Erzeugung frei schwebender normaler humaner Epithel-Fibroblasten-Sphäroid-Cokulturen

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein einfaches und sehr praktisches, aber zuverlässiges Protokoll für die direkte sphäroidale Co-Kultivierung von menschlichen Lungenepithelzellen und Fibroblasten, ohne auf eine Matrix angewiesen zu sein.

Zusammenfassung

Dreidimensionale (3D) Kultursysteme werden immer beliebter, da sie in der Lage sind, natürliche Zelleigenschaften und -architekturen zu reproduzieren und so gewebeähnliche Strukturen in vitro nachzuahmen. Unter diesen Modellen stellt die Kultur von kugelförmigen Zellaggregaten (sogenannten Sphäroide), die in eine halbfeste extrazelluläre Matrix (EZM) eingebettet sind, ein fortschrittliches near-in-vivo-Zellkulturmodell dar, da es unterschiedliche funktionelle Zellzustände als Ergebnis von Zell-Zell- und Zell-EZM-Wechselwirkungen sowie Sauerstoff- und Nährstoffgradienten ermöglicht. Da Sphäroide technisch weniger anspruchsvoll und relativ kostengünstig in der Beschaffung sind, werden sie häufig im Wirkstoffscreening und in der Toxizitätsprüfung eingesetzt, um ein High-Content-Screening für die Erprobung neuer Medikamente in der präklinischen Phase zu ermöglichen. Zu diesem Zweck werden überwiegend 3D-Strukturen verschiedener Tumoren nachgebildet. Gleichzeitig ist Matrigel derzeit eine der am weitesten verbreiteten EZMs und gilt als Goldstandard in der Sphäroid- und Organoid-Kultivierung, obwohl es sich um eine auf Mausversuchen basierende 3D-Matrix handelt, deren Extraktion – wie Tierversuche im Allgemeinen – mit großen ethischen Bedenken verbunden ist. In dieser Arbeit stellen wir ein matrixfreies Protokoll für die direkte sphäroidale Co-Kultivierung von humanen Bronchialepithelzellen und Fibroblasten vor, das als optimierte Co-Kultivierungsmethode angesehen werden kann, insbesondere hinsichtlich der epithelial-Fibroblasten-Kommunikation und der Interaktionen innerhalb der jeweiligen Sphäroide, ohne auf eine (tierische) Trägermatrix angewiesen zu sein. Durch die Etablierung dieser frei schwebenden epithelial-fibroblastoiden Sphäroid-Cokulturen als patientenorientierte in vitro Plattform zur Modellierung normaler (Lungen-)Gewebetoxizitäten krebstherapeutischer Ansätze kann nicht nur eine Reduzierung der Anzahl der Versuchstiere, sondern auch ein adäquater und sinnvoller Ersatz entsprechender Tierversuche erreicht werden.

Einleitung

Zweidimensionale (2D) Zellkulturen, in denen flache Monolayer-Zellen kultiviert, expandiert und dann für zellbasierte Forschungsassays plattiert werden, sind nach wie vor eine einfache, bequeme, kostengünstige und weit verbreitete Methode für präklinische Standard-Screening-Verfahren ^1,2. Um die interaktive (parakrine) Wechselwirkung zwischen verschiedenen Zelltypen in vitro zu untersuchen, kann ein konditioniertes Medium aus einem Zelltyp zur Stimulation eines anderen Zelltyps verwendet werden. Darüber hinaus haben sich verschiedene Co-Kultur-Methoden herausgebildet, z.B. indirekte Methoden, bei denen co-kultivierte Zellen mit Hilfe einer mikroporösen Membran physikalisch getrennt werden. Diese "Transwell-Systeme" enthalten einen Einsatz (die mikroporöse Membran), der in eine herkömmliche 2D-Zellkulturplatte eingelegt wird. Ein Zelltyp wird dann ausgesät und auf der Membran gezüchtet, wobei er das gleiche Medium wie der andere Typ teilt, der auf der Begleitvertiefung wächst, wodurch eine bidirektionale parakrine Kommunikation ermöglicht^{wird 2}. Die beiden Zelltypen könnten sogar auf den beiden Seiten der Membran ausgesät werden, wodurch sie eher eine direkte Zell-zu-Zell-Kontakt-Cokultur bilden, die für die Untersuchung barrierestrukturierter Gewebe geeignet ist ^3,4.

Die zellulären Antworten dieser selbst fortschrittlichen 2D-Zellkultursysteme spiegeln jedoch nicht immer die Ergebnisse der entsprechenden Tierversuche und sogar klinischer Studien wider, was unter anderem auf das Fehlen einer direkten Signalübertragung zwischen den verschiedenen Zelltypen und damit auf das Fehlen von in vivo-ähnlichen zellulären Organisationen zurückzuführen ist. Daher sind dreidimensionale (3D) Kultursysteme aufgrund der Fähigkeit natürlicher Zelleigenschaften und Architekturen, gewebeähnliche Strukturen in vitro nachzuahmen, immer beliebter geworden ^5,6. Unter diesen Modellen stellt die Kultivierung von sphärischen Zellaggregaten, sogenannten Sphäroiden, die in halbfeste extrazelluläre Matrizen eingebettet sind, ein fortschrittlicheres Zell-Co-Kulturmodell dar, bei dem unterschiedliche funktionelle zelluläre Zustände nach Zell-Zell- und Zell-ECM-Interaktionen sowie Gradienten von Sauerstoff und Ernährung erreicht werden können⁷. Diese gewünschten komplexeren in vivo ähnlichen in vitro Kulturen 3D-Kulturen sollten in Bezug auf die Größe der Zellanordnung homogen erzeugt und aufrechterhalten werden, während sie gleichzeitig die Zellentwicklung und -differenzierung fördern und gleichzeitig effektiv, schnell, konsistent und bequem sind ^7,8.

Unter Ausnutzung der natürlichen Eigenschaften der Selbstaggregation und Adhäsion werden Sphäroide (hauptsächlich Tumorsphäroide) in der Regel mit der Hanging Drop-Technik erzeugt ^9,10. Als eine der ersten Techniken zur Erzeugung embryonaler Körper hat sich der Hanging Drop Assay zu einer weit verbreiteten Methode zur Erzeugung zahlreicher homogener Sphäroide entwickelt, die auf den Prinzipien der Schwerkraft und Oberflächenspannung vor der ECM-Einbettung unter Verwendung von Matrigel, dem "Goldstandard" der extrazellulären Matrizen, basieren, obwohl es sich um Maus-basierte Matrizen handelt. Es wurden erhebliche Anstrengungen unternommen, um Sphäroide in gerüstfreien Ansätzen zu erzeugen ^8,11. So können beispielsweise Sphäroide unter Verwendung einer Zellkulturflasche mit Rührwerk erzeugt werden und so das Cell Seeding verhindert werden, die einfachste Methode, um Sphäroide in großem Maßstab herzustellen¹².

Das Schwierigste bei der Komplexierung von Zellkulturen und damit bei der Etablierung eines physiologisch wertvollen Systems wie in vivo wie in vitro Alternativen im eigenen Labor sind komplexe Protokolle mit vielen verschiedenen Schritten (die noch etabliert werden müssen). Zum Beispiel sind die Erzeugung zellulärer Strukturen zunächst mit einer Methode, ihre Ernte und ihre anschließende Einbettung in eine Matrix, insbesondere die Verwendung von Matrizen, die nicht einfach zu handhaben sind, kritische Schritte, die mehr Überzeugungsarbeit erfordern, bevor eine Methode routinemäßig und seriell eingesetzt werden kann. Hier haben wir eine extrem niedrige Attachment-Platte im 96-Well-Format verwendet, die praktisch keine Zellbindung an die Kulturware für die Etablierung komplexer 3D-Sphäroide von Lungenepithelzellen und Fibroblasten ermöglicht. Die resultierenden Sphäroide werden innerhalb von 24 h sehr gleichmäßig und ziemlich schnell gebildet, was die experimentelle Zeit verkürzt. Eine verlängerte Kultivierung und damit ein zuverlässiges Zellwachstum und eine Differenzierung werden über den gesamten Zeitraum in der gleichen Vertiefung durchgeführt, so dass nach der initialen Beschichtung über den gesamten Kultivierungszeitraum nur das Medium ausgetauscht werden muss. Daher stellen wir ein sehr einfaches, schnelles und daher sehr praktisches Protokoll zur Erzeugung menschlicher Lungensphäroide vor, die das Atemwegsepithel morphologisch und funktionell auf nahezu physiologischem Niveau replizieren. Ein weiterer Vorteil ist, dass dieses Protokoll leicht an andere Zellen angepasst werden kann.

Protokoll

Alle Schritte werden unter sterilen Bedingungen (Biosicherheitswerkbank) durchgeführt. Die in dieser Studie verwendeten Medienzusammensetzungen finden Sie in Tabelle 1.

1. Vorbereitung des Versuchsmaterials

1. Kultivieren und expandieren von humanen normalen Lungenepithelzellen (HBEC3-KT) auf Standard-Kunststoff-Zellkulturschalen (T75-Kolben) in normalem Epithelwachstumsmedium unter Verwendung eines Standard-Inkubators¹³ (siehe Tabelle 1).
   HINWEIS: Für ein verbessertes Wachstum kann das Medium zusätzlich mit 10% fetalem Kälberserum (FCS) ergänzt werden.
2. Kultur humaner Fibroblasten (HS-5) in RPMI-Medium, ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum und Penicillin/Streptomycin^10,14 (siehe Tabelle 1).
3. Bereiten Sie verzweigtes Lungenorganoid-Medium (BLO-Medium) vor, indem Sie DMEM/F12 mit N-2, B27, Penicillin-Streptomycin, Rinderserumalbumin, Monothioglycerin, Ascorbinsäure, KGF/FGF7, FGF10, ATRA und CHIR99021 ergänzen. (siehe Tabelle 1 und Tabelle der Materialien).
   HINWEIS: Es wird empfohlen, das Medium frisch zuzubereiten, mindestens unter Zusatz von KGF/FGF7, FGF10, ATRA und CHIR99021. Wird innerhalb kurzer Zeit mehr Medium benötigt, empfiehlt sich nur eine kurze Lagerdauer von wenigen Tagen (bis zu 1 Woche) bei 4 °C. Alternativ kann das kommerziell erhältliche PneumaCult Airway Organoid Differentiation Medium verwendet werden.

2. Präparation von Epithelzellen und Fibroblasten

HINWEIS: Verwenden Sie beide Zelltypen, wenn die Zellen eine Konfluenz von etwa 80 % erreichen. Bereiten Sie jeden Zelltyp separat vor.

1. Entfernen Sie das Kulturmedium und entsorgen Sie es.
2. Waschen Sie die Zellen, indem Sie die Zellschicht kurz mit 5 mL PBS spülen.
3. Trypsinisieren Sie Epithelzellen durch Zugabe von 2 ml 0,5 % Trypsin-EDTA, gefolgt von einer kurzen Inkubation bei 37 °C für 4-8 Minuten.
4. Ernten Sie abgerundete und fast abgelöste Zellen durch Zugabe von normalen Wachstumsmedien oder PBS, ergänzt mit 10 % FCS unter Verwendung einer serologischen 5-ml-Pipette.
5. Pipettieren Sie das entsprechende Volumen mehrmals im T75-Kolben auf und ab (entlang der Wachstumsoberfläche), um die Zellklumpen weiter zu trennen, und überführen Sie die Zellsuspension in ein 15-ml-Röhrchen.
6. HS5-Fibroblasten werden jeweils mittels TE-Trypsinisierung bei 37 °C für 3-5 min geerntet.
7. Pelletieren Sie jeden Zelltyp (und somit frei von Trypsin) durch Zentrifugation (z. B. 300-400 × g für 5 min bei Raumtemperatur [RT]) und resuspendieren Sie (sowohl Epithelzellen als auch Fibroblasten) in 1-2 ml normalem epithelialem Wachstumsmedium vor der Zählung.
8. Bestimmung der Anzahl lebensfähiger Zellen unter Verwendung eines geeigneten Volumens resuspendierter Zellen; jeweils 1/5 mit 0,4 % Trypanblauer Beize in einer Neubauer-Zählkammer unter dem Mikroskop verdünnt.

3. Erzeugung von epithelial-Fibroblasten 3D-Sphäroidkulturen

1. Verdünnen Sie die gewünschte Anzahl von Zellen in normalem epithelialem Wachstumsmedium mit einem 15-ml-Röhrchen. Berechnen Sie 2000 Epithelzellen mit 50 Fibroblasten in 100 μl Medium für jede Vertiefung der 96-Well-Platten. Die resultierende Zellzahl, die für eine 96-Well-Platte ausreicht, beträgt 200.000 HBEC-Zellen und 5.000 HS5-Fibroblasten in 10 ml normalem epithelialem Wachstumsmedium.
2. Vorsichtig mit sterilen 10-ml-serologischen Pipetten mischen.
3. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein steriles Reagenzreservoir für eine Mehrkanal-Mikropipette.
4. Säen Sie die Zellen in eine Platte mit extrem niedrigem Anheftungsgrad aus, indem Sie 100 μl der Zellsuspension mit einer (12-Kanal) Mehrkanalpipette in jede Vertiefung übertragen.
5. Unter Standard-Zellkulturbedingungen bei 37 °C und 5 % CO₂ in befeuchteter Atmosphäre inkubieren.
   HINWEIS: Die Sphäroidbildung wird durch regelmäßige mikroskopische Untersuchungen mit einem inversen Mikroskop und durch Fotografieren von Sphäroiden für jeden gewünschten Zeitpunkt beurteilt.
6. Geben Sie nach 4 Tagen 100 μl BLO-Medium pro Vertiefung zu den erzeugten Sphäroiden.
7. Unter Standard-Zellkulturbedingungen bei 37 °C und 5 % CO₂ in einer befeuchteten Atmosphäre weiter inkubieren.

4. Durchführen eines regelmäßigen Medienwechsels

1. Führen Sie nach 7-8 Tagen einen regelmäßigen Medienwechsel durch. Positionieren Sie daher die Platte in einem leichten Winkel, so dass die Sphäroide in Kipprichtung entsprechend der Schwerkraft absinken.
2. Saugen Sie den Überstand vorsichtig und so gut wie möglich mit einer 100-200 μL Pipettenspitze an.
3. Positionieren Sie die Platte horizontal neu und füllen Sie sie mit 100-150 μl BLO-Medium pro Vertiefung (mit einer Mehrkanalpipette)
4. Unter Standard-Zellkulturbedingungen bei 37 °C und 5 % CO₂ in einer befeuchteten Atmosphäre weiter inkubieren oder ein Experiment/eine Behandlung starten.
   HINWEIS: Die Sphäroide können über einen längeren Zeitraum (bis zu 21 Tage) kultiviert werden. Danach muss mindestens zweimal pro Woche ein kompletter Medienwechsel durchgeführt werden.

5. Nachgelagerte Analysen (Gewinnung von Sphäroiden)

1. Führen Sie regelmäßige mikroskopische Untersuchungen und Dokumentationen durch, indem Sie Fotos in Kombination mit Sphäroidgrößenmessungen und Volumenberechnungen anfertigen, um schließlich die Quantifizierung des Sphäroidwachstums und potenzieller Wachstumsveränderungen nach Behandlungen zu ermöglichen.
2. Für die Bildgebung von lebenden Zellen zu den gewünschten Zeitpunkten inkubieren Sie die Sphäroide für weitere 15 Minuten mit 1 μg/mL Hoechst 33342 (oder DAPI) für die Zellkernfärbung und analysieren Sie sie durch Fluoreszenzmikroskopie.
3. Ernten Sie die erzeugten Sphäroide zum gewünschten Zeitpunkt mit einer 200-μl-Pipette unter abgeschnittenem Auslass (steril halten), um den Durchmesser zu vergrößern. Aspirieren Sie daher auch das Medium, das das Sphäroid enthält. Kombinieren und sammeln Sie die Sphäroide in einem 2-5 mL Röhrchen. Nach 2-5 Minuten, wenn die Sphäroide aufgrund der Schwerkraft gesunken sind, entfernen Sie den Überstand und fahren Sie mit der nachgelagerten Analyse fort.
4. Zur Erzeugung ganzer sphäroider Proteinlysate geben Sie direkt eiskalten Lysepuffer (150 mmol/l NaCl, 1 % NP40, 0,5 % Natriumdesoxycholat, 0,1 % Natriumdodecylsulfat, 50 mmol/l Tris/HCl, pH 8, ergänzt mit Proteaseinhibitor-Cocktail) in das Röhrchen mit den geernteten Sphäroide. Nach zwei bis drei Gefrier- und Auftauzyklen wird der Proteingehalt der Lysate bestimmt und mit der nachgelagerten Analyse, z. B. der Western-Blot-Analyse, fortgefahren¹⁵.
5. Zur Erzeugung von ganzen sphäroiden RNA-Lysaten wird der RNA-Lysepuffer direkt in das Röhrchen mit den geernteten Sphäroiden gegeben und die RNA-Isolierung gemäß den Herstellerangaben des jeweils verwendeten RNA-Isolationskits durchgeführt.
6. Für die Immunhistochemie (IHC) und Immunfluoreszenzfärbung sind die Schritte 5.6.1 bis 5.6.3 zu befolgen.
   1. Behandeln Sie die geernteten Sphäroide 30 Minuten lang mit 1-2 ml 4% Paraformaldehyd/Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) und unterziehen Sie sie anschließend einer Paraffineinbettung und -sektion (3-5 μm).
   2. Vor der Immunfluoreszenzfärbung sind die Proben mit einer absteigenden Reihe von Alkohol vorzubereiten und mit einer Ziellösung zu inkubieren. Anschließend werden die Objektträger mit einer Blockierungslösung (2 % normales Ziegenserum/PBS) blockiert, um unspezifische Wechselwirkungen zu reduzieren, und primäre Antikörper über Nacht bei 4 °C inkubiert.
   3. Nachweis von Antigenen durch fluoreszenzmarkierte Sekundärantikörper. Gegenfärbung der Zellkerne mit DAPI. Führen Sie zusätzliche Färbungen (z. B. PAS-Färbekit) gemäß den Protokollen des Herstellers für die histologische Bewertung durch.
7. Befolgen Sie für einzellige Suspensionen die Schritte 5.7.1 und 5.7.2.
   1. Resuspendieren Sie geerntete Sphäroide in 1-2 mL TrypLE mit 100 U/mL DNase I, gefolgt von einer 15-minütigen Inkubation bei 37 °C. Stoppen Sie die Verdauung, indem Sie PBS mit 2-5 % FCS, 2 mM EDTA und DNAse I hinzufügen.
   2. Die zelluläre Lösung wird vor der nachgelagerten Analyse (z. B. Durchflusszytometrie oder Einzelzellanalyse) durch ein 70-μm-Zellsieb in ein frisches konisches Röhrchen geleitet.
8. Befolgen Sie für die Einzelzell-RNA-Sequenzierungsanalyse die Schritte 5.8.1 bis 5.8.3.
   1. Beschriften Sie die verschiedenen Einzelzellsuspensionen, die unterschiedliche Zeitpunkte oder Behandlungen repräsentieren, mit einem (menschlichen) Einzelzell-Multiplexing-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
   2. Kombinieren Sie anschließend die Proben und laden Sie sie auf eine Spur auf einer Einzelzellkartusche, die auf 10.000 bis 40.000 Zellen abzielt.
   3. Extrahieren Sie einzelne Zellen, führen Sie die reverse Transkription und die Bibliotheksvorbereitung gemäß den Anweisungen des Herstellers durch und sequenzieren Sie isolierte RNA.

Ergebnisse

Dieses einfache Protokoll ermöglicht die matrixfreie sphäroidale Co-Kultivierung von humanen Bronchialepithelzellen und Fibroblasten in Kombination mit extrem niedrigen Anheftungsplatten (Abbildung 1A). Während des Kultivierungsprozesses bilden sich aus den ursprünglich erzeugten Sphäroiden nach und nach komplexere Lungensphäroide, wobei die effiziente Erzeugung verschiedener epithelialer und fibroblastischer Strukturen direkte zelluläre Wechselwirkungen darstellt, wie morphologische Analyse...

Diskussion

3D-Zellkulturmodelle wurden vorgeschlagen, um die Lücke zwischen 2D-Kulturen und in vivo-Studien zu schließen, da diese Art von (Co-)Kultur die physiologischen, morphologischen und pathologischen Eigenschaften in vivo besser nachahmt, da mehr in vivo-ähnliche Zell-Zell-Interaktionen, Zell-EZM-Interaktionen, Reaktionen auf Reize, Genexpression, Proteinexpression und Differenzierung vorhanden sind^{17, 18}. ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
10 mL sterile serologische Pipetten	ThermoFischer	170356N	Nunc sterile serologische Pipetten oder gleichwertiges
konisches 15-ml-Röhrchen	Corning	430052	oder gleichwertig
37 &/de; C/ 5% CO2 befeuchtet  Inkubator
5 mL sterile serologische Pipetten	ThermoFischer	170355N	Nunc sterile serologische Pipetten oder gleichwertige
konische 50-ml-Röhrchen	Corning	CLS430829	oder gleichwertige
ATRA (All-Trans Retinsäure)	StemCell Technologies	Cat#72262	50 nM
B-27 Ergänzung (50x),	ThermoFischer/Gibco	Cat#17504044	1x
BD Rhapsody WTA Amplification Kit	BD Bioscience	Cat#633801	gemäß den Herstellerangaben verwenden
Biosicherheitswerkbank
Rinderserum Albumin	Roche	Cat#BSAVHS-RO	0,4% (v/v)
Zellsieb	Corning	352350	Falcon 70 & Mikro; m Cell Strainer, weiß, steril, einzeln verpackte
Zentrifuge	Eppendorf	https://www.fishersci.com/shop/products/eppendorf-5804-series-centrifuge-rotor-packages-9/p-4119001	z.B. Eppendorf Centrifuge 5804 - Tischzentrifuge
DMEM/F12	Invitrogen	Cat#11330-032	500 mL
DNase I, RNase-frei (1  U/μ L)	ThermoFischer	Cat#EN0521	100 U/mL
EDTA (0,5 M), pH 8,0, RNase-frei	ThermoFischer	AM9260G	2 mM
Eppendorf Research plus 12-Kanal-Mehrkanalpipette	Eppendorf		z.B., #3125000044 (10– 100 &Mikro; L) oder #3125000060 (30– 300 & Mikro; L)
Fötales Kälberserum	ThermoFischer/Gibco	Cat#A5256701	10% (v/v)
HBEC3-KT	ATCC	CRL-4051	menschliche normale Lungenepithelzelllinie
Heparin-Lösung (0,2%)	StemCell Technologies	Cat#7980	0,8 mL
Hoechst 33342	ThermoFischer	Cat#H1399	1 µ g/mL
HS-5	ATCC	CRL-3611	humane Stromafibroblasten
Hu Recom FGF-10 (KGF-2) ACF	StemCell Technologies	Cat#78173.1	10 ng/mL
Hu Recom FGF-7 (KGF) ACF	StemCell Technologies	Cat#78186.1	10 ng/mL
Human Single-Cell Multiplexing Kit	BD Bioscience	Cat#633781	gemäß den Anweisungen des Herstellers verwenden
Hydrocortisin Stammlösung	StemCell Technologies	Cat#7926	0,5 mL pro 500 mL
Laduviglusib (CHIR-99021)	Biozol/Selleckchem	Cat#S1263	3 & Mikro; M
L-Ascorbinsäure	Sigma-Aldrich	Cat#A92902	50 µ g/mL
Mikroskop	ZEISS
Monothioglycerol	Sigma-Aldrich	Cat#M6145	0.4 µ M
N-2 Supplement (100x)	ThermoFischer/Gibco	Cat#17502048	1x
Neubauer Zählkammer	Merck	BR718605	z.B. BRAND  Zählkammer BLAUBRAND  Neubauer
pattern Normales Ziegenserum	ThermoFischer	Cat#31873	2 % (v/v) in PBS NP-40
	Merck/Millipore	Cat#492016	NP-40-Alternative, 1 %
PAS Färbeset	Sigma Aldrich	Cat#1016460001	gemäß Herstellerangaben verwenden
PBS	ThermoFischer	Cat#10010023	1x
Penicillin-Streptomycin (10.000  U/mL), 100x	ThermoFischer/Gibco	Kat#15140122	1x
PFA	ThermoFischer	Kat#J61899. AK	Paraformaldehyd, 4 % in PBS
PneumaCult Airway Organoid Differentiation Medium (ODM)	StemCell Technologies	Cat#05060	PneumaCult Airway Organoid Basal Medium (#05061, 360 mL) und PneumaCult Airway Organoid Differentiation Supplement* (#05063, 40 mL)
PneumaCult Ex Plus Medium	StemCell Technologies	Cat#5040	Kit bestehend aus PneumaCult-Ex Plus Basalmedium (#05041, 490 mL ) und PneumaCult-Ex Plus 50X Supplement*(#05042, 10 mL)
Proteasehemmer Cocktail	Merck/Roche	Cat#4693132001	1 Tab/10 mL
Rhapsody cDNA Kit	BD Bioscience	Cat#633773	gemäß Herstellerangaben
verwenden RPMI 1640 Medium	ThermoFischer/Gibco	Cat#11875093	500 mL
Natriumchlorid	Merck/Sigma-Aldrich	S9625	150 mmol/L
Natriumcitrat	Merck/Sigma-Aldrich	Cat#1613859-1G	0,10%
Natriumdesoxycholat	Merck/Sigma-Aldrich	Cat#30970	0,50%
Natriumdodecylsulfat	Merck/Sigma-Aldrich	Cat#11667289001	0.10%
Steriles Reagenzreservoir für Mehrkanal-Mikropipetten (z.B. 60 ml)	ThermoFischer	9510037	oder gleichwertig
TC-Platte 96well BIOFLOAT a 4 Stü ck	Sarstedt (oder Facellitat)	83.3925.400 (oder F202003)	extrem niedrige Befestigungsplatte
Tris/HCl	ThermoFischer	Cat#AM9855G	50 mmol/L , pH 8
Triton  X-100	Sigma-Aldrich	Cat#X100-5ML	0.05 %
Trypan Blue Stain (0,4%)	ThermoFischer	Cat#15250061	1/5 (v/v) mit NGM
TrypLE	ThermoFischer	Cat#12604013	1x
Trypsin-EDTA (0,5 %)	ThermoFischer	Cat#15400054	0,05 % Trypsin-EDTA (TE) Lösung, aseptisch verdünnt auf 1X mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (ohne Calcium und Magnesium)
WST-1 Reagenz	CELLPRO-RO, Roche	Cat#5015944001	Reagenz für die Zellproliferation