Verständnis der Veränderungen in der mitochondrialen Morphologie durch dynamische und dreidimensionale Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen

Summary

Hier beschreiben wir den mitochondrial event localizer (MEL), ein ImageJ-Plugin, das bei der Quantifizierung der 3-dimensionalen Veränderungen der mitochondrialen Spaltung und Fusionsaktivität im Laufe der Zeit nützlich ist. Wir beschreiben auch eine Bildverarbeitungspipeline, die für die Bereinigung von Schliffbildern vor der Analyse in ImageJ nützlich ist.

Abstract

Mitochondrien sind hochdynamische Organellen, die für das Überleben eines jeden Tieres lebenswichtig sind und als Reaktion auf die Bedürfnisse oder Belastungen des Wirts regelmäßige Spaltungs- und Fusionsereignisse durchlaufen, was zu einem ständigen Umbau des mitochondrialen Netzwerks führt. Aus diesem Grund ist die Möglichkeit, das mitochondriale Netzwerk sowohl in drei Dimensionen als auch im Zeitverlauf zu bewerten, von Vorteil, um zu verstehen, wie das System auf Faktoren wie Stress oder pharmazeutische Eingriffe reagiert. Die Fluoreszenzbildgebung der mitochondrialen Netzwerke von Zellen ermöglicht es, diese Veränderungen sichtbar zu machen und zu überwachen. Das mitochondriale Netzwerk wird jedoch oft als zweidimensionale und statische Struktur beschrieben, die durch nicht standardisierte Metriken definiert wird. Aus diesem Grund haben wir uns daran gemacht, eine Pipeline zu beschreiben, die es dem Benutzer ermöglicht, seine Bilder für den mitochondrial event localizer (MEL) vorzubereiten, ein ImageJ-Plugin-Tool, das Spaltungs- und Fusionsereignisse im mitochondrialen Netzwerk im Laufe der Zeit und auf 3-dimensionale Weise erkennt und so einen Einblick in die dynamischen Veränderungen bietet, die dieses Netzwerk erfährt. Darüber hinaus beschreiben wir die Vorteile des Verständnisses von Spaltung und Fusion im Lichte der Veränderungen in der Mitochondrienzahl und morphologischen Veränderungen.

Introduction

Mitochondrien sind hochdynamische Organellen, die in allen eukaryotischen Zellen vorkommen und sie mit Energie versorgen und ihren Stoffwechsel regulieren. Die Mitochondrien stehen also an der Schnittstelle zwischen Zelltod und Überleben. Es hat sich gezeigt, dass Mitochondrien für eine Vielzahl von Prozessen essentiell sind, die von lysosomaler Übersäuerung und molekularer Motorik bis hin zu Muskelkontraktion und Synapsenfeuerung reichen ^1,2.

Mitochondrien durchlaufen regelmäßige Spaltungs- und Fusionsereignisse, um ein mitochondriales Netzwerk auf....

Protocol

1. Zellbehandlung und Mikroskopie-Gewinnung

1. Kultivieren Sie GT1-7-Zellen in 8 Kammerschalen in DMEM, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Penstrep (vollständiges Medium). Lassen Sie die Zellen über Nacht anheften und behandeln Sie sie dann 72 Stunden lang mit 2,5 mM Metforminhydrochlorid in DMEM mit 10 % FBS, wobei darauf zu achten ist, dass das Medium alle 24 Stunden ausgetauscht wird. Die Zellen werden 6 h vor der Bildgebung mit 10 μM CCCP und 4 h vor der Bildgebung mit 400 μM Bafilomycin A1 (Baf) gleichzeitig behandelt.
   HINWEIS: Dies kann mit jeder eukaryotischen Zelllinie Ihrer Wahl erfolgen.
2. Bere....

Results

Geeignete Zellen auswählen
Benutzer sollten sich darüber im Klaren sein, dass sich das mitochondriale Netzwerk je nach mitotischem Zustand der Zelle ändert. Erscheint der Zellkern hantel- oder U-förmig oder befindet sich in der Nähe des Zellkerns ein Raum ohne Fluoreszenzsignal, kann dies darauf hindeuten, dass sich die Zelle der Mitose nähert. In diesem Zustand werden die Mitochondrien wahrscheinlich aufgrund der Zellteilung und nicht aufgrund der Behandlungsintervention und ihrer Wirkung auf das Net.......

Discussion

Obwohl es eine wachsende Anzahl von Ansätzen zur Beschreibung der mitochondrialen Morphologie gibt, stehen nur begrenzte Techniken zur Verfügung, um die mitochondriale Dynamik angemessen und quantitativ zu erfassen. Darüber hinaus ist zu beachten, dass die Morphologie des mitochondrialen Netzwerks sowie die Mechanismen, die diese Morphologie steuern, unterschiedlicher Natur sind. Dies führt zu Netzwerken, die mit den Bedürfnissen der Zelle verknüpft sind, von einer verzweigten Formation .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
8 Kammerschüsseln	ThermoFisher	#Z734853
Angepasster Schwellenwert			https://sites.google.com/site/qingzongtseng/adaptivethreshold
Bafilomycin A1	LKT Labore	#B0026
Carbonylcyanid-Chlorphenylhydrazon (CCCP)	Merck	#C2759
Konfokales Mikroskop	Carl Zeiss AG		LSM780 ELYRA PS.1 Super-Resolution-Plattform
Dulbeccos modifizierter Eagle Medium (DMEM)	ThermoFisher	#341956062
Fötales Rinderserum (FBS)	Sigma-Aldrich	#F0679
Github-Link			https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin
GraphPad Prism v7.06
GT1-7 Zellen	ATCC	SCC116
Hoecsht	Sigma-Aldrich	Nr. H6024
ImageJ v1.53t	Fidschi
Macros			https://github.com/rensutheart/FMPP/tree/master/Sections
Metformin	Europäisches Arzneibuch	M06050000
Penicillin/Streptomycin (PenStrep)	Sigma-Aldrich	#P4333
T25s	Bio-Smart Scientific	#70025
TMRE	ThermoFisher	#T669
Trypsin	Sigma-Aldrich	#T4049