Synthese von zusammengesetzten Riesen-Unilamellenvesikeln: Ein biomimetisches Modell von Keimzellen

Zusammenfassung

In diesem Artikel wird ein Verfahren zur Herstellung von zusammengesetzten Riesen-Unilamellären Vesikeln (cGUVs) mit einer Vesikel-in-Vesikel-Struktur mit angepasster elektrischer Leitfähigkeit im inneren, ringförmigen und äußeren Bereich vorgestellt. Bei der Elektroformation werden einfache GUVs synthetisiert, die durch osmotischen Schock in Stomatozyten und cGUVs umgewandelt werden, was ein wertvolles Modell für die Untersuchung der Biophysik kernhaltiger Zellen darstellt.

Zusammenfassung

Ein einfaches unilamelläres Riesenvesikel (sGUV) ist ein kugelförmiges Vesikel von Mikrometergröße, das aus einer Lipiddoppelschicht besteht, die eine wässrige Lösung im Inneren umschließt und in einem anderen wässrigen Medium suspendiert ist. Als biomimetische Modelle biologischer Zellen sind sGUVs etablierte Systeme für biophysikalische Studien. sGUVs ahmen jedoch in erster Linie kernhaltige Zellen nach, was ihre Anwendung als Modelle für nicht-nukleate Zellen einschränkt. Wir schlagen compound Giant Unilamellar vesicles (cGUVs) als geeigneteres biomimetisches Modell für kernhaltige Zellen vor. cGUVs sind Vesikel-in-Vesikel-Strukturen, bei denen davon ausgegangen werden kann, dass die äußere und die innere Vesikeldoppelschicht die Zelle bzw. die Kernmembran einer Zelle repräsentieren.

In dieser Studie beschreiben wir eine einfache Methode zur Synthese von cGUVs. Kurz gesagt, sGUVs wurden unter Verwendung der Lipidzusammensetzung von DMPC und Cholesterin im Bereich von 37-43 mol% in einem Saccharosemedium mittels der Elektroformationsmethode erzeugt. Diese sGUVs wurden dann einem osmotischen Schock ausgesetzt, indem eine hypertone Glukoselösung eingeführt wurde, die einen sofortigen Übergang in eine somatozytäre Form auslöste. Dieser Prozess führte zur Bildung eines Zwischenzustands, in dem das äußere und das innere Vesikel durch einen Hals verbunden blieben, was schließlich zur Entwicklung einer Vesikel-in-Vesikel-Struktur, den sogenannten cGUVs, führte.

Darüber hinaus ist bekannt, dass GUVs, die mit einem höheren Cholesterinspiegel in der Doppelschicht hergestellt wurden, eine verminderte Ionenpermeabilität aufweisen. Diese Eigenschaft ermöglicht die Abstimmung der Leitfähigkeit in der ringförmigen Lösung eines cGUV durch Einstellen der Leitfähigkeiten des hydratisierenden Mediums, der inneren Lösung durch hypertonische Glukose und der äußeren Lösung durch Einstellen der Verdünnung oder der Zugabe von leitfähigen Medien, wodurch die resultierenden cGUVs mit kontrollierten Leitfähigkeiten im äußeren, ringförmigen und inneren Bereich entstehen. relevant für elektrische Feldstudien. Wir schlagen diesen effizienten und unkomplizierten Ansatz für die Synthese von Verbindungsvesikeln vor, die als biomimetisches Modell für eukaryotische, kernhaltige Zellen verwendet werden können, und fördern so ihre Anwendung in der biophysikalischen Forschung.

Einleitung

Biomimetische Modelle wurden in großem Umfang eingesetzt, um die komplexen biophysikalischen Phänomene von Zellmembranen zu untersuchen. Diese einfachsten biomimetischen Modelle liefern wertvolle Erkenntnisse, indem sie die Interferenz durch die unzähligen Variablen, die in biologischen Zellen vorhanden sind, minimieren. Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) sind ein grundlegendes biomimetisches System, das zur Untersuchung der Membranbiophysik verwendet wird ^1,2. GUVs sind als repräsentatives Modell der Zellmembran etabliert. Sie bestehen aus einer einzigen kugelförmigen Lipiddoppelschicht mit einem Durchmesser von 10 bis 30 μm und sind in einer wässrigen Lösung verkapselt und suspendiert. In diesem Artikel nennen wir diese sGUVs. Diese Systeme werden nach einem Bottom-up-Ansatz konstruiert, bei dem wesentliche zelluläre Komponenten - Lipide, Proteine und Katalysatoren - so angeordnet werden, dass sie die Struktur und Funktion biologischer Membranen nachahmen ^3,4.

Obwohl häufig einfache sGUVs verwendet werden, bei denen sich nur der wässrige Kern im Inneren befindet, wurden fortschrittlichere Modelle entwickelt, um spezifische Eigenschaften biologischer Zellen zu replizieren. Zum Beispiel emulieren GUVs mit Aktin-gestützten Strukturen das Zytoskelett ^5,6,7, während Umgebungen mit hohem Salzgehalt verwendet werden, um physiologische Bedingungen zu imitieren. Die höheren Salzumgebungen ahmen physiologische Bedingungen nach, aber es ist schwierig, sie in GUVs zu erhalten, da traditionelle Methoden, wie z. B. die Elektroformation ^8,9, oft ungeeignet sind, um mikrometergroße GUVs unter solchen Bedingungen zu synthetisieren. Neuere Methoden, wie z. B. die gelgestützte Methode, bei der Polymer- oder Stärkegele verwendet werden, um die Schwellung der Doppelschicht während der Hydratation zu unterstützen, beheben diese Einschränkungen^10,11. In ähnlicher Weise wurden morphologische Veränderungen der sGUVs untersucht¹². Die Zugabe von geschlossenen und offenen Filamenten, wie z. B. verkapseltem Aktin, Mikrotubuli und anderen Zytoskelettkomponenten, unterschiedlicher Steifigkeit, und der osmotische Stresszustand in ihnen beeinflussen den morphologischen Übergang dieser osmotisch entleerten, aber anfänglich quasi-sphärischen Vesikel. Theoretische Analysen zeigen verschiedene morphologische Transformationen, darunter röhrenförmige, kugelförmige, racketartige, kirschartige und Tröpfchenstrukturen, die gut mit experimentellen Beobachtungen übereinstimmen¹². Diese Ergebnisse haben erhebliche Auswirkungen auf das Verständnis der Organisation von Filamenten, Mikrotubuli und Nanoringen in Zellen und Vesikel. Andere Studien untersuchen Methoden zur Proteinverkapselung und untersuchen, wie verkapseltes Aktin, Mikrotubuli und Zytoskelettkomponenten die Form der osmotisch entleerten Vesikel regulieren^12,13.

Des Weiteren werden, inspiriert von der eukaryotischen Zellarchitektur, komplexe GUV-basierte Modelle entwickelt, um künstliche Modelle zu entwickeln, die der Spaltung und Zellteilung, der Reproduktion und den Multikompartimentmerkmalen von eukaryotischen Zellen, selbstreproduzierenden Zellen 14,15,16,17 und Multikompartimentzellen ähneln. Über die strukturelle Anwendung hinaus sind GUVs auch die bevorzugten Modelle für das Verständnis der Zellelektroporation - ein Prozess, bei dem ein angelegtes elektrisches Feld aufgrund von Maxwell-Stress die Porenbildung in der Lipidmembran induziert. GUVs, mit Abmessungen vergleichbar mit biologischen Zellen, weisen Elektrodeformation und Elektroporation unter elektrischen Feldern auf. Solche Studien an GUVs geben Einblicke in elektromechanische Eigenschaften wie Membrankapazität und Biegesteifigkeit¹⁸ sowie in Elektroporationsmechanismen ^2,19,20. In der Praxis sind diese Studien jedoch am besten repräsentativ für Kernzellen, wie z. B. rote Blutkörperchen (RBCs).

Um diese Lücke zu schließen, schlagen wir Giant Unilamellar Vesicles (cGUVs) als neuartiges biomimetisches Modell für nukleäre eukaryotische Zellen vor ^21,22. Diese Vesikel besitzen eine Vesikel-in-Vesikel-Struktur, bei der die innere Doppelschicht die Kernmembran nachahmt und die äußere Doppelschicht die Plasmamembran darstellt. Darüber hinaus zeigen wir, wie die elektrische Leitfähigkeit des inneren, ringförmigen und äußeren Bereichs moduliert werden kann, ohne dass fortschrittliche Instrumente wie Mikromanipulatoren oder Mikrospritzen erforderlich sind. Dieser vereinfachte Ansatz zur Synthese von cGUVs bietet eine vielversprechende Plattform, um die biophysikalische Forschung an kernhaltigen Zellen voranzutreiben.

Protokoll

1. Herstellung von Lipidmischungslösungen

1. Bereiten Sie 1 ml Lösung von DMPC und Cholesterin in einem molaren Verhältnis von 63:37 in einer Endkonzentration von 5 mg/ml vor. Fügen Sie dazu 149 μl DMPC (25 mg/ml-Brühe, wie sie in Chloroform gelöst ist), 252 μl Cholesterin (5 mg/ml Cholesterin in Chloroform gelöst) und 599 μl Chloroform hinzu.
2. Bereiten Sie eine weitere 1 ml-Lösung von DMPC vor: Cholesterin in einem molaren Verhältnis von 57:43 bei 5 mg/ml, mischen Sie 139,8 μl DMPC (25 mg/ml-Stamm, wie erhalten, gelöst in Chloroform), 301 μl Cholesterin (5 mg/ml, hergestellt aus in Chloroform gelöstem Pulver) und 559,2 μl Chloroform.
3. Um die Lipiddoppelschicht zu färben, fügen Sie 100 μl Nilrot (aus einer 5 mM Stammlösung) zu 1 ml der Lipidmischung hinzu, die DMPC und Cholesterin in einem molaren Verhältnis von 63:37 enthält (beschrieben in den Schritten 1.1 und 1.2). Alternativ können Sie 30 μl Liss Rhod-PE (1 mg/ml Vorrat an Liss Rhod-PE) zu dem 1 ml der vorbereiteten Lipidmischung (beschrieben in den Schritten 1.1 und 1.2) hinzufügen.
   HINWEIS: Da das Lösungsmittel (Chloroform) leicht flüchtig ist, kann es nach wiederholtem Öffnen des Fläschchens zur Verwendung der Stammlösung (25 mg/ml DMPC) zu Konzentrationen kommen, wodurch sich die Zusammensetzung verändern kann.

2. Elektroformationsprotokoll zur Synthese einfacher riesiger unilamellärer Vesikel (sGUVs)

1. Mit Indiumzinnoxid (ITO) beschichtete Objektträger gründlich mit einer Spülmittellösung reinigen und mit entionisiertem Wasser (0,055 μS/cm) abspülen. Reinigen Sie die Objektträger mit 100%iger Ethanollösung, spülen Sie sie mit entionisiertem Wasser ab und trocknen Sie sie im Ofen bei 85 °C.
2. Identifizieren Sie die leitfähige Seite der ITO-beschichteten Objektträger mit einem Zangenmessgerät. Sichern Sie den gereinigten ITO-beschichteten Objektträger mit einem Vakuum mit der leitfähigen Seite nach oben auf dem Schleuder-Coater-Tisch.
3. 25 μl der Lipidlösungen (hergestellt in Schritt 1.1) werden aufgetragen, indem vier Tröpfchen der Lösung auf die leitfähige Seite des ITO-Objektträgers gegossen werden. Nehmen Sie dann einen weiteren ITO-Objektträger und tragen Sie 25 μl der Lipidlösungen (hergestellt in Schritt 1.2) auf, indem Sie vier Tröpfchen der Lösung auf die leitfähige Seite des ITO-Objektträgers gießen.
4. Trocknen Sie beide lipidbeschichteten Objektträger in einem Exsikkator, der mindestens 2 Stunden im Dunkeln aufbewahrt wird, vakuum.
   HINWEIS: Der Schutz vor Licht schützt die Lipide vor möglichen chemischen Veränderungen.
5. Ein lipidbeschichteter ITO-Objektträger (beschichtet mit dem in Schritt 1.1 hergestellten Lipid) wird parallel zu anderen sauberen ITO-Objektträgern mit der leitfähigen Seite zueinander angeordnet und mit einem 3 mm dicken Silikonkautschuk-Abstandshalter dazwischen angeordnet. Versiegeln Sie die Baugruppe mit einer Klemme, um eine sichere Elektroformationskammer zu schaffen.
6. Befolgen Sie das gleiche Verfahren, das in Schritt 2.5 beschrieben wurde, für den ITO-beschichteten Objektträger mit Lipidlösung, der in Schritt 1.2 hergestellt wurde, um eine Elektroformationskammer zu bilden.
7. Beide Kammern werden in einen bei 38-40 °C gehaltenen Inkubator gestellt und die Kammer mit Hilfe einer 2-ml-Spritze mit 100 mM Saccharoselösung gefüllt. Anlegen eines elektrischen Wechselfeldes von 5 Vpp bei einer Frequenz von 10 Hz unter Verwendung eines zweikanaligen Funktionsgenerators für 4 h.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die leitfähige Seite des ITO-Objektträgers korrekt an den Krokodilklemmen festgeklemmt ist, die mit dem Funktionsgenerator verbunden sind.
8. Trennen Sie die Elektroformierkammer vom Funktionsgenerator. Nehmen Sie die Kammer aus dem Inkubator und lassen Sie sie auf Raumtemperatur abkühlen. Ernten Sie die synthetisierten sGUVs aus beiden Kammern mit einer Spritze und überführen Sie sie jeweils in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und inkubieren Sie sie 1 h lang bei Raumtemperatur (25-27 °C), bevor Sie sie einem osmotischen Schock aussetzen.

3. Formübergang bei osmotischem Schock (sGUV-zu-Stomatozyten-zu-cGUV)

1. 200 μl sGUVs, die in hydratisierenden Medien mit 100 mM Saccharoselösung suspendiert sind, werden in eine Beobachtungskammer überführt.
2. Geben Sie 125 μl Glukoselösung (300 mM) in diese sGUV-Suspension, die 200 μl 100 mM Saccharose enthält, in der Beobachtungskammer, um einen osmotischen Schock zu induzieren, der den Formübergang der sGUVs einleitet.
   HINWEIS: Befolgen Sie das gleiche Verfahren (in Schritt 3 beschrieben) für die sGUV-Synthese aus der in den Schritten 1.1 und 1.2 angegebenen Lipidzusammensetzung für den osmotischen schockgetriebenen Formübergang.
3. Lassen Sie die osmotischen schockinduzierten sGUVs 1 h lang in der Beobachtungskammer ruhen, die auf dem Mikroskopietisch platziert ist.
4. Um den Formübergang von sGUVS durchzuführen und zu beobachten, stellen Sie die Beobachtungskammer (Elektroschweißkammer, eine Petrischale, einen konkavierten Objektträger oder eine andere Kammer, die für die mikroskopische Betrachtung verwendet werden kann) auf den Tisch eines inversen Mikroskops und lassen Sie die Vesikel absetzen.
5. Überwachen Sie die Formübergänge innerhalb der Kammer. Verwenden Sie Differentialinterferenzkontrast (DIC) und Epifluoreszenzmikroskopie mit Plan fluor, ELWD 20x/0,45 und Plan fluor, ELWD 40x/0,60 Objektiven, um die Formübergänge der sGUVs zu beobachten.
6. Beobachten Sie die Bildung von stomatozytären Vesikeln während des Übergangs. Überwachen Sie die Kammer im Laufe der Zeit, während sich größere Vesikel am Boden absetzen, gefolgt von einer erhöhten Anzahl kleinerer Vesikel.

4. Modifikation der Leitfähigkeit im inneren, ringförmigen und äußeren Bereich von cGUVs

1. Passen Sie die Leitfähigkeit von Lösungen in verschiedenen Bereichen von cGUVs (innerlich, ringförmig und außen) an, indem Sie geeignete Mengen (μL) einer 7,5 mM Stammsalzlösung hinzufügen, bevor Sie den sGUVs einen osmotischen Schock geben.
   1. Um beispielsweise eine höhere Leitfähigkeit im äußeren und inneren Bereich im Vergleich zum ringförmigen Bereich zu erreichen, werden 200 μl Saccharoselösung in die Elektroschweißkammer überführt. Geben Sie 20 μl 7,5 mM Salzlösung in die Kammer. Induzieren Sie einen osmotischen Schock durch Zugabe von 125 μl 300 mM Glukoselösung.
   2. Lassen Sie die osmotisch geschockten sGUVs 3-4 h ruhen. In diesem Fall erhält man cGUVs mit einer höheren Leitfähigkeit im äußeren und inneren Bereich als im ringförmigen Bereich am Ende.
2. Führen Sie die Elektrodeformation von cGUVs durch, indem Sie ein elektrisches Wechselstrompotential von 7,5 Vpp bei 100 kHz unter Verwendung eines Funktionsgenerators in einer Elektroschweißkammer anlegen, die Drahtelektroden im Abstand von 500 μm enthält.
3. Nach dem Anlegen eines elektrischen Wechselfeldes nehmen Sie ein Video mit 10 Bildern/s auf und beobachten Sie die abgeflachte Formverformung der äußeren Vesikel und die prolate Formverformung der inneren Vesikel, was eine höhere Leitfähigkeit im äußeren und inneren Bereich als im ringförmigen Bereich in cGUV-Domänen bestätigt.

5. Mikroskopische Analyse von cGUVs

1. Inverse Mikroskop-Bildgebung: Führen Sie Differenzialinterferenzkontrast- (DIC) und Epifluoreszenzmikroskopie mit einem inversen Mikroskop und gekoppelt mit einer monochromatischen Kamera durch. Verwenden Sie DIC- und Epifluoreszenzmikroskopie mit den Objektiven Plan fluor, ELWD 20x/0,45 und Plan fluor, ELWD 40x/0,60, um die Formübergänge der sGUVs zu beobachten. Verwenden Sie für die Epifluoreszenzstudie einen Grünfilter (EX 510-560, DM 575, BA 590) für die Doppelschicht der Nilrotfärbung.
   HINWEIS: DIC-Bilder liefern wertvolle Einblicke in den Zustand des angeschlossenen Halses und bestätigen, ob er intakt bleibt oder zu cGUVs fusioniert.
2. Verwenden Sie die ImageJ-Software, um eine Maßstabsleiste einzufügen und Mikroskopiebilder zuzuschneiden. Um eine Maßstabsleiste hinzuzufügen, gehen Sie zu Analysieren | Stellen Sie Skalierung ein, um das Bild zu kalibrieren, und gehen Sie dann zu Analysieren | Werkzeuge | Maßstabsleiste , um die Maßstabsleiste einzufügen.
3. Konfokalmikroskopie für die Morphologie: Um ein klareres Verständnis der cGUV-Morphologie zu erhalten, wird ein konfokales Laserscanning-Mikroskop für die z-Achsen-Abtastung mit einer Schrittweite von 1 μm eingesetzt. Bildgebung mit einem konfokalen Mikroskop: Verwenden Sie ein konfokales Laserscanning-Mikroskop mit einem Plan-Apochromat 40x/1,3 Öl DIC-Objektiv, um die cGUVs abzubilden. Bild Nilrot- oder Rhodamin-PE-gefärbte cGUVs im roten Einkanalmodus mit einer Anregungswellenlänge von 561 nm und einem Emissionsbereich von 561-695 nm.
4. Um die .czi-Datei des Bildes in der mit dem Mikroskop verknüpften Software zu ändern und zu extrahieren, fügen Sie Grafiken wie eine Maßstabsleiste ein, aktivieren Sie die 2D- und 3D-Ansicht, und gehen Sie dann zu Verarbeitung | Methode | Parameter und klicken Sie auf Übernehmen , um ein Bild im JPG-Format zu erhalten.
5. Vorbereitung für die konfokale Mikroskopie: Füllen Sie eine wässrige Lösung, die cGUVs enthält, in eine modifizierte benutzerdefinierte Kammer (Bodenglas durch Deckglas ersetzt) für die konfokale Bildgebung. Lassen Sie die Probe 10-15 Minuten lang ungestört, damit sich die cGUVs für die konfokale Bildgebung absetzen können. Laden Sie das cGUVs-Gemisch in den Hohlraumschieber und verschließen Sie es mit einem Deckglas, um die Bewegungen der cGUVs zu stoppen. Analysieren Sie anschließend die cGUVs durch konfokale Mikroskopie und z-Scanning im Abstand von 1 μm.

Ergebnisse

sGUVs wurden mit der Elektroformationsmethode synthetisiert (wie in Abbildung 1 gezeigt) und mit einer Spritze aus der Kammer geerntet. Die entnommenen sGUVs wurden zunächst unter einem inversen Mikroskop sichtbar gemacht und einem osmotischen Schock unterzogen, um ihre Umwandlung in eine Stomatozytenform zu induzieren. Nach weiterem Membranumbau wird dieser Stomatozyt in eine Vesikel-in-Vesikel-Struktur umgewandelt, die als Giant Unilamellar Vesicle (cGUV) ...

Diskussion

Die Zusammensetzung und die Art der Lipide bestimmen weitgehend die mechanischen Eigenschaften der Doppelschicht, die ein GUV bildet. Eine Doppelschicht aus DMPC/Chol weist einzigartige Formübergänge auf, wenn sie osmotischen Schocks ausgesetzt wird. Unter einem starken hypertonen osmotischen Schock wird das wässrige Fluid im Inneren des sGUV ausgestoßen, was zu einer Verformung der GUV-Doppelschicht führt. Die beobachteten Formübergänge werden vor allem durch den nach außen gerichteten ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Cholesterol (Sigma grade, 99%)	Avanti Polar Lipids, Inc.	C8667	Für sGUV Synthese
Choloroform	Merck Life Science Pvt. Ltd.	DA2P711602	als Lösungsmittel für die Herstellung von Lipid-Stammlösung verwendet
DMPC	Avanti Polar Lipids, Inc.	850345C	Für sGUV Synthese
Ethanol	Hayman	F204325	Zur Reinigung von ITO-Objektträgern
FITC-DEXTRAN (4 Kda-MW)	Sigma-Aldrich	466994	Zur Einkapselung in die inneren Vesikel von cGUV
Glucose	Sigma-Aldrich	G-7021	Zur Herstellung von Glucose-Lösung, verwendet für osmotischen Schock von sGUV, suspendiert in der Saccharose-Lösung
Liss Rhod PE	Sigma-Aldrich	810150C-1MG	Zum Anfärben von Lipidmolekülen
Nile red	Sigma-Aldrich	72485	Zum Anfärben von cGUV- und sGUV-Membranen
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	1936060521	Zur Herstellung von Salz-Stammlösung, zur Änderung der Leitfähigkeit der cGUV-Kompartimente
Saccharose	Sigma-Aldrich	S9378	Für Saccharose-Lösung als Hydrationsmedium der Elektroformierungskammer
Geräte
Cavitly-Objektträger	Blue star		cGUV-Suspension zur mikroskopischen Beobachtung
cMOS pco.edge 4.2 Kamera	Excelitas	61009524	Für fluoreszierende monochromatische Bilder und DIC-Bildgebung
Deckglas (22 x 60 mm)	Blue star		Zum Abdecken von Kavitäts-Objektträgern
Eppendrof Elektrofusionskammer	Sigma-Aldrich		sGUV-Suspension in der Kammer für osmotische und mikroskopische Beobachtung platziert, eine andere einfache Kammer kann ebenfalls verwendet werden
Funktionsgenerator (Dualkanal)	Tektronix	AFG3022C	Funktionsgenerator zur Bereitstellung eines Wechselstromfeldes für die Elektroformierungskammer
Inkubator	lokale Anpassung		Elektroformierungskammer bei 40 °C platziert
ITO-Objektträger	Sigma-Aldrich	576352-10PAK	ITO-Objektträger, verwendet in der Elektroformierungsmethode
Nikon Eclipse Invertmikroskop	Nikon	TE2000-U	Zur Visualisierung von sGUV und cGUV
Silikonfolie (3 mm Dicke)	Sigma-Aldrich	GF49463141	Zum Abstandhalten in der Elektroformierungskammer
Spritze (2 mL)	Becton Dickinson India Pvt Ltd.	300844	Verwendet zum Injizieren eines Hydrationsmediums und zur Ernte der sGUV aus der Elektroformierungskammer
Zeiss Konfokalmikroskop-Setup	Zentraleinrichtung des IIT Bombay