Methodenartikel

Reproduzierbare Herstellung von SPOT als Gerüst-basierte Kulturplattform mit hohem Durchsatz

DOI:

10.3791/68405

⸱

29. Juli 2025

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1Institute of Biomedical Engineering, University of Toronto, 2Department of Chemical Engineering and Applied Chemistry, University of Toronto, 3Division of Engineering Science, University of Toronto

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll dokumentiert die Herstellung und Montage von SPOT, einer auf Gerüsten basierenden Hochdurchsatz-Kulturplattform, in den Formaten 96 und 384 Wells. Außerdem wird der Aussaatprozess für SPOT sowohl manuell als auch mit einem handelsüblichen Liquid-Handler beschrieben.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In der Krebsforschung werden zunehmend Patienten-entstammte Organoide (PDOs) eingesetzt, um Tumore zu modellieren. Sie kombinieren die Vorteile von in vivo und traditionellen in vitro Modellen, indem sie die Komplexität und Heterogenität des Gewebes rekapitulieren, während sie immer noch aus menschlichen Zellen bestehen. Das Aufkommen physiologisch repräsentativer PDO-Modelle hat zu einem Bedarf an Geräten geführt, die eine einfache Analyse des Verhaltens von Organoiden ermöglichen. In diesem Protokoll wird erläutert, wie die Scaffold-supported Platform for Organoid-based Tissues (SPOT), ein dreidimensionales (3D) Organoid-Kulturgerät mit hohem Durchsatz, zusammengebaut und verwendet wird. Diese Plattform eliminiert den Meniskus, der typischerweise von ausgesäten Hydrogelen gebildet wird, und ermöglicht so eine genaue, schnelle Bildgebung, ähnlich dem Bildgebungsprozess für zweidimensionale (2D) Kulturen. Dadurch können Organoide und Co-Kulturen, die in SPOT ausgesät wurden, leicht mit Hilfe der Hochdurchsatzmikroskopie abgebildet werden. SPOT wurde für den Standardgebrauch entwickelt, ist für Forscher mit grundlegender Erfahrung in Gewebekulturen zugänglich und sowohl mit manuellen als auch mit automatisierten Aussaat-Workflows kompatibel. Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von SPOT in den Formaten 96 und 384 Wells, einschließlich Schritt-für-Schritt-Anleitungen für Montage, Seeding, Qualitätskontrolle und Fehlerbehebung. Während die Herstellung 3-4 Stunden ohne Leerlaufzeiten benötigt, können mehrere Platten gleichzeitig hergestellt werden, was die Skalierbarkeit verbessert. Durch die Rationalisierung der PDO-Kultur und -Analyse bietet SPOT ein robustes Werkzeug für das Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening und die translationale Krebsforschung.

Einleitung

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Trotz Fortschritten in der biomedizinischen Forschung bleibt die Entwicklung physiologisch relevanter In-vitro-Assays eine Herausforderung. Ein idealer Assay sollte eine Vielzahl von Zelltypen, Behandlungsformulierungen, Zeitskalen, kommerziellen Instrumenten und analytischen Messwerten berücksichtigen, um den Anforderungen von Forschern aus verschiedenen Disziplinen gerecht zu werden. Aufgrund des Mangels an geeigneten Werkzeugen verlassen sich Forscher jedoch oft auf vereinfachte Modelle, wie z. B. 2D-Monoschichten immortalisierter Zelllinien, die die Komplexität und klinische Relevanz nicht rekapitulieren, insbesondere in der Krebsforschung 1,2. Um dieses Problem zu lösen, haben groß angelegte Tumor-Biobanken und die Zusammenarbeit mit Klinikern die Entwicklung von hochgenauen In-vitro-Modellen wie patientenabgeleiteten Tumororganoiden (PDOs) vorangetrieben, die im Vergleich zu Zelllinien patientenspezifischere genetische und therapeutische Profile aufweisen 3,4,5. In der Zwischenzeit erfordern Fortschritte in der Laborautomatisierung und Wirkstoffforschung Plattformen, die sich nahtlos in Hochdurchsatz-Arbeitsabläufe integrieren lassen. Während bestehende Plattformen entweder biologische Genauigkeit oder Skalierbarkeit bieten, waren nur wenige in der Lage, beide Herausforderungen gleichzeitig zu lösen 6,7,8. Die Entwicklung automatisierter Hochdurchsatzmodelle, die wichtige Krankheitsmerkmale replizieren, ist entscheidend für die Weiterentwicklung der biomedizinischen Forschung und die Beschleunigung der Datengenerierung für translationale Anwendungen.

Zahlreiche neue Modelle zielen darauf ab, die Herausforderungen zu bewältigen, die mit der Kultivierung spezialisierter Zelltypen, wie z. B. PDOs, mit hohem Durchsatz verbunden sind (Abbildung 1). Standardplattformen, bei denen Organoide mit Hydrogel in 96- oder 384-Well-Platten gemischt werden, weisen mehrere Einschränkungen auf: (i) ein hohes Zell-Gel-Volumen führt zu einem inkonsistenten Nährstoffzugang, (ii) die Krümmung des Well-Meniskus führt zu bildgebenden Artefakten und zellulären Gradienten, (iii) die Hydrogel-Aussaat ist über Chargen und Personal hinweg nicht einheitlich, (iv) Inkompatibilität mit automatisierter Herstellung und automatisierter Mikroskopie und (v) die Verwendung von extrazellulärer Matrix (ECM), die in der Regel weich und zerbrechlich ist. Zerstörung bei physiologischen Gewebedichten oder Einbau kontraktiler Zelltypen 1,9. Gegenwärtig wird die Mehrzahl der plattenbasierten PDO-Studien entweder durch manuelles Aussäen des Zellgels in die Platte10,11 oder durch ein Gel-Overlay-Verfahren durchgeführt, bei dem das Hydrogel mit einem weniger viskosen Medium verdünnt wird und die Zellen bis zum Bohrlochboden zentrifugiert werden, um sie in der geeigneten optischen Ebenezu platzieren 12,13. Beide Ansätze bieten keine mechanische Unterstützung für eine langfristige Kultur. Basierend auf unseren früheren Beobachtungen (unveröffentlichte Daten) zieht sich kommerzielles Hydrogel, das mit Zellen in Standard-Well-Platten gemischt ist, in 9 von 12 Wells über einen Zeitraum von 12 Tagen von den Oberflächen des Wells zusammen, während bei der Gel-Overlay-Methode physiologische Zell-Matrix-Wechselwirkungen fehlen. Darüber hinaus können die resultierenden Kulturen aufgrund von Platzbeschränkungen innerhalb der Vertiefung nicht über lange Zeiträume aufbewahrt werden und sind nicht mit Assays kompatibel, die ein hohes Reagenzien-Zell-Medium-Verhältnis erfordern 14,15,16. Diese praktischen Hindernisse behindern die Einführung von 3D-Modellen und schränken die experimentelle Reproduzierbarkeit in der gesamten Praxis ein.

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Abbildung 1: Bewertung von Kulturmodellen auf Basis von Skalierbarkeit und biologischer Relevanz. Die relative Positionierung verschiedener in vitro und in vivo Kultursysteme entlang der Skalierbarkeit (y-Achse), definiert durch den Plattendurchsatz, und der biologischen Relevanz (x-Achse), wobei die Kompromisse zwischen Durchsatzpotenzial und physiologischer Genauigkeit hervorgehoben werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Motiviert durch diese Herausforderungen wurden die hohe Porosität und die mechanische Verstärkung eines dünnen Zellulosegerüsts genutzt, um die Scaffold-supported Platform for Organoid-based Tissues (SPOT) zu entwickeln, die sowohl im 96- als auch im 384-Well-Format erhältlich ist. SPOT enthält ein polymer-vorstrukturiertes Gerüst unter Verwendung eines zuvor entwickelten Infiltrationsverfahrens17, das dem Plattenlayout entspricht, eine präzise Platzierung von Zell-Gel-Tröpfchen ermöglicht und eine strukturelle Unterstützung für die Hydrogelphase bietet (Abbildung 2A). Der Kapillartransport in das Gerüst leitet die Zell-Gel-Lösung und bildet ein mechanisch verstärktes Biokomposit-Netzwerk (Abbildung 2B). Aufgrund der porösen Struktur des Gerüsts infiltriert das Zellgel und bildet eine dünne Schicht (etwa 70 μm dick), wodurch eine zehnmal geringere Menge an Zellgel erforderlich ist, um den Boden der Vertiefung zu bedecken14. Die Verträglichkeit von SPOT mit der Aussaat von PDAC-PDOs (Pankreas-duktales Adenokarzinom) wurde ebenfalls durch die Beurteilung ihres Wachstums mit Hilfe von metabolischen Assays und bildbasierten Messungen nachgewiesen. Seit seiner Entwicklung hat SPOT eine erhebliche Vielseitigkeit und Benutzerfreundlichkeit für Forscher bewiesen, die sich mit Organoidkulturen beschäftigen. Darüber hinaus bietet das Design von SPOT eine benutzerfreundliche Skalierbarkeit mit reduzierten Reagenzienvolumina und verbesserten Bildgebungsmöglichkeiten durch seine flache, meniskusfreie Mikrogelgeometrie, die eine gleichmäßige Lichtdurchdringung und eine genaue High-Content-Bildgebung gewährleistet14 (Abbildung 2C,D). SPOT unterstützt auch die Co-Kultur mit anderen relevanten Zelltypen, wie z. B. Fibroblasten, um die Mikroumgebung des Tumors besser zu rekapitulieren18.

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Abbildung 2: Überblick über das 96-SPOT-Gerät und den Arbeitsablauf für die Bildanalyse. (A) Schematische Darstellung der Herstellung von SPOT-Platten: Das Gerät wird zusammengebaut, indem eine handelsübliche Bottomless-Well-Platte (oben), ein Gerüst mit PMMA-Muster (in blau dargestellt) und eine Polycarbonatfolie (unten) unter Verwendung von Schichten aus doppelseitigem Polyacrylkleber (gelb dargestellt) zusammengebaut werden. (B) Aussaat der Zellen in die Vertiefung des Gerüsts: Die Zellen werden in einem nicht polymerisierten Hydrogel (rosa dargestellt) suspendiert und in jede Vertiefung pipettiert, wo es das Gerüst infiltriert. Das Hydrogel wird dann geliert, um die Zellen in dem gerüstgestützten Hydrogel einzukapseln. (C) Mikroskopie: Das resultierende Mikrogewebe kann mit Hilfe der automatisierten Weitfeldmikroskopie abgebildet werden. (D) Bildbasierte Analyse: Aufgenommene Bilder von fluoreszierenden Zellen (grün), die in Gel suspendiert sind, können mit Standard-Bildanalyse-Pipelines analysiert werden. Repräsentative Epifluoreszenzmikroskopie-Aufnahme von GFP-exprimierenden KP4-Zellen in einem 96-SPOT-Well. Die Maßstabsleiste beträgt 500 μm. Diese Zahl wurde von14 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ein weiterer Vorteil von SPOT besteht darin, dass das System in einen Open-Source-Liquid-Handler integriert werden kann, was die automatisierte, reproduzierbare Herstellung von PDO-Kulturen ermöglicht. Diese Weiterentwicklung reduziert die Variabilität der Anwender und unterstützt komplexe experimentelle Designs, einschließlich Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening und personalisierter medizinischer Ansätze18. Es wurde bereits gezeigt, dass SPOT mit der einzelzellbasierten Multiplex-Charakterisierung zellulärer Phänotypen in heterogenen Tumorumgebungen und der Extraktion der Zellen bei Bedarf aus SPOT durch Verdau kompatibel ist18. Diese Eigenschaften positionieren SPOT als vielseitiges Werkzeug für Screening-Anwendungen, bei denen hochaufgelöste Längsschnittdaten für die Bewertung der Wirksamkeit von Arzneimitteln und des zellulären Verhaltens unter physiologisch relevanten Bedingungen unerlässlich sind14,18. Durch die Kombination dieser technischen Innovationen überwindet SPOT kritische Einschränkungen in herkömmlichen 3D-Kultursystemen.

Dieses Protokoll bietet einen umfassenden Leitfaden für die Herstellung von SPOT-Komponenten, die Montage von Platten und Aussaatmethoden für robuste und reproduzierbare 3D-Organoidkulturen. Es enthält detaillierte Anweisungen für die manuelle Plattenaussaat mit einer Mikropipette und automatisierte Seeding-Workflows mit einem Liquid Handler, der sowohl 96- als auch 384-Well-Formate unterstützt. Darüber hinaus beschreibt dieses Protokoll wesentliche Qualitätskontrollmaßnahmen, wie z. B. die Überprüfung der gleichmäßigen Gelverteilung und der Integrität des Gerüsts, um hohe experimentelle Standards aufrechtzuerhalten. Es werden auch Strategien zur Fehlerbehebung bereitgestellt, um häufige Probleme wie unvollständige Gelinfiltration, Verdunstung während der Aussaat und Gerüstablösung zu beheben und den Forschern praktische Lösungen an die Hand zu geben, um ihre Arbeitsabläufe zu optimieren und zuverlässige Ergebnisse zu erzielen.

SPOT wurde entwickelt, um die Lücken zu schließen, mit denen herkömmliche Organoid-Assays konfrontiert sind, einschließlich der Herausforderungen im Zusammenhang mit der Durchführung von Assays und Medienwechseln bei gleichzeitiger Wahrung der Gelintegrität 10,11,12,13. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, eine gerüstgestützte Plattform herzustellen, die die Organoidkultur über einen Zeitraum von 12 Tagen unterstützt. Darüber hinaus deckt diese Methode auch die Erzeugung von Gewebearrays in SPOT durch manuelles oder Liquid Handler-gestütztes Seeding ab, um den Anwendern die Durchführung nachgelagerter Störungen zu ermöglichen, einschließlich IC50-Assays für Medikamente und Screening kleiner Moleküle.

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Protokoll

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In diesem Protokoll wurden am Beispiel Organoide des duktalen Adenokarzinoms (PDAC) des Pankreas verwendet. Diese Organoide wurden von PDAC-Patienten ermittelt und von der UHN-Biobank des Princess Margaret Cancer Centre (PMLB-Kennung PPTO.46 des University Health Network, Kanada) im Rahmen eines Protokolls in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Research Ethics Board der University of Toronto (Protokoll #36107) gekauft. Bitte beachten Sie alle erforderlichen Materialien, Reagenzien und Geräte in der Materialtabelle.

1. Herstellung von PMMA-Aceton-Lösung (Zeit: 20 min + ~8-16 h im Leerlauf)

HINWEIS: Polymethylmethacrylat (PMMA)-Acetonlösung wird in SPOT verwendet, um Bohrlöcher abzugrenzen und Leckagen zwischen den Bohrlöchern zu verhindern. Das allgemeine Verfahren besteht darin, festes PMMA in Aceton aufzulösen. Zuvor wurde PMMA-Aceton-Lösung verwendet, um ein ähnliches Papiergerüst zu strukturieren, um den Medien- und Gasaustausch zu blockieren und Hypoxie in einem anderen 3D-Kulturmodellzu erreichen 17. Hier wird die PMMA-Aceton-Formel angepasst, um PMMA-infiltrierte Gerüste für die SPOT-Fertigung zu erzeugen.

  1. In ein beschriftetes konisches 50-ml-Zentrifugenröhrchen 1,75 g PMMA-Pulver geben. Geben Sie dann in einen Abzug 7,84 ml Aceton und verschließen Sie das Röhrchen fest, um eine Verdunstung des Lösungsmittels zu vermeiden.
  2. Wenn eine Visualisierung des Polymermusters erforderlich ist, geben Sie 5-10 Tropfen Nagellack in die Lösung. Verschließen Sie das Zentrifugenröhrchen fest. Schütteln Sie die Tube manuell, um die Politur mit der PMMA-Aceton-Lösung zu mischen.
    HINWEIS: Um über mehrere Plotchargen hinweg konsistent zu sein, verdünnen Sie eine bekannte Menge Nagellack in Aceton und pipettieren Sie diese Lösung dann als 7,84 ml Aceton.
  3. Geben Sie die PMMA-Aceton-Lösung über Nacht auf den Vortex-Mischer, um sicherzustellen, dass sich die Lösung auflöst. Lagern Sie die PMMA-Aceton-Lösung ungeöffnet bei 4 °C für maximal 2 Wochen.

2. Herstellung von PMMA-infiltrierten Gerüsten

(Zeitplan: Für 96-SPOT-Strukturierung: 15 min Aufbau + 6 min pro Gerüst; für 384-SPOT-Strukturierung: 15 min Aufbau + 10 min pro Gerüst)

HINWEIS: Die Herstellung von PMMA-infiltrierten Gerüsten für 96-/384-SPOT erfolgt ausschließlich auf einer Werkbank (unsterile Umgebung). Um 96/384-SPOT-Gerüste herzustellen, stellen Sie bitte sicher, dass die entsprechende Grafikbearbeitungs-Plotter-Software oder die Vektorplotter-Steuerungsbibliothek installiert ist. Bitte beachten Sie, dass einige Unterabschnitte des Verfahrens sowohl für 96-SPOT als auch für 384-SPOT gelten, während andere spezifisch für eine Plattengröße sind. Im letzteren Fall werden die Optionen A (für 96-SPOT) und B (für 384-SPOT) vorgestellt. Für das (A) 96-SPOT-Muster gibt es drei Schichten; Erstens stellen die Grundierungslinien einen gleichmäßigen Fluss der PMMA-Aceton-Lösung her; zweitens das Array von 96 Kreisen; Schließlich werden in einem Muster des Handlungsreisenden (TSP) die Zwischenräume dargestellt. Für das (B) 384-SPOT-Muster enthält das erste Modul Grundierungslinien; zweitens die Grenze, die die Bohrlochplatte umgibt; Zuletzt wird ein Raster so gezeichnet, dass 384 Regionen übrig bleiben. Bei beiden Mustern können die Größen der Vertiefungen durch Ändern des Quellcodes gesteuert werden, wie Li et al.14 zeigen.

  1. Aufbau für die Gerüstversickerung
    1. Lassen Sie die PMMA-Aceton-Lösung (bei 4 °C gelagert) 10 Minuten lang bei Raumtemperatur schütteln. Lassen Sie den Röhrenhalter, bis der Plott beginnt.
    2. Schließen Sie den Plotter über das Netzkabel an die Stromversorgung an. Ein grünes Blinklicht zeigt an, dass das Gerät eingeschaltet ist. Stecken Sie das USB-Kabel des Plotters in den dafür vorgesehenen Computer, um zu plotten.
    3. Decken Sie die Staffelei mit einem Blatt Pergamentpapier ab. Stellen Sie sicher, dass die gesamte Oberfläche der Staffelei bedeckt ist.
      1. Um das Plotten von 96-/384-SPOT-Mustern zu unterstützen, bereiten Sie eine 96-/384-SPOT-Vorlage auf einem Blatt Druckerpapier vor. Führen Sie die Schritte 2.2-2.3 mit einem Stift anstelle einer Spritze aus und drucken Sie Papier anstelle des Pergamentpapiers und des Teefilters. Sobald die Vorlage fertig ist, positioniere sie auf der Clip-Staffelei und decke sie mit Pergamentpapier ab. Fahren Sie mit Schritt 2.2 fort und befolgen Sie das Protokoll zur Herstellung von 96-/384-SPOT-Gerüsten.
    4. Klemmen Sie das Pergamentpapier mit Klammern auf die Staffelei (Abbildung 3A). Nehmen Sie ein Blatt Gerüst (z. B. Teefilterpapier) und schneiden Sie entlang der Seiten, an denen die beiden Schichten miteinander verschmolzen sind (Abbildung 3B).
    5. Positionieren Sie den abgeschnittenen Teefilter - im Folgenden Papiergerüst genannt - mit der glatten Seite (Außenseite des Teefilters) nach oben auf die Clip-Staffelei. Klemmen Sie es an drei Seiten fest. Stellen Sie sicher, dass das Papiergerüst auf der Clip-Staffelei vollständig abgeflacht ist. Es dürfen keine Falten im Plotbereich vorhanden sein.
  2. Plotten des 96/384-SPOT-Musters
    1. Um die Plottersoftware und -datei für 96-SPOT einzurichten, folgen Sie der Option 2.2.2; Um die Software und die Datei für 384-SPOT einzurichten, folgen Sie der Option 2.2.3.
    2. Einrichten der Plottersoftware und der 96-SPOT-Plotdatei
      1. Öffnen Sie in der Software-App die SVG-Datei für 96-SPOT (Ergänzungsdatei 1; Abbildung 4A). Navigieren Sie in der Menüleiste zu Extensions > Plotter Control (Erweiterungen Plottersteuerung ) (Abbildung 4B).
      2. Wenn das neue Fenster angezeigt wird, passen Sie die Einstellungen an die ergänzende Abbildung 1 an. Kehren Sie zur Registerkarte Plotten des Fensters Erweiterung der Plottersteuerung zurück. Lassen Sie dies für später offen.
    3. Einrichten der API für die Vektorplotter-Steuerungsbibliothek und der 384-SPOT-Plotdatei
      1. Öffnen Sie das Eingabeaufforderungsfenster (Windows) bzw. Terminal (Mac). Geben Sie den Befehl ein, um das angegebene Interactive Computing-Notebook zu starten. Stellen Sie sicher, dass das Notizbuch in einem Browser geöffnet wird.
      2. Wählen Sie die 384-SPOT-Codedatei (Zusatzdatei 2) aus, die geöffnet werden soll. Aspirieren Sie mit einer 20-G-Spitze (oder 16-G-Spitze für das 384-SPOT-Muster) 1 ml PMMA-Aceton-Lösung mit der 3-ml-Plotspritze (Abbildung 3C).
        HINWEIS: Das Durchflussregelventil zwischen der 10-ml-Ladespritze und dem EVA-Schlauch muss geöffnet sein (parallel zum Zylinder). Da der Infiltrationsprozess durch die Schwerkraft gesteuert wird, stellen Sie sicher, dass die 3-ml-Plottspritze immer zwischen der 0,5- und 1,5-ml-Markierung gefüllt ist, um ein gleichmäßiges Dosiervolumen während des Plottens zu gewährleisten.
    4. Während sich die Spitze der 3-ml-Plotspritze noch in der PMMA-Aceton-Lösung befindet, schließen Sie das Durchflussregelventil zwischen der 10-ml-Ladespritze und dem EVA-Schlauch (bringen Sie es senkrecht zum Zylinder).
    5. Verschließen Sie schnell die Tube mit der PMMA-Aceton-Lösung. Legen Sie die 3-ml-Spritze auf den Penhalter. Passen Sie die Höhe der Spritze in Bezug auf den Halter an, um die folgende Ausrichtung zu erreichen (Abbildung 3D).
    6. Passen Sie die Position der Clip-Staffelei so an, dass die Spitze der 3-ml-Spritze am Ursprung des geplotteten Musters aufliegt (d. h. am dunklen Punkt oben links im Schablonenmuster). Heben Sie den Plotterstifthalter mit der daran befestigten Spritze an, um die Clip-Staffelei darunter zu schieben.
    7. Trennen Sie die 10-ml-Spritze schnell vom Schlauch, damit der atmosphärische Druck Druck auf die in der 3-ml-Plottspritze gelagerte PMMA-Aceton-Lösung ausüben kann. Öffnen Sie das Durchflussregelventil.
    8. Um mit dem Plotten des 96-SPOT-Musters zu beginnen, führen Sie die Schritte 2.2.9 aus. Um mit dem Plotten von 384-SPOT zu beginnen, befolgen Sie Schritt 2.2.10.
    9. Starten Sie das Plotten von 96-SPOT in dem dafür vorgesehenen Plotter wie unten beschrieben.
      1. Klicken Sie in der Software auf Anwenden für den Plotter Control Extensions. Der Plotter beginnt nun zu laufen und zeichnet das PMMA-Muster auf. Es sind keine weiteren Aktionen erforderlich, bis das Plotten abgeschlossen ist und der Plotterstifthalter in seine Ausgangsposition zurückkehrt.
      2. Um den Plotter während des Plottens anzuhalten, drücken Sie den kleinen silbernen Knopf auf der linken Seite des Plotters. Wählen Sie dann über die Registerkarte "Steuerelementerweiterungen" > "Fortsetzen " des Plotters in der Grafiksoftware aus, ob das Plotten an der Stelle fortgesetzt werden soll, an der es gestoppt wurde, oder ob der Stifthalter in die Ausgangsposition zurückversetzt werden soll (Ergänzende Abbildung 1C(iii)).
    10. Initiieren Sie das Plotten von 384-SPOT in der angegebenen Rechenschnittstelle, wie unten beschrieben.
      1. Klicken Sie in der Benutzeroberfläche auf Kernel neu starten und erneut ausführen (Doppelpfeil in der Symbolleiste). Der Code beginnt nun mit der Ausführung und zeichnet das PMMA-Muster auf. Es sind keine weiteren Aktionen erforderlich, bis das Muster fertig geplottet ist und der Stifthalter in seine Ausgangsposition zurückkehrt.
      2. Um den Plotter während des Plottens anzuhalten, drücken Sie die kleine silberne Taste auf der linken Seite des Plotters. Bewegen Sie den Druckkopf manuell ganz nach hinten und links, sodass er seine Ausgangsposition erreicht. Schließen Sie den Plotter wieder an die Stromversorgung an. Im Gegensatz zum Plotten von 96-SPOT gibt es keine Möglichkeit, das Plotten für 384-SPOT von der Stelle aus fortzusetzen, an der es angehalten wurde. Ersetzen Sie das Papiergerüst und beginnen Sie den Code von vorne.
  3. Entladen der Spritze und Aufräumen
    1. Sobald das Plotten abgeschlossen ist, befestigen Sie die 10-ml-Spritze wieder an den Schlauch. Nehmen Sie die 3-ml-Spritze aus dem Plotterstifthalter und geben Sie die restliche PMMA-Aceton-Lösung zurück in das Vorratsfläschchen oder entsorgen Sie sie, wenn während der vorherigen Schritte eine signifikante Verdunstung aufgetreten ist.
    2. Waschen Sie den Zylinder der 3-ml-Spritze, indem Sie Aceton einpipettieren. Lassen Sie das Spritzenschlauchsystem an der Luft trocknen, bevor Sie es an seinen Aufbewahrungsort zurückbringen.
    3. Lösen Sie das SPOT-Gerüst vorsichtig von der Clip-Staffelei.
    4. Überprüfen Sie die gezeichneten SPOT-Gerüste, um sicherzustellen, dass sie für Experimente verwendet werden können (Abbildung 3E, F). Weitere Informationen finden Sie in Tabelle 1 zur Fehlerbehebung und in den Tabellen 2 und 3 zur Qualitätssicherung und -kontrolle.
    5. Bewahren Sie alle Gerüste mit PMMA-Muster in einem Zip-Lock-Beutel an einem kühlen, trockenen Ort auf.

3. Schneiden von 96/384-Well-Bändern

(Zeitplan: Für 96-SPOT-Musterung: 15 min pro 5 Stück Band; für 384-SPOT-Musterung: 30 min pro 5 Stück Band)

HINWEIS: Dies ist eine der effizientesten Methoden, um Bänder präzise und effizient zu schneiden, insbesondere bei 384-Well-Bandmustern. Dieses Verfahren bietet auch die Möglichkeit, eine Schicht des Bandes mit dem Laser zu gravieren (Kunststoff der oberen Abdeckung), um die Benutzerfreundlichkeit während des Montageprozesses zu verbessern. Alternativ können die Bänder auch mit Papierschneidern langsamer geschnitten werden, ohne dass der Gravurprozess erforderlich ist.

  1. Öffnen Sie die 96-/384-Well-Bandmuster-Laserschneiddatei (Zusatzdatei 3, Zusatzdatei 4) und laden Sie das mit drei verschiedenen Farben codierte Druckmuster in die Laserschneidsoftware, indem Sie mit den folgenden Einstellungen in der ergänzenden Abbildung 2A auf Plotten klicken.
  2. Legen Sie ein Stück Klebeband auf die Oberfläche des Laserschneiders und stellen Sie sicher, dass das Klebeband glatt auf der Oberfläche abgeflacht ist. Verwenden Sie entweder Papierbänder oder schwere Gewichte, um die Bänder während des Schneidens festzuhalten.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Klebeband flach auf der Oberfläche des Laserschneiders liegt. Jede Beule kann die Qualität von geschnittenen Bändern beeinträchtigen, insbesondere von 384-Well-Bändern.
  3. Passen Sie die Position des Druckmusters an die Position des Bandes an, basierend auf dem Handbuch des Laserschneiders.
  4. Schneiden Sie beide 96-/384-Well-Bänder mit der gleichen Laserschneideinstellung wie in der ergänzenden Abbildung 2B gezeigt. Die Reihenfolge der Linien mit bestimmten Farben ist wichtig. Schneiden Sie zuerst die rote Linie vor der grünen Linie ab. Schneide das Blau zum Schluss ab.
    Rote Linie: Rast/Vest-Modus mit 45 % Laserleistung, 80 % Geschwindigkeit, 1000 PPI und 0,50 mm Z-Achse.
    Grüne Linie: Rast/Vest-Modus mit 7 % Laserleistung, 100 % Geschwindigkeit, 1000 PPI und 0,50 mm Z-Achse.
    Blaue Linie: Rast/Vest-Modus mit 50 % Laserleistung, 80 % Geschwindigkeit, 1000 PPI und 0,50 mm Z-Achse.
  5. Lagern Sie die gemusterten Bänder bis zur SPOT-Montage ordnungsgemäß.

4. Montage 96/384-SPOT (Zeit: 1 h)

HINWEIS: In diesem Abschnitt wird das Verfahren für die Montage von 96-/384-SPOT-Produkten in einer sterilen Umgebung, wie z. B. einer Biosicherheitswerkbank (BSC), beschrieben. Alternativ können die 96-/384-SPOT-Geräte in einer unsterilen Umgebung vormontiert und anschließend über ein Ethylengas-Sterilisationsverfahren sterilisiert werden.

  1. Vorbereitung des SPOT-Gerüsts für die Montage
    1. Nehmen Sie ein Gerüst mit PMMA-Muster für entweder 96- oder 384-SPOT. Schneiden Sie das überschüssige Papier um den blauen Bereich des Gerüsts herum ab. Lassen Sie 5 mm Weißraum um den Umfang des blauen Bereichs. Das resultierende Blech wird ca. 760 mm x 1300 mm groß sein.
      HINWEIS: Schneiden Sie die Grundierungslinie nicht ab. Es ist nützlich, um zu bestimmen, welche Seite des Gerüsts rau/glatt ist (Abbildung 3E,F).
    2. Um ein 96-SPOT-Gerüst für die Montage vorzubereiten, befolgen Sie Schritt 4.1.3. Um ein 384-SPOT-Gerüst vorzubereiten, befolgen Sie Schritt 4.1.4.
    3. Führen Sie die Perforation der Zwischenräume auf dem Gerüst 96-SPOT durch.
      1. Legen Sie ein Stück Polyethylenfolie (1000 mm x 1500 mm) auf einen starren Acrylträger (2700 mm x 2700 mm). Legen Sie den mit einer Polyethylenfolie überzogenen Träger auf die Arbeitsfläche und legen Sie das Gerüst über die Polyethylenfolie (Abbildung 5A).
      2. Richten Sie eine Kante des Lineals zwischen den ersten beiden Zeilen so aus, dass das Nachzeichnen entlang dieser Kante nicht in ein Vertiefungsfeld geführt wird.
      3. Setzen Sie das Pausrad gegen das Lineal am unteren Rand des Gerüsts. Rollen Sie das Spurrad nach oben bis zur Oberseite des Gerüsts und verwenden Sie das Lineal, um den Weg der Klinge zu führen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Abstände zwischen den Reihen auf dem Gerüst (z. B. 7x).
      4. Wiederholen Sie die Schritte 4.1.3.2 und 4.1.3.3 für jeden zweiten Abstand zwischen den Spalten, beginnend mit dem Abstand zwischen den ersten beiden Spalten.
    4. Führen Sie keine Perforation der Zwischenräume auf dem Gerüst 384-SPOT durch, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
      1. Perforieren Sie nicht die Zwischenräume des 384-SPOT-Gerüsts. Fahren Sie direkt mit Schritt 4.2 fort.
  2. Sterilisieren von SPOT-Materialien und Montageanlagen
    1. Legen Sie das bedruckte Gerüst, zwei 96-Well-Bänder (oder 384-Well-Bänder), eine 96-Well-Bottomless-Platte (oder eine 384-Well-Bottomless-Platte), eine 96-Well-Plattenabdeckung (oder eine 384-Well-Plattenabdeckung), die Polycarbonatfolie, die Polydimethylsiloxan-Platte (PDMS), die wiederverschließbare Plastiktüte, die Pinzette und das Präzisionsmesser auf einer Seite 20 Minuten lang in den BSC, UV (Abbildung 5B).
    2. Drehen Sie alle Materialien und Montagegeräte auf die andere Seite und UV-Verfahren für weitere 20 Minuten.
  3. Befestigung des Gerüsts am ersten 96/384-Well-Band
    1. Legen Sie das Gerüst mit der rauen Seite nach oben (Bild 3F) so auf die PDMS-Decke, dass die Reihen horizontal verlaufen. Verwenden Sie die Priming-Linie, um zu bestimmen, welche Seite rau ist (Rechtsbündig zeigt die Priming-Linie mit der rauen Seite nach oben an).
    2. Glätten Sie das Gerüst auf der PDMS-Platte so, dass keine Falten oder Blasen auf (oder unter) dem Gerüst vorhanden sind. Entfernen Sie die Schutzschicht von der nicht gravierten Seite des doppelseitigen Klebebandes. Schnallen Sie die Mitte des Bandes leicht an und richten Sie die mittleren beiden Spalten des Bandes am Gerüst aus.
    3. Sobald es ausgerichtet ist, drücken Sie die Mitte des Klebebandes nach unten. Glätten Sie das Klebeband auf dem Gerüst, beginnend in der Mitte und nach außen.
      HINWEIS: Ein falsch ausgerichtetes Gerüst weist ein offensichtliches PMMA-Muster auf, das sich in den Well-Seeding-Bereich überschneidet.
    4. Verwenden Sie die Pinzette, um das Gerüst vorsichtig von der PDMS-Platte zu entfernen und die Platte für zukünftige Fertigungen aufzubewahren.
  4. Befestigung des Gerüsts an zweitem 96/384-Well-Band
    1. Stellen Sie das Gerüst auf die Werkbank. Drehen Sie das Gerüst so um, dass die glatte Seite (nicht verklebte Seite) nach oben zeigt.
    2. Entfernen Sie die mittlere Schutzschicht von der gravierten Seite des zweiten Klebebandes. Stellen Sie sicher, dass die beiden mittleren Spalten des Klebebandes freiliegen. Wenn das nicht gravierte Klebebanddesign verwendet wird, entfernen Sie die Schutzschicht von einer Seite vollständig.
    3. Schnallen Sie die Mitte des Bandes leicht an und richten Sie die mittleren beiden Spalten des Bandes am Gerüst aus.
    4. Sobald das Klebeband auf dem Gerüst ausgerichtet ist, drücken Sie die Mitte des Klebebandes nach unten. Wenn das gravierte Klebeband verwendet wird, entfernen Sie die beiden anderen Schutzschichten, die an den freiliegenden Mittelteil des Klebebandes angrenzen. Glätten Sie das Klebeband auf dem Gerüst, beginnend in der Mitte und nach außen.
  5. Befestigung des Gerüsts an der bodenlosen Platte
    1. Entfernen Sie die Schutzschicht des Bandes von der rauen Seite des Gerüsts. Wenn Sie das gravierte Klebebanddesign verwenden, entfernen Sie nur die mittlere Schutzschicht.
    2. Richten Sie das Gerüst an der Unterseite der bodenlosen Platte (mit Deckel) aus. Drücken Sie nach dem Ausrichten die Mitte des Gerüsts auf die Unterseite der Platte. Wenn Sie das gravierte Design verwenden, entfernen Sie die Schutzschichten, die an die freiliegende Mitte angrenzen. Glätten Sie das Gerüst von der Mitte nach außen auf der Platte.
  6. Befestigung des Gerüsts an der Polycarbonatfolie
    1. Lösen Sie mit einer Pinzette vorsichtig die Schutzschicht der Polycarbonatfolie. Sobald sie sich gelöst hat, ziehen Sie die Schutzschicht langsam von der Folie ab. Erstellen Sie keine Vertiefungen in der Folie, da dies die optischen Eigenschaften für die Mikroskopie beeinträchtigt.
    2. Wiederholen Sie Schritt 4.6.1 mit der anderen Seite der Polycarbonatfolie. Sobald beide Schutzschichten entfernt sind, legen Sie die Folie auf die Werkbank.
    3. Entfernen Sie die Schutzschicht von dem Klebeband, das an der Unterseite der Platte befestigt ist. Drücken Sie die Polycarbonatfolie von der Mitte nach außen auf das Gerüst.
    4. Drücken Sie die Polycarbonatfolie fest auf den Plattenboden, so dass alle Vertiefungen einen gut ausgeprägten Rand erhalten.
    5. Schneiden Sie mit einem Präzisionsmesser vorsichtig das überschüssige Material vom Plattenboden ab.
      HINWEIS: Achten Sie besonders darauf, nicht in die Platte oder eine der Vertiefungen zu schneiden. Wenn das Messer nicht leicht durchschneidet, prüfen Sie, ob es in die Platte schneidet.
  7. Lagerung von 96/384-SPOT nach der Montage
    1. Nachdem Sie 96-SPOT vollständig zusammengebaut haben, legen Sie es in eine durchsichtige, wiederverschließbare Plastiktüte. Bringen Sie die Tasche vor das BSC.
    2. Platzieren Sie eine starre Acrylstütze auf der Unterseite der Platte. Klemmen Sie die Acrylstütze an gegenüberliegenden Ecken an die Platte (Abbildung 5C). Vor dem Gebrauch mindestens 30 Minuten an jeder Ecke festklemmen.
    3. Lagern Sie die Platte bis zur Verwendung an einem sauberen, trockenen Ort.

5. Aussaat 96/384-SPOT (Zeit: 2 h 45 min)

HINWEIS: In diesem Abschnitt wird das Verfahren zum Seeden von 96-/384-SPOT-Geräten zur Erstellung einheitlicher 3D-Mikrogewebe beschrieben. Der Seeding-Prozess beinhaltet das sorgfältige Dispensieren eines definierten Zell-Gel-Volumens (z. B. 5 μL für 96-SPOT oder 2 μL für 384-SPOT) auf das vormontierte SPOT-Gerüst. Um eine gleichmäßige Infiltration und Gelverteilung zu gewährleisten, wird das Zell-Gel-Tröpfchen durch Kapillardochte entlang der porösen Struktur des Gerüsts geführt. Dieser Schritt kann manuell mit einer Mikropipette oder automatisiert mit Liquid Handling durchgeführt werden. Nach der Aussaat werden die Platten bei 37 °C inkubiert, um eine Gelpolymerisation und Zellverkapselung zu ermöglichen.

  1. Vorbereitung der 96/384-SPOT-Platte
    1. Lösen Sie 96-/384-SPOT und entfernen Sie die Acrylstütze von der Unterseite.
    2. Entfernen Sie in einem BSC SPOT aus der Plastiktüte. Schalten Sie die UV-Strahlung ein, um das Innere der Platte zu sterilisieren, und decken Sie sie 20 Minuten lang ab, bevor Sie den Deckel schließen und für weitere 20 Minuten UV-Behandlung auf den Boden der Platte klappen.
    3. Pipettieren Sie 70 μl PBS in jeden Zwischenraum der 96-SPOT-Platte. Pipettieren Sie PBS nicht in die 384-SPOT-Platte. Kühle die Platte vor der Aussaat mindestens 30 Minuten lang bei 4 °C.
  2. Vorbereitung der Zellen
    1. Trennen Sie Zellen aus Kulturflaschen oder Organoide von Gelkuppeln auf der Grundlage der empfohlenen Handhabung und zählen Sie die Zellmenge mit dem Hämozytometer gemäß den Anweisungen des Herstellers. Notieren Sie die Zelldichte der Zellsuspension (d. h. die Anzahl der Zellen pro ml), um das für die Schritte 5.4.1 bis 5.4.2 erforderliche Zellsuspensionsvolumen basierend auf der gewünschten Seeding-Dichte zu berechnen.
  3. Zubereitung des Gels
    1. Befolgen Sie die zuvor optimierten Anweisungen zur Herstellung von Hydrogelen 17,19,20,21 und stellen Sie das Hydrogel her, indem Sie 1 ml 3 mg/ml Rinderkollagen vom Typ 1 in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen abgeben.
      HINWEIS: Die Komponenten und die resultierende Mischung müssen während der gesamten Zubereitungszeit auf Eis aufbewahrt werden.
    2. Geben Sie 125 μl 10x konzentriertes Minimum Essential Medium (MEM) in das Rinderkollagen ab. Pipettieren Sie langsam auf und ab, um zu mischen, bis die Mischung von rosa zu gelb wird.
    3. Geben Sie 8 μl 0,8 M Natriumbicarbonat in die Rinderkollagenmischung. Pipettieren Sie langsam auf und ab, um zu mischen, bis die Mischung blassrosa wird. Verwenden Sie die gemischte Lösung innerhalb von 30 Minuten nach der Zubereitung, um eine konsistente Gelierung über mehrere Experimente hinweg zu gewährleisten.
      HINWEIS: Wenn die Mischung gelb bleibt, titrieren Sie die Lösung auf pH 7, indem Sie 0,8 M in 0,5 μl Aliquots hinzufügen, bis eine blassrosa Farbe erreicht ist. OPTIONAL: Nach dem gleichen Verfahren kann das Gel für Kulturen hergestellt werden, die eine höhere Kollagenkonzentration erfordern. Für die Kultivierung von Organoiden verwenden Sie die Hydrogelmischung, die von Landon-Brace et al.17 charakterisiert wurde.
  4. Suspension der Zellen in Gel
    1. Geben Sie das für die Zielzell-Gel-Dichte erforderliche Volumen der Zellsuspension in ein Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie es 5 Minuten lang bei 300 x g .
    2. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in Gel (das Volumen variiert je nach Zielkonzentration)
  5. Säen von 96-/384-SPOT-Platten manuell
    1. Legen Sie die 96-/384-SPOT-Platte auf einen gefrorenen Eisbeutel. Um 96-SPOT zu seeden, führen Sie die Schritte 5.5.2 aus. Um das Seeding für 384-SPOT durchzuführen, führen Sie die Schritte 5.5.3 aus.
    2. Manuelles Säen von 96-SPOT
      1. Beschichten Sie eine 10 μL Pipettenspitze mit der Zell-Gel-Mischung. 5 μl Gel mit einer 20-μl-Pipette aspirieren und bis zum ersten Anschlag ausstoßen, bis sich an der Spitze ein Tröpfchen bildet. Berühre das Tröpfchen in der Mitte einer Vertiefung.
        HINWEIS: Beim Ausstoßen des Gels durch Drücken der Pipette bis zum zweiten Anschlag können Luftblasen entstehen. Alle Wells müssen innerhalb von 5 Minuten ausgesät werden, um eine gleichmäßige Gelierung zwischen den Wells zu gewährleisten.
      2. Nachdem Sie alle gewünschten Vertiefungen ausgesät haben, decken Sie die Platte ab und inkubieren Sie bei 37 °C für 45 min gemäß den Anweisungen des Herstellers, um das Gel zu polymerisieren. Geben Sie 200 μl des Mediums in jede ausgesäte Vertiefung und inkubieren Sie mindestens 1 Stunde ohne Unterbrechung, bevor eine Bildgebung oder Störung erforderlich ist.
    3. Manuelles Seeden von 384-SPOT
      1. Beschichten Sie eine 10 μL Pipettenspitze mit der Zell-Gel-Mischung. 2 μl Gel mit einer 10 μl Pipette aspirieren und bis zum ersten Anschlag ausstoßen, bis sich an der Spitze ein Tröpfchen bildet.
        HINWEIS: Eine Mehrkanalpipette mit 10 μl wird dringend empfohlen.
      2. Berühre das Tröpfchen in der Mitte einer Vertiefung. Nachdem Sie alle gewünschten Vertiefungen ausgesät haben, decken Sie die Platte ab und inkubieren Sie bei 37 °C für 45 min gemäß den Anweisungen des Herstellers, um das Gel zu polymerisieren.
      3. Geben Sie 60 μl des Mediums in jede ausgesäte Vertiefung und inkubieren Sie mindestens 1 Stunde lang ununterbrochen, bevor eine Bildgebung oder Störung erforderlich ist.
    4. Aussaat 96/384-SPOT mit einem Liquid Handler
      1. Schalten Sie während der Vorbereitung der Zell-Gel-Mischung den Liquid Handler und sein HEPA-Filtermodul auf hohe Stufe ein. Sprühen Sie vorsichtig 70 % Ethanol in den Liquid Handler und wischen Sie es mit ethanolgetränkten Papiertüchern ab.
      2. Laden Sie entweder das 96-SPOT- oder das 384-SPOT-Seeding-Protokoll (Zusatzdatei 5 oder Zusatzdatei 6), bevor Sie die Pipettenkopfkalibrierung durchführen. Installieren Sie Temperaturmodule in den Steckplätzen 1 und 4 (Abbildung 6A).
      3. Verwenden Sie zu Kalibrierungszwecken die dafür vorgesehenen Boxen mit P20- und P200-Filterspitzen. Legen Sie sie in die Steckplätze 5 bzw. 6 ein (Abbildung 6B). Kalibrieren Sie den Pipettenkopf basierend auf den in der Software angezeigten Anweisungen. Wechseln Sie nach der Kalibrierung zur sterilen P20- und P200-Filterspitzenbox, um sie auf die Schlitze 5 und 6 zu säen. Besprühen Sie die Oberfläche erneut mit 70% Ethanol und schließen Sie die Tür bis zur Aussaat.
        HINWEIS: Es ist wichtig, die Spitzen bis zur Oberseite der 96-/384-SPOT-Platte genau zu kalibrieren. Es wird empfohlen, Plattendichtband zu verwenden, um die Z-Achse der Spitzen relativ zur Oberseite der Platte zu visualisieren. Die ideale Position ist, wenn die Spitzen des Mehrkanalkopfes alle das Plattendichtband berühren und eine winzige Delle erzeugen.
    5. Schalten Sie beide Temperaturmodule ein und stellen Sie sie auf 4 °C ein, während sich die Zellen während der Vorbereitung der Zell-Gel-Mischung im letzten Schleuderschritt befinden. Nach Abschluss von Schritt 5.4 laden Sie die gewünschte Menge des Zell-Gel-Gemisches in jedes Röhrchen der 8-Streifen-0,2-ml-PCR-Röhrchen im BSC.
      HINWEIS: Das Mindestvolumen des Zell-Gel-Gemisches, das in jedes Röhrchen geladen werden muss, beträgt: 96-SPOT: 5 μl multipliziert mit der Anzahl der Säulen, die ausgesät werden mussten, zuzüglich des Totvolumens; 384-SPOT: 2 mal 2 μl multipliziert mit der Anzahl der Säulen, die ausgesät werden mussten, mal und dann plus dem Totvolumen. Es wird empfohlen, das Totvolumen bei etwa 10 - 20 μL pro Röhrchen zu halten, um Blasen und unvollständige Säulen gegen Ende zu vermeiden.
    6. Verschließen Sie die 8-Streifen-0,2-mL-PCR-Röhrchen mit den 8-Streifen-Schieberkappen, bevor Sie das Zell-Gel-Gemisch auf Eis aus dem BSC übertragen.
    7. Legen Sie die vorgekühlte SPOT-Platte mit dem Formatblock für die Flachbodenplatte auf das Temperaturmodul in Steckplatz 4 ein (Abbildung 6B).
    8. Laden Sie die 8-Streifen-0,2-mL-PCR-Röhrchen mit dem Zell-Gel-Gemisch auf das Temperaturmodul in Steckplatz 3 mit dem 96-Well-Formatblock.
    9. Öffnen Sie die flachen Kappen und den SPOT-Plattendeckel und bewahren Sie sie im Liquid Handler auf, aber nicht in der Nähe der verwendeten Schlitze. Öffnen Sie den Deckel der Filterspitzenbox P20 und P200.
    10. Führen Sie das Protokoll aus. Nachdem Sie alle gewünschten Vertiefungen ausgesät haben, decken Sie die Platte ab und inkubieren Sie bei 37 °C für 45 min gemäß den Anweisungen des Herstellers, um das Gel zu polymerisieren.
    11. Dispensieren Sie 200 μl oder 60 μl (96-/384-SPOT) des Mediums in jede ausgesäte Vertiefung und inkubieren Sie mindestens 1 Stunde lang ununterbrochen, bevor eine Bildgebung oder Störung erforderlich ist.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die PMMA-Strukturierung des Papiergerüsts dient als physische Barriere, um den Austausch von Inhalten zwischen Vertiefungen zu verhindern. Dieses Design ist entscheidend, um sicherzustellen, dass benachbarte Vertiefungen chemisch und biologisch isoliert bleiben, um eine unbeabsichtigte Diffusion von Medien, Arzneimitteln, sezernierten Faktoren oder sogar Zellen zu verhindern14. Die Einbeziehung von PMMA ermöglicht eine präzise Kompartimentierung, was SPOT zu einer zuverlässigen Plattform für Hochd...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In diesem Protokoll wird eine detaillierte Anleitung für die Herstellung und Verwendung von 96- und 384-Well-SPOT bereitgestellt, die die Montage, die manuelle und die Liquid-Handler-gestützte Zell-Gel-Aussaat abdeckt. Im Gegensatz zu herkömmlichen Hydrogel-Plug-Systemen eliminiert SPOT meniskusbedingte Artefakte und ermöglicht so eine zerstörungsfreie In-situ-Bildgebung von Organoiden, wie zuvor beschrieben 14,16,22.

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren danken Jennifer Lam für ihre Hilfe bei der Bilderfassung. Abbildung 1, Abbildung 2 und Abbildung 7A wurden mit BioRender.com erstellt. Diese Arbeit wurde durch den Discovery Grant des Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) (Grant #RGPIN-2021-03488) an A.P.M. unterstützt; das Canada First Research Excellence (CFREF) Medicine by Design Grand Questions-Programm an A.P.M.; die NSERC Canada Graduate Scholarships - Doktorandenprogramm für R.C.; den Peterborough K.M. Hunter Charitable Foundation Award an R.C.; das CRAFT-Stipendium des National Research Council (NRC), das an N.T.L. vergeben wurde; das NSERC CREATE TOeP bis N.T.L.; den NSERC Undergraduate Student Research Award an Z. K.; und den University of Toronto Excellence Award an C.M.T.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,2 ml PCR-Röhrchen (Streifen mit 8 Stück) & nbsp;Sarstedt72.985.002
1,5 mL ZentrifugenröhrchenFroggaBioLMCT1.7B
1000-& mu; L PipettenspitzenFinsternis4-1019-260-000
Serologische 10-ml-PipettenFroggaBio394010
10-ml-SpritzeBD, Kanada302995
10x Minimal essentielles Medium (MEM 10x)Gibco11430030
150-mm-SchüsselCorning430599
16-Gauge-Dosierkanülen mit Luer-Lock-AnschlussMcMaster-Carr, Illinois, Vereinigte Staaten von AmerikaArtikel-Nr.: 6699A2
20&Mikro; L Filterspitzen RacksOpentrons999-00099
200&Mikro; L Filterspitzen RacksOpentrons999-00081
200-& mu; L PipettenspitzenFinsternis4-1030-260-000
20-Gauge-Dosierkanülen mit Luer-Lock-AnschlussMcMaster-Carr, Illinois, Vereinigte Staaten von Amerika6699A4
384-Well-Well-Platte ohne Boden (schwarz)Greiner82051-544
3-ml-Spritze BD, Kanada309657
Konisches Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen / 50 mlVWRCA21008-940
Konisches Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen / 50 mlVWRCA21008-940
96-Well-Well-Platte ohne Boden (schwarz)Greiner82050-714
AcetonFisher ScientificNr. A18-1
Analytische WaageN/AN/A
AxiDraw Erweiterung für Inkscape (https://wiki.evilmadscientist.com/Axidraw_Software_Installation)N/AN/A
AxiDraw Python API (https://axidraw.com/doc/py_api/#installation) N/AN/A
AxiDraw V3 Persönliche Hochleistungs-Schreib- und ZeichenmaschineBöse verrückte Wissenschaftler, USAN/A
Rinderkollagen (PureCol 3 mg/ml)Fortschrittliche BioMatrix5005
Zelllinie der WahlN/AN/A
Clip Easel (im Lieferumfang von AxiDraw V3 enthalten)Böse verrückte Wissenschaftler, USAN/A
Nährmedien der WahlN/AN/A
Schutzband zum Auffangen von Schmutz3M6851 PN36851
Doppelseitiges Polyacryl-Klebeband (800 mm x 1200 mm)Klebstoffforschung, ARcare90106NB
Fötales Rinderserum (FBS)Gibco12483-020
Finum Teefilter XL Riensch & Held GmbH & Co. KG, Hamburg, Deutschland420.69.00
Flache Verschlüsse für 0,2 mL PCR-Röhrchen (Streifen mit 8 Stück)Sarstedt65.989.002
Robuste Federklemmen aus KunststoffBENCHMARK1024-554
HEPA-Modul – Modell mit 110-130 V und 60 HzOpentrons999-00109
Eisbeutel (gefroren, 1400 mm x 1800 mm)N/AN/A
Inkscape-SoftwareN/AN/A
LaserschneiderUniverselles LasersystemVLS3.75
Miniaturschlauch aus Ethylvinylacetat (EVA) mit einem Außendurchmesser von 0,07 ZollMcMaster-Carr, Illinois, Vereinigte Staaten von AmerikaNr. 1883T3
Elektronische Mehrkanalpipette P20 (Gen2)Opentrons999-00005
Elektronische Mehrkanalpipette P300 (Gen2)Opentrons999-00006
NagellackSally HansenSBS-006861Optional, zum Pigmentieren von PMMA-Tinte
Opentrons OT-2Opentrons999-00111
P1000 PipetteGilsonFA10006M
P200 8-Kanal-PipetteGilsonF144072
P200 PipetteGilsonFA10005M
PapierhandtücherN/AN/A
ParafilmBemis Company, Inc.52859-079
Pergamentpapier   N/AN/A
Pasteur-PipettenVWR14672-380
Penicillin-Streptomycin (P/S)Sigma-AldrichNr. P4333
Poly(methylmethacrylat) (PMMA)Sigma-Aldrich182230
Polycarbonat-Folie (760 mm x 1300 mm)McMaster-CarrArtikel-Nr.: 85585K102
Polydimethylsiloxan-Monomer und -Vernetzer (PDMS, 1500 mm x 2700 mm)Ellsworth Klebstoffe4019862
PräzisionsmesserN/AN/A
Starre Acrylhalterung (Größe an der Unterseite der Well-Platte angebracht)McMaster-CarrArtikel-Nr.: 8560K239
Halterung aus starrem KartonN/AN/A
LinealN/AN/A
Schere N/AN/A
Natriumbicarbonat (0,8 M in destilliertem Wasser)Sigma-AldrichNr. S6014
Temperaturdeck mit Aluminiumblöcken (Gen2)Opentrons999-00097
Tastrad HEEPDD (Amazon)B07YQWB284
Transparentes Klebeband N/AN/A
Trypan-BlauGibco15250-061
TrypsinGibco25200-056
PinzetteN/AN/A
Vortex-Mischer N/AN/A

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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