Effiziente Probenahme von genetisch kodierten Biosensoren Design Space mit einem Design of Experiment- und Automatisierungs-Workflow

Summary

Dieses Protokoll stellt eine Methode zur systematischen globalen Optimierung von genetisch kodierten Biosensoren durch automatisierungsgestützte Generierung und Bewertung genetischer Bibliotheken zur Verfügung. Dies wird mit Design-of-Experiment-Methoden gekoppelt, um Experimente zu rationalisieren und die Auswahl genetischer Komponenten zu ermöglichen, um Biosensoren auf bestimmte Designergebnisse abzustimmen.

Abstract

Genetisch kodierte Biosensoren sind leistungsfähige Werkzeuge für die Informationsverarbeitung mit hohem Durchsatz, die die Transduktion von Umwelt- oder chemischen Eingangssignalen in eine Vielzahl von Ausgängen ermöglichen. Dies ermöglicht eine dynamische Sensorik, direkte Steuerung und fein abgestimmte Regulation der Genexpression in einer Vielzahl von biotechnologischen Anwendungen, einschließlich Enzymoptimierung, Stammentwicklung und mikrobieller Prozesskontrolle. Um sie für ihren Zweck fit zu machen, kann die Leistung von Biosensoren verfeinert werden, indem die Stöchiometrie von Komponenten der Biosensor-Schaltkreise (z. B. Transporter, Ein- und Ausgabemodule) modifiziert und/oder die damit verbundenen intermolekularen Wechselwirkungen zwischen Wirt und Biosensor (z. B. DNA-Protein, Protein-Protein) abgestimmt werden. Hier schafft die große Anzahl möglicher Biosensor-Permutationen jedoch einen komplexen kombinatorischen Designraum, der eine sorgfältige Optimierung der Screening-Strategien erfordert, um Konfigurationen zu identifizieren, die die gewünschte phänotypische Leistung liefern. Diese Komplexität wird durch Leistungsmerkmale von Biosensoren, wie z. B. die Abstimmbarkeit, die eine Effektortitrationsanalyse unter monoklonalen Screening-Bedingungen erfordern, noch verstärkt. Aufgrund der Notwendigkeit, verschiedene Sequenzen und Experimentierräume zu erforschen, eignen sich daher fraktionierte Sampling-Methoden besonders gut für diesen Zweck. Die Grundlage dieses Workflows sind DoE-Algorithmen (Design of Experiment), die gut positioniert sind, um eine effiziente statistisch basierte strukturierte Kartierung und fraktionierte Stichprobenziehung dieses kombinatorischen experimentellen Designraums zu ermöglichen.

Darin enthalten ist ein kombinierter Hochdurchsatz-Automatisierungs- und Berechnungsansatz zur effizienten Abtastung des Designraums von allosterischen Transkriptionsfaktor-basierten Biosensoren, um unterschiedliche Konfigurationen mit sowohl digitalen als auch analogen Dosis-Wirkungs-Kurven zu ermöglichen. Das Protokoll beginnt mit der Erstellung und automatisierten Auswahl von Promotor- und Ribosomen-Bindungsstellenbibliotheken. Diese Bibliotheken und die entsprechenden Ausdrucksdaten werden in strukturierte, dimensionslose Eingaben umgewandelt, die eine rechnerische Abbildung des gesamten experimentellen Designraums ermöglichen. Die fraktionierte Probenahme wird dann unter Verwendung eines DoE-Algorithmus durchgeführt und mit einer Effektortitrationsanalyse unter Verwendung einer Hochdurchsatz-Automatisierungsplattform gekoppelt. Dieser Workflow bietet einen agnostischen Rahmen für die Entwicklung und Optimierung zukünftiger Biosensorsysteme und genetischer Schaltkreise und bietet ein regulatorisches Instrumentarium für die Gemeinschaft der synthetischen Biologie.

Introduction

Die Fähigkeit, die Expression von Genen zu regulieren, ist eine wesentliche Funktion in allen Lebensformen und ermöglicht dynamische Reaktionen in Echtzeit auf innere und äußere Einflüsse, die von chemischen Effektoren bis hin zu biophysikalischen Reizen reichen¹. Die Vielzahl der transkriptionellen Regulationssysteme, die in der Natur zu finden sind, hat ein enormes Potenzial für die Erweiterung und Beschleunigung des Metabolic Engineering und der biotechnologischen Forschung, die durch die synthetische Biologie ermöglicht wird. In Prokaryoten wird ein Großteil der Regulation, die in der Zelle stattfindet, durch Einkomponenten-Regulationsmechanismen gesteuert, die durch die Wechselwirkungen von allosterischen Transkriptionsfaktoren (aTFs) mit einer Reihe von niedermolekularen Effektoren gesteuert^{werden 2}. aTFs, die typischerweise aus einer Effektorbindungsdomäne (EBD) und einer DNA-Bindungsdomäne (DBD) bestehen, fungieren als molekulare Schalter bei der Bindung an spezifische niedermolekulare Effektoren und modulieren die Affinität ihrer DBD zu spezifischen DNA-Operatorsequenzen, die sich in den Promotorregionen des Genoms befinden, was zu einer Aktivierung oder Repression der Transkription führt³. Dieser täuschend einfache Mechanismus hat zu einer Reihe unterschiedlicher Regulationsstrategien geführt, die von Verdrängungs-/Derepressionssystemen bis hin zu Aktivatoren reichen, die in der Lage sind, eine erstaunliche Anzahl von niedermolekularen Effektoren oder Umweltreizen zu erkennen und darauf zu reagieren⁴. Folglich hat die synthetische Biologie diese Vielfalt genutzt, um genetisch kodierte Biosensoren zu konstruieren, die in der Lage sind, eine Vielzahl von Eingangssignalen in maßgeschneiderte Ausgänge zu koppeln, d. h. die Produktion fluoreszierender Reporterproteine und die Regulierung von Synthesewegen. Wenn solche Systeme in biotechnologischen Arbeitsabläufen eingesetzt werden, ermöglichen sie die Echtzeitüberwachung intrazellulärer Konzentrationen von Metaboliten, die dynamische Regulierung von Signalwegen und einfache Auslesungen, die bei der Entwicklung effizienterer Signalwege, Stämme und Bioprozesse helfen 5,6,7,8.

Grundsätzlich werden Biosensoren anhand einer Reihe von Parametern charakterisiert, darunter Spezifität, Betriebsbereich, Dynamikbereich, Empfindlichkeit und Steigung, wobei die Dosis-Wirkungs-Kurve eines Biosensors diese Parameter über das Ausgangssignal in Abhängigkeit von der Ligandenkonzentration beschreibt (Abbildung 1)9,10,11,12 . Die Hill-Gleichung kann verwendet werden, um die Leistungsmerkmale eines Biosensors anzupassen, indem sie semi-empirische Beweise für jeden der oben beschriebenen Parameter liefert und somit ein Mittel zur Charakterisierung des Biosensorsystems bietet und gleichzeitig die Bewertung des Aufwands ermöglicht, der erforderlich ist, um das System auf anwendungsorientierte Ergebnisse abzustimmen. Spezifität kann definiert werden als die relativen Unterschiede in der Signalausgabe, die von einem Effektor im Vergleich zu einem Array anderer potenzieller Effektormoleküle induziert werden, und wird typischerweise auf der EBD-Ebene des aTF moduliert. Der Betriebsbereich ist definiert als der Bereich der Ligandenkonzentrationen, den der Biosensor erfassen kann, und bestimmt den Konzentrationsbereich, auf den der Biosensor reagieren kann. Im Gegensatz dazu beschreibt der Dynamikbereich das Verhältnis des höchsten messbaren Aktivierungszustands (ON) zum inaktivierten (OFF) Zustand und ist ein wichtiger Parameter, um sicherzustellen, dass der Biosensor Effektorkonzentrationen oberhalb der Hintergrund-Autofluoreszenz¹⁰ zuverlässig meldet. Die Empfindlichkeit für das Effektormolekül wird beschrieben als die Konzentration, die erforderlich ist, um ein bestimmtes Ausgangssignal hervorzurufen, gemessen durch die halbmaximale Konzentration (EC₅₀) des Effektors¹³. Schließlich wird die Steigung der Kurve durch die Kooperativität (n_H) des aTF für seine Bedienerstelle am Promotor bezeichnet und führt zu einem digitaleren oder analogeren Ausgangsprofil. Die Kooperativität entsteht aus Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen ligandengebundenen aTFs, die multimere Komplexe bilden, die die Affinität zur Operatorstelle stärken, was zu einer starken Zunahme der Reaktionsfähigkeit des Schaltkreises bei sättigenden Ligandenkonzentrationen und einem digitaleren Reaktionsprofil führt¹⁴.

Die Dosis-Wirkungs-Eigenschaften eines Biosensors können die Eignung seiner Anwendungen erheblich beeinflussen und sind oft ein entscheidender Punkt für jede konzeptionelle Anwendung. Die Leistung von Biosensoren kann von System zu System enorm variieren, wobei der Betriebsbereich in der Regel zwischen 0,1 nM und 10 mM¹³ variiert, während die Dynamikbereiche zwischen 1,4 und 2000 x¹⁵ liegen können. Darüber hinaus ist die Anzahl der Effektorverbindungen, die für aTF berichtet werden, zwar breit gefächert (Stoffwechselprodukte, Aminosäuren, Metalle, Antibiotika, Quorum Sensing usw.),¹¹ ist es nicht allumfassend und stellt Forscher vor Herausforderungen, wenn es in der Literatur noch keinen geeigneten Biosensor für ihren Effektor gibt. Die synthetische Biologie ermöglichte die Entwicklung von Biosensoren, die solche Herausforderungen angehen und die Abstimmung des Effektorbereichs und der Dosis-Wirkungs-Eigenschaften ermöglichen, um sie besser mit den Forschungsergebnissen der Anwendung in Einklang zu bringen, und wurde zur Lösung der beiden oben genannten Probleme eingesetzt^16,17. Zwei Schlüsselbereiche für die Entwicklung sind mit Hilfe der synthetischen Biologie anvierbar, die Promotorregion des Biosensors und der aTF selbst, die ihre Effekte auf Transkriptions- und Proteinebene vermitteln. Ansätze, die sich auf die genetischen Elemente des Biosensors konzentrieren, um die Leistung auf Promotorebene zu modulieren, umfassen das Engineering des RBS, der Operator-Standorte und -35, -10 (Hexboxen) zur Abstimmung der Empfindlichkeit, des Betriebs- und Dynamikbereichs und stehen im Mittelpunkt der in diesem Manuskript beschriebenen Methodik (Abbildung 1). Alternativ kann die Modifikation der Selektivität und Empfindlichkeit des Biosensors durch Analyse seiner Effektorbindungsdomäne und der Mutation von Resten, die an der Effektorkoordination beteiligt sind (unter Verwendung von Sequenzhomologie und/oder Strukturbiologie), seine Reaktion auf einen verwandten Effektor^modulieren 18,19,20 oder sie vollständig in Richtung eines nicht verwandten Effektors von Interesse verändern 16,17,21 . Solche Abstimmungsbemühungen können Biosensoren dann auf spezifische Anwendungen ausrichten, wobei es sich dabei häufig um Stoffwechselcontroller (Rückkopplungsschleifen, Regelkreise), primäre Screening-Tools (Enzym- oder Stammerkennung), sekundäre Screening-Tools (Enzymvarianten-Screening, Metabolic Engineering) und Transporter-Bioprospektion handelt 22,23,24. Ein solches Beispiel beinhaltet die Verwendung eines Muconsäure-responsiven aTF, CatM, in Kombination mit einer technisch hergestellten Promotorsequenz, um den Dynamik- und Betriebsbereich zu verbessern. Dieses System wurde in eine fluoreszenzaktivierte Zellsortierung integriert, um die effektivsten Muconsäure-Produktionsstämme auf der Grundlage von GFP-Fluoreszenz nach adaptiver Laborevolution^{zu isolieren 25}.

Während der Erfolg der oben skizzierten Engineering-Strategien offensichtlich ist, können die gegenseitigen Abhängigkeiten der Hebel, die einem synthetischen Biologen zur Abstimmung von Biosensoren zur Verfügung stehen, den Designprozess verkomplizieren und den Zeitraum für die Entwicklung von Biosensoren verlängern, was einige Forscher davon abhalten könnte, Biosensoren in ihre eigenen Arbeitsabläufe zu implementieren. Wie in Abbildung 1 dargestellt, können Versuche, einen Biosensor durch Modifikation der Hexboxen auf ein bestimmtes Ergebnis abzustimmen, versehentlich andere Parameter abschwächen, wobei diese Interdependenz eine anerkannte Herausforderung in der Biosensortechnik^{darstellt 12}. Gängige Ansätze der Biosensor-Abstimmung bestehen aus rationalem Design und gerichteter Evolutionstechnik, wobei erstere sich auf ein a priori Verständnis der strukturellen und mechanistischen Merkmale des Systems stützen, um Experimente auf Komponenten mit hoher Erfolgswahrscheinlichkeit zu konzentrieren; während letzteres auf randomisierter Mutagenese und natürlicher Evolution in Verbindung mit einem Hochdurchsatz-Screening beruht, um Varianten mit optimierten Eigenschaften^auszuwählen 26,27,28,29,30. Beide Techniken sind zwar effektiv, weisen aber auch einige Nachteile auf: Gezieltes Engineering, z. B. durch die Fokussierung auf bestimmte Struktur- oder Funktionselemente, ist anfällig für eine begrenzte Erkundung des gesamten Versuchsraums und kann allosterische oder sekundäre Effekte ignorieren³⁰. Die ungezielte Generierung und das Screening von Bibliotheken sind zwar ideal für die Optimierung von Designs auf ungesteuerte Weise und erfordern nur wenig Vorab-Designarbeit (d. h. Bibliotheksdesign und -generierung), erfordern jedoch eine Tendenz zu nützlichen Mutationen. Ohne eine solche Verzerrung ist zu erwarten, dass ein viel größerer Prozentsatz der Mutationen schädlich sein kann, was ein stärkeres Screening erfordert³¹. Daher sind ganzheitliche Ansätze, die nicht nur die primäre Wirkung der Bestandteile des Biosensors (aTF, RBS, Operator-Standorte und Hexboxen) berücksichtigen, sondern auch die Art und Weise, wie diese Komponenten miteinander interagieren, um die Parameter des Biosensors zu beeinflussen, sehr attraktiv.

Strukturierte multivariate Experimente und statistische Modellierungsmethoden haben sich in verfahrenstechnischen Arbeitsabläufen weit verbreitet, um den mehrdimensionalen Experimentierraum mit einer möglichst geringen Anzahl von Experimenten abzufragen. Dieser Ansatz, der Experimente und Modellierung kombiniert, wird als Versuchsplanung (DoE) bezeichnet, ermöglicht es den Forschern entscheidend, komplexe multivariable Prozesse im Hinblick auf definierte Ergebnisse zu optimieren, ohne dass umfangreiches A-priori-Wissen erforderlich ist^23,30. Während DoE typischerweise zur Optimierung kontinuierlicher Variablen eingesetzt wird, für die eine strukturierte experimentelle Exploration einfacher ist, wurde DoE auch bei der Optimierung von Stoffwechselwegen auf genetischer Ebene eingesetzt 31,32,33. Dabei handelt es sich um einen ersten Screening-Schritt, in dem die Faktoren ausgewählt werden, die für das gewünschte Ergebnis als am wichtigsten erachtet werden, gefolgt von einem Optimierungsschritt, bei dem die ausgewählten Faktoren angepasst werden, um die gewünschte Leistung zu erzielen, in diesem Fall zur Optimierung spezifischer Biosensorparameter, um ihren Anwendungsbereich zu erweitern. Entscheidend ist, dass diese Technik mit automatisierten Liquid-Handler-Plattformen gekoppelt werden kann, um den Screening-Durchsatz auf mittelgroße Bibliotheken von 10,³ und 10⁴ zu erhöhen, um die Leistung von Biosensoren weltweit auf datengesteuerter Basis^{zu optimieren 23}. Im Folgenden beschreiben wir ein Protokoll für die Implementierung eines DoE-gesteuerten Ansatzes zur Optimierung von Biosensoren, der mit Liquid-Handling-Robotik unterstützt wird, um die Bibliothekserstellung, das Screening und die Datenerfassung für die globale Optimierung der Biosensorempfindlichkeit zu rationalisieren.

Protocol

1. Design des RBS/Promotor-Teils

1. Identifizieren Sie biosensorspezifische regulatorische Elemente, die als kontinuierliche Variablen im DoE-Prozess systematisch abgestimmt werden können. Gruppieren Sie diese regulatorischen Elemente in verschiedene Module. Dies kann Module umfassen, die den Effektortransport, die Expression von Transkriptionsfaktoren und/oder die Ausgangsgenexpression regulieren. Stellen Sie sicher, dass jedes Modul auf transkriptioneller und/oder translationaler Ebene durch einen Promotor oder RBS anpassbar ist (z. B. RBS_trans, P_reg, RBS_out bzw. P_out).
2. Bestimmen Sie wichtige funktionale Stellen innerhalb ausgewählter Promotor- und RBS-Regionen, wie z. B. Hex-Boxen, Operator-Standorte und RBS-Sequenzen.
   HINWEIS: In der Literatur gibt es viele charakterisierte Promotoren und RBSs, um Bibliotheken aus 34,35,36 zu erstellen. Für nicht charakterisierte Promotorsequenzen (typischerweise der_{P-Reg-Promotor}) siehe jedoch unten für weitere Schritte zur Lokalisierung einstellbarer genetischer Sequenzelemente, falls keine in der Literatur verfügbar sind.
   1. Lokalisieren Sie andere Operons, die die interessierenden Biosensorsequenzen enthalten, über BlastP-Suchen des aTF mit dem gewünschten Sensoreingang. Extrahieren Sie die intergene Region des aTF und seine regulierten Gene, um Promotorsequenzen zu erhalten.
      HINWEIS: Die Position und Anzahl der Promotorsequenzen variiert je nach verwendeter aTF-Klasse.
3. Verwenden Sie mehrere Sequenzausrichtungswerkzeuge und andere Motivsoftware, um die mutmaßlichen Promotoren nach konservierten Motiven wie Hexboxen und Operatorstellen zu durchsuchen. Wählen Sie auf der Grundlage der Promotorsequenzanalyse Nukleotidsequenzen für die Randomisierung mit entarteten Basen aus, z. B. N = alles, R = beliebiges Purin, Y = beliebiges Pyrimidin usw.
   HINWEIS: Die Leser werden auf die Quellenpublikation verwiesen, um weitere Einzelheiten zur Promotoranalyse und zur Basenrandomisierung^{zu erfahren 23}.

2. Zusammenstellung und Validierung der Teilebibliothek

1. Entwicklung und Anordnung von Primern, die den gewünschten Expressionsvektor spezifisch amplifizieren, um die Insertion von Promotor/RBS-Sequenzvarianten stromaufwärts eines fluoreszierenden Markers (z. B. GFP) zu ermöglichen. Verdünnen Sie lyophilisierte Primer bei der Ankunft auf eine Endkonzentration von 100 μM in sterilem deionisiertem H₂O.
   1. Das PCR-Reaktionsgemisch auf Eis in PCR-Röhrchen entsprechend den Parametern der spezifischen Polymerase zusammensetzen. Stellen Sie sicher, dass eine High-Fidelity-Polymerase verwendet wird, um die Verschleppung von Mutationen in das Rückgrat des Expressionsvektors zu verhindern. Passen Sie die Glühtemperatur und die Verlängerungszeit entsprechend den Anforderungen der Primer und der Länge des gewünschten PCR-Produkts an.
   2. Analysieren Sie das PCR-Produkt mittels Gelelektrophorese und reinigen Sie den linearisierten Vektor entweder mit PCR-Aufreinigung oder einem Gelextraktionskit. Messen Sie die Konzentration der linearisierten Vektor-DNA und lagern Sie sie bei -20 °C.
2. Bestellen Sie die entworfenen Variantenbibliotheken (RBS oder Promotoren) für die Insertion in den linearisierten Vektor als einzelsträngige degenerierte Oligonukleotide mit 30 bp Plasmid-Homologiearmen sowohl am 5'- als auch am 3'-Ende für eine gezielte homologe Rekombination in den Expressionsvektor.
   1. Bei der Ankunft werden die lyophilisierten Oligonukleotide auf eine Endkonzentration von 100 ng/μl in sterilem deionisiertem H₂O resuspendiert.
3. Bestimmen Sie Volumina für äquimolare Mengen der linearisierten Vektor- und Variantenbibliothek mit Hilfe von Online-Rechnern. Es ist sicherzustellen, dass das endgültige Volumen der Reaktion 20 μl beträgt und dass ein molares Verhältnis von Insert zu Vektor von 2:1 verwendet wird.
   1. Tauen Sie ein Aliquot des handelsüblichen Gibson-Assemblierungs-Mastermixes (X2) auf Eis auf und montieren Sie die Reaktion in einem PCR-Röhrchen entsprechend den Volumina, die vom gewählten Rechner bereitgestellt werden.
      HINWEIS: Gibson Mastermix kann auch im Labor hergestellt werden^37,38.
   2. 10 μL 2x Gibson Mastermix zu den DNA-Fragmenten geben und 1 h bei 50 °C in einem Thermocycler o.ä. inkubieren.
   3. Tragen Sie alle 20 μl des Ligaturprodukts auf 200 μl kompetente E. coli in einem Mikrozentrifugenröhrchen auf. 30 min auf Eis inkubieren, gefolgt von einem Hitzeschock für 45 s bei 42 °C.
   4. Setzen Sie die Zellen für 2 Minuten wieder auf Eis, geben Sie 800 μl superoptimale Brühe mit Katabolit-Repressionsmedium (SOC) in das Röhrchen und lassen Sie die Zellen 1 h lang bei 37 °C in einem Schüttelinkubator erholen.
   5. Verteilen Sie 50 μl transformierter Zellen auf mehrere 60 mm Luria-Bertani (LB) Agar-Petriplatten mit entsprechender Antibiotikaauswahl. Die Platten bei 37 °C 18 h inkubieren.
4. Überprüfen Sie die Platten auf Transformanten, berechnen Sie die Anzahl der Kolonien, die das 3-fache der theoretischen Bibliotheksvielfalt repräsentieren, um eine ausreichende Repräsentation jeder Variante zu erfassen. Optimieren Sie die isotherme Baugruppe, wenn die Anzahl der Kolonien niedrig/null ist.
   HINWEIS: Oversampling ist erforderlich, wenn eine ideale Bibliothek aus High-Fidelity-Reagenzien oder Synthesen generiert wird. Dies ist in der Regel 3x größer als die Gesamtgröße der Bibliothek. Beispiel: 4 Positionen der Entartung (NNNN) = 4⁴ = 256 eindeutige Sequenzen. Kratzen Sie daher ~768 Völker ab.
   1. Die erforderliche Anzahl von Kolonien wird in einen sterilen 125-ml-Kolben mit 25 ml LB-Medium gegeben, das mit geeigneten Antibiotika ergänzt wird. Der Kolben wird bei 37 °C 18 Stunden lang in einem Schüttelbrutkasten (180 U/min) inkubiert, wobei darauf zu achten ist, dass die Kultur nach Ablauf dieser Zeit sichtbar dicht ist.
   2. Verwenden Sie ein Plasmid-Midi-Prep-Aufreinigungskit, um die Variantenbibliothek aus der vorbereiteten Transformantenkultur zu reinigen. Bestimmen Sie die Konzentration der DNA der Plasmidbibliothek; Für nachgelagerte Schritte werden 1-10 μg benötigt. Stellen Sie sicher, dass die Bibliotheks-DNA mit sterilem deionisiertem H₂O eluiert wird.
      HINWEIS: Die Schritte nach diesem Punkt konzentrieren sich auf das Klonen und die Validierung von Variantenbibliotheken im Expressionshost von Pseudomonas putida (P. putida). Die Anpassung des Protokolls an andere Wirte kann eine Änderung der Inkubationszeiten, der Inkubationstemperaturen und der Transformationsmethoden erfordern.
5. Bereiten Sie eine LB-Agarplatte des gewünschten Expressionswirts P. putida vor, indem Sie aus einem Glycerinstamm streifen und die Platte 18 h lang bei 30 °C inkubieren.
   1. Nehmen Sie eine einzelne Kolonie von P. putida aus der LB-Agarplatte, inokulieren Sie 10 mL LB-Medium und wachsen Sie 18 Stunden lang bei 30 °C und 180 U/min unter Schütteln.
   2. Bereiten Sie die Zellen für die Elektrokompetenz vor, indem Sie die gezüchtete Kultur bei 4000 x g bei 18 °C für 2 min zentrifugieren. Der Überstand wird abgegossen, in 1 ml sterilem deionisiertem H₂O resuspendiert und die resuspendierten Zellen in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen überführt.
      HINWEIS: P . putida-Zellen sollten rosa erscheinen, wenn sie pelletiert werden.
   3. Zentrifugieren Sie die Zellen 1 Minute lang bei 4 x g in einer Mikrozentrifuge, gießen Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie in 1 mL sterilem deionisiertem H₂O. Wiederholen Sie die Zentrifugations- und Resuspensionsschritte noch 4 Mal.
      HINWEIS: Beim Abgießen des Überstands während des Waschens kann es zu Zellverlust kommen. Das ist normal und sollte die Erträge nicht beeinträchtigen.
   4. 100 μl gewaschene Zellen in eine 0,2 cm große Elektroporationsküvette geben, 1-10 μg Plasmidbibliotheks-DNA in die Küvette geben und mischen.
   5. Schalten Sie den Elektroporator ein, stellen Sie sicher, dass die Spannung für die 0,2 cm Küvette auf 2,5 kV eingestellt ist, setzen Sie die Küvette in die Elektroporationskammer ein und pulsieren Sie.
   6. Geben Sie 900 μl SOC-Medium in die Küvette, mischen Sie sie und übertragen Sie die Zellen in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen. Lassen Sie die Zellen 2 h lang bei 30 °C in einem Schüttelinkubator erholen.
6. 50 μl transformierter Zellen werden auf große quadratische Petriplatten (230 mm) aus LB-Agar verteilt, die mit dem entsprechenden Antibiotikum ergänzt werden, und 18 Stunden lang bei 30 °C inkubiert.
   HINWEIS: Achten Sie auf eine moderate Koloniedichte auf den Bibliotheksplatten (2-3 KBE/cm²). Dies hängt von der bakteriellen Kompetenz und dem Plattierungsvolumen ab. Wenn es zu niedrig ist, kann die Optimierung der Transformation oder aufeinanderfolgende Transformationsrunden verwendet werden, um die Anzahl der Kolonien zu erhöhen.
7. Wählen Sie zwischen 25 und 50 Kolonien aus allen Transformantenplatten für die Sequenzvalidierung aus. Verwenden Sie Primer, die über die entartete Sequenz amplifizieren, amplifizieren Sie die Region durch PCR und senden Sie sie zur Sanger-Sequenzierung, um die Sequenzdiversität sowie die Polyklonalität zu bewerten.
   HINWEIS: Wenn Polyklonalität problematisch wird, kann die Verteilung von Transformationen auf mehrere Chargen von Küvetten mit 1 μg DNA helfen, diesen Effekt zu reduzieren.

3. Klonales Screening der Teilebibliothek - Automatisierung

1. Einrichtung des Liquid Handlers
   1. Erstellen Sie 7 Programme auf einer Liquid-Handler-Plattform, um sicherzustellen, dass pipettierintensive Schritte trivialisiert werden.
   2. Erstellen Sie ein "MTP Liquid Transfer"-Programm und stellen Sie sicher, dass der Liquid Handler so eingerichtet ist, dass er ein einstellbares Volumen aus einem vorbereiteten Reservoir in leere Mikrotiterplatten (MTP) in seinem Layout pipetiert.
   3. Erstellen Sie ein Programm "Glycerin zu MTP hinzufügen", stellen Sie sicher, dass der Liquid Handler so programmiert ist, dass er 100 μl Volumen von 50 % Glycerin in Platten pipettiert, und stellen Sie sicher, dass die Dispensier- und Aspirationsgeschwindigkeit 5-20 μL/s beträgt.
      HINWEIS: Es wurde ein separates Programm erstellt, um die höhere Viskosität von 50 % Glycerin zu berücksichtigen, die zu Blasenbildung, unvollständiger Aspiration oder Kreuzkontamination benachbarter Vertiefungen aufgrund von Spritzern führen kann, wenn sie nicht kontrolliert wird.
   4. Erstellen Sie ein "DWB Liquid Transfer"-Programm, richten Sie den Liquid Handler so ein, dass er in Deep-Well-Blöcke (DWB) mit einer einstellbaren Volumeneinstellung pipettieren kann, und stellen Sie sicher, dass der Liquid Handler aus einem vorgefüllten Reservoir pipettiert.
   5. Erstellen Sie ein Programm "Aus aufgetautem MTP impfen", stellen Sie sicher, dass der Liquid Handler so programmiert ist, dass er 5 μL aus aufgetautem MTP aspiriert, das die ausgewählten Kolonien enthält, und übertragen Sie diese in die entsprechenden DWB-Platten im Layout.
      HINWEIS: Achten Sie genau auf die MTP- und DWB-Anordnung im Layout, um eine logische Reihenfolge der Ereignisse zu gewährleisten, um versehentliche Doppelimpfung oder verpasste Platten zu vermeiden.
   6. Erstellen Sie ein "Transfer to Assay DWB"-Programm und stellen Sie sicher, dass der Liquid Handler so eingestellt ist, dass 5 μl Zellen von einer DWB-Plattenposition auf eine andere DWB-Plattenposition übertragen werden. Das Programm muss diesen Vorgang dann 4 Mal wiederholen, wobei bei jedem Transfer eine andere Plattenposition geimpft wird, d. h. P1 -> P2, P1 -> P3 usw.
      HINWEIS: Dieses Programm gewährleistet die nahtlose Subkultivierung von 96 Varianten in verschiedene Assay-Konzentrationen.
   7. Erstellen Sie ein "Assay Setup - PBS Resuspension (DWB)"-Programm, stellen Sie sicher, dass der Liquid Handler jedes DWB im Layout mit 500 μl PBS pipetiert, das Programm muss auch einen Mischschritt enthalten, um sicherzustellen, dass die Zellpellets richtig resuspendiert werden.
   8. Erstellen Sie ein Programm "Assay Setup - Cells and PBS Addition (MTP)", und stellen Sie sicher, dass dieses Programm einen Schritt zum Übertragen von 200 μl der resuspendierten Zellen von einer DWB-Plattenposition auf eine leere MTP-Position enthält.
      HINWEIS: Für alle Schritte von 3.1 variieren die Programmier- und Liquid-Handler-Layouts; Die Forscher sollten sich auf die Handbücher bestimmter kommerzieller Liquid Handler beziehen, um die oben genannten Programme an die Kapazität und die Anforderungen des Experiments anzupassen.
2. Kultivierung und Barcode von Variantenbibliotheken
   1. Ermitteln Sie die theoretische Bibliotheksgröße und berechnen Sie die Anzahl der einzelnen Varianten, um > 95%ige Bibliotheksabdeckung zu gewährleisten (3x Bibliotheksgröße empfohlen) (siehe Hinweis zu Schritt 2.5.).
   2. Berechnen Sie das erforderliche Volumen an mit Antibiotika supplementierten LB-Medien entsprechend der Anzahl der zu untersuchenden Völker (200 μl pro Kolonie + 10 % über).
   3. Öffnen Sie die Liquid-Handler-Software und klicken Sie neben dem MTP Liquid Transfer-Programm auf Ausführen (siehe Zusatzdatei 1). Legen Sie das vorbereitete Medium in die entsprechende Behälterposition und füllen Sie das Deck entsprechend dem Layout mit leeren MTPs. Stellen Sie das Programm so ein, dass 200 μl Medien dosiert werden. Klicken Sie auf OK, um den Programmstart zu bestätigen.
      HINWEIS: Stellen Sie immer sicher, dass die Behälter und Spitzen ausreichend mit der Liquid-Handler-Plattform versorgt sind, bevor Sie den Programmstart bestätigen, um Unterbrechungen zu vermeiden.
   4. Wiederholen Sie das Programm so oft wie nötig und versiegeln Sie die gefüllten MTPs mit einer atmungsaktiven Membran, um die Sterilität zu erhalten.
   5. Gefüllte MTP-Platten auf eine Koloniepicker-Plattform übertragen und die quadratischen Platten von P. putida , die mit der DNA der Plasmidvariantenbibliothek transformiert wurden, entsiegeln und auf die Koloniepicker-Plattform übertragen. Verwenden Sie den Koloniepicker, um jede der vorgefüllten Mikrotiterplattenvertiefungen mit einer einzelnen Kolonie aus den Transformantenbibliotheksplatten zu beimpfen.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Mindesttiefe des Agars 25 ml beträgt, um eine Beschädigung des Koloniepflückerkopfes zu vermeiden.
   6. Verschließen Sie die inokulierten Platten wieder und überführen Sie sie in einen Schüttel-Offline-Inkubator bei 30 °C (800 U/min), um sicherzustellen, dass die Feuchtigkeitskontrolle bei 75 % aktiviert ist, um eine Verdunstung der Kultur zu vermeiden. Lassen Sie diese 16 Stunden lang wachsen.
      HINWEIS: Nach der Inkubation erscheinen die Kulturen für das Auge sichtbar dicht, wenn dies nicht der Fall ist, überprüfen Sie erneut die Medien- und Antibiotikaanforderungen.
   7. Nach 16 Stunden Wachstum die gewachsenen Platten wieder auf die Liquid-Handler-Plattform legen und die Versiegelung lösen. Klicken Sie auf Ausführen neben dem Protokoll Glycerin zum MTP-Protokoll hinzufügen (siehe Ergänzende Datei 1) und stellen Sie sicher, dass das Plattenlayout auf dem Bildschirm mit dem des Liquid-Handler-Docks übereinstimmt. Klicken Sie auf OK und lassen Sie die Ausführung des Protokolls zu.
   8. Wenn Sie fertig sind, verschließen Sie die Platten erneut und mischen Sie sie kurz für 5 Minuten in einem Offline-Schüttelinkubator (800 U/min), bevor Sie sie mit einem Barcode versehen und bei -80 °C lagern.
   9. Wiederholen Sie die Schritte 3.2.7. und 3.2.8. bis alle MTPs mit Glycerin versetzt, gemischt, mit Barcodes versehen und bei -80 °C gelagert wurden.
      HINWEIS: Das Protokoll kann an dieser Stelle pausiert werden, um die folgenden Charakterisierungsschritte vorzubereiten. Darüber hinaus kann das Blockieren der Platten in verschiedene Versuchsläufe geplant werden, um der Kapazität der verwendeten Liquid-Handler-Plattform gerecht zu werden oder die Arbeitsbelastung in einer Sitzung zu reduzieren.
3. Prüfung von Variantenbibliotheken
   1. Berechnen Sie das erforderliche Volumen des mit Antibiotika supplementierten Mediums für die Anzahl der zu füllenden DWB (~495 μl pro Vertiefung + 10 % darüber).
   2. Klicken Sie neben dem DWB Liquid Transfer-Programm auf Ausführen (siehe Zusatzdatei 1), stellen Sie sicher, dass das Medium dem richtigen Behälter im Programmlayout hinzugefügt wird. Stellen Sie sicher, dass leere DWB an den entsprechenden Layoutpositionen hinzugefügt werden und dass ein ausreichender Vorrat an Spitzen zur Verfügung steht. Stellen Sie das Programm so ein, dass 495 μl Medien ausgegeben werden. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf OK, um das Programm zu starten.
   3. Die gefüllten DWBs mit einer atmungsaktiven Membran verschließen und in die Zwischenlagerung bei 4 °C überführen, Schritt 3.3.2 wiederholen. bis die erforderliche Anzahl an DWBs mit Medien gefüllt wurde.
   4. Klicken Sie neben dem Programm Incoculate from Thawed MTP auf Run (siehe Ergänzungsdatei 1), stellen Sie sicher, dass MTP-Kryobestände und gefüllte DWBs gemäß dem Layout auf die Liquid-Handler-Plattform übertragen werden. Stellen Sie sicher, dass ein ausreichender Vorrat an Trinkgeldern vorhanden ist. Klicken Sie auf OK, um das Programm zu initialisieren.
      HINWEIS: Tauen Sie die Vorratsplatten 30 Minuten lang auf Eis auf, nur wenn die erforderlichen Programme und Platten vorbereitet wurden, um eine optimale Lebensfähigkeit der Zellen zu gewährleisten.
   5. Wenn das Programm beendet ist, versiegeln Sie die über Nacht geimpften DWBs mit einer atmungsaktiven Membran und geben Sie sie in einen Offline-Plattenschüttler-Inkubator mit 75% Feuchtigkeitskontrolle und lassen Sie sie über Nacht 16 Stunden lang bei 30 °C (180 U/min) wachsen.
   6. Verschließen, mischen und geben Sie Kryostock-MTPs gemäß Schritt 3.2.8 in den -80 °C-Gefrierschrank zurück.
   7. Wiederholen Sie die Schritte 3.3.4. bis 3.3.6. so viele Male erforderlich, bis die erforderliche Anzahl von DWBs über Nacht geimpft und in den Inkubator überführt wurde.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, aufzuzeichnen, wann jede Charge von Platten zum Inkubator hinzugefügt wird, um die Zeitverzögerung zwischen den Läufen während der Inokulation zu berücksichtigen und die gleiche Reihenfolge für nachgelagerte Schritte zu verwenden.
   8. Berechnen Sie das erforderliche Volumen des Mediums, das mit unterschiedlichen Konzentrationen von Effektor und Antibiotikum ergänzt wird, entsprechend der Anzahl der über Nacht zu screenenden DWB (495 μL pro Vertiefung + 10 % über). Jede Effektorkonzentration benötigt ein eigenes separates Reservoir im Liquid Handler.
      HINWEIS: Für die erste Charakterisierung, wie z. B. das EIN/AUS-Screening, sind zwei Effektorkonzentrationen ausreichend (z. B. 0 und 1000 μM Endkonzentration). Um Dosis-Wirkungs-Daten für eine robustere Charakterisierung zu generieren, wird dieser Bereich auf mindestens vier Konzentrationen erhöht (z. B. 0, 1, 25 und 1000 μM Endkonzentration). Bei Repressorsystemen ist die Zugabe eines Effektors zur Feststellung der Funktion nicht erforderlich, während bei Aktivatoren, wie dem beschriebenen System, ein Effektor erforderlich ist.
   9. Klicken Sie neben dem DWB Liquid Transfer-Programm auf Ausführen (siehe Zusatzdatei 1). Stellen Sie sicher, dass sich die Behälter mit Effektor-supplementierten Medien in den richtigen Positionen entsprechend dem Layout befinden. Fügen Sie leere DWBs zur Liquid-Handler-Plattform hinzu. Stellen Sie sicher, dass der Plattform ausreichend Trinkgelder zur Verfügung stehen. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf OK, um das Protokoll zum Generieren der Assay-DWBs zu starten.
   10. Verschließen Sie die Assay-DWBs nach dem Befüllen mit einer atmungsaktiven Membran und überführen Sie sie in eine vorübergehende Lagerung bei 4 °C, und befüllen Sie die Liquid-Handler-Plattform mit weiteren leeren Platten.
   11. Wiederholen Sie die Schritte 3.3.9 und 3.3.10 so oft wie nötig, bis die erforderliche Anzahl von DWBs gefüllt ist.
   12. Klicken Sie auf Ausführen neben dem Programm Transfer to Assay DWB (siehe Zusatzdatei 1). Stellen Sie sicher, dass unversiegelte Assay-DWBs, die Effektor-supplementiertes Medium enthalten, an den richtigen Stellen im Liquid-Handler-Layout hinzugefügt werden.
   13. Übertragen und entsiegeln Sie die DWBs über Nacht, die gezüchtete P. putida , die in Schritt 3.3.4 geimpft wurden. an die Liquid-Handler-Plattform, wodurch wiederum sichergestellt wird, dass das Layout strikt eingehalten wird. Stellen Sie sicher, dass der Plattform ausreichend Trinkgelder zur Verfügung stehen. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf OK , um das Protokoll zu starten.
       HINWEIS: Der Transfer und die Anordnung von Subkulturen in die Assay-Platten muss in der Regel in Chargen erfolgen, abhängig von der Größe der Liquid-Handler-Plattform.
   14. Nach Abschluss des Programms bringen Sie Dichtungen an und überführen Sie die Assay-Platten in einen Offline-Inkubator bei 30 °C und 75 % Luftfeuchtigkeit für 16 h (180 U/min), wobei das endgültige Assay-Volumen zu diesem Zeitpunkt 500 μl beträgt.
   15. Die DWBs über Nacht nach der Inokulation verwerfen und die Schritte 3.3.12 bis 3.3.14 nach Bedarf wiederholen, bis alle erforderlichen Assay-DWBs geimpft wurden und in Offline-Inkubatoren wachsen.
   16. DWBs aus dem Inkubator nehmen, in eine Zentrifuge umfüllen und bei 4000 x g, 18° C 5 min erhitzen. Gießen Sie den Überstand ab und legen Sie die zentrifugierten DWBs auf die Liquid-Handler-Plattform.
       HINWEIS: Das Volumen der Zellpellets kann je nach Effektorkonzentration oder -variante variieren, zusätzlich können einige Pellets für das Auge sichtbarer fluoreszierend erscheinen als andere.
   17. Berechnen Sie das erforderliche Volumen von 1x PBS basierend auf der Anzahl der zu screenenden DWB (500 μl pro Vertiefung + 10 % über).
   18. Klicken Sie neben dem Programm Assay Setup - PBS Resuspension (DWB) auf Run (siehe Ergänzungsdatei 1), stellen Sie das Dispensiervolumen auf 500 μL ein, stellen Sie sicher, dass 1x PBS in das richtige Reservoir gegeben wird, und ordnen Sie dann die zentrifugierten Platten entsprechend dem Layout des Liquid Handlers an. Stellen Sie sicher, dass ausreichend Tipps zur Verfügung stehen. Klicken Sie auf OK, um das Programm zu starten.
       HINWEIS: Das Waschen der Zellen wird durchgeführt, um verbleibende Wachstumsmedien zu entfernen, die eine gewisse Autofluoreszenz erzeugen können.
   19. Verschließen Sie die resuspendierten Platten wieder und entfernen Sie sie aus dem Liquid Handler. Stellen Sie sicher, dass die Pellets vollständig resuspendiert sind, indem Sie die Unterseite der Platte überprüfen. Fahren Sie mit dem Transfer von pelletierten DWBs in den Liquid Handler fort und wiederholen Sie Schritt 3.3.18. bis alle Platten wieder aufgehängt sind.
   20. Klicken Sie auf Ausführen neben dem Programm Assay Setup - Cells and PBS addition (MTP) (siehe Ergänzungsdatei 1). Übertragen Sie die resuspendierten DWBs aus Schritt 3.3.18. in den Liquid Handler gemäß dem vorgeschlagenen Layout ein. Übertragen Sie leere MTPs entsprechend dem Layout in den Liquid Handler. Stellen Sie sicher, dass das Dosiervolumen auf 200 μl eingestellt ist und dass genügend Spitzen verfügbar sind. Klicken Sie auf OK , um das Programm zu starten.
   21. Übertragen Sie gefüllte MTPs (endgültiges Assay-Volumen 200 μL) auf einen Offline-Multimode-Plattenreader, messen Sie die relative Fluoreszenz bei einer geeigneten Anregungsemissionswellenlänge (z. B. sfGFP lEx/lEm = 488/520) und OD₆₀₀ für jede Vertiefung in der Platte.
       HINWEIS: Die Einstellungen für die Wellenlänge der Anregungsemission hängen von der Wahl des Fluoreszenzgens ab, das im Expressionsvektor kodiert ist. Stellen Sie sicher, dass die Verstärkungseinstellungen am Plattenleser durchgehend konsistent sind, und ermöglichen Sie die Unterscheidung zwischen niedrigen und hohen Varianten, ohne den Detektor zu überlasten.
   22. Wiederholen Sie die Schritte 3.3.20. und 3.3.21. bis alle Assay-DWPs in MTPs übertragen und gemessen wurden.

4. Datenverarbeitung/-transformation und differentielle Einstufung

1. Führen Sie eine Normalisierung der gesammelten Daten durch, indem Sie die aufgezeichnete GFP-Fluoreszenz (RFU) durch die aufgezeichnete OD_600-Messung für jede Variante für jede der bewerteten Effektorkonzentrationen (0 und 1000 μM) dividieren.
   HINWEIS: Die meisten Plattenlesegeräte können so programmiert werden, dass die Fluoreszenz während der Datenerfassung automatisch um OD₆₀₀ normalisiert wird.
2. Berechnen Sie EIN/AUS, um den Dynamikbereich jeder Variante zu erhalten, indem Sie die RFU/OD₆₀₀ bei 1000 μM (ON) durch die RFU/OD₆₀₀ bei 0 μM (OFF) dividieren. Zeichnen Sie alle EIN/AUS-Variantenwerte als Streudiagramm unter Verwendung der EIN/AUS-Funktion des Basis-Biosensorkonstrukts, um Varianten zu bestimmen, die eine Aktivität oberhalb des Basisniveaus aufweisen.
   HINWEIS: Das EIN/AUS des anfänglichen Biosensorkonstrukts, das in dem Protokoll verwendet wurde, wurde auf der Grundlage der anfänglichen Charakterisierung der Wildtyp-Sequenz²³ als 3,6-fach bestimmt.
3. Für eine detaillierte Charakterisierung passen Sie die Dosis-Wirkungs-Daten mit einer Hill-Funktion mit variabler Steigung an, um EC50- und/oder Hill-Slope-Werte mit Hilfe von Analysesoftware zu extrahieren.
   HINWEIS: Um die Empfindlichkeit und den EC₅₀ zu schätzen, erfassen Sie mindestens vier Datenpunkte, die den Bereich abdecken, in dem die Reaktion von niedriger zu hoher Aktivierung übergeht, in der Regel der steilste Teil der Kurve. Während mehr Datenpunkte die Auflösung und Genauigkeit verbessern, reichen vier Punkte für die Schätzung des Sensitivitätsrankings aus.
4. Wählen Sie aus dem vollständigen Satz von Varianten eine Teilmenge von Varianten aus (z. B. N = 100), um eine ausgewogene Abdeckung der gewünschten Platzierungen zu gewährleisten, in diesem Fall EC₅₀. Zu diesem Zweck sollten Varianten identifiziert werden, die in EC₅₀ ein breites Spektrum abdecken, und sicherstellen, dass Varianten mit hohem und niedrigem Rang proportional vertreten sind. Entfernen Sie Varianten, die redundant sind (z. B. solche mit ähnlichem Ranking und minimalen Auswirkungen auf die Verbreitungsabdeckung).
5. Nachdem Sie die endgültige Varianten-Beispielbibliothek (z. B. N = 100) ausgewählt haben, transformieren Sie die Daten mit der folgenden linear-logarithmischen (lin-log) Transformationsgleichung (Gl. 1).
   Gl. 1:
   
   wo
   
   
   
6. Weisen Sie für EC50-Werte +1 für die höchste (am wenigsten empfindliche) und -1 für die niedrigste (am wenigsten vertrauliche) Werte zu. Ein geometrischer Mittelwert von 0 entspricht den mittleren Ausdrucksstufen.

5. Definitive Generierung des Screening-Designs / DoE

1. Um den Designraum von Biosensoren systematisch zu erforschen, verwenden Sie ein Definitive Screening Design (DSD). Dieses Design wird aufgrund seiner Fähigkeit bevorzugt, den Designraum effizient zu erkunden und gleichzeitig die Studie an die spezifischen Systemanforderungen anzupassen.
2. Klicken Sie auf die Kategorie DOE und wählen Sie dann die Schaltfläche Definitives Screening-Design in der Statistiksoftware (siehe Ergänzende Datei 2).
3. Definieren Sie die experimentellen Faktoren (z. B. RBS_trans , P_reg , RBS_out und P_out) als stetige Variablen, indem Sie auf die Schaltfläche Kontinuierlich klicken und sie benennen, wobei Sie darauf achten, dass die Werte auf +1 und -1 gesetzt sind (siehe Zusatzdatei 3).
4. Definieren Sie die gewünschten Antworten (z. B. ON , OFF , ON/OFF , EC50 , Slope), indem Sie auf die Schaltfläche Antwort hinzufügen klicken und den Namen anpassen (siehe Zusatzdatei 4).
   HINWEIS: Legen Sie das Ziel der Antwort fest, indem Sie auf das Dropdown-Menü "Ziel" klicken und je nach Ziel des Designs (z. B. Erkundung oder Optimierung) "Keine " oder "Maximieren " auswählen.
5. Sobald die Faktoren und Antworten definiert sind, klicken Sie auf Weiter , um die Registerkarte Designoptionen zu öffnen. Wählen Sie Keine Blöcke erforderlich und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Design erstellen (siehe Zusatzdatei 5).
   HINWEIS: Blöcke können hinzugefügt werden, um die Konstruktion vor Störfaktoren (Faktoren, die nicht von primärem Interesse sind) zu isolieren. Dies kann die Komplexität von Experimenten erhöhen. Es wird jedoch nach Ermessen des Forschers verwendet.
6. Die Software erstellt eine experimentelle Designtabelle, in der die spezifischen Kombinationen der zu testenden Faktoren aufgeführt sind. Die genetischen Teile aus den entsprechenden lin-log-transformierten Bibliotheken werden verwendet, um die entsprechenden 17 Konstrukte zu generieren. Speichern und exportieren Sie die Designtabelle, indem Sie auf Tabelle erstellen klicken (siehe Zusatzdatei 6).

6. Wiederholen Sie Schritt 2 - Design und Assemblierung von DoE-informierten genetischen Designs

1. Beginnen Sie mit der Konstruktion der multivariablen Plasmide gemäß dem DSD-Plan (Definitive Screening Design).
   1. Identifizieren Sie eine Anfangsvariable (z. B. Promotor, RBS usw.). Entwerfen und ordnen Sie Primer an, um den Expressionsvektor zu linearisieren und sicherzustellen, dass die Primer den Zielvariablenbereich flankieren und die Entfernung bereits vorhandener Sequenzelemente sicherstellen.
   2. Entwerfen und ordnen Sie Primer an, die Variantensequenzen spezifisch amplifizieren, die den vordefinierten Bibliotheksebenen (z. B. -1, 0, +1) für jeden regulatorischen Knoten entsprechen (P_out P_reg RBS_out RBS_trans). Stellen Sie sicher, dass jeder Primer 30 bp-Homologiearme enthält, die komplementär zur Einfügestelle des Expressionsvektors sind.
   3. Aufreinigung der Plasmid-DNA aus der relevanten Kryo-Stammkultur entsprechend den Bibliothekswerten +1, 0 und -1 für die identifizierte Variable mittels miniprep.
2. Richten Sie die PCR-Reaktionen für den linearisierten Expressionsvektor und die Bibliotheksfragmente auf Eis ein und bestimmen Sie die Konzentration des Produkts wie in den Schritten 2.1.1 und 2.1.2 beschrieben.
   1. Wiederholen Sie die Schritte 2.3 bis 2.4 des Protokolls, um die Gibson-Assemblierung des linearisierten Expressionsvektors und der Bibliotheksfragmente durchzuführen. Stellen Sie sicher, dass zu diesem Zeitpunkt Petrischalen in Standardgröße verwendet werden.
   2. Screenen Sie die Kolonien mit Hilfe der Sanger-Sequenzierung, um die korrekte Konstruktassemblierung für jedes der vorgeschlagenen DSD-Designs zu bestätigen, und fahren Sie dann mit der Transformation von P. putida fort (Schritte 2.5 - 2.6).
   3. Bestätigen Sie mit Hilfe der PCR das Vorhandensein des richtigen Plasmids in transformierten Kolonien. Wählen Sie bestätigte Transformanten und inokulieren Sie sie in 10 ml LB, ergänzt mit Antibiotikum für das Wachstum über Nacht bei 30 °C für 18 h (180 U/min). Kryobestände (25 % Glycerin final) herstellen und bei -80 °C lagern.

7. Screening und Datenrationalisierung

1. Aus Kryo-Stämmen wird der P. putida , der mit den entsprechenden DSD-Design-Konstrukten auf LB-Agar transformiert wird, mit Antibiotikum ergänzt, über Nacht 18 Stunden lang bei 30 °C inkubiert, um Kolonien zu züchten.
   1. Entnehmen Sie drei Einzelkolonien aus jeder Platte, die den empfohlenen DSD-Designs entsprechen, und kultivieren Sie sie über Nacht in 10 ml LB-Medien, die mit Antibiotikum bei 30 °C für 18 Stunden ergänzt werden.
   2. Am folgenden Tag wird ein DWB mit einem Effektorkonzentrationsgradienten von 0 mM bis 1 mM (Endkonzentration) pro Reihe auf ein Gesamtvolumen von 50 μl pro Vertiefung geladen. Verdünnen Sie die Übernachtkulturen zu 1/100 in frisches LB und fügen Sie dem DWB über den Konzentrationsgradienten 450 μl Kultur hinzu.
   3. Wiederholen Sie manuell die Schritte 3.3.14 und 3.3.16, um gewachsene DWBs zu erhalten, und fahren Sie dann mit den Schritten 3.3.18 und 3.3.20 fort, und führen Sie diese manuell aus. und 3.3.21. , um RFU/OD-Daten für jede vorgeschlagene Variante zu erhalten.
2. Passen Sie die Dosis-Wirkungs-Daten (RFU/OD) mit einer Hill-Funktion (mit variabler Steigung) an und extrahieren Sie geeignete Parameter (Faktoren) für die Optimierung, wie z. B. EC₅₀, Hangneigung, Dynamikbereich oder Betriebsbereich. Transformieren Sie die resultierenden Daten in log10 und geben Sie die extrahierten Parameter für jedes der getesteten Designs in die DSD-Tabelle ein.
   1. Führen Sie eine zweistufige Screening-Analyse durch, um signifikante Faktoren zu identifizieren, die die Leistung von Biosensoren beeinflussen. Verwenden Sie die Lenth-Verhältnis-Analyse und die Diagrammanalyse der halben Normalverteilung^{23, 30} , um zu bestimmen, welcher Faktor von der erwarteten Verteilung abweicht, und um ihn im Modell beizubehalten. Bewahren Sie die Wirkung der Vererbung und stellen Sie sicher, dass jeder Faktor, der nur in der Interaktion von Bedeutung ist, auch einzeln einbezogen wird.
   2. Führen Sie die standardmäßige Regression der kleinsten Quadrate (SLSR)³⁰ für jede Antwortvariable unabhängig voneinander durch, wobei nur die identifizierten signifikanten Faktoren berücksichtigt werden. Bewerten Sie die Diagnose des Regressionsmodells, einschließlich Residuendiagrammen, Mangelanpassungstests und R²-Werten, um eine ordnungsgemäße Datenanpassung sicherzustellen.
   3. Verwenden Sie einen Response-Profiler, um die optimalen Faktoreinstellungen basierend auf den gewünschten Biosensoreigenschaften zu bestimmen. Definieren Sie Zielfunktionen für jede Antwortvariablen (z. B. Maximierung des Dynamikbereichs bei gleichzeitiger Minimierung von EC₅₀), um Faktoreinstellungen zu generieren, die unter Berücksichtigung von Systemeinschränkungen und Kompromissen die beste Balance über alle Reaktionen hinweg erreichen.
3. Kehren Sie zu den Variantenbibliotheken zurück und erstellen Sie den optimierten Biosensor gemäß den vom Response-Profiler vorgeschlagenen Modulen, indem Sie die Schritte 6.1 bis 6.2 des Protokolls befolgen. Validieren Sie die Leistung des optimierten Konstrukts durch Dosis-Wirkungs-Charakterisierung.

Results

Zunächst müssen Module ausgewählt werden, von denen angenommen wird, dass sie die Funktion von Biosensoren beeinflussen, um sie zu variieren. Dies kann die Regulation von Transportproteinen umfassen, die die intrazelluläre Konzentration von Liganden und damit die Ausgabe von Biosensoren beeinflussen kann, aber auch die relativen Transkriptions- und Translationsniveaus des aTF selbst sowie des fluoreszierenden Reporters oder Ausgangsgens (Abbildung 1). Abbildung 2 zeigt einen typischen Arbeitsablauf, der bei der Entwicklung eines DoE-basierten Experiments zur Optimierung von Biosensoren verwendet wird. beginnend mit der Organisation regulatorischer Elemente in unterschiedlichen Modulen, die durch synthetische Biologie durch Änderungen auf Sequenzebene, insbesondere an Operator-Standorten, Hexboxen oder RBS, manipuliert werden können" (Abbildung 2A). Daher ist der nächste Schritt im DoE-Workflow die Randomisierung von Sequenzstellen, um Variantenbibliotheken zu generieren (Abbildung 2B). Der Grad der Randomisierung muss sorgfältig abgewogen werden, da die Anzahl der gescreenten Völker mit dem Randomisierungsgrad 4^N skalieren sollte, wobei N gleich der Anzahl der randomisierten Basispositionen ist. Die Behandlung jedes eindeutigen Promotors oder jeder RBS-Sequenz als eindeutige kategoriale Variable in DoE würde die Anzahl der erforderlichen Konstrukte auf ein experimentell nicht durchführbares Niveau erhöhen, da eine solche Umwandlung in stetige Variablen durch Charakterisierung der Bibliotheken ein notwendiger Triage-Schritt ist, um den durch Randomisierung erworbenen Funktionsbereich zu messen und die obere, mittlere, und untere Grenzen der Funktionalität. Dies wird zunächst durch die Analyse des Outputs der Bibliotheken als Maß für die Stärke des RBS oder der Promotorvariante durch ein Reportergen erreicht (Abbildung 2C). Wie gezeigt, wird eine Lin-Log-Transformation durchgeführt, um die kontinuierlichen Variablen in Stufen zu diskretisieren, die von DoE verwendet werden können, um verschiedene Kombinationen zu untersuchen und ein Modell zu entwickeln, das die Auswirkungen dieser Varianten beschreibt. Anschließend wird ein Screening-Design mit 3 Ebenen implementiert, die den Aktivitätsbereich für jeden Faktor kombinatorisch beschreiben (Abbildung 2D). Durch den Zusammenbau und die Erprobung der vorgeschlagenen Designs wird der Experimentierraum effizient erkundet und die Wechselwirkungen zwischen den Faktoren aufgedeckt. Die statistische Analyse der resultierenden Daten wird verwendet, um zu bestimmen, welche Kombination von Faktoren den signifikantesten Einfluss auf die Ausgabe des Biosensors hat, und SLSR wird verwendet, um das Verhalten des Systems unter verschiedenen Kriterien vorherzusagen, was die Optimierung des Biosensors im Hinblick auf bestimmte Ergebnisse wie einen erhöhten Dynamikbereich oder eine erhöhte Empfindlichkeit erleichtert (Abbildung 2D).

Abbildung 3 demonstriert die Assemblierung und das Screening einer aTF-regulierten Promotorbibliothek. Die isotherme Assemblierung unter Verwendung eines degenerierten Oligonukleotids wurde durchgeführt, um eine Plasmid-kodierte Bibliothek zu erstellen, wobei jedes Plasmid an bestimmten Positionen eindeutig randomisiert wird. Der Grad der Bibliotheksvielfalt wird letztendlich die Anzahl der zu screenenden Kolonien bestimmen, wobei größere theoretische Bibliotheksgrößen stark von der Automatisierung profitieren. Die Promotorsequenzanalyse von homologen Operonen zu TphR lieferte eine Karte der Basenerhaltung, die als Information über Randomisierungsorte diente, insbesondere Basen, die ein gewisses Maß an Variation aufwiesen und daher die Aktivität modulieren können, ohne absolut notwendig zu sein²³. Drei Basen in jeder der -35- und -10-Hex-Boxen wurden für die vollständige Randomisierung anvisiert, zusätzlich zu sechs Basen in der Operator-Site (Abbildung 3A), was zu einer theoretischen Promotorbibliothek von ~500.000 führt. Die Plasmidbibliothek wurde anschließend verwendet, um den Wirtsstamm zu transformieren. In dieser Phase ist eine gute Transformationseffizienz von entscheidender Bedeutung, um eine ausreichende Bibliotheksabdeckung mit gängigen Ansätzen zur Fehlerbehebung zu erreichen, die in Abbildung 3B. Die Optimierung der DNA-Konzentrationen, der Transformationsmethode und des Klonierungsdesigns kann die Transformantenausbeute erheblich verbessern. Abbildung 3C Zeigt einen typischen Arbeitsablauf bei der Gewinnung von Transformanten, einzelne Kolonien, die einzigartigen Varianten entsprechen, müssen zunächst in Medien gezüchtet werden, bevor mit der Charakterisierung begonnen werden kann. Um die theoretische Bibliotheksgröße abzudecken, muss eine große Anzahl von Varianten ausgewählt und in Platten angeordnet werden. Der Einsatz automatisierter Systeme wie Liquid Handler und Colony Picker kann diesen arbeitsintensiven Schritt trivialisieren. Schritt 1 von Abbildung 3C veranschaulicht die Übergabe von Wachstumsmedien an MTPs, die manuell in das Liquid-Handler-Dock geladen wurden, gefolgt von einer automatisierten Inokulation durch einen Koloniepicker. Einige Schritte, wie z. B. das Versiegeln der Platten und das Übertragen in Offline-Inkubatoren, erfolgen manuell, können aber auf Wunsch auch automatisiert werden. Nach dem Wachstum der Kulturen können Liquid Handler auch zur Erzeugung von Kryo-Beständen durch Zugabe von Glycerin verwendet werden, wie in Abbildung 3C. In dieser Phase wird durch die Barcodes der Platten sichergestellt, dass jede ausgewählte Variante mit einer bestimmten Platte und einem bestimmten Well-Standort verknüpft wird, was eine einfache Referenzierung für die weitere nachgelagerte Charakterisierung ermöglicht. Einer der Hauptvorteile automatisierter Ansätze ist neben der Reduzierung des Arbeitsaufwands die Reduzierung menschlicher Fehler, da Fehler in der Phase der Bibliotheksvorbereitung weniger wahrscheinlich übernommen werden. Schritt 2 von Abbildung 3C veranschaulicht die automatisierte Charakterisierungsphase der Bibliotheksvorbereitung. Das beginnt via die Befüllung der DWBs mit Medien über die Liquid-Handler-Plattform, gefolgt von der Inokulation mit den barcodierten Kryo-Stoffen. Die Automatisierung in dieser Phase sorgt wiederum dafür, dass Pipettierfehler und Arbeitsaufwand minimiert werden. Die Platten werden dann versiegelt und manuell in Offline-Inkubatoren für das Wachstum überführt, woraufhin die Anordnung der Effektorverbindungen in frische Deep-Well-Platten eingeleitet werden kann. Für die Zwecke einer ersten Überprüfung von Bauteilbibliotheken kann ein einfacher EIN/AUS-Bildschirm wünschenswert sein, da dieser verwendet werden kann, um nicht-funktionale Varianten vorzuprüfen, die die gleiche oder eine schlechtere Aktivität als das Basiskonstrukt aufweisen, und den Variantenpool für Varianten mit erhöhter Aktivität anzureichern. Dies hat den zusätzlichen Vorteil, dass die Materialkosten für Spitzen und Platten gesenkt werden, die bei Screening-Protokollen großer Bibliotheken unerschwinglich sein können. Wenn jedoch eine Optimierung komplexerer Leistungsmetriken von Biosensoren erforderlich ist (z. B. EC₅₀) sind zusätzliche Effektorkonzentrationen erforderlich. Nach dem Wachstum der Kulturen werden die Platten wieder auf die Liquid-Handler-Plattform zurückgeführt, die mit der Inokulation der Platten mit Effektorverbindungen beginnt, bevor sie für die Dauer des Assays wieder manuell in den Inkubator zurückgeführt wird. Abbildung 3D Veranschaulicht den letzten Automatisierungsschritt vor der Datenerfassung. Nach Ablauf der verstrichenen Zeit für das Wachstum und die Aktivierung des Biosensors werden die Platten aus dem Offline-Inkubator entnommen und an die Liquid-Handler-Plattform zurückgegeben. Um verbleibende Wachstumsmedien zu entfernen, die die Fluoreszenzdatenerfassung beeinträchtigen können, sind Zentrifugation, Entfernung des Überstands und Waschen der Zellen mit 1x PBS erforderlich. Der Einsatz von Liquid Handlern kann diesen Prozess erneut trivialisieren, da die automatische Resuspension der Kulturen eine schnelle Verarbeitung der Platten ermöglicht, einschließlich der Übertragung der gewaschenen Zellen auf MTPs im 96-Well-Format für das Screening. Die Datenerfassung kann manuell oder automatisiert erfolgen, wobei einige Lesegeräte mit Plattenstapeln ausgestattet sind, die mit Liquid Handlern verbunden werden können, um den Datenerfassungsprozess weiter zu automatisieren. Durch den Vergleich des Verhältnisses der Biosensoraktivierung in Gegenwart eines Effektors (ON) zu seiner Abwesenheit (OFF) wurden 5.000 Varianten anhand des Grades der Biosensoraktivierung (Faltungsänderung) bewertet, um die Biosensorfunktion zu bestimmen; Nur die Varianten mit einer Aktivität oberhalb der des Basiskonstrukts (3,6-fach) wurden für die weitere Charakterisierung herangezogen, wie der rot-rosa schattierte Bereich des Streudiagramms (Abbildung 3D). Basierend auf den Platten- und Well-Positionen des angereicherten Variantenpools kann dann eine robuste Charakterisierung mit biologischen Replikaten oder unterschiedlichen Effektorkonzentrationen durchgeführt werden, indem auf die ursprünglichen barcodierten Kryo-Stockplatten zurückgegriffen wird, die in Schritt 1 des Workflows erzeugt wurden.

Abbildung 4 zeigt das Screening der triagierten Varianten aus dem ersten Bibliotheksscreening mit dem Ziel, eine Promotorbibliothek zur Optimierung der Sensitivität zu entwickeln. Unter Verwendung der Daten aus den 5.000 Varianten, die im vorherigen Workflow gescreent wurden, wurde ein triagierter Pool von 226 Varianten aus dem anfänglichen EIN/AUS-Bildschirm, die als aktiver als die elterliche Sequenz bestimmt wurden, dann weiter charakterisiert und nach ihrer Sensitivität eingestuft, um als Niveaus zu fungieren, um die herum eine DSD entworfen werden konnte. In einem ersten Schritt müssen die kategorialen Variablen, in diesem Fall die P_out top-Varianten, in stetige Variablen umgewandelt werden, die einen weiten Sensitivitätsbereich abdecken. Um die Empfindlichkeit zu screenen, sind Dosis-Wirkungs-Kurven erforderlich, um EC_50-Daten aus einer aufgetragenen Hill-Funktion zu erhalten. Dies erhöht die Beschichtungsarbeit erheblich und eignet sich gut für die Automatisierung mit Liquid Handlern, um den Prozess der Assay-Einrichtung und des Screenings zu vereinfachen, wie in Abbildung 4A gezeigt. Gemäß dem in Schritt 2 von Abbildung 3C festgelegten Arbeitsablauf wurden Platten-Barcodes und Well-Positionen, die dem angereicherten Pool von Varianten entsprachen, verwendet, um DWBs zu impfen, die mit Wachstumsmedien und Antibiotika gefüllt waren. Um die experimentelle Robustheit zu verbessern, wurden die Varianten in biologischer Ausfertigung gescreent. Nach dem Transfer der Platten in den Offline-Inkubator zur Zucht wurden frische DWBs mit 0-, 1-, 25- und 1000-μM-Effektor-supplementierten Wachstumsmedien befüllt, wobei die Liquid-Handler verwendet wurden, um den Arbeitsaufwand zu reduzieren. Um die Anzahl der für den Assay erforderlichen Platten zu reduzieren, wurde ein Konzentrationsbereich gewählt, der die untere Mitte und den oberen Rand der Kurve umfasst, wobei die mittleren Konzentrationen die relative Sensitivität jeder Variante anzeigen, wie in Abbildung 4A dargestellt. Nach der Inokulation der Variantenpools bei jeder Effektorkonzentration und der Analyse von Fluoreszenz und OD₆₀₀ wurden Dosis-Wirkungs-Kurven gezeichnet, wobei eine nichtlineare Regressionsanalyse zur Bestimmung von EC₅₀ verwendet wurde. In dieser Phase wurde eine Rohbibliothek jeder Variante mit einem eindeutigen EC_50-Wert generiert, wobei die 100 robustesten Varianten weitergeführt wurden, wie in Abbildung 4B gezeigt, um die Bibliotheksgröße weiter zu reduzieren. Bevor diese Bibliothek jedoch in DoE verwendet werden kann, muss die Konvertierung der eindeutigen Varianten in eine Ranglistenbibliothek generiert werden, die den darin enthaltenen Empfindlichkeitsbereich darstellt. Dies wurde durch die Durchführung einer Lein-Log-Transformation der Daten erreicht, bei der die Daten so eingestuft und neu skaliert werden, dass jede Variante von der empfindlichsten (-1) bis zur am wenigsten empfindlichen (+1) eingestuft wird, sowie durch die Definition eines Mittelwerts (0), der das geometrische Mittel des Datensatzes darstellt Abbildung 4C. Die Transformation der Rohdaten erzeugte das in Abbildung 4D gezeigte blaue Diagramm, aus dem diskrete P-Out-Sequenzen, die +1, 0 und -1 entsprachen, als P-out-Faktorstufen in das endgültige Screening-Design übernommen wurden.

Abbildung 5 demonstriert den kompletten Workflow nach der Bibliotheksgenerierung von der DSD-Generierung über die Modellierung bis hin zur globalen Optimierung eines Biosensors auf Basis der DoE-gestützten Learnings. Abbildung 5A zeigt eine Aufteilung eines typischen Biosensors in 3 Module mit entweder 1 (Transport- und Reglermodul) oder 2 (Ausgangsmodul) Regelungsknoten. Nach dem Vorbild von Abbildung 4, RBS- oder Promotorbibliotheken wurden entwickelt, und es wurden Stufen zwischen +1, 0 und -1 ausgewählt, um die größte Variation jedes Faktors zu berücksichtigen. Die Größe der gescreenten Bibliotheken bestimmt in der Regel die Anzahl der Experimente, die erforderlich sind, um den Entwurfsraum vollständig zu erkunden, z. B. wenn jede Bibliothek die Größe 22 hätte, würde dies 22 entsprechen⁴ (234.256) Kombinationen. DoE zielt darauf ab, den experimentellen Arbeitsaufwand zu vereinfachen, indem die Anzahl der Kombinationen durch strukturierte Screening-Designs reduziert wird. Obwohl viele Methoden möglich sind, ist DSD ideal für die Entwicklung von Biosensoren, da es die Identifizierung von Hauptfaktoren und Zwei-Faktoren-Wechselwirkungen ermöglicht und gleichzeitig verwirrende Effekte zweiter Ordnung vermeidet. Da DSD-Designs 3 Stufen verwenden, ist es außerdem möglich, die Krümmung (Nichtlinearität) zu schätzen. Abbildung 5A demonstriert einen typischen DSD-Ausgang, bei dem jedes der 4 Module auf unterschiedliche Pegel eingestellt ist; Da jede Stufe einem bestimmten Promotor oder einer bestimmten RBS-Variante entspricht, wird die isotherme Assemblierung verwendet, um die genetischen Konstrukte zu erzeugen, die den empfohlenen Designs der DSD entsprechen. Nach dem Zusammensetzen und Transformieren des Wirtsstamms mit den empfohlenen Konstrukten werden Dosis-Wirkungs-Kurven unter Verwendung eines vollständigen Bereichs von Effektorkonzentrationen erhalten, um mehr Vertrauen in die Leistung jedes der Konstrukte zu schaffen Abbildung 5B. Da DSD die Anzahl der Konstrukte drastisch reduziert, kann dieser Schritt oft von Hand oder auf Wunsch mit automatisierten Liquid Handlern durchgeführt werden. Abbildung 5C stellt die Ausgabe des Vorhersageprofils dar, das nach der Konstruktion und dem Testen der vorgeschlagenen Kombinationen aus dem DSD-Bildschirm und der Erstellung von Vorhersagemodellen auf der Grundlage des Hügelkoeffizienten (n_H) und EC₅₀ Ausgabe jeder getesteten Kombination. Ziel des Experiments war es, ein Biosensor-Konstrukt zu entwickeln, das global optimiert ist und sowohl auf die_H und EG₅₀ durch Modulation der Expression der 4 regulatorischen Knoten, um beide Parameter zu maximieren. Jeder regulatorische Faktor wird in einer eigenen Spalte angezeigt, wobei der Expressionsgrad entlang der x-Achse entsprechend den lin-log-transformierten Promotoren und RBS-Bauteilbibliotheken (-1 bis +1) angegeben wird. Die Auswirkung der Änderung der Expression von Knoten auf beide EC₅₀ und n_H wird durch die Kurven in den Teildiagrammen angezeigt. Die Profildiagramme verdeutlichen die oft unintuitive Natur der Biosensoroptimierung, bei der die Abstimmung eines regulatorischen Knotens gegensätzliche Auswirkungen auf die Ausgabeparameter haben kann. Beispiel: RBS_trans zeigt sich, dass es keine starke Korrelation mit n_H,_{sie korreliert jedoch positiv mit EC50} auf nichtlineare Weise. Im Fall von RBS sind auch Wechselwirkungen höherer Ordnung (nichtlinear) impliziert_aus Eine Erhöhung der Festigkeit erhöht die Steigung (höher n_H) mit einer gleichzeitigen Erhöhung der Empfindlichkeit (niedrigere₅₀), was zu einer Kurve mit einer digitaleren Steigung und einer schärferen Reaktion auf zunehmende Effektorkonzentration führt. Aus diesen Modellen können unintuitive Facetten des Biosensor-Tunings klarer dargestellt werden, was die Optimierung der Regulationsknoten in Richtung eines globalen Optimums ermöglicht. Die Modelle wurden verwendet, um die globalen Optima sowohl für EC als auch für EC₅₀ und n_H , wobei die roten Linien im Diagramm die optimalen Niveaus der einzelnen regulatorischen Knoten anzeigen (Abbildung 5C). Abbildung 5D zeigt das Dosis-Wirkungs-Profil des anfänglichen elterlichen Biosensor-Konstrukts (blau) im Vergleich zum leistungsstärksten DSD-Design (Grün) und dem global optimierten Konstrukt (Flieder). Verwendung des Modells zur Vorhersage der idealen Modulstärken für die Maximierung des EC₅₀ und n_H, eine Variante, die RBS entspricht_trans (-1), P_Reg (-0,7), P_aus (-0,3) und RBS_aus (+1) Stärken wurden zusammengestellt und mit dem optimierten Konstrukt charakterisiert, das Verbesserungen in EC zeigt₅₀ und n_H (Abbildung 5D). Während sowohl der DSD als auch global optimierte Biosensoren eine ähnliche EC₅₀ (0,8 vs 0,7 μM), n_H erheblich verbessert wurde, ohne die₅₀ bereits erzielte Gewinne. Die Ergebnisse zeigen deutlich die Vorteile von datengetriebenem Design gegenüber intuitionsbasierten Ansätzen und dienen dazu, DoE als Mittel zur Rationalisierung und Vereinfachung des Biosensor-Tuning-Prozesses zu validieren.

Abbildung 1: Abstimmung von genetisch kodierten Biosensorparametern. Layout der genetischen Module eines genetisch kodierten Biosensors, einschließlich aTF, Operator Sites (OS), Hexboxen (-35, -10) und RBS-Komponenten. Farbige Kästchen entsprechen Wechselwirkungen, die typischerweise Biosensorparameter beeinflussen, wie z. B.: Ligand-aTF-Affinität (grau), aTF-Operator (rosa), RNAP-Hexbox (grün) und RBS (orange). Die Auswirkungen der einzelnen Parameter auf die Dosis-Wirkungs-Eigenschaften sind in den repräsentativen Diagrammen dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Überblick über einen typischen Arbeitsablauf zur Optimierung von DoE-Biosensoren. (A) Überblick über die Modularisierung von Biosensorkomponenten, die ein Transportmodul zeigen, das für ein Transportprotein kodiert, um den Zieleffektor zu importieren, ein Regulatormodul, das zum aTF gehört, und ein Ausgangsmodul, das für ein Reporterprotein wie sfGFP kodiert. Ebenfalls dargestellt sind Regulationsknoten wie RBS_trans, P_reg, P_out und RBS_out, die den genetischen Knoten entsprechen, die einer Randomisierung unterzogen werden, um Biosensorparameter zu untersuchen. (B) Eine Auswahl von Sequenzelementen, die für die Basenrandomisierung geeignet sind, einschließlich Promotoren und RBS. Die Elternsequenz des Promotors ist in der oberen Zeile dargestellt, wobei die endgültige Mutantensequenz unten dargestellt ist, Sterne zeigen unveränderte Basen an, während K, M und N sich auf Guanin/Thymin, Adenin/Cytosin bzw. ein beliebiges Nukleotid beziehen. Promotoren bieten ein größeres Randomisierungspotenzial durch das Targeting von Hexboxen oder Operator-Standorten und können auch die Duplizierung oder Änderung des Sequenzabstands umfassen. RBS-Bibliotheken bieten eingeschränktere Randomisierungsoptionen, sind jedoch aufgrund ihrer geringeren maximalen Vielfalt wesentlich einfacher zu überprüfen. (C) Die Expressionsniveaus der Varianten werden charakterisiert und dann in eine rangierte Lin-Log-Bibliothek konvertiert, um die kategorialen Variantenfaktoren in 3 diskrete Ebenen umzuwandeln, die für die Analyse über DoE besser geeignet sind. (D) Die Kartierung des Experimentierraums erfolgt unter Verwendung von Multiplex-Kombinationen der drei Ebenen jedes Moduls, um ein Modell zu generieren, das als Grundlage für Designentscheidungen verwendet werden kann, um die Leistung des Biosensors auf die gewünschten Ergebnisse abzustimmen, z. B. auf den Dynamikbereich oder auf die Empfindlichkeit. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Modularisierung von Biosensoren, Aufbau von Promotorbibliotheken und automatisierter Arbeitsablauf. (A) Beispiel für die Randomisierung spezifischer Sequenzen im aTF-Promotor und die Einfügung in das Biosensorkonstrukt durch isotherme Assemblierung. Fettgedruckte Buchstaben kennzeichnen Positionen, die während der degenerierten Oligonukleotidsynthese in der Operator-Site oder in den Hexboxen entsprechend dem bereitgestellten Schlüssel randomisiert wurden. (B) Panel, das die Transformation der resultierenden Biosensor-Variantenbibliothek in einen Klonierungswirt wie E. coli und die nächsten Schritte in Abhängigkeit von der Transformantenausbeute beschreibt. Eine geringe Transformationseffizienz kann zu einer schlechten theoretischen Bibliotheksabdeckung und einer unzureichenden Erkundung des Designraums führen. Die Fehlerbehebung in dieser Phase ist unerlässlich, um sicherzustellen, dass ein erheblicher Teil der Varianten für die Charakterisierung zur Verfügung steht, wobei gängige Maßnahmen zur Fehlerbehebung beschrieben werden. (C) Ablauf der Schritte 1 und 2, wie im Protokoll beschrieben, wobei das rote Handsymbol manuelle Schritte und das Zahnrad automatisierte Schritte anzeigt. Der Arbeitsablauf Schritt 1 hebt die wichtigsten Schritte im Protokoll hervor, von der Kolonieauswahl bis zur Generierung von Kryobeständen. Der Arbeitsablauf in Schritt 2 demonstriert die Wiederbelebung und Neuanordnung von Kryo-Stämmen für die Analyse anhand der Dosis-Wirkungs-Kurve. (D) Das Gremium, das das abschließende Verfahren vor dem Screening demonstriert, einschließlich des Waschens der Zellen und des Transfers auf Assay-Platten vor der Messung von Fluoreszenz und OD. Ein gescreenter Variantenpool von 5000 ist in dem Panel dargestellt, wobei die Varianten, die ON/OFF über die elterliche Promotorsequenz (3,6-fach) hinaus aufweisen, in der orangefarbenen Box hervorgehoben sind. Viele der Varianten gruppieren sich um 1, was auf eine schlechte Leistung und geringe Variabilität hinweist, was wahrscheinlich auf die Randomisierung auf Sequenzebene zurückzuführen ist, die zu einem Funktionsverlust führt. Die 226 Varianten, die in der Grafik in Boxen gezeigt wurden, wurden für eine robuste Charakterisierung weitergeführt. Die Daten wurden aus der Originalveröffentlichung von Alvarez Gonzalez et al.²³ übernommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Screening und Diskretisierung der Top-Variante der Promotorbibliothek mittels Lin-Log-Transformation. (A) Überblick über das Standardverfahren zur Erzeugung von Expressionsdaten für ein RBS oder eine Promotorbibliothek. Unter Verwendung der triagierten Varianten, die einen guten Bereich von Expressionsniveaus repräsentieren, werden Liquid Handler verwendet, um Assay-Platten zu erzeugen, die mit einer vorbestimmten Konzentration des Effektors vorgefüllt sind, aus denen Dosis-Wirkungs-Kurven der triagierten 226 Varianten abgeleitet werden können. (B) Nach EC_{50-Bestimmung} und weiterer Reduzierung der charakterisierten Bibliothek auf 100 Varianten werden die Daten als Balkendiagramm dargestellt, das den Mix verschiedener Sensitivitäten zeigt, der aus der Promotor-Randomisierung generiert wurde. (C)Die EC_50-Daten werden unter Verwendung der Zeilen-Log-Ratengleichung transformiert, um den kontinuierlichen Datensatz in einen kategorialen Datensatz umzuwandeln, der sich besser für die Faktorisierung in einer DSD eignet. (D) Die transformierten EC_{50-Variantendaten} werden nun auf eine vereinfachte Skala reduziert und von hoher bis niedriger EC_{50-Aktivität} eingestuft. Daraus werden 3 Ebenen ausgewählt, die den Varianten des oberen (+1) geometrischen Mittels (0) und des unteren (-1) entsprechen und in das DSD zur Erkundung des Experimentierraums übernommen werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: DSD-Versuchsdesign, Tests und modellbasierte Lernergebnisse. (A) Schematischer Arbeitsablauf, der die Generierung einer DSD-Designtabelle basierend auf den lin-log-transformierten Ranglistenbibliotheken der RBS-Module_trans, P_reg,_{P out und RBSout} zeigt. Die DSD-Designtabelle schlägt die kleinste Anzahl von Kombinationen vor, um den Experimentierraum effizient abzubilden. Es wird eine Beispielausgabe gegeben, bei der +1, 0 und -1 auf die leistungsstärksten Varianten mit oberer, mittlerer und unterster Leistung für jeden regulatorischen Knoten verweisen, wie durch die lin-log-Transformationen beschrieben. Diese werden durch isotherme Assemblierung konstruiert und durch Sequenzierung bestätigt, bevor sie zur Charakterisierung in den Expressionswirt transformiert werden. (B) Nach der Transformation werden die Zellen gezüchtet und gegen einen breiten Bereich von Effektorkonzentrationen getestet, und die Fluoreszenzleistung wird gemessen, um Dosis-Wirkungs-Kurven zu erstellen. Verschiedene Parameter, wie z. B. nH und EC50, werden aus den Dosis-Wirkungs-Kurven extrahiert und in das DSD eingespeist, um Vorhersagemodelle für jeden Faktor zu erstellen. (C) Mit Hilfe der Modelle können Vorhersagen über die Auswirkungen der Modulation eines Biosensorparameters durch Änderung des Expressionsniveaus eines regulatorischen Moduls getroffen werden. Wichtig ist, dass eine globale Abstimmung der regulatorischen Knoten möglich wird, die die Maximierung eines oder mehrerer Biosensorparameter gleichzeitig ermöglicht, was durch die gestrichelten roten Linien in jedem Teildiagramm angezeigt wird. (D) Die Optimierung des Modells in Richtung maximaler Sensitivität führt zu dem global optimierten Konstrukt (lila), dessen Dosis-Wirkungs-Kurve gegen das leistungsstärkste DSD-Konstrukt (grün) und das elterliche Biosensor-Konstrukt (blau) aufgetragen wird. Die extrahierten n n_H - und EC_50-Parameter sind unterhalb des Diagramms dargestellt, was die Verbesserung beider Parameter gegenüber dem leistungsstärksten DSD-Konstrukt demonstriert und die Wirksamkeit der aus der DSD generierten Vorhersagemodelle validiert. Die Daten wurden aus der Originalveröffentlichung von Alvarez Gonzalez et al.²³ übernommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 1: Automatisierte Schritte des Liquid-Handling-Protokolls, die für die Vorbereitung der Biosensorbibliothek und die Einrichtung des Assays verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2 zur ergänzenden Abbildung 6: Schritt-für-Schritt-Generierung eines Definitive Screening Designs (DSD). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Bibliotheken genetischer Elemente, die eine breite genetische Variabilität umfassen, sind entscheidend für den Erfolg einer DoE-basierten Methodik. Wie in Abbildung 2A gezeigt, steigt die Anzahl der theoretischen Varianten mit der Anzahl der Positionen, die für die Mutagenese anvisiert werden sollen, sowie mit dem Grad der Randomisierung, wobei diese ständig wachsende Bibliotheksgröße zu erheblichen Screening-Engpässen führt. Die Reduzierung der Anzahl der Zielpositionen oder des Grades der Randomisierung kann die Anzahl der zu screenenden Varianten reduzieren und ist ein attraktiver Ansatz, wenn ein gezielterer Ansatz für die Abstimmung erforderlich ist oder wenn signifikante a priori Kenntnisse des Systems als Leitfaden vorhanden sind. Im Falle von Systemen wie Biosensoren, die viele überlappende Merkmale aufweisen oder möglicherweise keine gut charakterisierten genetischen Elemente aufweisen, ist es jedoch schwierig, die Anforderung an die Bibliotheksgröße zu umgehen. Der Einsatz automatisierter Liquid-Handler kann die Arbeit bei der Kommissionierung von Kolonien und der Kultivierung von Varianten trivialisieren, insbesondere wenn eine verstärkte Datenpunkterfassung für die Darstellung fortschrittlicherer Funktionen wie Dosis-Wirkungs-Kurven im Vergleich zu zwei Datenpunktkomparatoren, wie z. B. EIN/AUS, erforderlich ist. Es ist zwar schwierig, die Zeitersparnis durch die Einbeziehung automatisierter Arbeitsabläufe spezifisch zu quantifizieren, Der Hauptvorteil der Umsetzung liegt in der Zeit, die für andere parallele Experimente aufgewendet werden kann³⁸.

Trotzdem werden in vielen Fällen, in denen die Bibliotheksgröße 10⁴ übersteigt, selbst Liquid Handler-gestützte Methoden unpraktisch³⁹. In solchen Fällen ist ein vorläufiges Screening der Varianten mittels Durchflusszytometern ein sehr attraktiver Ansatz, mit einer deutlich größeren Sortierkapazität von bis zu 10⁷ Zellen pro h⁴⁰. Die Verwendung von fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) mit zwei Runden positiver Selektion und mindestens einer Runde negativer Selektion wurde routinemäßig bei der Triage der leistungsstärksten Varianten von Biosensoren eingesetzt, bevor eine umfassendere Charakterisierung vorgenommen wurde 16,26,42. Die Entwicklung und Ausführung solcher Protokolle unter Verwendung von FACS ist an anderer Stelle ausführlich untersucht^{worden 31}. Erste Triage-Screenings sind unter Verwendung von plattenbasierten Liquid-Handler-Assays möglich, wie im obigen Protokoll beschrieben; Durch den Vergleich von ON/OFF-Daten unter Verwendung einer einzigen Effektorkonzentration, wie in Abbildung 3D gezeigt, können nur variante Biosensoren mit einem nennenswerten Funktionsgewinn (3,6-fach, wie in den Methoden vorgesehen) für eine weitere detaillierte Charakterisierung ausgewählt werden, wodurch die Bibliotheksentwicklung und die experimentelle Laufzeit optimiert werden. Sowohl FACS- als auch Liquid-Handler-Plattformen sind jedoch mit erheblichen Kapitalinvestitionen für das Labor verbunden und erfordern oft ein gewisses Maß an technischem Know-how für den Betrieb und die Wartung. Agarplatten-basierte Screens bieten eine niedrigere technische und finanzielle Eintrittsbarriere und wurden in Kombination mit GFP oder Blau-Weiß-Kolonie-Screening verwendet, um RBS-Bibliotheksvarianten sowie Enzymmutanten basierend auf der Intensität der Fluoreszenz^{auszuwählen 43,44}. Auch diese sind jedoch in der Anzahl der Varianten, die effektiv gescreent werden können, begrenzt, erfordern aber auch einen signifikanten Unterschied in der Fluoreszenz, um nachweisbar zu sein⁴⁴. Als Kompromiss zwischen der vollständig kombinatorischen gleichzeitigen Mutation mehrerer Elemente zielt eine "Teile und herrsche"-Methode stattdessen darauf ab, große Variantenbibliotheken in besser handhabbare Screening-Blöcke aufzuteilen⁴¹. Ein modularisierter Ansatz mag zwar pragmatisch sein, erforscht aber den kombinatorischen Designraum nicht effektiv, da die Leistung biologischer Komponenten bekanntermaßen stark kontextabhängig ist, insbesondere bei Bakterien, bei denen transkriptionelle und translationale Kopplung vorherrschend sind. Dies hat das Potenzial, zu Designentscheidungen zu führen, die auf die lokalen Maxima statt auf die globalen Optima abzielen.

Der Transport und die Erkennung spezifischer Induktoren stellen ein weiteres wichtiges Merkmal der Biosensorentwicklung dar, das Erwähnung verdient, obwohl es nicht im Mittelpunkt des skizzierten Protokolls steht. Das Fehlen eines geeigneten aTF für das Zielmolekül stellt eine große Herausforderung für die Forscher dar. Die rationale Auswahl eines vorhandenen aTF, das ein strukturelles Analogon des Zieleffektors bindet, kann eine ideale Vorlage für die Anwendung der Codon-Randomisierung bieten, um die Spezifität des aTF auf den gewünschten Effektor¹⁷ abzustimmen. Die Ausrichtung der Zielsequenz auf gelöste Strukturen oder Alphafold-Vorhersagen kann die Identifizierung von Effektorbindungsstellen mit vermuteten Aminosäureresten ermöglichen, die einer semi-rationalen Randomisierung und Rangfolge unterzogen werden, die an das Protokoll^{angepasst werden kann 17}. In ähnlicher Weise kann die Auswahl und Modulation von Transportern, die für den Import/Export von Effektoren verantwortlich sind, die Dosis-Wirkungs-Eigenschaften von Biosensoren erheblich verändern. Es wurde festgestellt, dass die Genexpression von Transportern ein wichtiger Faktor bei der Reaktion von Biosensoren ist, wobei eine diversifizierte Bibliothek von P-Tac-Promotoren und RBS die Expression eines MucK-Transporters steuert, der zur Stabilisierung seiner Expression über mehrere FACS-Runden verwendet wird, wodurch die Robustheit der Biosensorantwort erhöht^{wird 17}. In ähnlicher Weise kann das Screening verschiedener Transporterproteine selbst die Spezifität von Biosensoren modulieren, wobei das Screening eines mutmaßlichen Satzes von PcaK-Transportern unter Verwendung eines PCA-responsiven Biosensors zur Identifizierung von zwei Transportern führt, die in einzigartiger Weise in der Lage sind, 3,5-hydroxylierte Substrate aufzunehmen, wodurch die Menge der von diesem System nachweisbaren Verbindungen erweitert^{wird 24}.

Automatisierte Plattformen können zu noch leistungsfähigeren Werkzeugen für die Charakterisierung und Exploration werden, wenn DoE-Prinzipien mit Deep-Learning-Modellen gekoppelt^{werden 46,47}. Nach der ersten Erkundung des Designraums eines Biosensors mit einer Hochdurchsatzplattform wurden Algorithmen des maschinellen Lernens genutzt, um die Funktion uncharakterisierter Sequenzen mit guter Genauigkeit vorherzusagen ⁴⁷. Die in diesem Protokoll beschriebenen Methoden könnten leicht beim Testen neuer Sprachlernmodelle für das Promotordesign angewendet werden, ähnlich wie Modelle, die auf der Grundlage der Cross-RBS-Sequenzvorhersage^{entwickelt wurden 48}. Darüber hinaus kann die Integration solcher Modelle die in den nicht-funktionalen Promotordesigns enthaltenen Sequenzfunktionsdaten nutzen und einen kritischen Einblick in die breitere Funktionalität des Biosensors als Ganzes geben. Dies hätte nämlich das Potenzial, eine entscheidende Einschränkung des DoE-Workflows zu beheben, nämlich dass falsch positive Ergebnisse, z. B. ein nicht-funktionaler Promotor, nicht unbedingt mit einer gemessenen Ausgabe von Null gleichzusetzen sind, mit Phänomenen wie falscher Transkription oder der Einführung eines Rauschelements in DoE-Daten, das schwer zu identifizieren und zu kontrollieren ist. Entscheidend ist, dass alle generierten Bibliotheken, um den gesamten experimentellen Designraum zu umfassen, ein breites Spektrum an Aktivitäten aufweisen müssen, da ein unzureichender Aktivitätsbereich zu verzerrten Designergebnissen führt und zu Unzuverlässigkeiten in allen statistischen Modellen führt, die aus dem Datensatz³⁰ generiert werden. Wenn eine geringe Bibliotheksvariabilität ein Problem darstellt, kann die Erkundung anderer Sequenzelemente oder die Erhöhung des Randomisierungsgrades implementiert werden, und die Variation zwischen den Bibliotheken kann verglichen werden, bis ein geeigneter Variantenpool erreicht ist.

Ein entscheidender Aspekt des DoE-Prozesses ist die korrekte Schätzung und Auswahl der primären und sekundären Effekte aus dem DSD, die dann in die statistische Analyse einfließen. Da es sich um einen modellierungsbasierten Ansatz handelt, ist DoE sehr anfällig für Überanpassung und Verzerrung, was den Optimierungsprozess schnell verkomplizieren kann, indem iterative Engineering-Bemühungen in suboptimale Abschnitte des Designraums gelenkt^{werden 49}. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, sicherzustellen, dass alle Designs sowohl in der Phase der Konzeption als auch bei der Analyse der Daten robust vor solchen Auswirkungen geschützt sind. In der anfänglichen Screening-Entwurfsphase können zentrierte Durchläufe, bei denen alle Faktoren auf das geometrische Mittel (d. h. 0,0,0,0) eingestellt sind, dazu beitragen, die Modellverzerrung zu reduzieren, indem nichtlineare Wechselwirkungen besser berücksichtigt werden, ohne einen signifikanten experimentellen Aufwand (1-3 zusätzliche Durchläufe) zu verursachen)⁴⁹. Darüber hinaus kann die Einbeziehung randomisierter Designs dazu beitragen, irrelevante Variablen zu berücksichtigen, die nicht im experimentellen Design enthalten sind, aber dennoch die gemessenen Antwortvariablen beeinflussen könnten. In einem biologischen Kontext befasst sich die Randomisierung mit Themen wie raumzeitlichen Effekten, wie z. B. der Plattenposition oder der Variation von Charge zu Charge, und verhindert, dass solche Effekte die Dateninterpretation signifikant beeinflussen. Die Beachtung solcher Details in diesem frühen Stadium kann die Robustheit von Modellen verbessern und zu zuverlässigeren Schlussfolgerungen führen. Nach Durchführung der von der DSD vorgeschlagenen Experimente ist eine statistische Analyse der Daten erforderlich, um die Faktoren aufzuklären, die einen signifikanten Einfluss auf die Ausgabeparameter hatten. Diagramme mit halber Normalverteilung bieten eine intuitive visuelle Darstellung der Effektgrößen, wobei Effekte ohne Signifikanz in der Regel entlang einer geraden Linie fallen, während Effekte mit signifikanten Auswirkungen von dieser Linie abweichen, was eine einfache Auswahl der wichtigsten Faktoren bei der Optimierung von Biosensoren ermöglicht. Vor diesem Hintergrund sollte wie bei allen Modellierungen ein konservativer Ansatz bei der Effektauswahl gewählt werden, um das Risiko einer Modellüberanpassung zu verringern.

Die Fähigkeit, Biosensoren und andere genetische Schaltkreise schnell zu entwerfen und zu optimieren, wird das Tempo der Forschung auf dem Gebiet der Biotechnologie erheblich beschleunigen, z. B. bei der Stamm- und Enzymentwicklung, aber auch in der Echtzeitdiagnostik. Das Aufkommen von DoE-basierten Screening-Methoden in diesem Bereich ist besonders vielversprechend, da sie die effiziente Nutzung von Zeit und Ressourcen bei gleichzeitiger Auslotung des maximal möglichen Gestaltungsspielraums erleichtern und bereits mit großem Erfolg bei der Optimierung genetischer Schaltkreise für Stoffwechselwege und für Biosensoren eingesetzt wurden 31,33,34,51. DoE eignet sich besonders gut für multifaktorielle Optimierungsprobleme, bei denen viele Wechselwirkungen erster, zweiter oder sogar dritter Ordnung am Werk sind, die sonst mit dem typischen experimentellen Designansatz nur schwer zu hinterfragen wären. Darüber hinaus führen die Bemühungen, einen Aspekt eines Biosensors zu entwickeln, oft versehentlich dazu, dass ein anderer Parameter geopfert wird, wie z. B. die Verbesserung der Empfindlichkeit auf Kosten des Dynamikbereichs⁵¹. Durch die Fähigkeit von DoE, solche verborgenen Wechselwirkungen abzubilden und Modelle zu erstellen, die das Verhalten von Biosensoren vorhersagen, wird der Lernzyklus des Build-Tests erheblich beschleunigt.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1000 &Mikro; L CO-RE Spitzen, steril ohne Filter	Hamilton	235939
2,2 mL 96 Deepwell-Platte, quadratische Vertiefungen mit V-förmigen Böden	Thermo	11594754
300 & Mikro; L CO-RE Spitzen, gestapelte NTRs, steril	Hamilton	235985
96 Wells klarer Boden, schwarze Mikrotiterplatten	Greiner	655097
Agarose	Invitrogen	16500100
Assemblierte Plasmid-DNA	Vom Benutzer bereitgestellt	NA
ClarioStar Plus Mikroplatten-Lesegerät	BMG	NA
Dexynucloetid (dNTP) Lösungsmix	SCHNABEL	Nr. N0447L
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Fisher BioReaggents	Nr. BP231-100
DNA-Leiter 100bp	SCHNABEL	Nr. N3231L
DNA-Leiter 1KB	SCHNABEL	Nr. N3232L
DNA-Sequenzierung	Quelle: Biowissenschaften	NA
DNA-Synthese	IDT	NA
Escherichia coli DH5α Kompotente Zellen	SCHNABEL	Nr. C2987H
Gel Loading Farbstoff, Lila X6 Ohne SDS	SCHNABEL	B7025S
Genpulser/Mikropulser Elektroporationsküvetten, 0,2 cm Abstand	Biorad	1652082
Graph Pad Prism 10	GraphPad	NA
Hamilton Star Liquid Handler	Hamilton	NA
HT Multitron Plattenschüttler Inkubator	Infors HT	NA
JMP Statistical Analysis Suite	JMP	NA
LB Brühe (Müller)	Müller	Nr. L3522
LB Bouillon (Müller) mit Agar	Sigma	Nr. L3147
MicroPulser Elektroporator	Biorad	1652100
NEBuilder HiFi-DNA-Montage-Mastermix	SCHNABEL	E2621S
Q5 DNA-Polymerase mit hoher Genauigkeit	SCHNABEL	M0491S
QIAprep Spin Midiprep Kit	QIAGEN	12143
QIAprep Spin Miniprep Bausatz	QIAGEN	27104
QIAquick Gel-Extraktions-Kit	QIAGEN	28706X4
QIAquick PCR-Aufreinigungskit	QIAGEN	28104
Qpix 420 Kolonie-Picker	Molekulare Bauelemente Deutschland	NA
SOC Outgrowth Medium	SCHNABEL	B9020S
SYBR Safe DNA Gel Stain	Invitrogen	Nr. S33102
TAE-Puffer (Tris-Acetat-EDTA, 50X)	Thermo Fisher	Nr. B49
UltraPureTM Dnase/Rnase-freies destilliertes Wasser	Invitrogen	10977015