Synthese von zusammengesetzten Riesen-Unilamellenvesikeln: Ein biomimetisches Modell von Keimzellen

Zusammenfassung

In diesem Artikel wird ein Verfahren zur Herstellung von zusammengesetzten Riesen-Unilamellären Vesikeln (cGUVs) mit einer Vesikel-in-Vesikel-Struktur mit angepasster elektrischer Leitfähigkeit im inneren, ringförmigen und äußeren Bereich vorgestellt. Bei der Elektroformation werden einfache GUVs synthetisiert, die durch osmotischen Schock in Stomatozyten und cGUVs umgewandelt werden, was ein wertvolles Modell für die Untersuchung der Biophysik kernhaltiger Zellen darstellt.

Zusammenfassung

Ein einfaches unilamelläres Riesenvesikel (sGUV) ist ein kugelförmiges Vesikel von Mikrometergröße, das aus einer Lipiddoppelschicht besteht, die eine wässrige Lösung im Inneren umschließt und in einem anderen wässrigen Medium suspendiert ist. Als biomimetische Modelle biologischer Zellen sind sGUVs etablierte Systeme für biophysikalische Studien. sGUVs ahmen jedoch in erster Linie kernhaltige Zellen nach, was ihre Anwendung als Modelle für nicht-nukleate Zellen einschränkt. Wir schlagen compound Giant Unilamellar vesicles (cGUVs) als geeigneteres biomimetisches Modell für kernhaltige Zellen vor. cGUVs sind Vesikel-in-Vesikel-Strukturen, bei denen davon ausgegangen werden kann, dass die äußere und die innere Vesikeldoppelschicht die Zelle bzw. die Kernmembran einer Zelle repräsentieren.

In dieser Studie beschreiben wir eine einfache Methode zur Synthese von cGUVs. Kurz gesagt, sGUVs wurden unter Verwendung der Lipidzusammensetzung von DMPC und Cholesterin im Bereich von 37-43 mol% in einem Saccharosemedium mittels der Elektroformationsmethode erzeugt. Diese sGUVs wurden dann einem osmotischen Schock ausgesetzt, indem eine hypertone Glukoselösung eingeführt wurde, die einen sofortigen Übergang in eine somatozytäre Form auslöste. Dieser Prozess führte zur Bildung eines Zwischenzustands, in dem das äußere und das innere Vesikel durch einen Hals verbunden blieben, was schließlich zur Entwicklung einer Vesikel-in-Vesikel-Struktur, den sogenannten cGUVs, führte.

Darüber hinaus ist bekannt, dass GUVs, die mit einem höheren Cholesterinspiegel in der Doppelschicht hergestellt wurden, eine verminderte Ionenpermeabilität aufweisen. Diese Eigenschaft ermöglicht die Abstimmung der Leitfähigkeit in der ringförmigen Lösung eines cGUV durch Einstellen der Leitfähigkeiten des hydratisierenden Mediums, der inneren Lösung durch hypertonische Glukose und der äußeren Lösung durch Einstellen der Verdünnung oder der Zugabe von leitfähigen Medien, wodurch die resultierenden cGUVs mit kontrollierten Leitfähigkeiten im äußeren, ringförmigen und inneren Bereich entstehen. relevant für elektrische Feldstudien. Wir schlagen diesen effizienten und unkomplizierten Ansatz für die Synthese von Verbindungsvesikeln vor, die als biomimetisches Modell für eukaryotische, kernhaltige Zellen verwendet werden können, und fördern so ihre Anwendung in der biophysikalischen Forschung.

Einleitung

Biomimetische Modelle wurden in großem Umfang eingesetzt, um die komplexen biophysikalischen Phänomene von Zellmembranen zu untersuchen. Diese einfachsten biomimetischen Modelle liefern wertvolle Erkenntnisse, indem sie die Interferenz durch die unzähligen Variablen, die in biologischen Zellen vorhanden sind, minimieren. Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) sind ein grundlegendes biomimetisches System, das zur Untersuchung der Membranbiophysik verwendet wird ^1,2. GUVs sind als repräsentatives Modell der Zellmembran etabliert. Sie bestehen aus einer einzigen kugelförmigen Lipiddop....

Protokoll

1. Herstellung von Lipidmischungslösungen

1. Bereiten Sie 1 ml Lösung von DMPC und Cholesterin in einem molaren Verhältnis von 63:37 in einer Endkonzentration von 5 mg/ml vor. Fügen Sie dazu 149 μl DMPC (25 mg/ml-Brühe, wie sie in Chloroform gelöst ist), 252 μl Cholesterin (5 mg/ml Cholesterin in Chloroform gelöst) und 599 μl Chloroform hinzu.
2. Bereiten Sie eine weitere 1 ml-Lösung von DMPC vor: Cholesterin in einem molaren Verhältnis von 57:43 bei 5 mg/ml, mischen Sie 139,8 μl DMPC (25 mg/ml-Stamm, wie erhalten, gelöst in Chloroform), 301 μl Cholesterin (5 mg/ml, hergestellt aus in Chloroform gelöst....

Ergebnisse

sGUVs wurden mit der Elektroformationsmethode synthetisiert (wie in Abbildung 1 gezeigt) und mit einer Spritze aus der Kammer geerntet. Die entnommenen sGUVs wurden zunächst unter einem inversen Mikroskop sichtbar gemacht und einem osmotischen Schock unterzogen, um ihre Umwandlung in eine Stomatozytenform zu induzieren. Nach weiterem Membranumbau wird dieser Stomatozyt in eine Vesikel-in-Vesikel-Struktur umgewandelt, die als Giant Unilamellar Vesicle (cGUV) .......

Diskussion

Die Zusammensetzung und die Art der Lipide bestimmen weitgehend die mechanischen Eigenschaften der Doppelschicht, die ein GUV bildet. Eine Doppelschicht aus DMPC/Chol weist einzigartige Formübergänge auf, wenn sie osmotischen Schocks ausgesetzt wird. Unter einem starken hypertonen osmotischen Schock wird das wässrige Fluid im Inneren des sGUV ausgestoßen, was zu einer Verformung der GUV-Doppelschicht führt. Die beobachteten Formübergänge werden vor allem durch den nach außen gerichteten .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Cholesterol (Sigma grade, 99%)	Avanti Polar Lipids, Inc.	C8667	Für sGUV Synthese
Choloroform	Merck Life Science Pvt. Ltd.	DA2P711602	als Lösungsmittel für die Herstellung von Lipid-Stammlösung verwendet
DMPC	Avanti Polar Lipids, Inc.	850345C	Für sGUV Synthese
Ethanol	Hayman	F204325	Zur Reinigung von ITO-Objektträgern
FITC-DEXTRAN (4 Kda-MW)	Sigma-Aldrich	466994	Zur Einkapselung in die inneren Vesikel von cGUV
Glucose	Sigma-Aldrich	G-7021	Zur Herstellung von Glucose-Lösung, verwendet für osmotischen Schock von sGUV, suspendiert in der Saccharose-Lösung
Liss Rhod PE	Sigma-Aldrich	810150C-1MG	Zum Anfärben von Lipidmolekülen
Nile red	Sigma-Aldrich	72485	Zum Anfärben von cGUV- und sGUV-Membranen
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	1936060521	Zur Herstellung von Salz-Stammlösung, zur Änderung der Leitfähigkeit der cGUV-Kompartimente
Saccharose	Sigma-Aldrich	S9378	Für Saccharose-Lösung als Hydrationsmedium der Elektroformierungskammer
Geräte
Cavitly-Objektträger	Blue star		cGUV-Suspension zur mikroskopischen Beobachtung
cMOS pco.edge 4.2 Kamera	Excelitas	61009524	Für fluoreszierende monochromatische Bilder und DIC-Bildgebung
Deckglas (22 x 60 mm)	Blue star		Zum Abdecken von Kavitäts-Objektträgern
Eppendrof Elektrofusionskammer	Sigma-Aldrich		sGUV-Suspension in der Kammer für osmotische und mikroskopische Beobachtung platziert, eine andere einfache Kammer kann ebenfalls verwendet werden
Funktionsgenerator (Dualkanal)	Tektronix	AFG3022C	Funktionsgenerator zur Bereitstellung eines Wechselstromfeldes für die Elektroformierungskammer
Inkubator	lokale Anpassung		Elektroformierungskammer bei 40 °C platziert
ITO-Objektträger	Sigma-Aldrich	576352-10PAK	ITO-Objektträger, verwendet in der Elektroformierungsmethode
Nikon Eclipse Invertmikroskop	Nikon	TE2000-U	Zur Visualisierung von sGUV und cGUV
Silikonfolie (3 mm Dicke)	Sigma-Aldrich	GF49463141	Zum Abstandhalten in der Elektroformierungskammer
Spritze (2 mL)	Becton Dickinson India Pvt Ltd.	300844	Verwendet zum Injizieren eines Hydrationsmediums und zur Ernte der sGUV aus der Elektroformierungskammer
Zeiss Konfokalmikroskop-Setup	Zentraleinrichtung des IIT Bombay