Ein olfaktorischer Präferenztest zur Messung olfaktorischer hedonischer Verzerrungen in Mausmodellen für Depressionen

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll eines olfaktorischen Präferenztests vor, das es ermöglicht, negative olfaktorische Verzerrungen sowohl gegenüber appetitiven als auch gegenüber aversiven Geruchsreizen in Mausmodellen für Depressionen zu bewerten.

Zusammenfassung

Depressionen sind weltweit die größte Ursache für Behinderungen und betreffen jährlich 280 Millionen Menschen. Neben verminderter Aktivität und Motivation hat sich gezeigt, dass Depressionen mit einer negativen Verzerrung der Valenz verbunden sind: Patienten empfinden neutrale und positive sensorische Reize als weniger angenehm und negative unangenehmer als gesunde Personen. Insbesondere die olfaktorische hedonische Verzerrung kann bei Patienten einen Zustandsmarker für die Krankheit darstellen und kann in Mausmodellen leicht gemessen werden. Es gibt jedoch nur sehr wenige Tests an Tieren, um emotionale Verzerrungen auf translationale Weise zu messen. In dieser Arbeit schlagen wir ein Protokoll zur zuverlässigen Bewertung der Geruchsvalenzzuschreibung von Kontroll- und depressiven Mäusen durch die Erforschung von Geruchsstoffen vor, die mit verschiedenen hedonischen Werten assoziiert sind. Mit diesem olfaktorischen Präferenztest und mehreren Verhaltensmessungen bestätigen wir eine negative olfaktorische Verzerrung sowohl gegenüber appetitiven als auch gegenüber aversiven Reizen in zwei verschiedenen Mausmodellen für Depressionen. Wichtig ist, dass diese Methode sowohl auf männliche als auch auf weibliche Personen anwendbar ist. Schließlich ermöglicht dieses Protokoll mehrere Anpassungen, um die Bewertung der emotionalen Reaktion zu verbessern, und kann leicht mit klassischen Tools zur Live-Überwachung der neuronalen Aktivität kombiniert werden.

Einleitung

Depressionen sind eine schwere affektive Störung und weltweit eine der Hauptursachen für Behinderungen. Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation leiden etwa 280 Millionen Menschen, d.h. 4% der Bevölkerung, an Depressionen. Sie ist bei Frauen um 50 % häufiger als bei Männern, und der Ausbruch von COVID-19 hat die Prävalenz depressiver Störungen im ersten Jahr der Pandemie um 25 % erhöht (Weltgesundheitsorganisation, 2022). Hinzu kommt, dass etwa ein Drittel der Patienten nicht auf klassische Antidepressiva-Therapien anspricht, es Wochen dauert, bis antidepressive Wirkungen beobachtet werden, und die Physiopathologie von Stimmungsstörungen ist weitgehend unbekannt.

Basierend auf dem DSM-5¹ stützt sich die Diagnose einer Depression auf mehrere Symptome, darunter depressive Stimmung, Verlust des Interesses oder der Freude, signifikante Gewichtsvariationen, eine physische und psychische Verlangsamung, Müdigkeit, Gefühle der Wertlosigkeit, Konzentrationsschwierigkeiten und wiederkehrende Gedanken an den Tod. Klinische Studien zeigten auch, dass Stimmungsstörungen mit sensorischen Veränderungen einhergehen: Depressive Patienten empfinden sensorische Reize als weniger angenehm als Kontrollpersonen ^2,3,4.

Hedonische "Valenz" bezieht sich auf den Grad, in dem etwas lustvoll (positive Valenz) oder aversiv (negative Valenz) ist. Die Valenzzuweisung zu einem Reiz kann ein angepasstes Verhalten auslösen, einschließlich Annäherung oder Vermeidung⁵. Interessanterweise ist dieser Prozess zwischen den Arten, von Insekten bis zum Menschen, stark konserviert⁶. Depression ist also mit einer negativen Tendenz der Valenz verbunden. Die klinische Diagnose stützt sich jedoch noch wenig auf sensorische Verzerrungen.

Unter den sensorischen Modalitäten ist der Geruchssinn besonders interessant, da die olfaktorischen Eingaben die thalamischen Relais weitgehend umgehen und bei Säugetieren, einschließlich des Menschen, in das limbische System projizieren. Aus evolutionärer Sicht hat sich gezeigt, dass dieses System entscheidend für die Kodierung einer Reihe von primären Reaktionen auf Umweltreize^ist 7,8,9,10,11,12. Zusätzlich zu diesen gemeinsamen neuronalen Schaltkreisen zeigen klinische Studien einen bilateralen Zusammenhang zwischen Geruchssinn und Depression, wobei depressive Patienten sowohl olfaktorische Veränderungen als auch olfaktorische Störungen erlebten, die depressive Symptome verursachten¹³. Darüber hinaus wird die Geruchsfunktion bei depressiven Patienten nach Medikation oder Therapie wiederhergestellt 14,15,16,17. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass olfaktorische Defizite eher ein Biomarker für den Zustand (Status der klinischen Manifestationen bei Patienten) als für ein Merkmal (Eigenschaften, die eine vorhergehende, möglicherweise kausale Rolle in der Pathophysiologie der psychiatrischen Störung spielen und daher für eine frühe, präsymptomatische Diagnose genutzt werden können) für die Erkrankung^{sein könnten 18}. Dementsprechend könnte ein besseres und weitergehendes Verständnis der Veränderung der olfaktorischen Modalität bei Depressionen den Weg zu neuen therapeutischen Instrumenten zur Diagnose und Erkennung des Ansprechens auf die Behandlung ebnen.

Daher wäre die Bewertung der olfaktorischen hedonischen Verzerrung in Modellen der Depression von besonderem Interesse, sowohl zur Bewertung des induzierten depressiven Phänotyps als auch als Werkzeug zur Untersuchung der neuronalen Mechanismen hinter diesen Veränderungen in der Valenzzuweisung. Frühere Studien haben bereits verhaltenswissenschaftliche Ansätze verwendet, um die Zuordnung der Geruchsvalenz bei Mäusen zu bewerten. Diese Tests weisen jedoch mehrere Vorbehalte auf: Sie erfordern ausgeklügelte Vorrichtungen¹⁹, die meist Kästen umfassen, die durch einen Deckel verschlossen sind 19,20,21^{, die} einen ständigen physischen Kontakt mit der Geruchslösung 20,21,22 implizieren und/oder zu sehr kurzen Geruchserkundungszeiten führen 21,22,23 . Dies macht diese Assays inkompatibel mit klassischen Instrumenten zur Live-Überwachung der neuronalen Aktivität, die bei angebundenen Mäusen längere Probenzeiten erfordern.

Darüber hinaus haben Malkesman et al. bereits den Female Urine Sniffing Test (FUST) entwickelt, um die Belohnungsaktivität bei Nagetieren zu überwachen, indem sie die olfaktorische Untersuchung männlicher Mäuse messen, die weiblichem Mausurin ausgesetzt waren²⁴. Dieser Test bewertet jedoch nur die Verhaltensreaktion auf einen bestimmten positiven Reiz sozialer Natur und mit kurzen Interaktionszeiten. Darüber hinaus wurde dieser Test ausschließlich für männliche Nagetiere entwickelt, obwohl Depressionen bei Frauen doppelt so häufig auftreten wie bei Männern.

Um all diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir hier einen Olfaktorischen Präferenztest (OPT) in Anlehnung an Bigot et ^al.14 entwickelt, bei dem sowohl männliche als auch weibliche Mäuse einer Vielzahl von neutralen, positiven und negativen Gerüchen ausgesetzt werden können, um die hedonische Reaktion im Kontext von Depressionen genau zu beurteilen. Die Wahl der Gerüche kann auf früheren Veröffentlichungen basieren^14,25, aber dieser Test ermöglicht auch die Erforschung neuer sozialer, ernährungsphysiologischer und infektionsbezogener Reize, wobei sowohl natürliche Komponenten als auch monomolekulare oder speziell entwickelte chemische Mischungen verwendet werden.

Protokoll

Alle Tierhaltungs- und Versuchsverfahren folgten den nationalen und europäischen (2010/63/EU) Richtlinien und wurden vom französischen Forschungsministerium genehmigt (APAFiS: #16380-2018080217358599_v1; APAFIS #51636-2024101718013761_v4). Männliche und weibliche Mäuse des Typs C57BL/6JRj (UCMS-Modell) und männliche Mäuse des Typs C57BL/6NTac (CORT-Modell) (8 Wochen alt) wurden sozial untergebracht (4-5 Mäuse pro Käfig) und unter Standardbedingungen (23 ± 1 °C; Luftfeuchtigkeit 40 %) in einem 14/10-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus (Licht an um 7 Uhr) mit Futter und Wasser ad libitum gehalten.

1. Der Versuchsaufbau

1. Installation der Arena
   1. Bereiten Sie den Versuchsaufbau vor, der aus einer zweiteiligen Arena (45 cm × 50 cm × 25 cm) aus grauen Plexiglaswänden und einem weißen Boden besteht. Trennen Sie die beiden Fächer (25 cm × 45 cm) durch eine graue Plexiglaswand (37 cm × 25 cm).
   2. Platzieren Sie eine perforierte Petrischale (60 mm × 15 mm mit 7 Löchern von 5 mm Durchmesser) auf der Unterseite der Wand aus jedem Fach.
   3. Fixieren Sie die Petrischalen vertikal mit beidseitigem Kleber oder Haftkleber (z. B. Blu-tack) an der Wand.
   4. Platzieren Sie eine Kamera auf der Arena, um das Verhalten der Tiere (2 m über der Arena) aufzuzeichnen und ihre Bewegungen während des Experiments automatisch zu verfolgen.
2. Auswahl an Gerüchen
   1. Wählen Sie vor dem Experiment eine Liste von Gerüchen mit neutraler, positiver und negativer Wertigkeit aus, die getestet werden sollen (Beispiele finden Sie in Tabelle 1 ).
   2. Vergewissern Sie sich, dass alle ausgewählten Gerüche einen ähnlichen Dampfdruck haben. Bewerten Sie zusätzlich die Diffusion in der Arena für einige Gerüche mit einem Photoionisationsdetektor (PID)²⁶.
   3. Testen Sie jeden Geruch an einem separaten Tag.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, die Verwendung von neutralen Gerüchen zuerst, dann von appetitlichen Gerüchen und schließlich von aversiven Gerüchen zu planen, um die Explorationseffekte von einem Tag auf den anderen zu minimieren. Diese Reihenfolge minimiert Übertragungseffekte von einem Testtag auf einen anderen. Alternativ könnte eine zufällige Präsentation verwendet werden, aber alle Versuchsgruppen müssen mit der gleichen Geruchssequenz getestet werden.
3. Aufbau von Versuchsgruppen
   1. Teilen Sie die Mäuse in mindestens zwei Versuchsgruppen ein: Kontrollmäuse und Mäuse, die das Modell der Depression durchlaufen. Halten Sie die Tiere aus der gleichen Gruppe in den gleichen Käfigen.
      VORSICHT: Jede Versuchsgruppe sollte mindestens etwa 7-8 Personen umfassen, um eine statistische Signifikanz zu erhalten. Käfige sollten in der Nähe des Tierhauses platziert werden, um den Käfigeffekt zu minimieren.
   2. Induktion eines depressiven Phänotyps in relevanten Mausgruppen unter Verwendung des Depressionsmodells der Wahl.
      HINWEIS: Die Beschreibung von Protokollen zur Induktion von depressionsähnlichen Verhaltensweisen bei Mäusen würde den Rahmen dieses Artikels sprengen. In dieser Studie werden jedoch Experimente mit zwei verschiedenen Modellen (dem Unpredictable Chronic Mild Stress [UCMS] und Corticosteron [CORT])^27,28 als repräsentative Ergebnisse für diesen Geruchspräferenztest vorgestellt. Kurz gesagt, das UCMS-Modell beruht auf der Exposition gegenüber einer Vielzahl verschiedener Umweltstressoren über mehrere Wochen, während das CORT-Modell aus der chronischen Verabreichung von im Trinkwasser von Mäusen gelöstem Corticosteron besteht (ca. 5 mg/kg/Tag, je nachdem, wie viel Mäuse trinken).

2. Gewöhnungsphase

1. Allgemeine Gewöhnung und Handhabung
   1. Lassen Sie die Mäuse bei der Ankunft 1 Woche lang ungestört, ohne dass die Einstreu gewechselt wird. Fügen Sie zusätzliches Baumwollmaterial und ein Iglu in den Käfig ein, um Stress zu reduzieren.
   2. Nach 1 Woche behandeln Sie alle Mäuse täglich für 3-4 Tage sanft und gewöhnen Sie sie an den Umgang mit den Bechern, vorzugsweise im Versuchsraum.
2. Experimentelle Bedingungen des Tests
   1. Bringen Sie die Maus 30 Minuten vor Beginn des Experiments in den Verhaltenstestraum.
      HINWEIS: Im Idealfall sollte der Verhaltensraum aus zwei separaten Teilen bestehen, so dass sich die Tiere in einem Teil befinden können, während die getestete Maus im anderen Teil arbeitet.
   2. Achten Sie darauf, dass die üblichen Wohnbedingungen (23 ± 1 °C; Luftfeuchtigkeit 40 %) eingehalten werden und sich keine störenden Geräusche, Licht- oder Gerüche im Raum befinden.
   3. Stellen Sie die Beleuchtung in der Arena mit einem Luxmeter auf ca. 40 Lux ein. Achten Sie auf eine homogene Ausleuchtung in der Arena.
3. Gewöhnung an die Arena
   1. Geben Sie ein sauberes Filterpapier (42,5 mm) in beide Petrischalen (60 mm × 15 mm).
   2. Befestigen Sie den Deckel der Petrischale mit transparentem Klebeband an der Unterseite (da er vertikal platziert wird).
   3. Setzen Sie am ersten Tag alle Mäuse aus dem gleichen Haltungskäfig für 10 Minuten vorsichtig zusammen in die Arena, um Neophobie zu reduzieren.
      ACHTUNG: Setzen Sie Mäuse immer durch die Handhabung von Bechern in die Arena, um Stress durch das Aufheben am Schwanz zu vermeiden.
   4. Führen Sie am nächsten Tag jede Maus einzeln in die Arena ein, genau zwischen den beiden Kammern, und zeichnen Sie das Verhalten 10 Minuten lang auf.
   5. Wiederholen Sie dies 2-3 Tage hintereinander.
4. Kriterium der Erkundung
   1. Definieren Sie die beiden Bereiche (25 cm 15 cm), in denen die Petrischalen platziert wurden, und messen Sie die Zeit, die jedes Tier in jeder Zone verbringt.
   2. Mitteln Sie diese Maßnahmen über alle einzelnen Gewöhnungsschritte.
   3. Wenn die durchschnittliche Verweildauer in jeder der Zonen mehr als 50 s beträgt, ist das Kriterium erfüllt. Ist dies nicht der Fall, wiederholen Sie die Gewöhnungssitzungen, bis das Kriterium erreicht ist, oder schließen Sie das Tier von der Analyse aus.
      HINWEIS: Es können maximal zwei Gewöhnungssitzungen pro Tag durchgeführt werden (morgens und nachmittags).

3. Testphase

1. Vorbereitung des Geruchs
   1. Bereiten Sie den Geruch am Tag des Tests mit der richtigen Verdünnung unter einer chemischen Haube vor. Verdünnen Sie den Geruch je nach chemischer Struktur in Mineralöl oder destilliertem Wasser. Um eine Kontamination zu vermeiden, lagern Sie Mineralöl in einem separaten belüfteten Raum fern von Geruchsstoffen.
      HINWEIS: Die Verwendung einer neuen Flasche Mineralöl wird empfohlen, wenn ein neuer Versuch begonnen wird.
   2. Bewahren Sie die Odorierlösung in einem Glasfläschchen auf. Vermeiden Sie Tubenbehälter aus Kunststoff, die zu einer Geruchskontamination führen könnten.
   3. Unmittelbar bevor jede Maus getestet wird, sammeln Sie 200 μl der Geruchslösung mit einer Mikropipette und legen Sie sie auf das Filterpapier in einer der beiden Petrischale.
   4. Lassen Sie das andere Filterpapier in der zweiten Petrischale unberührt.
   5. Übertragen Sie die Petrischalen in den Testraum und fixieren Sie sie senkrecht an der Wand der Arena.
      ACHTUNG: Bereiten Sie die Odorierlösungen im Versuchsraum nicht vor und entsorgen Sie sie nicht, um eine Geruchskontamination zu vermeiden. Wechseln Sie während des Versuchs regelmäßig die Handschuhe. Wenn der Verdacht besteht, dass die Handschuhe während der Geruchsmanipulation kontaminiert sein könnten, wechseln Sie sie, bevor Sie die Mäuse zum Testen greifen.
2. Verhaltenstest
   1. Platzieren Sie jede Maus einzeln in der Arena, genau zwischen den beiden Fächern.
   2. 10 min aufnehmen.
   3. Entferne die Maus aus der Arena.
   4. Entfernen Sie den Geruch Petrischale.
   5. Reinigen Sie die Arena mit einer Desinfektionslösung (z. B. Ethanol 70 %) und trocknen Sie sie ab.
   6. Werfen Sie das Filterpapier weg und wiederholen Sie die Geruchsvorbereitung für die nächste Maus.
   7. Im Idealfall testen Sie nur einen Geruch pro Tag. Verwenden Sie bevorzugt zuerst neutrale Gerüche, dann positive Gerüche und schließlich negative Gerüche (siehe Abbildung 1).
      ACHTUNG: Führen Sie sowohl die Gewöhnungs- als auch die Testschritte an den Tagen des Versuchs ungefähr zur gleichen Tageszeit durch (idealerweise zwischen 9 und 15 Uhr). Wenn die Anzahl der Tiere einen längeren Zeitraum erfordert, achten Sie darauf, verschiedene Versuchsgruppen abwechselnd zu testen, um eine Verzerrung der Tageszeit zu vermeiden. Wenn Männchen und Weibchen im selben Experiment getestet werden müssen, sollten Sie lieber ein Geschlecht nach dem anderen testen.
      HINWEIS: Verwenden Sie an jedem Tag des Tests saubere Petrischale, um eine Geruchskontamination zu vermeiden. Bemerkenswert ist, dass perforierte Petrischalen nach ordnungsgemäßer Reinigung und Geruchsdekontamination für mehrere Experimente wiederverwendet werden können.

4. Datenanalyse

1. Verfolgung des Verhaltens
   1. Verwenden Sie ein automatisches Tracking-Programm, um die Position der Maus während der Tests aufzuzeichnen.
   2. Definieren Sie separate Zonen in der Arena für die Analyse (siehe Abbildung 1):
      1. Definieren Sie eine "Geruchszone" (25 cm × 15 cm), den Bereich, in dem die Petrischale mit dem mit dem Geruch getränkten Filterpapier platziert wird (d. h. der Bereich, der dem Geruch am nächsten ist und etwa ein Drittel des Oberflächenkompartiments ausmacht).
      2. Definieren Sie eine "Kontrollzone" (25 cm × 15 cm), symmetrisch zur "Geruchszone", aber ohne Zusatz von Gerüchen in der Petrischale.
      3. Definieren Sie eine "hintere Geruchszone" (25 cm × 30 cm), d.h. der Rest des Fachs ist dort, wo die Geruchspetrischale platziert ist.
      4. Definieren Sie eine "hintere Kontrollzone" (25 cm × 30 cm), symmetrisch zur "hinteren Kontrollzone", die aus dem restlichen geruchsfreien Fach besteht.
         HINWEIS: Die Verfolgung des Mittelpunkts des Mauskörpers ist ausreichend, um die Geruchspräferenz des Tieres zu analysieren. Die genaue Verfolgung der Nase jeder Maus kann jedoch die Geruchsuntersuchung durch das Tier genauer veranschaulichen.
2. Auslesungen der hedonischen Reaktion
   1. Sammeln Sie mit dem automatischen Tracking für jede Maus und jeden Tag des Tests die folgenden Informationen, einschließlich der Gewöhnungsschritte:
      1. Notieren Sie die gesamte zurückgelegte Strecke in der Arena (m).
      2. Notieren Sie die Zeit, die Sie in jeder Zone der Arena(n) verbracht haben.
      3. Notiere die Anzahl der Eintritte in jeder Zone der Arena.
   2. Verwenden Sie die zurückgelegte Gesamtstrecke, um die wichtigsten Auswirkungen des Fortbewegungsapparates zu beurteilen.
   3. Um Unterschiede in der Geruchspräferenz gegenüber verschiedenen Gerüchen zu beurteilen, verwenden Sie die wichtigsten Messwerte:
      1. Nutzen Sie die Zeit, die Sie in der Geruchszone verbringen.
      2. Verwenden Sie die Anzahl der Einträge in der Geruchszone.
      3. Verwenden Sie einen Präferenzindex, der berechnet wird, indem die in der Geruchszone verbrachte Zeit auf die Zeit in dieser Zone während der Gewöhnung normalisiert wird (die Normalisierung wird an Mäusen aus allen Gruppen durchgeführt). Der Mittelwert bezieht sich auf das arithmetische Mittel der Zeit, die in der Geruchszone verbracht wird, und sd bezieht sich auf seine Standardabweichung.
         
      4. Verwenden Sie einen Geruchserkundungsindex, der als Durchschnitt der normalisierten Werte der zurückgelegten Entfernung, der in der Geruchszone verbrachten Zeit und der Anzahl der Einträge in der Geruchszone wie folgt berechnet wird:
         
         
         HINWEIS: Dieser Präferenzindex kann bei Bedarf angepasst werden, z. B. durch den Vergleich von Zeit, die in der Geruchs- und Kontrollzone verbracht wird. Wenn Gruppen während der Gewöhnung signifikante Unterschiede in ihrer Erkundung der "Geruchszone" zeigen, kann die Normalisierung nur in Bezug auf die Kontrollgruppe und nicht auf alle Gruppen zusammen durchgeführt werden.
   4. Stellen Sie diese Messwerte für Kontroll- und depressive Mäuse visuell als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dar.
   5. Verwenden Sie eine Zwei-Wege-Varianzanalyse (ANOVA) mit wiederholten Messungen, gefolgt von Post-hoc-Tests (hier unkorrigierter Fisher-Test der geringwertigsten Differenz), um sowohl die Versuchsgruppen, Gerüche (Faktor für wiederholte Messungen) als auch die Faktoren für den Interaktionseffekt zu berücksichtigen. Der Interaktionsfaktor gibt an, ob die Unterschiede zwischen den Gruppen über alle präsentierten Gerüche hinweg konsistent sind.
   6. Überprüfen Sie Normalität und Homoskedastizität mit angepassten Tests (Shapiro-Wilk-Test, Bartlett-Test). Die statistische Signifikanz wurde auf *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001 festgelegt.

Ergebnisse

Um zu verifizieren, dass depressive Mäuse eine negative olfaktorische Verzerrung^{aufweisen 14,29} und dass diese mit dem Protokoll des hier beschriebenen olfaktorischen Präferenztests zuverlässig gemessen werden kann, untersuchten wir die hedonische Reaktion auf verschiedene Gerüche in zwei verschiedenen Mausmodellen für Depressionen.

Zunächst verwendeten wir ein Mausmodell für unvorhersehbaren chronischen milden Stress (UCMS) über eine Dauer von 4 Wochen, angepasst an²⁸ (siehe Ergänzungsdatei 1 für ein detailliertes Protokoll), um einen depressiven Phänotyp in jungen weiblichen C57BL/6JRj-Mäusen zu induzieren (Abbildung 2A,B). Diese weiblichen Mäuse wurden im Geruchspräferenztest mit männlichem Mausurin (MU, rein) als appetitlichem Geruch und 2,4,5-Trimethylthiazol (TMT, 5% in Mineralöl) als aversivem Geruch getestet. Im Durchschnitt verbrachte jede Maus während der Gewöhnung mindestens 50 s sowohl in der "Kontroll"- als auch in der "Geruchszone" und erfüllte damit das Kriterium (Abbildung 2C). Durch die Gewöhnung verbrachten UCMS-Mäuse jedoch signifikant mehr Zeit in der "Kontrollzone" im Vergleich zu Kontrollen, aber da es keinen signifikanten Unterschied in Bezug auf die Zone gibt, in der der Geruch hinzugefügt wird, kann dieser Unterschied verworfen werden. In Bezug auf die Distanz bewegten sich Kontrollmäuse signifikant mehr als UCMS, wenn sie MU ausgesetzt waren, jedoch nicht während der Gewöhnung oder in Gegenwart von TMT (Abbildung 2D). Schließlich zeigen alle Messwerte der hedonischen Reaktion (Zeit, die in der Geruchszone verbracht wurde, Anzahl der Einträge in der Geruchszone und Präferenzindex) signifikante Unterschiede oder eine statistische Tendenz zwischen Kontroll- und UCMS-Weibchen (Abbildung 2E-G). Dieser Effekt ist auch durch den Global Odor Exploration Index sichtbar, der ein kombiniertes Maß für hedonische und lokomotorische Reaktionen ist (Abbildung 2H). Konsistent zeigt jede Messung also eine negative hedonische Verzerrung als Reaktion sowohl auf appetitive als auch auf aversive Geruchsreize. Interessanterweise ist der Emotionalitäts-Score, der als normalisierter Wert des angst- und depressiven Phänotyps auf der Grundlage einer großen Batterie von Verhaltenstests¹⁴ berechnet wird, positiv mit dem Geruchsexplorationsindex sowohl von MU als auch von TMT korreliert (Abbildung 2I), was einen Zusammenhang zwischen der Verhaltensreaktion auf positive und negative Geruchsstoffe und dem angst- und depressiven Phänotyp zeigt.

Zweitens verwendeten wir das gleiche UCMS-Protokoll, um diesmal einen depressiven Phänotyp bei männlichen Mäusen zu induzieren. Während des Olfaktorischen Präferenztests wurden diese Mäuse dem weiblichen Mausurin (FU, rein) ausgesetzt, der appetitiv ist, und TMT wie zuvor als negativem Geruch (Abbildung 3A,B). Es gibt keinen Unterschied in der Zeit, die während der Gewöhnung in den vier Zonen verbracht wurde, noch in der Entfernung, die durch den Test zurückgelegt wurde (Abbildung 3C,D). Die Zeit, die in der Geruchszone verbracht wird, zeigt eine signifikante Reduzierung der FU- und TMT-Exploration in UCMS im Vergleich zu Kontrollen (Abbildung 3E). Darüber hinaus dringen UCMS-Mäuse signifikant weniger in die Geruchszone ein oder neigen dazu, und weisen einen signifikant reduzierten Präferenzindex sowohl für FU als auch für TMT auf (Abbildung 3F,G), was eine negative olfaktorische Verzerrung in einem depressiven Zustand bestätigt. Ebenso zeigt der Odor Exploration Index eine negativ verschobene Verhaltensreaktion auf FU und TMT von UCMS-Mäusen im Vergleich zu Kontrollen (Abbildung 3H), die tendenziell positiv mit dem Emotionalitätswert der Tiere korreliert (Abbildung 3I).

In einem dritten Experiment haben wir auf ein anderes Modell der Depression zurückgegriffen, das auf der chronischen Verabreichung von Corticosteron (CORT) im Trinkwasser von männlichen C57BL/6NTac-Mäusen beruht, während Kontrollmäuse nur die Vehikellösung (Veh) (10% 2-Hydroxypropyl-beta-Cyclodextrin) erhalten ²⁷. Nach vierwöchiger CORT- oder Veh-Behandlung wurden die Mäuse vier Tage lang an sie gewöhnt und dann einem neutralen Geruch (OCT: 2-trans-Octenal, 1% in Wasser), einem positiven Geruch (PO: Erdnussöl) und einem negativen Geruch (TMT: 2,4,5-Trimethylthiazol, 5% in Mineralöl) ausgesetzt (Abbildung 4A,B). Durch Gewöhnung gab es keine Unterschiede zwischen Veh und CORT (Abbildung 4C). Beide Gruppen verbrachten jedoch deutlich mehr Zeit in der "Geruchszone" als in der "Kontrollzone". Es gibt keine Unterschiede für die zurückgelegte Strecke, mit Ausnahme des positiven Geruchs (PO), für den sich Veh-Mäuse mehr bewegten als CORT (Abbildung 4D). Wichtig ist, dass wie bei UCMS-Mäusen die Zeit, die in der Geruchszone verbracht wurde, auch bei CORT-Mäusen signifikant reduziert wurde, wenn sie einem neutralen und appetitiven Geruch ausgesetzt waren (Abbildung 4E). Eine verminderte Geruchserkundung zeigt sich auch durch eine deutliche Reduzierung bzw. Tendenz zu einer geringeren Anzahl von Einträgen in der Geruchszone (Abbildung 4F). In diesem Fall zeigen sich Unterschiede zwischen den Gruppen in Abhängigkeit von der analysierten Auslesung, wahrscheinlich aufgrund der Einschränkungen in Bezug auf die Anzahl der verwendeten Tiere sowie eines potenziellen Bodeneffekts, der durch die geringe Explorationszeit nach der TMT-Exposition verursacht wird. Insgesamt ist der Präferenzindex bei CORT-Mäusen für alle Geruchsreize signifikant niedriger als bei Veh (Abbildung 4H). Schließlich korreliert der Odor Exploration Index für alle Gerüche signifikant mit dem Emotionalitäts-Score der Tiere (Abbildung 4I), was einmal mehr zeigt, dass dieser olfaktorische Präferenztest ein geeignetes Instrument ist, um negative emotionale Verzerrungen in mehreren Mausmodellen für Depressionen zu bewerten.

Schließlich können wir die Möglichkeit ausschließen, dass die beobachteten Unterschiede eher durch eine Verringerung der Bewegungsaktivität als durch emotionale Verzerrungen verursacht werden. Tatsächlich unterscheidet sich die Fortbewegung während der Gewöhnung nicht zwischen den Gruppen, wenn die zurückgelegte Gesamtstrecke bewertet wird (Abbildung 2D, Abbildung 3D, Abbildung 4D). Darüber hinaus kann auf der Grundlage der statistischen Analyse auch eine generelle Verringerung des Aufgabenengagements oder ein Neuheitseffekt diese Verzerrungen nicht erklären. Tatsächlich fanden wir einen signifikanten Effekt des Geruchsfaktors in der Präferenzindexanalyse, ohne signifikante Wechselwirkung zwischen Versuchsgruppen und Gerüchen. Diese Ergebnisse zeigen, dass depressive Mäuse diese Aufgabe tatsächlich erfüllen und dass ihre reduzierte Erkundung spezifisch für jeden olfaktorischen Hinweis ist.

Abbildung 1: Allgemeines Schema des zeitlichen Ablaufs und des Aufbaus des Geruchspräferenztests. Mäuse werden zuerst an die Arena gewöhnt. Am ersten Tag der Gewöhnung werden Mäuse aus demselben Käfig zusammengelegt, um die Neophobie zu reduzieren. Am nächsten Tag werden sie einzeln in der Arena platziert. Nach der Gewöhnung wird einer der Kammern ein Geruch zugesetzt. Bevorzugt werden zuerst neutrale Gerüche geprüft, gefolgt von positiven Gerüchen und schließlich negativen Gerüchen. Zur Analyse kann die Arena in vier verschiedene Zonen unterteilt werden. Erstellt mit Biorender. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Negative olfaktorische Verzerrung in einem UCMS-Modell für weibliche Maus für Depressionen. (A,B) Zeitverlauf und Versuchsgruppen der Studie: Kontroll- und UCMS (Unpredictable Chronic Mild Stress) weibliche Mäuse werden im Olfaktorischen Präferenztest mit einem positiven (MU: männlicher Mausurin, rein) und negativem Geruch (TMT: 2,4,5-Trimethylthiazol, 5% in Mineralöl) getestet. Erstellt mit Biorender. (C) UCMS-Mäuse verbrachten im Durchschnitt signifikant mehr Zeit in der "Kontrollzone" und weniger Zeit in der "hinteren Geruchszone" im Vergleich zu Kontrollen während der Gewöhnung (Gruppe: F(1, 12) = 74,03, p < 0,0001; Zone: F(2,434, 29,21) = 7,688, p = 0,0012; Wechselwirkung: F(3, 36) = 5,148, p = 0,0046). (D) Die zurückgelegte Gesamtdistanz verringerte sich bei UCMS signifikant, wenn sie MU ausgesetzt war, jedoch nicht für Habituation (Hab) und TMT (Gruppe: F(1, 12) = 4,664, p = 0,0518; Geruch: F(1,871, 22,45) = 4,846, p = 0,0195; Wechselwirkung: F(2, 24) = 4,797, p = 0,0177). (E) UCMS-Mäuse verbrachten signifikant weniger Zeit mit der Erforschung von MU und TMT (Gruppe: F(1, 12) = 24,39, p = 0,0003; Geruch: F(1, 12) = 59,69, p < 0,0001; Wechselwirkung: F(1, 12) = 2,267, p = 0,1580). (F) UCMS-Mäuse drangen weniger als in die Geruchszone ein oder neigten dazu, (Gruppe: F(1, 12) = 9,279, p = 0,0102; Geruch: F(1, 12) = 5,100, p = 0,0433; Wechselwirkung: F(1, 12) = 1,649, p = 0,2233). (G) Der Präferenzindex für MU und TMT ist bei UCMS-Mäusen signifikant reduziert (Gruppe: F(1, 12) = 24,39, p = 0,0003; Geruch: F(1, 12) = 59,69, p < 0,0001; Wechselwirkung: F(1, 12) = 2,267, p = 0,1580). (H) Der Geruchsexplorationsindex für MU und TMT ist in UCMS-Mäusen signifikant reduziert (F(1, 12) = 14,71, p = 0,0024; Geruch: F(1, 12) = 0, p > 0,9999; Wechselwirkung: F(1, 12) = 0,02630, p = 0,8739). (I) Der Geruchsexplorationsindex für MU und TMT ist beide positiv mit dem Emotionalitätswert der Tiere korreliert (MU: Pearson R² = 0,4837, F(1,12) = 11,24, **p = 0,0058; TMT: Pearson R² = 0,5340, F(1,12) = 13,75, **p = 0,0030). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Negative olfaktorische Verzerrung in einem männlichen UCMS-Mausmodell für Depressionen. (A,B) Zeitleiste und Versuchsgruppen der Studie: Kontroll- und UCMS-Mäuse werden im Olfaktorischen Präferenztest mit positivem (FU: weiblicher Mausurin, rein) und negativem Geruch (TMT: 2,4,5-Trimethylthiazol, 5% in Mineralöl) getestet. Erstellt mit Biorender. (C) Es gibt im Durchschnitt keine Unterschiede in der Zeit, die in den verschiedenen Zonen der Arena durch Gewöhnung verbracht wird (Gruppe: F(1, 13) = 3,921, p = 0,0693; Zoner = F(1,688, 21,94) = 34,57, p < 0,0001; Wechselwirkung: F(3, 39) = 0,7385, p = 0,5355). (D) Es gibt keine Unterschiede in der Gesamtstrecke zwischen Controls und UCMS (Gruppe: F(1, 13) = 2,313, p = 0,1522; Geruch: F(1,722, 22,38) = 1,746, p = 0,1998; Wechselwirkung: F(2, 26) = 0,8806, p = 0,4266). (E) Die Zeit, die für die Erforschung der Geruchszone mit FU und TMT aufgewendet wird, ist bei UCMS-Mäusen signifikant reduziert (Gruppe: F(1, 13) = 6,808, p = 0,0216; Geruch: F(1, 13) = 16,21, p = 0,0014; Wechselwirkung: F(1, 13) = 0,3304, p = 0,5753). (F) UCMS-Mäuse traten signifikant seltener in die Geruchszone für TMT ein und tendenziell für FU (Gruppe: F(1, 13) = 6,572, p = 0,0236; Geruch: F(1, 13) = 3,784, p = 0,0737; Wechselwirkung: F(1, 13) = 0,2145, p = 0,6509). (G) Der Präferenzindex von UCMS-Mäusen ist für FU und TMT signifikant reduziert (Gruppe: F(1,13 ) = 6,808, p = 0,0216; Geruch: F(1, 13) = 16,21, p = 0,0014; Wechselwirkung: F(1, 13) = 0,3304, p = 0,5753); (H) Der Geruchsexplorationsindex des UCMS ist für beide Gerüche signifikant reduziert (Gruppe: F(1, 13) = 12,42, p = 0,0037; Geruch: F(1, 13) = 0,002580, p = 0,9603; Wechselwirkung: F(1, 13) = 0,5804, p = 0,4598). (I) Der Geruchsexplorationsindex für FU und TMT korreliert tendenziell positiv mit dem Emotionalitätswert der Tiere (FU: Pearson R² = 0,2573, F(1, 13) = 4,504, p = 0,0536; TMT: Pearson R² = 0,2266, F(1, 13) = 3,809, p = 0,0729). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Negative olfaktorische Verzerrung in einem männlichen CORT-Mausmodell für Depressionen. (A,B) Zeitverlauf und Versuchsgruppen der Studie: Veh- und CORT-Männchen werden im Olfaktorischen Präferenztest mit einem neutralen (OCT: trans-2-octenal, 1% in Wasser), einem positiven (PO: Erdnussöl, rein) und einem negativen Geruch (TMT: 2,4,5-Trimethylthiazol, 5% in Mineralöl) getestet. Veh- und CORT Mäusen wird während der gesamten Dauer des Experiments die Vehicle- bzw. Vehicle + Corticosteron-Lösung verabreicht. Erstellt mit Biorender. (C) Durchschnittliche Zeit, die während der Gewöhnung in den verschiedenen Zonen der Arena verbracht wurde (Gruppe: F(1, 10) = 0,07588, p = 0,7886; Zone: F(2,224, 22,24) = 6,939, p = 0,0036; Wechselwirkung: F(3, 30) = 0,7033, p = 0,5575). (D) Gesamtstrecke, die während des Tests auf Gewöhnung (Hab) und die verschiedenen Gerüche zurückgelegt wurde (Gruppe: F(1, 10) = 4,193, p = 0,0678; Geruch: F(3, 30) = 11,80, p < 0,0001; Wechselwirkung: F(3, 30) = 1,489, p = 0,2375). (E) CORT-Mäuse verbringen weniger Zeit in der Geruchszone als Veh für OCT und PO (Gruppe: F(1, 10) = 5,094, p = 0,0476; Geruch: F(2, 20) = 28,87, p < 0,0001; Wechselwirkung: F(2, 20) = 3,841, p = 0,0388). (F) CORT-Mäuse treten im Vergleich zu Veh seltener in die Geruchszone ein oder tendieren dazu (Gruppe: F(1, 10) = 6,832, p = 0,0259; Geruch: F(2, 20) = 2,738, p = 0,0889; Wechselwirkung: F(2, 20) = 0,2902, p = 0,7512). (G) CORT qmice zeigt einen niedrigeren Präferenzindex für OCT und PO (Gruppe: F(1, 10) = 5,895, p = 0,0356; Geruch: F(2, 20) = 20,83, p < 0,0001; Wechselwirkung: F(2, 20) = 1,437, p = 0,2611). (H) Der Geruchsexplorationsindex ist bei UCMS-Mäusen für alle Gerüche signifikant reduziert (Gruppe: F(1, 10) = 12,35, p = 0,0056; Geruch: F(2, 20) = 0,04381, p = 0,9572; Wechselwirkung: F(2, 20) = 0,3622, p = 0,7006). (I) Der Geruchserkundungsindex für jeden Geruch korreliert positiv mit dem Emotionalitätswert der Tiere (OKT: Pearson R² = 0,5601, F(1, 10) = 12,73, **p = 0,0051; PO: Pearson R² = 0,4495, F(1, 10) = 8,165, *p = 0,0170; TMT: Pearson R² = 0,5061, F(1, 10) = 10,25, **p = 0,0095). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Name	Abkürzung	Verdünnung	Valenz
2,4,5-Trimethylthiazol	TMT	5% in Mineralöl	Negativ
2-trans-octenal	OKT	1 % in Wasser	Neutral
Weiblicher Mausurin	FU	Rein	Positiv
Männlicher Mausurin	MY	Rein	Positiv
Erdnussöl	PO	Rein	Positiv

Tabelle 1: Beispiele für Gerüche mit neutraler, positiver und negativer Wertigkeit.

Ergänzende Datei 1: Protokoll für 4-wöchigen unvorhersehbaren chronischen leichten Stress. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Negative emotionale Verzerrung ist ein Hauptmerkmal depressiver Störungen und von besonderem Interesse, um die Physiopathologie der Krankheit besser zu verstehen. Es ist daher von entscheidender Bedeutung, sowohl die Bewertung sensorischer Verzerrungen in präklinischen Modellen einzubeziehen, um die Charakterisierung des depressiven Phänotyps zu verbessern als auch zu untersuchen, welche biologischen Mechanismen der emotionalen Verarbeitung und ihren Veränderungen in pathologischen Zuständen zugrunde liegen. Darüber hinaus ist der Geruchssinn ein Gefühl der Wahl, um emotionale Verzerrungen zu untersuchen. Aus translationaler Perspektive ist es ethologisch relevant, die emotionale Verarbeitung sowohl bei Mäusen als auch bei Menschen zu erfassen. Darüber hinaus sind olfaktorisches und emotionales System stark miteinander verflochten und teilen im Laufe der Evolution gemeinsame neuronale Strukturen. Es besteht eine starke, wechselseitige Beziehung zwischen gestörtem Geruchssinn und Depression¹⁰, was den Geruchssinn zu einem vielversprechenden und leistungsfähigen Instrument macht, das sowohl für die Diagnose und das Ansprechen auf die Behandlung als auch in der Grundlagenforschung eingesetzt werden kann.

Hier haben wir ein Protokoll für einen olfaktorischen Präferenztest entwickelt, um olfaktorische emotionale Verzerrungen in zwei Mausmodellen für Depressionen zu bewerten. Wichtig ist, dass diese Methode die Bewertung der Reaktion auf eine Vielzahl von Reizen mit variabler Valenz ermöglicht, sowohl positive als auch negative, sowie neutrale Reize, deren Wert unter pathologischen Bedingungen verändert werden könnte. Diese späteren Stimuli sind für die Validität des Tests nicht zwingend erforderlich, können aber interessante Zusatzinformationen in das Experiment einbringen. Dieser Test ermöglicht auch die Bewertung der Skalierbarkeit der Reaktion durch die Verwendung unterschiedlicher Geruchskonzentrationen. Entscheidend ist es, die Reaktion auf Reize mit unterschiedlichen hedonischen Werten zu beurteilen und positive von negativer emotionaler Verarbeitung im Kontext von Depressionen zu trennen. In der Tat deuten präklinische Ergebnisse darauf hin, dass die Behandlung mit Antidepressiva möglicherweise nicht gleichmäßig die gleiche positive und negative olfaktorische Verarbeitung wiederherstellt¹⁴. Die spontane Erkundung von angeborenen hervorstechenden appetitiven oder aversiven Geruchsreizen verhindert auch Störfaktoren durch kognitive oder motivationale Defizite, die mit depressiven Zuständen verbunden sind^30,31. Daher erfordert dieses Protokoll keine langen Lernphasen, was technische Vorteile mit sich bringt. Es ist wichtig zu beachten, dass beide Modelle, die in dieser Studie verwendet wurden, auf Interventionen beruhen, die im Erwachsenenalter durchgeführt wurden, so dass zukünftige Experimente erforderlich sein werden, um zu bewerten, ob dieses Protokoll auch für die Bewertung anderer Depressionsrisikofaktoren, einschließlich Widrigkeiten im frühen Leben, empfindlich ist.

Wichtig ist, dass dieses Protokoll sowohl für männliche als auch für weibliche Personen anwendbar ist, was von entscheidender Bedeutung ist, da Frauen doppelt so häufig von Depressionen betroffen sind wie Männer. Bei Männern ist es jedoch wahrscheinlich, dass Depressionen aufgrund sozialer Erwartungen, Scham oder Stigmatisierung unterdiagnostiziert werden, wie Shi et ^al.32 untersucht. Nichtsdestotrotz scheint sich die Depression zwischen Männern und Frauen in Bezug auf die Symptomatik (klinische Manifestationen), die Ätiologie (biologische Ursachen) und die Vorhersage der Behandlung zu unterscheiden 33,34,35, dennoch sind viele Modelle und Tests der Depression immer noch in erster Linie nur für männliche Probanden konzipiert. Zum Beispiel verwendet der Standard-Urinschnüffeltest²⁴ für Frauen ein ähnliches Protokoll, stützt sich jedoch auf einen einzigartigen sozialen Geruchshinweis. Obwohl dieser Test sehr informativ ist, führt er zu einer kurzen Explorationszeit (30 s bei Kontrollen) und ist hauptsächlich an männliche Mäuse angepasst, da der weibliche Urin für beide Geschlechter nicht die gleiche ethologische und hedonische Bedeutung hat. Schließlich scheint es, dass die olfaktorische hedonische Reaktion empfindlich auf die Behandlung mit Antidepressiva^{reagiert 14}, was unseren Test zu einem Instrument der Wahl macht, um depressive ähnliche Zustände zuverlässig zu charakterisieren, und andere umstrittene Assays wie den Kraftschwimmtest 36,37,38 ersetzt.

Wichtig ist, dass der Test im Vergleich zu den zuvor beschriebenen Tests 21,22,23 zu längeren Stimulus-Explorationszeiten (100-200 s) führt. Eine längere Explorationsdauer ist besonders wichtig, wenn dieser Test beispielsweise mit Live-Überwachungstechniken der neuronalen Aktivität kombiniert wird. Darüber hinaus erfordert dieser Test keinen Nahrungs-/Wasserentzug, wodurch metabolische Störfaktoren vermieden werden. Schließlich kann dieser Test während der Lichtperiode durchgeführt werden, wodurch experimentelle Einschränkungen (inverser Zyklus, Infrarotaufnahmen) reduziert werden.

Um dieses Protokoll erfolgreich durchzuführen, sind jedoch einige technische Schritte entscheidend. Zunächst ist es wichtig, dass die Experimente in einer sehr kontrollierten und stressfreien Umgebung durchgeführt werden: Die Beleuchtung sollte homogen und nicht zu hell sein, und es sollte keine störenden Geräusche oder Gerüche im Raum geben. Mäuse können einmal am Tag in der Arena getestet werden, und der Test muss jeden Tag ungefähr zur gleichen Zeit durchgeführt werden. Darüber hinaus wird bei der Durchführung dieser Versuche ein spezieller Experimentator empfohlen, um den Stress der Tiere zu reduzieren.

Zweitens muss eine ausreichende Erkundung der Arena durch Gewöhnungstage sichergestellt werden. Verbringt eine Maus durchschnittlich weniger als 50 s in einer der Zonen, in denen Petrischalen während der Gewöhnung platziert werden, kann eine oder zwei zusätzliche Gewöhnungstage hinzugefügt werden, bevor die Gerüche getestet werden. Wenn die Maus die Arena immer noch nicht lange genug erkundet, sollte sie von der Analyse ausgeschlossen werden. Im Falle einer anfänglichen unsymmetrischen Erkundung der "Geruchszone" während der Gewöhnung zwischen Versuchsgruppen kann die Berechnung des Präferenzindex angepasst werden, um differentielle spontane Präferenzverzerrungen zu korrigieren, z. B. durch Normalisierung nach der während der Gewöhnung verbrachten Zeit in Bezug auf jede Gruppe oder sogar in Bezug auf ihre eigene Erkundung während der Gewöhnung. Eine weitere Schwierigkeit kann in der Tat die hohe Variabilität zwischen den Versuchsgruppen sein. Wenn das Problem auftritt, können zur Begrenzung der intraindividuellen Variabilität Mäuse an zwei aufeinanderfolgenden Tagen mit demselben Geruch getestet werden. Die Ergebnisse können dann zwischen den beiden Tagen gemittelt werden. Wichtig ist, dass die konsekutive Testung der Geruchsreaktion das explorative Verhalten nicht signifikant beeinflussen^{soll 14}.

In Bezug auf die Geruchszubereitung müssen die Lösungen in einem anderen Raum als dem Test hergestellt werden, und die Experimentatoren sollten sich darüber im Klaren sein, dass die Lösung im Verhaltensraum nicht übermäßig diffundiert. Schließlich sollten Lösungen vorzugsweise kurz vor dem Test hergestellt und in einem geruchsfreien Glasfläschchen aufbewahrt werden, damit der Geruch nicht verblasst oder verunreinigt wird. Bei einigen Gerüchen wie männlichem und weiblichem Mausurin, die angeblich sehr appetitlich sind, sollte die Lösung überprüft werden, wenn Kontrollmäuse keine Explorationswerte aufweisen, die mit einer sehr positiven Wertigkeit verbunden sind. Insbesondere muss Mausurin von jungen Mäusen (maximal 5 Monate alt) kurz vor dem Test (maximal 2-3 Tage vorher) frisch entnommen und bei 4 °C gelagert werden, um die Geruchseigenschaften zu erhalten. Zu beachten ist, dass die Entnahme an mehreren aufeinanderfolgenden Tagen Auswirkungen aufgrund von Östruszyklusstadien bei weiblichen Mäusen verhindern sollte. Bei Bedarf kann der Urin für eine längerfristige Lagerung bei -20 °C aufbewahrt werden, wobei dieses Verfahren nicht empfohlen wird, da es die Geruchsintensität sinnvoll reduziert. In ähnlicher Weise kann auch die empfundene Angenehmheit von Erdnussöl unterschiedlich sein, zum Beispiel je nach Charge oder Marke. Wichtig ist, dass zwei unterschiedliche Gerüche oder Gerüche mit unterschiedlichen Konzentrationen in den Kammern anstelle der "Kontrollzone" ohne Geruchsmittel hinzugefügt werden können, um die Präferenz zwischen zwei Odorierungslösungen zu messen.

Schließlich kann der Geruchspräferenztest auf verschiedene Weise angepasst werden, um sein Design zu verbessern und seine Anwendungsmöglichkeiten zu erweitern. Abgesehen von der motorischen Auslesung könnte die Beurteilung der emotionalen Reaktion durch diesen Test durch die Kombination verschiedener Techniken zur Messung verschiedener Komponenten von Emotionen verbessert werden⁶. So kann beispielsweise ein Ultraschallmikrofon neben der Arena aufgestellt werden, um Ultraschalllaute aufzuzeichnen, die als Reaktion auf bestimmte positive und negative Reize ausgesendet werden können^24,39. Die Körpertemperatur kann auch mit einer Infrarotkamera oder einem implantierbaren Echtzeit-Telemetriesender überwacht werden 40,41,42. Einige dieser Transmitter sind sogar in der Lage, die Herz- und Atemfrequenz abzurufen 43,44,45. Die Kombination dieser Instrumente würde dazu beitragen, eine verfeinerte Verhaltensbewertung der emotionalen Reaktion zu erstellen. Der olfaktorische Präferenztest kann auch leicht mit anderen Techniken gekoppelt werden, um neuronale Mechanismen hinter emotionaler Dysregulation weiter aufzuklären, wie z. B. Optogenetik, Faserphotometrie oder Mini-Scope-Live-Imaging oder in vivo elektrophysiologische Aufnahmen. Schließlich kann dieses Protokoll leicht in die Klinik übertragen werden, indem die Bewertung von sensorischen Verzerrungen und hedonischer Geruchsreaktion in die Humanforschung und sogar als Instrument für die Diagnostik oder Behandlung integriert wird.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
2,4,5-Trimethylthiazol	Sigma-Aldrich	W332518-100G-K
2-fach Oktenal	Sigma-Aldrich	Artikel-Nr.: 52464-1ML
Blu-tack	UHU	N/A
Filterpapier	Fisher Scientific	11710125	42,5 mm
Fläschchen aus Glas	DUTSCHER DOMINIQUE	958983
Mineralöl	Sigma-Aldrich	M5904-500ML
Noldus Ethovision	Noldus Ethovision	Version 17.5	Alternativ könnte auch Single Mouse Tracker in der Open-Source-Software ICY oder Deeplabcut verwendet werden
Petrischale	Falke	351007	60 mm x 15 mm Petrischale mit 7 maßgefertigten Löchern von 5 mm Durchmesser
Arena aus Plexiglas	Sonderanfertigung	N/A	45 cm x 50 cm x 25 cm große Plexiglasarena, die durch eine 37 cm x 25 cm große Wand in der Mitte in zwei Kammern unterteilt ist.