite des Stifts in die Mitte der Röntgenkamera (Abbildung 3A). Richten Sie die Teleskopkamera (TC), die wie im Bild (Abbildung 3) 90° zum Strahl eingestellt ist, so aus, dass sie im Zentrum des Sichtfelds (FOV) steht. Bestimme die Koordinaten dieser Position in TC-Pixelkoordinaten.
5. Aktualisieren Sie die Sample-Zielposition im Skript, das die Sample-Ausrichtung übernimmt.
6. Stellen Sie eine repräsentative Probe an. Führe das automatische Sample-Ausrichtungsskript aus, um die Probe im Rotationszentrum des TC zu platzieren. Der Link zum Skript ist in Supplementary File 1 bereitgestellt.
7. Überprüfen Sie, ob der Probenbereich von Interesse (ROI) im Sichtfeld (FOV) der Röntgenkamera zentriert ist.
8. Wenn die ROI nicht im Sichtfeld zentriert ist, wiederholen Sie die Schritte 5,5 bis 5,7 und verfeinern Sie die Probenausrichtung, indem Sie die Koordinaten für die Zielposition ändern.
   HINWEIS: Die Abschnitte 4 und 5 werden vom lokalen Kontakt ausgeführt, mit Ausnahme von Abschnitt 4.2.

6. Datenerfassungseinrichtung

1. Überprüfen Sie, ob die erforderliche Datei-/Ordnerstruktur im DLS-Dateisystem erstellt wurde, um Rohdaten, Metadatendateien und Analyseergebnisse zu speichern.
2. Kopiere die samples.csv-Datei in den in Schritt 6.1 genannten Ordner.
3. Aktualisieren Sie die Belichtungszeit der Kamera und die Anzahl der Projektionen, die im samples.csv aufgenommen werden sollen, basierend auf der Probenstruktur und dem gewünschten Kontrast.
4. Definieren Sie zwei Gruppen von Motorpositionen, die Ladeposition (LP) und Scanning Position (SP) genannt werden. LP ist das Set, bei dem die Stufen für das Laden der Proben optimiert sind, und das SP für die Tomographie-Scanning der Probe.
   HINWEIS: Abschnitt 6 wird vom lokalen Kontakt ausgeführt oder automatisch von den DLS-Systemen erstellt.

7. Datenerhebung durchführen

1. Montiere alle Proben an den richtigen Puck- und Pinpositionen, wie in der samples.csv-Datei angegeben.
2. Für die Datenerhebung verwenden Sie die Generic Data Acquisition (GDA) Workbench, eine Open-Source-Software, die von DLS (https://alfred.diamond.ac.uk/documentation/manuals/GDA_User_Guide/master/introduction.html) entwickelt wurde. Es handelt sich um ein Java-basiertes System, das in DLS zur Steuerung von Experimenten und Datenerfassung verwendet wird. Ein Screenshot ist in ergänzender Abbildung 1 enthalten.
3. Verwenden Sie in GDA ein Objekt namens Tomomatic für den automatischen Probenwechsel, die Probenausrichtung und die Tomographiemessung.
4. Gib den Befehl tomomatic.load (/dls/i13/data/year/... samples.csv) im GDA-Terminal, um die Datei zu laden. Dann geben Sie den Tomomac aus. scannen () zum Ausführen des Befehls.
5. Der Roboter nimmt die Probe zunächst aus dem Ladebrett und bringt sie zum Laser-Barcodeleser. Nachdem der Barcode ausgelesen wurde, wird die Probe in die Tomographie-Phase gebracht und montiert. Stellen Sie sicher, dass der gesamte Prozess reibungslos verläuft.
   HINWEIS: Hier wird ein Yaskawa-Roboter mit dem hauseigenen Flexur-Gripper verwendet.
6. Sobald das Sample-Laden durchgeführt wurde, bewegen sich die Stufen in die SP-Position. Anschließend wird die Funktion autoCentrePin im tomomatischen Skript ausgeführt, die die Probe ins Rotationszentrum (COR) bringt. Die Röntgentomographie-Messung mit einem Roboterprobenwechseler ist nun bereit zur Durchführen.
   HINWEIS: Bitte prüfen Sie die Supplementary File 1 auf den Pseudocode des Tomomatik-Skripts.
7. Führen Sie die TomoFlyscan-Funktion für die Tomographiemessung durch. Die Funktion sammelt zunächst 40 Projektionsbilder ohne Röntgenstrahl, das als Dunkelbild (DI) bezeichnet wird, und 40 Bilder mit Röntgenstrahl, aber ohne Probe im Strahl, was als Flachfeldbild (FI) bezeichnet wird. Diese Bilder werden während der Datenrekonstruktion zur Bildnormalisierung verwendet.
8. Sammeln Sie Projektionsbilder (PI) mit der Probe im Strahl bei Rotationswinkelintervallen der Proben, wie in der samples.csv-Datei angegeben. Für den vorliegenden Fall verfügt er über 3001 PI-Bilder.
   HINWEIS: Alle Schritte, von 7,5 bis 7,8, gehen nacheinander ohne menschliches Eingreifen voran.

8. Zugriff auf die Daten und Analyse

1. Greifen Sie auf die gespeicherten Daten zu, indem Sie das entsprechende Dateisystem und den entsprechenden Ordner durchsuchen. Die im vorherigen Abschnitt erwähnten gescannten Daten werden in zwei verschiedenen Dateien gespeichert, eine mit *.nxs und einer *.hdf-Datei, wobei * eine numerische Zahl ist, zum Beispiel: 123456.nxs und 123456.hdf. Das NXS enthält die Metadaten für den Scan, während das HDF alle Projektionsbilddaten (verknüpfte Daten von NXS) enthält.
2. Verwenden Sie die Savu-Rekonstruktionspipeline¹⁹ , um 2D-Schnitte aus Projektionsbildern zu erzeugen.
3. Zugriff auf und visualisieren Sie die rekonstruierten Bilder mit 3D-Rendering-Software wie AVIZO/ImageJ.
   HINWEIS: Der Abschluss der Abschnitte 7 und 8 erfordert koordinierte Maßnahmen sowohl von Nutzern als auch von lokalen Kontakten, wobei jeweils einzelne Unterschritte durchgeführt werden.

Results

Abbildung 1 zeigt den Yaskawa GP7 Sample-Changer-Roboter, der auf der Diamond I13-2 Imaging Beamline installiert ist. Abbildung 1A zeigt den Roboter (1) und den hauseigenen Flexur-Gripper (2). Dieser Greifer kann eine Probe mit einem Durchmesser von ≤ 8 mm aufnehmen. Abbildung 1B zeigt den Roboter (1) und das Optik-/Röntgenkamerasystem (4) und (6), die zur Tomographie-Datenerfassung verwendet werden. Der Roboter-Greifer nimmt die Probe aus dem Probenfach (3), das 7 Uni-Pucks mit jeweils 16 Proben aufnehmen kann, wie in Abbildung 1C gezeigt. Die Proben werden auf dem Aluminiumstab (5) montiert, und die Tomographie-Datenerfassung erfolgt mit dem Detektorsystem (6). Die Details von (5) und (6) werden im letzten Absatz des Einleitungsabschnitts dargelegt. Die rote gebrochene Linie in Abbildung 1B zeigt die Richtung des Röntgenstrahls an.

Details des Mustermontageschemas und des Flexur-Gripper-Designs sind in Abbildung 2 dargestellt. Abbildung 2A zeigt eine zylindrische Kunststoffprobe, die durch 3D-Druck gefertigt und auf die Probenbasis geklebt wurde. Der Rand der Probe stellt die Hüllkurve der maximalen Probengröße und den Durchmesser dar. Die roten Pfeile zeigen die Position an, an der der Flexurgripper die Probenbasis hält, um sie vom Probetablett in die Tomographiephase zu bewegen und umgekehrt. Ein 3D-Design des Flexur-Grippers ist in Abbildung 2B dargestellt. Die Finger des Greifers werden durch ein pneumatisch gesteuertes Antriebsrohr betätigt (Abbildung 1B, Punkt 2). Der zentrale Raum im Greifer hat einen Durchmesser von 8,9 mm, wie in Abbildung 2C dargestellt, was eine maximale Probengröße von 8 mm mit einem Rand von ~1 mm ermöglicht. Abbildung 2D zeigt das Bild des oberen Teils der Tomographie-Stufe. Auf den beiden orthogonalen Stufen und einer magnetischen Scheibe ist ein Aluminiumstab montiert, der einen exakten Durchmesser hat, sodass die Vertiefung am Boden der Probenbasis passt. Da diese Scheibe magnetisch ist, hält sie die montierte Probebasis während der Tomographiemessungen fest an Ort und Stelle.

Für dieses repräsentative Experiment wurden 64 Insektenproben ausgewählt, bereitgestellt vom Natural History Museum (NHM) in London. Die Exemplare wurden ausgewählt, um eine Reihe von Gliederfüßerphänotypen darzustellen und dabei innerhalb der Größenbeschränkungen des Greifers zu passen. Da Gliederfüßer, insbesondere Insekten, die überwiegende Mehrheit der bekannten Artenvielfalt mit über 1 Million benannten Arten ausmachen, ist es besonders schwierig, sie für vergleichende Phänotypstudien zu beproben. Die vorliegende Probe zeigt daher das Potenzial dieses Ansatzes, indem drei Klassenkladen von Gliederfüßern untersucht werden: Arachnida, Entognatha und Insekten, sowie feiner Proben innerhalb von Insekten, um Variationen in sieben Ordnungen zu erfassen, darunter vier der artenreichsten heute lebenden Ordnungen. Die Proben wurden mit Kleber auf einer Karte befestigt. Die Karten wurden dann an den Sample-Pins montiert. Das direkte Anbringen von Proben (Insekten) an den Probenstiften wird vermieden, da eine stark absorbierende Struktur im Strahl mit Probenabnahmen während der Rekonstruktionen Streifenartefakte erzeugt und es schwierig ist, sie sicher an Probenstiften zu montieren. Tabelle 1 zeigt die Vorlage samples.csv Datei, die der Benutzer mit den erforderlichen Parametern für die Tomographie ausfüllt (Spalten A, B, C, E, F, G, H, K). Die Beschreibung jeder der Spalten ist in der Tabelle enthalten. Die Säulen D, I, J und L im input_file werden nach Ausrichtung und Optimierung der Tomographieparameter an der Strahllinie aufgefüllt. Alle 64 Proben wurden zunächst mit einem 1,25-fachen Objektiv (Sichtfeld von 6,7 mm x 5,6 mm) auf einer optimierten Röntgenausbreitungsdistanz (von Probe zum Detektor) gemessen, später wurden dieselben Proben mit einem 4-fachen Objektiv unter Verwendung eigener optimierter Parameter gemessen. Sobald die Proben auf die Probenschale geladen und der Versuchsbehälter gesichert ist, wird der Scan mit GDA gestartet.

Die automatische Ausrichtung der Probe erfolgte durch ein in Python geschriebenes Skript (Speicherort der Datei auf GitHub: https://gist.github.com/ndg63276/9b3c5cfe7db26b14930dff3ef889e2bc). Zunächst wird die Probenausrichtung mit einer Kombination aus einer Probenbasis und einem Probenstift ohne die Probe eingerichtet. Abbildung 3 zeigt den Probenstift, wie er von der Seitenkamera des Teleskops (Kamera in 90° Entfernung zum Röntgenstrahl – Abbildung 1B, Punkt 4) zu sehen ist, der als Standardausrichtungsprobe verwendet wird. Das Bild der Teleskopkamera ist binarisiert, sodass die Probe aus dem Hintergrund erkannt werden kann. Die Kanten der Probe werden bestimmt und als weiße Rand markiert, wie in Abbildung 3 dargestellt. Die Referenzkoordinatenposition der Probe ist die Oberseite des Pins, der als weißer Kreis in Abbildung 3A markiert ist. Betrachtet man das Röntgenbild, wird der ROI der Probe auf dem COR positioniert, und die erforderliche Zielkoordinatenposition, markiert als blaues Doppelkopf-Pfeilkreuz mit rotem Punkt (Abbildung 3B), wird auf der Seitenkamera bestimmt. Diese Zielpositionseinstellung erlaubt es, die Probe nicht nur auf die COR zu legen, sondern bei Bedarf auch einige mm höher, tiefer oder etwas außerhalb der Mitte. Nachdem die Probe auf der Tomographiestufe geladen wurde, wird die automatische Zentrierungsfunktion ausgeführt. Das Skript bewegt die Probe zunächst zur Zielposition (Abbildung 3B) und bewegt sich auf 0°. Anschließend bewegt sie die Probe auf 90° (Abbildung 3C) und bestimmt, wie viel Probe bewegt werden muss, um die Probe in den Rotationsmittelpunkt (COR) zu bringen. Das dauert normalerweise etwa 15-20 Sekunden. Die Probe befindet sich nun im COR (Abbildung 2D), und COR wurde bereits mit dem Zentrum der Kamera ausgerichtet. Das System ist nun bereit für die Tomographie-Erfassung.

In dieser NHM-Insektenstudie wurden 128 Tomographie-Scans ohne menschliches Eingreifen durchgeführt. Die Messung dauerte insgesamt 17 Stunden. Jeder Scan dauerte etwa 8 Minuten. Ein solches Experiment ohne den Einsatz des Roboters hätte pro Tomographie-Scan etwa 20 bis 25 Minuten gedauert. Das bedeutet, dass Tomographie-Scans mit Robotern 3-4-mal schneller sind als manuelle Scans im vorliegenden Fall. Tabelle 2 zeigt eine typische Logdatei, die am Ende eines Roboter-Batch-Scans erstellt wird, einschließlich der Parameter, die erforderlich sind, um jede Scannummer mit der entsprechenden Probe zu verknüpfen. Weitere Details finden sich in der Legende Tabelle 2 .

Abbildung 4 zeigt normalisierte Projektionsbilder einer der Proben, eines Insekts (Klasse – Insekten, Ordnung – Coleoptera), aufgenommen während des oben erwähnten Tomographie-Experiments mit 1,25- und 4-facher Vergrößerung. Die oberste Zeile, Abbildung 4A-C, zeigt eine Stichprobe mit 1,25x, und dann wurde dieselbe Probe mit 4x abgebildet, also Abbildung 4D-F. Abbildung 4 A–F zeigt die Projektionsbilder, die bei 0°, 90° und 180° aufgenommen wurden. Das gelbe Rechteck zeigt das Sichtfeld der herangezoomten Projektionsbilder, die mit einem 4x-Objektiv aufgenommen wurden. Es ist wichtig zu beachten, dass nach dem Laden der Proben auf dem in Abbildung 1C gezeigten Tablett alle Prozesse ohne menschliches Eingreifen verliefen. Bitte beachten Sie, dass diese beiden Scans im Abstand von ~8,5 Stunden aufgenommen wurden. Dies zeigt die Stabilität und Reproduzierbarkeit des Setups an.

Abbildung 5 zeigt horizontale oder transversale Schnitte aus dem Set der Tomographie-Rekonstruktionsschnitte der in Abbildung 4 erwähnten Probe. Sowohl die 1,25x (Abbildung 5A) als auch die 4x (Abbildung 5B) Schnitte werden ohne Bildzuschneiden dargestellt und haben 2510 x 2510 Pixel. Die Schnitte sind gut im Sichtfeld zentriert, was zeigt, dass das Zoomen in einen Bereich mit höherer Vergrößerung ohne physische Eingriffe möglich ist.

Die hier präsentierten Ergebnisse zeigen, dass die Implementierung eines robotischen Systems für den Probenaustausch in Synchrotron-Mikrotomographie-Experimenten mehrere bedeutende Vorteile bietet. Dazu gehören eine erhöhte Durchsatzleistung, eine verbesserte Betriebseffizienz und die Möglichkeit, Scans mit mehreren Vergrößerungen (Zoom-in) ohne menschliches Eingreifen durchzuführen. Angesichts der Anzahl der Proben, die gescannt werden müssen, wie in der hier vorgestellten NHM-Studie, wäre es unmöglich, durch manuelles Scannen statistisch robuste und konsistente Schlussfolgerungen zu erzielen.

Abbildung 1: Bild des Roboters und des Tomographie-Experimentalsystems, das in der I13-2-Strahllinie installiert ist. (A) Der Roboter (1) mit einem hausintern entwickelten Flexur-Gripper (2). (B) Das Probenladefach (3) und die Tomographie-Stufe (5). Die optische Kamera (Teleskopkamera), angegeben als (4), wird verwendet, um die Proben auf die COR auszurichten. Das für die Messung verwendete Detektorsystem (6) enthält mehrere motorisierte Objektive zur automatischen Änderung des Sichtfelds sowie einen pco.edge 5.5-Detektor. Der rot gestrichelte Pfeil stellt die Richtung des Röntgenstrahls dar. (C) Bild des Probenladetrays mit 7 Pucks, und jeder Puck kann bis zu 16 Proben aufnehmen, die auf einer Kombination aus Probenbasis und Probenstiften montiert sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: Details zum Mustermontageschema und des Flexurengripper-Designs. (A) Bild einer 3D-gedruckten Kunststoffdummy-Probe, die auf einer Probenbasis montiert ist und die maximale Probenhülle darstellt, die vom Flexur-Gripper bewältigt werden kann. Die roten Pfeile zeigen die Position an, an der der Greifer die Probenbasis hält. (B) 3D-Design des Flexur-Grippers. Die Finger des Greifers werden so betätigt, dass sie die Probenbasis halten oder loslassen. (C) Vertikale Schnittzeichnung des Greifers mit Maßen. Die maximale Öffnung in der Mitte beträgt 8,9 mm; daher beträgt die maximal zulässige Stichprobengröße ≤ 8 mm. (D) Bild der Oberseite der Tomographie-Stufe. Ein Aluminiumstab (angezeigt durch den blauen Pfeil) ist oben an den beiden orthogonalen Stufen montiert. Eine magnetische Scheibe wird am oberen Rand des Stabs befestigt, auf dem die Probebasis (mit der Probe) vom Greifer positioniert ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3: Schnappschüsse aus dem Videograph des COR-Ausrichtungsverfahrens mit der Seitenteleskopkamera. (A) Bild des Ausrichtungsstifts kurz vor Beginn der Ausrichtungsroutine. Das blaue Doppelkreuz mit zentralem rotem Punkt ist die Zielposition, die mit dem COR der Tomographie-Rotationsstufe zusammenfällt. Das Inset zeigt das vergrößerte Bild des oberen Teils des Pins, das das erkannte Probenzentrum sowohl in Höhe als auch in der Breite zeigt. (B) Stift auf die Zielposition auf 0° ausgerichtet. (C) Stift auf 90° gedreht, und er ist aus der Zielposition. (D) Stift auf die Zielposition in 90° ausgerichtet. Nun ist der Stift in beide orthogonalen Richtungen ausgerichtet; daher dreht sich die Probe im Zentrum der Kamera. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4: Normalisierte Projektionsbilder eines Insekts, gesammelt mit einem 1,25- und einem 4x-Objektiv. Das Insekt gehörte zur Klasse Insekten, Ordnung Coleoptera. Das entspricht zwei von 128 Tomographie-Scans. Das Insekt wurde auf ein Papier geklebt und an der Probenadel befestigt. Projektionsbilder mit 1,25x Objektiv befinden sich bei (A) 0°, (B) 90°, (C) 180° und 4x bei (D) 0°, (E) 90° und (F) 180°. Der Satz von 1,25- und 4x-Tomographie-Scans wurde in einer einzigen Sitzung ohne menschliches Eingreifen durchgeführt. Eine Bildreihe mit 1,25x bietet eine vollständige Ansicht der Probe, und eine 4x-Bildreihe zeigt die Zoomfähigkeit. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 5. Vergleich eines identischen tomographischen Schnitts, der mit zwei verschiedenen Sichtfeldern aufgenommen wurde. Ein einzelner rekonstruierter Ausschnitt aus der Tomographie der Projektionsbilder in Abbildung 4 für (A) 1,25x und (B) 4x Vergrößerungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Tabelle 1: Typische samples.csv Datei, die der Benutzer bereitstellt und Tomographieparameter enthält. Diese Datei wird vom tomomatischen Python-Skript gelesen, das für die Datenerfassung verwendet wird. Die Spalten A (Beschreibung der Probe), B (Puck-ID), C (Slot im Puck), E (Tomographie-Rotationsschritt), F (Anzahl der FI), G (Anzahl der DI), H (zu verwendende Vergrößerung) und K (Slot-Priorität) werden vom Benutzer ausgefüllt. Die Spalten D (Belichtungszeit), I (Röntgenausbreitungsdistanz zwischen Probe und Kamera), J (Kamerabewegung über den Strahl zur Platzierung des COR in die Mitte der Kamera) und L (Barcode der Probenbasis) werden nach der Ausrichtung und der vorläufigen Optimierung ergänzt. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Typische Ausgabe-Logdatei, die als Output_file.txt gespeichert wird, nachdem alle Proben gescannt wurden. Die Datei meldet alle Eingabeparameter und liefert zusätzlich den Barcode der gescannten Probe (Spalte M), den Pfad zu den gescannten Metadaten und Bilddateien (Spalte N) sowie die Position des Motors, der zur Erfassung von FI verwendet wird (Spalte O). Im Grunde liefert diese Ausgabedatei die notwendigen Informationen für die Datenrekonstruktion und -analyse. Da in Spalte A der Eingabedatei keine Eingabe angegeben war, wird diese Spalte mit der aktuellen Anzahl des Scans sowie Puck- und Pin-Nummern gefüllt. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzende Datei 1: Pseudocode, der das Skript beschreibt, das den Roboter als Sample-Changer bedient. Die Datei beschreibt die Routine für die automatische Mustermontage, das Lesen von Datenmatrixcodes, die automatische Ausrichtung der Proben und die Ausführung eines Tomographiescans. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 1: Screenshot der generischen Datenerfassungs-GUI. Diese Schnittstelle ermöglicht die Anpassung grundlegender Kameraparameter, die Live-Visualisierung der Probe und die Initiierung von Tomographie-Aufnahmen. Scans können über die Bildschirmtaste (nur manuelles Scannen) oder über die Kommandozeile gestartet werden, die durch das gelbe Rechteck unten in der Mitte des Screenshots angezeigt wird. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Fotografie des SPIN-Standard-Pucks (links) und der Puckkappe (rechts). Die in Rot dargestellten Stiftpositionen, auf denen die Probenbasen montiert sind, sind ausgehend von der Position gegenüber der Kerbe am zentralen Haltepfosten nummeriert. Die Nummer 7267 (weiß markiert) ist die Puck-Identifikationsnummer. Die Puckkappe kann am Puck montiert werden, um Proben während des Transports oder der Lagerung zu schützen. Bitte stellen Sie sicher, dass die Stichprobengrößen kompatibel sind, bevor Sie versuchen, die Kappe zu montieren. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Probenvorbereitung und Probenausrichtung sind zwei entscheidende Schritte, damit der automatische Probenwechselroboter korrekt und effektiv funktioniert.¹¹. Die Stichprobengröße und die Montageanforderungen sind in Abschnitt 2 (Protokoll) angegeben. Im Grunde muss der Probendurchmesser 8 mm oder weniger betragen und gut auf der Probenbasis¹² zentriert sein. Diese Einschränkung wird durch die Gripper-Dimensionen festgelegt. Außerdem müssen alle Proben in einer einzigen Messung auf derselben Höhe liegen, damit die Positionierung der Proben im Rotationszentrum über alle Proben hinweg einheitlich ist. Wenn der Roboter für ein Experiment ausgerichtet wurde, ist das Durchführen eines weiteren Experiments mit dem Probenwechsler vollständig automatisiert, mit Ausnahme der Festlegung des Interessenbereichs für die Probe. Dies wird im Abschnitt mit repräsentativen Ergebnissen, Abbildung 3, erklärt. Es ist auch wichtig zu beachten, dass dies Teil des Ausrichtungsprozesses ist, der vom Strahlleitungspersonal (lokaler Kontakt) durchgeführt wird. Sobald dies gesetzt ist, werden alle Probenmessungen ohne menschliches Eingreifen durchgeführt. Aus Sicht des Nutzers sind die Messungen vollständig automatisiert. Bis heute werden nur Probenbasen und Probenstifte von Molecular Dimensions Ltd verwendet; es gibt jedoch auch andere Anbieter wie MiTeGen und Hampton Research, die SPIN-ähnliche Sample-Basen und Sample Pins herstellen.

Größere Probengreifer, die Proben mit bis zu 12 mm Durchmesser aufnehmen können, befinden sich derzeit in Entwicklung und Tests. Dadurch kann der Roboter größere Proben verarbeiten, wie sie beispielsweise in Mikrozentrifugenröhren platziert und auf einer Probenbasis montiert sind. Ein verbessertes Gripper-Design könnte einen Mechanismus beinhalten, der sich der Probe von der Seite nähert und so die aktuellen Beschränkungen für die Stichprobengröße aufhebt. Darüber hinaus wird die Aufrüstung der Strahlleitung den Durchsatz um eine Größenordnung erhöhen, was das Scannen von mehr als 3.000 Proben pro Tag ermöglicht. Dies wiederum ermöglicht die Sammlung statistisch signifikanter Datensätze mit etwa 30.000 Proben innerhalb von 10 Tagen nach der Strahlzeit. In naher Zukunft werden wir eine neue Tomographie-Rekonstruktionspipeline namens HTTomo implementieren.

Es sollte beachtet werden, dass Parameter wie die Ausbreitungsentfernung des Strahls (Probe-zu-Detektor-Entfernung), Belichtungszeit, Anzahl der Projektionen usw. im Voraus optimiert werden müssen, wie bei jedem anderen Synchrotron-Röntgentomographie-Experiment. Eine weitere Einschränkung ist, dass die im Experiment beteiligten Phasen, wie 6-Achsen-Probenmanipulation, Tomographiestufen und Kamera-Manipulationsstufen, an einer bestimmten definierten Position für das Laden und Entladen der Probe sein mussten. Das bedeutet, dass die Stufen beim Laden und Entladen der Proben hin und her bewegt werden müssen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass eine Hochdurchsatztomographie mit Hilfe des Probenaustauschroboters durchgeführt werden kann, wodurch der Prozess mindestens 4- bis 10-mal schneller wird und die Totzeit im Vergleich zum manuellen Betrieb reduziert oder eliminiert wird. Experimentelle Automatisierung mit Robotern ermöglicht es uns auch, Personal effizienter einzusetzen, da weniger Personen für die Messungen benötigt werden. Die Messung statistisch signifikanter Datensätze ist für viele wissenschaftliche Bereiche wichtig, in denen ein zuverlässiges und ausreichendes Datenvolumen erforderlich ist, um den wissenschaftlichen Fall abzudecken. Der Einsatz eines Roboters kann bei solchen Aufgaben erheblich helfen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Luftlager-Rotationsbühne	Aerotech, Inc.	https://www.aerotech.com/wp-content/ uploads/2021/01/abrt-data-sheet.pdf	Tomographie-Rotationsbühne
AVIZO	ThermoFisher scientific		Kommerzielle Datenvisualisierungs- und Analysesoftware
Cryocap -MiTeGen	MiTeGen LLC	https://www.mitegen.com/product/ reusable-goniometer-base-styles/	Alternativer CryoCap-Anbieter
CryoCap-Hampton research	Hampton research	https://hamptonresearch.com/ product-CrystalCap-SPINE-HT-445.html	Alternativer CryoCap-Anbieter
Cryocaps( MD7-401) und Cryopins(MD7-410)	Calibre Scientific	https://www.moleculardimensions.com/ products/magnetic-cryovials-and-cryocaps	Zum Befestigen von Proben verwendet
Detektor-Optik	Olympus/Evident Scientific	https://evidentscientific.com/en/objective-finder? creative=651972731238&keyword =olympus+objectives&matchtype= e&network=g&device=c&campaign id=19865307548&adgroupid=144 087466781&gad_source=1&gad_ campaignid=19865307548&gbraid =0AAAAADMIOOmWDa2WC5VP2 Ngxlqao8dyWe&gclid=Cj0KCQiAhtv MBhDBARIsAL26pjFYUqjLVZ1Miz p2W7eGzD2SEPNTjxiA87Dry6un 1Fx6GplHQjuBR94aAs1xEALw_wcB	Objektiv und Foto-Okular
GDA	Diamond Light Source Ltd.	https://www.diamond.ac.uk/Users/Experiment -at-Diamond/IT-User-Guide/Software/Data-Acq/GDA.html	Generische Datenerfassungssoftware
Hexapod	PI miCos GmbH	https://www.physikinstrumente.co.uk/en/pro ducts/6-axis-hexapods-parallel-positioners	6-Achs-Bühne für Tomographie-Ausrichtung und Probenmanipulation
ImageJ	Entwickelt am National Institutes of Health, University of Wisconsin	https://imagej.net/ij/	Open Source Bildverarbeitungs- und Visualisierungssoftware
pco.edge 5.5 sCMOS-Kamera	PCO (PCO AG / Excelitas Technologies)	https://www.excelitas.com/product-category/ pcoedge-cooled-scmos-cameras	Röntgenkamera für die Tomographie-Bildgebung
SAVU	Diamond Light Source Ltd.	https://www.diamond.ac.uk/Home.html ;jsessionid=8977FA8A10694BFA2AA DFD5D0D23B320	Tomographie-Rekonstruktionspipeline
Szintillatoren	CRYTUR, spol. S r.o	https://www.crytur.com/materials/luag-ce/	Szintillator-Optik
Universal V1-Puck( Uni-Puck)	Calibre Scientific	https://www.moleculardimensions. com/products/uni-pucks-and-accessories	Proben werden auf Uni-Puck für den Roboter zum Aufnehmen montiert