Dieses Protokoll beschreibt die In-Ovo-Xenotransplantation von patienteneigenen B- und T-Zellen der akuten lymphatischen Leukämie (ALL), die 4 Tage nach der Injektion erfolgt.
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Methodenartikel
In Ovo Xenotransplantation von patienteneigenen Zellen der akuten lymphatischen Leukämie (ALL) (PDX-ALL)
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
In dieser Studie wird eine schnelle, kostengünstige und effiziente Methode zur In-Ovo-Xenotransplantation von patienteneigenen Zellen der akuten lymphatischen Leukämie (ALL) vorgestellt, die sowohl B-Zell- als auch T-Zelllinien umfasst. Unter Verwendung befruchteter Hühnerembryonen injizierten wir 11 Tage nach der Befruchtung (11dpf) von Patienten stammende B-ALL- und T-ALL-Zellen in das Gefäßsystem der Embryonen. Bemerkenswert ist, dass die transplantierten menschlichen Leukämiezellen vier Tage nach der Injektion ein signifikantes Überleben, eine signifikante Proliferation und Gefäßbesiedlung innerhalb des sich entwickelnden Hühnerembryos zeigten. Bei 15dpf konnten wir einen bemerkenswerten Anstieg der CD10/CD19+ B-ALL- und CD4/CD8+ T-ALL-Zellen in Blutproben aus dem Gefäßsystem des Embryos feststellen, was die erfolgreiche Transplantation bestätigt. Dieses System ermöglicht eine effiziente und reproduzierbare Beurteilung des Verhaltens von Leukämiezellen in einem lebenden Organismus, ohne die erheblichen Kosten und ethischen Einschränkungen, die mit anderen Tiermodellen verbunden sind. Dieser schnelle Ansatz bietet eine hochdurchsatzfähige und biologisch relevante In-vivo-Plattform für die Bewertung potenzieller therapeutischer Wirkstoffe. Das hier vorgestellte in ovo patient-derived xenograft (PDX)-ALL-System bietet ein vielversprechendes Werkzeug für präklinisches Wirkstoffscreening, mechanistische Studien und möglicherweise für personalisierte medizinische Ansätze in der Leukämieforschung.
Einleitung
Die chorioallantoische Membran (CAM) des Kükens beginnt am 7. Tag nach der Befruchtung nach der Inkubation Gestalt anzunehmen und ist am 12. Tag fertig. Das CAM steht im Rampenlicht als geeignetes in vivo-Modell für die Angiogenese1 und die Transplantation von Krebszellen 2,3,4,5,6,7,8,9,10, insbesondere blutverwandten Krebszellen 11, da es von Natur aus immundefizient ist und eine gut entwickelte Vaskularisation aufweist. Darüber hinaus ist das CAM auch ein wünschenswertes System zur Untersuchung der Tumorinvasion und Metastasierung, da es eine Reihe von extrazellulären Matrixproteinen trägt, darunter Kollagen, Integrin αVβ3, Fibronektin, Laminin und Matrix-Metalloproteinase-2 (MMP-2)10.
Die akute lymphatische Leukämie (ALL) ist eine Krebserkrankung des Knochenmarks und des Blutes, die durch einen raschen Anstieg unreifer B- und T-Lymphozyten gekennzeichnet ist. Es ist die am weitesten verbreitete Krebserkrankung bei Kindern und die Hauptursache für den Krebstod bei Kindern. ALL ist bei >85 % der betroffenen Kinder heilbar, aber Erwachsene und Säuglinge haben deutlich niedrigere Heilungsraten, und rezidivierte/refraktäre ALL hat ein 5-Jahres-Überleben von <10 %12. Daher ist die Entwicklung neuer Behandlungsstrategien zur Prävention oder zum Stopp einer rezidivierenden oder refraktären ALL dringend erforderlich. Obwohl eine Reihe von Xenotransplantatmodellen, wie z. B. Maus und Ratte13, entwickelt wurden, sind diese Methoden zeitaufwändig (z. B. Monate) und teuer und erfordern umfassende ethische Vorschriften. Um einen ungedeckten klinischen Bedarf an neuartigen ALL-Therapien zu decken, ist die Entwicklung eines reproduzierbaren, zeit- und kosteneffizienten Tiermodells, das zur Erweiterung der grundlegenden In-vitro-Arbeit geeignet ist, unerlässlich.
In dieser Studie berichten wir über die erfolgreiche Etablierung eines In-Ovo-Xenotransplantationsprotokolls, das zuverlässig eine 3D-Gefäßbesiedlung von B- und T-ALL-Zellen von Patienten erzeugt, die möglicherweise für das Design einer neuartigen Therapie verwendet wird, die das Fortschreiten der ALL stoppen könnte, und für die Entwicklung eines prädiktiven Werkzeugs für das Ergebnis und die Risiken der ALL-Behandlung.
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Protokoll
Die Experimente wurden auf der Grundlage des Protokolls durchgeführt, das von der Ethikkommission der Universität Calgary (REB15-1143; wobei die Einverständniserklärung ALLER Probanden eingeholt wurde) und dem Health Research Ethics Board des Alberta Cancer Committee (HREBA) genehmigt wurde. CC-17-0108_REN8). Patienten mit ALL zum Zeitpunkt der Diagnose (vor Beginn einer Therapie), die zirkulierende Blasten (Blasten nicht nur im Knochenmark, sondern auch im Blut) hatten, wurden in die Studie eingeschlossen. Die verwendeten Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.
1. Inkubation der Eizellen
- Besorge dir befruchtete Hühnereier. Erhalten Sie ~10 % mehr Eier als nötig, um die Anzahl der während des Transports oder des Aufschlagens beschädigten Eier zu berücksichtigen.
- Lagern Sie die befruchteten Eizellen bis zu zwei Wochen bei 12 °C, ohne an Lebensfähigkeit zu verlieren.
- Bringen Sie die Eier in einen befeuchteten (~50%-60%) Rollbrutkasten bei 39 °C.
- Inkubieren Sie die Eier im Inkubator für 10dpf. Beachten Sie, dass Tag 1 beginnt, wenn die Eizellen in den Brutkasten überführt werden.
2. Isolierung von Zellen der akuten lymphatischen Leukämie aus Blutproben von Patienten mit ALL
- Isolieren Sie die Zellen wie zuvor beschrieben 14,15.
- Sammeln Sie 10 ml peripheres Blut (oder Knochenmark) von B- und T-ALL-Patienten in heparinisierte Reagenzgläser.
- Übertragen Sie die Blutproben in ein steriles 50-ml-Zentrifugenröhrchen und verdünnen Sie sie dreimal mit 2 Volumina 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), die 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 und 1,8 mM KH2PO4 enthalten.
- 1 Volumen der verdünnten Blutproben auf 1 Volumen Dichtegradientenmedium auflegen und bei Raumtemperatur ohne Bremse bei 300 x g für 30 min zentrifugieren.
- Sammeln Sie die Buffy-Coat-Schicht von mononukleären Zellen (MNCs) von der Grenzfläche und übertragen Sie sie mit einer sterilen Pipette in ein neues steriles 15-ml-Röhrchen.
- Fügen Sie 10 ml 1x PBS hinzu und zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 300 x g , um alle verbleibenden Serumbestandteile zu entfernen (wiederholen Sie diesen Schritt zweimal).
- Geben Sie 2 ml 0,8 % NH4Cl in das Zellpellet, wirbeln Sie es sanft auf, inkubieren Sie es 5 Minuten lang bei Raumtemperatur und drehen Sie es 5 Minuten lang bei 300 x g , um die roten Blutkörperchen zu lysieren (falls erforderlich, wiederholen Sie diesen Schritt).
- Waschen Sie die Zellen in 1x PBS, wie in Schritt 2.6 beschrieben.
- Resuspendieren Sie die Zellen in RPMI 1640 mit 10 % FBS und zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Hämozytometer.
- Beurteilen Sie die Zellviabilität mit dem Trypanblau-Ausschluss-Assay.
- Die Zellen werden im Gefriermedium (10 % DMSO in FBS) resuspendiert, bei -80 °C eingefroren und in flüssigem Stickstoff gelagert.
3. Amplifikation von replikationsinkompetenten Lentiviren der 2. Generation, die mCherry tragen
- Säen Sie HEK293T menschlichen embryonalen Nierenzellen bei ~60 %-70 % Konfluenz in eine 6-Well-Platte, die DMEM enthält, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2.
- Cotransfizieren Sie die Zellen (1,5 x 106) mit FUW-Luc-mCherry-puro-Transfer, pCMVΔr8.91 Verpackung und pVSV-G Hüllvektoren im Verhältnis 3:2:1 mit Lipofectamine 3000 für 2 Tage.
- Den lentivirushaltigen Überstand ernten und durch einen 0,45 μm Filter filtrieren.
- Den geklärten Virusüberstand in Zentrifugenröhrchen überführen, 2 h bei 4 °C bei 20.000 x g zentrifugieren, den Überstand verwerfen und das Pellet in 100 μl PBS oder serumfreiem Medium resuspendieren.
- Messen Sie die Multiplizität der Infektion (MOI) mit dem qPCR Lentivirus Titer Kit.
4. Markierung von kontinuierlich wachsenden ALL-Zelllinien und patienteneigenen ALL-Zellen mit mCherry
- Platte1 x 106 Zellen/ml B-(SEM) und T-ALL (MOLT3)16,17 Zelllinien und vom Patienten stammende B- oder T-ALL-Zellen in 6-Well-Platten mit RPMI 1640 + 10 % FBS.
- Infizieren Sie die Zellen mit 300 μl lentiviralem Präparat mit einem Virustiter von 3,47 x 106 IE/ml, um einen MOI von 1 für 1 x 106 Zellen zu erhalten, mischen Sie es vorsichtig und inkubieren Sie es 2 Tage lang bei 37 °C mit 5 % CO2 .
- Geben Sie 1 μg/ml Puromycin in das Kulturmedium, um stabil transduzierte Zellen für 2 Tage auszuwählen.
- Visualisieren Sie mCherry-markierte Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop.
5. In-Ovo-Xeno-Transplantation
- Am Tag 10 (siehe oben Abschnitt über die Inkubation der Eizellen) untersuchen Sie das Gefäßsystem der Hühnerembryonen unter Licht, um die Lebensfähigkeit der Embryonen zu beurteilen. Waschen Sie die Eier dann vorsichtig mit 70% Ethanol, um die Oberfläche zu sterilisieren.
- Bohren Sie mit einer Handbohrmaschine in die Luftzelle der Eier, um ein kleines Fenster (~2,0 cm Durchmesser) zu erstellen.
- Mit transparentem Klebeband verschließen und in einen 5% CO2 -Inkubator zurückgeben.
- Am 11. Tag injizieren Sie 1 x 107 mKirsch-markierte ALL-Zellen mit 34-G-Nadeln in die Blutgefäße der sich entwickelnden Embryonen. Beachten Sie, dass es sich als schwierig erwies, zu bestätigen, ob ALLE Zellen an identischen Stellen an verschiedenen Embryonen injiziert wurden, da das Öffnen des Fensters an denselben Stellen nicht garantiert ist.
- Verschließen Sie die Fenster mit transparentem Klebeband, kehren Sie zum 5%igen CO2 -Inkubator zurück und überwachen Sie täglich die Lebensfähigkeit des Embryos.
- Präparieren Sie am 15. Tag Blutgefäße aus Embryonen, platzieren Sie sie auf Objektträgern und fotografieren Sie erfolgreiche Xenotransplantate mit einem Präpariermikroskop, das mit Fluoreszenzfunktionen ausgestattet ist.
HINWEIS: Jenseits von 15 dpf (da Federn den gesamten Körper bedecken und das Eiweiß fast verschwunden ist) muss eine Immunhistochemie durchgeführt werden, um die Veränderungen in der Proliferation und Besiedlung ALLER Zellen im Gefäßsystem des Hühnerembryos zu beurteilen.
6. Durchflusszytometrie
- Am 15. Tag wird mit einer sterilen Spritze mit einer 32-g-Nadel Blut aus dem Gefäßsystem des Hühnerembryos entnommen, in ein steriles 1,5-ml-Röhrchen mit Heparin überführt und bei 226 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert.
- Entfernen Sie den Überstand (Plasma) und resuspendieren Sie das Zellpellet in 1x PBS mit 1% BSA (Rinderserumalbumin).
- Führen Sie die Schritte 2.7 und 2.8 durch, um die roten Blutkörperchen zu lysieren.
- B-ALL-Zellen mit humanen FITC-CD10- und humanen PE-CD19-Antikörpern und T-ALL-Zellen mit humanen FITC-CD4- bzw. humanen PE-CD8-Antikörpern bei 4 °C im Dunkeln für 30 Minuten markieren.
- Waschen Sie die markierten Zellen zweimal mit PBS mit 1 % BSA, zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei 4 °C bei 226 x g , resuspendieren Sie sie in 1x PBS und analysieren Sie sie mittels Durchflusszytometrie.
- Stellen Sie die Spannungen für Forward Scatter (FSC) und Lateral Scatter (SSC) auf 400 V bzw. 360 V ein. Stellen Sie die Detektorverstärkungen für die FITC- und PE-Kanäle auf 450-500 V bzw. 400-450 V ein.
HINWEIS: Gating-Strategie: (a) Lichtstreu-Gating (FSC vs. SSC): verwenden Sie FSC-A vs. SSC-A zur Identifizierung einer Population mit intermediärer Vorwärtsstreuung (Größe) und niedriger Seitenstreuung (Granularität), die der Lymphoblastregion entspricht. Beachten Sie, dass dieser Schritt hilft, Ablagerungen und körnigere Zellen wie Monozyten oder Granulozyten auszuschließen. (b) Auswahl des Singuletts (FSC-H vs. FSC-A): Dublett-Unterscheidung durch Gating auf FSC-H vs. FSC-A, das sicherstellt, dass nur einzelzellige Ereignisse analysiert werden18. - Quantifizierung von CD10/CD19+ B-ALL- und CD4/CD8+ T-ALL-Zellen durch Zählung von Ereignissen in Quadrant 2 (Q2; FITC/PE+) von FITC vs. PE-Grundstücke18. Gegenwärtig bedeutet ± REM von drei unabhängigen Experimenten (n = 3).
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Ergebnisse
Um festzustellen, ob die Transplantation von humanen ALL-Zellen in die Entwicklung von Hühnerembryonen erfolgreich war, wurden replikationsinkompetente Lentiviren der 2. Generation, die mCherry trugen, amplifiziert und zur Markierung von B- und T-ALL-Zelllinien, SEM bzw. MOLT316,17 verwendet. Wie in Abbildung 1A gezeigt, wurden ~50 % der Zellen B-(oben links, zwei Felder) und T-(oben rechts, zwei Felder) ALLER Zellen mit m...
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Diskussion
Es wurden drei kritische Schritte währendder In-Ovo-Xenotransplantation identifiziert, um eine mikrobielle Kontamination zu verhindern und das Überleben von Hühnerembryonen zu maximieren: d.h. (1) Sterilisation der Eierschalenoberfläche mit 70% Ethanol vor der Herstellung des Fensters und (2) dichtes Verschließen des Eierschalenfensters mit Zellklebeband, um eine Verdunstung des Inhalts des Hühnerembryos während der Inkubation zu verhindern, und (3) die Verwendung der feinen Na...
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.
Danksagungen
Wir danken Dr. Andrew Kung von der Columbia University für die Bereitstellung von FUW-Luc-mCherry-puro. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des CIHR (PJT-174983) an KYL und der National Research Foundation of Korea (NRF; RS-2023-00284121) an KYL und M-YJ.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 34 G Nadeln | BD Perisafe | ||
| Attune NxT Durchflusszytometer | Thermo Fischer | ||
| BD Perisafe Spritze (32 g) | BD Perisafe | ||
| Rinderserumalbumin (BSA) | Millipore Sigma | Nr. A9647 | |
| Medium zum Einfrieren von Zellen | Gibco, ThermoFisher Scientific | 12648010 | |
| Zentrifuge (Allegra X-22R Zentrifuge ) | Beckman Coulter | ||
| Einweg-Handschuhe | Royal Touch300 Nitril-Untersuchungshandschuhe | ||
| Präpariermikroskop | Leica MZ16FA | ||
| DMEM | Gibco, ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DMSO | Invitrogen, ThermoFisher Scientific | Nr. D12345 | |
| Brutkasten für Eier, Vevitts 120 Inkubator mit Rollen | Vixest Trading Co. | ||
| Ethylalkohol (95%) | VWR Deutschland | BDH1158-4LP | |
| Fötales Rinderserum (FBS) | Gibco, ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| Ficoll-Lösung (Ficoll?? Paque Plus) | MilliporeSigma | GE17-1440-02 | |
| FITC-CD10 Antikörper | Santa Cruz Biotech | sc-46656 FITC | |
| FITC-CD4 Antikörper | Santa Cruz Biotech | sc-19641 FITC | |
| Fluoreszenzmikroskop | Leica Mikrosysteme | ||
| Handbohrmaschine (Dremel3000) | Bosch | ||
| HEK293T | ATCC, VA, VEREINIGTE STAATEN VON AMERIKA | CRL-3216 | |
| Hämozytometer | VWR international, Hausser Scientific | 15170-263 | |
| Heparin-Natriumsalz aus der Darmschleimhaut von Schweinen | Millipore Sigma | Nr. H3149 | |
| Heparinisierte Reagenzgläser | BD Vacutainer | BD 366480 | |
| Lipofectamin 3000 | Invitrogen, ThermoFisher Scientific | L3000008 | |
| Multiplex-Lentivirus-Titer-Kit (qPCR-Lentivirus-Titer-Kit) | Abm | LV900 | |
| NH4Cl (Ammonium chloride_ | Millipore Sigma | Nr. A9434 | |
| Olympus IX71 inverses Mikroskop | Olymp | ||
| PE-CD19 Antikörper | Santa Cruz Biotech | sc-19650 PE | |
| PE-CD8 Antikörper | Santa Cruz Biotech | sc-1177 PE | |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) | Gibco, ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) | Sigma | Nr. P3813 | |
| Pipetten (einstellbares Volumen) | Eppendorf | ||
| Puromycin | Gibco, ThermoFisher Scientific | A1113803 | |
| RPMI 1640 | Gibco, ThermoFisher Scientific | 11875093 | |
| Scotch Cellotape | 3M | ||
| Sterile 6-Well-Platten | VWR international, Corning | 22250-140 | |
| Sterile Zentrifugenröhrchen | Axygen Inc, Corning | AXYMCT-150-C-S | |
| Sterile Kulturflaschen (75T) | VWR Deutschland | 10062-872 | |
| Sterile Falcon-Röhrchen (15 mL) | SARSTEDT | 62.554.502 | |
| Sterile Falcon-Röhrchen (50 mL) | SARSTEDT | 62.547.254 | |
| Sterilfilter (0,45 &Mikro; m Filter) | VWR Deutschland | 76778-974 | |
| Sterile Pinzette | VWR Deutschland | 82027-404 | |
| Objektträger aus sterilem Glas | VWR Deutschland | 48300-031 | |
| Sterile Pipettenspitzen | VWR Deutschland | 76322-136, 76322-134, 76322-154 | |
| Sterile Spritzen | BD-Spritze | 309628? | |
| Trypan-Blau | Invitrogen, ThermoFisher Scientific | Nr. T10282 |
Referenzen
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Nachdrucke und Genehmigungen
