Method Article

Verständnis der Veränderungen in der mitochondrialen Morphologie durch dynamische und dreidimensionale Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen

DOI:

10.3791/68478

⸱

August 15th, 2025

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, Stellenbosch University, 2Department of Biochemistry, University of Toronto, 3Department of Electrical and Electronic Engineering, Stellenbosch University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschreiben wir den mitochondrial event localizer (MEL), ein ImageJ-Plugin, das bei der Quantifizierung der 3-dimensionalen Veränderungen der mitochondrialen Spaltung und Fusionsaktivität im Laufe der Zeit nützlich ist. Wir beschreiben auch eine Bildverarbeitungspipeline, die für die Bereinigung von Schliffbildern vor der Analyse in ImageJ nützlich ist.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondrien sind hochdynamische Organellen, die für das Überleben eines jeden Tieres lebenswichtig sind und als Reaktion auf die Bedürfnisse oder Belastungen des Wirts regelmäßige Spaltungs- und Fusionsereignisse durchlaufen, was zu einem ständigen Umbau des mitochondrialen Netzwerks führt. Aus diesem Grund ist die Möglichkeit, das mitochondriale Netzwerk sowohl in drei Dimensionen als auch im Zeitverlauf zu bewerten, von Vorteil, um zu verstehen, wie das System auf Faktoren wie Stress oder pharmazeutische Eingriffe reagiert. Die Fluoreszenzbildgebung der mitochondrialen Netzwerke von Zellen ermöglicht es, diese Veränderungen sichtbar zu machen und zu überwachen. Das mitochondriale Netzwerk wird jedoch oft als zweidimensionale und statische Struktur beschrieben, die durch nicht standardisierte Metriken definiert wird. Aus diesem Grund haben wir uns daran gemacht, eine Pipeline zu beschreiben, die es dem Benutzer ermöglicht, seine Bilder für den mitochondrial event localizer (MEL) vorzubereiten, ein ImageJ-Plugin-Tool, das Spaltungs- und Fusionsereignisse im mitochondrialen Netzwerk im Laufe der Zeit und auf 3-dimensionale Weise erkennt und so einen Einblick in die dynamischen Veränderungen bietet, die dieses Netzwerk erfährt. Darüber hinaus beschreiben wir die Vorteile des Verständnisses von Spaltung und Fusion im Lichte der Veränderungen in der Mitochondrienzahl und morphologischen Veränderungen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondrien sind hochdynamische Organellen, die in allen eukaryotischen Zellen vorkommen und sie mit Energie versorgen und ihren Stoffwechsel regulieren. Die Mitochondrien stehen also an der Schnittstelle zwischen Zelltod und Überleben. Es hat sich gezeigt, dass Mitochondrien für eine Vielzahl von Prozessen essentiell sind, die von lysosomaler Übersäuerung und molekularer Motorik bis hin zu Muskelkontraktion und Synapsenfeuerung reichen 1,2.

Mitochondrien durchlaufen regelmäßige Spaltungs- und Fusionsereignisse, um ein mitochondriales Netzwerk aufrechtzuerhalten, das ATP als Reaktion auf den Stoffwechselbedarf und Stress der Zelle effizient produziert. In der Tat wurde gezeigt, dass Mitochondrien gespalten werden, um die Mitophagie, die selektive Entfernung von mitochondrialen Fragmenten, zu erleichtern. Daher verbleiben nur aktiv atmende und nicht depolarisierte Mitochondrien im zellulären System 3,4. Die Fusion erfolgt jedoch als Mittel zur Erhöhung der ATP-Leistung des Netzwerks, falls ein erhöhter Bedarf besteht 5,6. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass sowohl die Spaltung als auch die Fusion eine wichtige Rolle bei der Teilung und dem Schutz der mitochondrialen DNA spielen 7,8. Es sollte beachtet werden, dass das Ausmaß der Spaltung und Fusion eine sorgfältige homöostatische Kontrolle erfordert, um ein gesundes mitochondriales Netzwerk zu gewährleisten, da sich zu viel oder zu wenig von einem der beiden Prozesse als schädlich erwiesen hat.

Es wurde gezeigt, dass eine übermäßige Spaltung zu einem fragmentierten mitochondrialen Netzwerk mit anschließenden verringerten ATP-Spiegeln bei Alzheimer, Parkinson und Tauopathien führt 9,10,11, und niedrige Spaltungsraten können zu einer Anhäufung von depolarisierten Mitochondrien führen, was zu Parkinson-ähnlichen Symptomen führt12. Es ist bekannt, dass eine Hyperfusion des Netzwerks in Zeiten von Stress auftritt, um die ATP-Produktion zu erhöhen. Es hat sich jedoch gezeigt, dass das Vorhandensein in diesem Zustand über längere Zeiträume die ROS-Spiegel und die Autophagieaktivität erhöht, was zum Beginn des Zelltods führt 9,12.

Es wird daher deutlich, dass das Verständnis des Zustands des mitochondrialen Netzwerks wichtige Erkenntnisse zum Verständnis des Zustands der Zelle und damit des Organismus bietet. Die klare Bedeutung des Verständnisses des mitochondrialen Netzwerks im Kontext von Gesundheit und Krankheit, seiner Fähigkeit, Spaltungs- und Fusionsereignisse zu durchlaufen, und deren Auswirkungen auf die zelluläre Gesundheit hat die Entwicklung dieses Protokolls und der zugehörigen Analysewerkzeuge motiviert. Insbesondere sind Werkzeuge, die die Charakterisierung der mitochondrialen Dynamik ermöglichen, weitgehend begrenzt und in der Literatur schlecht beschrieben.

Die mitochondriale Morphologie wird in der Regel durch konfokale Mikroskopie bestimmt, gefolgt von einer computergestützten Analyse, bei der rohe Mikroskopaufnahmen einem gewissen Grad unterzogen werden müssen, um ihre Qualität für die Bewertung zu verbessern, da dies die mitochondriale Organisation am besten beschreibt. Auf diese Weise können Benutzer viele morphometrische Ergebnisse des mitochondrialen Netzwerks bestimmen, wie z. B. Anzahl, Volumen, Länge und Seitenverhältnis 13,14,15. Benutzer können entweder 2D- oder 3D-Mikroskopaufnahmen für morphologische Bewertungen verwenden, obwohl die 3D-Analyse eine höhere Genauigkeit und einen besseren Einblick bietet, da das mitochondriale Netzwerk aus 3D-Strukturen besteht. Für die Analyse von Spaltung und Fusion werden Mikroskopaufnahmen mit einer z-Achse empfohlen, da diese die 3-Dimensionalität des mitochondrialen Netzwerks16 am besten kompensieren.

Viele Studien befassen sich mit der Kategorisierung von Mitochondrien in fragmentierte, filamentöse oder intermediäre Zustände, um das Netzwerk zu beschreiben16,17. Die 3D-Analyse ist aufgrund der unterschiedlichen Formen, die die Mitochondrien in der Zelle annehmen, besonders vorteilhaft. Das Hinzufügen von 3-Dimensionalität zu der eigenen Studie verleiht Vertrauen, insbesondere bei der Anzahl der Mitochondrien, da sich Mitochondrien wahrscheinlich entlang einer z-Achse entweder nach oben oder unten bewegen. MEL ist ein ImageJ-Plugin, das auf 3D-erfasste Bilder18 angewiesen ist. Hier verwendeten wir GT1-7-Maus-Hippocampus-Neuronalzellen, die mit TMRE und Hoechst gefärbt wurden, um das mitochondriale Netzwerk sowie den Zellkern sichtbar zu machen. Die Zellen wurden dann durch eine Vorverarbeitungspipeline platziert, um die Qualität der Mikroskopbilder für die Bildanalyse zu verbessern.

Es wurden viele Techniken zur Verfügung gestellt, die es ermöglichen, die mitochondriale Morphologie auf der Grundlage statischer Metriken zu bestimmen. Nur wenige beinhalten Spaltungs- und Fusionsaktivitäten und ermöglichen die quantitative Erfassung des dynamischen Verhaltens von Mitochondrien 13,19,20,21. Hier werden wir ein Protokoll zur Bildverbesserung vor der Bestimmung von Netzwerkeigenschaften beschreiben, wobei der Schwerpunkt auf der mitochondrialen Spaltung und Fusionsaktivität liegt. Wir werden zeigen, wie diese Technik bereits veröffentlichte Methoden zur Bestimmung der mitochondrialen Morphologie ergänzen kann.

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Protocol

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1. Zellbehandlung und Mikroskopie-Gewinnung

  1. Kultivieren Sie GT1-7-Zellen in 8 Kammerschalen in DMEM, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Penstrep (vollständiges Medium). Lassen Sie die Zellen über Nacht anheften und behandeln Sie sie dann 72 Stunden lang mit 2,5 mM Metforminhydrochlorid in DMEM mit 10 % FBS, wobei darauf zu achten ist, dass das Medium alle 24 Stunden ausgetauscht wird. Die Zellen werden 6 h vor der Bildgebung mit 10 μM CCCP und 4 h vor der Bildgebung mit 400 μM Bafilomycin A1 (Baf) gleichzeitig behandelt.
    HINWEIS: Dies kann mit jeder eukaryotischen Zelllinie Ihrer Wahl erfolgen.
  2. Bereiten Sie vor der Bildgebung einen Cocktail aus vorgewärmten vollständigen Medien vor, der 5 nM Hoechst und 100 nM TMRE enthält.
  3. Ersetzen Sie das Zellbehandlungsmedium durch den Bildgebungscocktail und warten Sie 10 Minuten Inkubationszeit vor der Bildgebung.
    HINWEIS: Aufgrund der dynamischen Aktivität der Mitochondrien sollten die Zellen unter Verwendung eines Mikroskops mit einer Inkubationskammer von 37 °C und 5 % CO 2 abgebildet werden.

2. Bildgebung

  1. Bilden Sie Zellen mit 100-facher Vergrößerung mit 1,4 NA ab.
  2. Passen Sie die Laserleistung so an, dass die Leistung niedrig genug ist, um Photobleaching zu vermeiden, ~2%. Stellen Sie sicher, dass die Scangeschwindigkeit hoch ist. Nehmen Sie Bilder mit einer Auflösung von 512 x 512 auf.
  3. Stellen Sie die Z-Schicht-Intervalle in Schritten von 0,25 μm ein. Um diesem Protokoll zu folgen, stellen Sie die Zellen so dar, dass sie aus 10 Z-Stapeln bestehen. Erfassen Sie fünf Zeitrahmen ohne Intervall zwischen der Erfassung eines Z-Stapels.
    HINWEIS: Nach der Optimierung sollte dieses Protokoll nicht zwischen Behandlungsgruppen oder Versuchsgruppen angepasst werden, da die hier aufgeführten Makros erfordern, dass das Bildgebungsprotokoll für alle Zellen standardisiert ist.

3. Computergestützte Bewertung

HINWEIS: Die gesamte nachfolgende Verarbeitung wurde mit ImageJ v1.53t durchgeführt. Das MEL-Plugin sowie unterstützende Module finden Sie unter https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin, während alle verwendeten Makros unter https://github.com/rensutheart/FMPP/tree/master/Sections zu finden sind.

  1. Bildvorbereitung
    1. Öffnen Sie die Rohdatei in ImageJ.
    2. Um mehrere Zellen aus einem einzigen Mikrofoto zu beschneiden, beginnen Sie damit, das Bild bis zur Anzahl der einzelnen Zellen zu duplizieren, die analysiert werden sollen.
    3. Verwenden Sie das Werkzeug Fenster synchronisieren , das Freihandzeichenwerkzeug und die Farbanpassung, um einen Interessenbereich um eine interessante Zelle zu zeichnen, in der sich mehrere Zellen in einem Sichtfeld befinden (Ergänzende Abbildung S1).
    4. Klicken Sie auf Bearbeiten | Außen klar.
    5. Trennen Sie den roten und den blauen Kanal voneinander und speichern Sie den mitochondrialen Kanal als . Tiff-Datei.
  2. Generierung und Dekonvolution von Punktspreizungsfunktionen
    1. Um eine Point-Spread-Funktion (PSF) zu generieren, verwenden Sie das PSF-Generator-Plug-In mit eingebetteten Mikrographeninformationen. Gehe zu Plugins | PSF Generator , um das Plugin zu öffnen. Gehen Sie außerdem zu Bild | Info anzeigen... oder drücken Sie I, um die Bildinformationen zu öffnen, und scrollen Sie nach unten. Ändern Sie mithilfe der Voxelgröße und -tiefe im Feld "Informationen anzeigen" die Pixelgröße XY auf 166,1 nm und den Z-Schritt auf 200 nm. Ändern Sie die Wellenlänge in 568 nm, die Größe XYZ für eine Bildauflösung von 512 x 512 und einen Z-Stapel von 10 Z-Scheiben (Ergänzende Abbildung S2).
    2. Gehe zu Plugins | Makros | Bearbeiten | Deconvolution_time_lapse_mine.ijm-Makros.
    3. Bearbeiten Sie die Ein- und Ausgangszeilen und drücken Sie Run (Ergänzende Abbildung S3).
  3. Verbesserung des Bildkontrasts und Unschärfe
    1. Gehe zu Plugins | Makros | Bearbeiten | Vorverarbeitung.ijm.
    2. Verwenden Sie in den Preprocessing.ijm-Makros eine Hintergrundsubtraktion mit einem rollenden Kugelradius von 6. Stellen Sie Sigma Filter Plus so ein, dass der Radius gleich 1 ist, die verwendeten Pixel gleich 2 sind und der minimale Pixelanteil gleich 0,2 ist, wobei das Plugin Ausreißer erkennt. Passen Sie die CLAHE-Einstellungen so an, dass die Blockgröße 64 beträgt. Legen Sie die Bins des Histogramms auf 256, die maximale Steigung auf 2,5 und das Gamma auf 0,8 fest.
      HINWEIS: Alle diese Einstellungen wurden für unsere Datensätze optimiert, und die Werte sollten für alternative Datensätze optimiert werden, bevor sie angewendet werden. Die Sigma-Filterung wird angewendet, um das Bild zu glätten und benachbarte Pixel effektiv zu mischen, um konsistente Strukturen zu gewährleisten. Lokaler Kontrast wird angewendet, um den Kontrast zwischen hellen und dunklen Pixeln zu erhöhen, und in Verbindung mit einer Änderung des Gammas wird das Vorhandensein der mitochondrialen Strukturen verbessert, während Hintergrundpixel minimiert werden.
    3. Ändern Sie die Eingabezeile in den Ordner mit den Mikrographen, die einer Dekonvolution unterzogen wurden (Ergänzende Abbildung S4).
    4. Klicken Sie auf Ausführen.
  4. Schwellenwerte für Bilder
    HINWEIS: Obwohl Benutzer jedes beliebige Schwellenwert-Tool verwenden können, empfehlen wir das adaptive Schwellenwert-Plugin von Qingzong Tseng (https://sites.google.com/site/qingzongtseng/adaptivethreshold).
    1. Öffnen Sie eine gewünschte Datei, die von den Preprocessed.ijm-Makros in ImageJ geändert wurde.
    2. Gehen Sie zu Plugins | adaptiveThr.
    3. Legen Sie den lokalen Schwellenwert auf Gewichteten Mittelwert und Pixelblockgröße entsprechend den Einstellungen des Benutzers fest.
      HINWEIS: Die Pixelblockgröße sollte zwischen den Zellen konsistent gehalten werden, da dieser Wert mitochondriale Dimensionsbewertungen wie Volumen oder Seitenverhältnis beeinflusst.
    4. Um die Zeit zu optimieren, klicken Sie auf Vorschau und passen Sie die Blockgröße so an, dass so viele Mitochondrien wie möglich eindeutig enthalten sind. Passen Sie auch den Subtraktionswert für jede Zelle an, um unnötigen Hintergrund zu entfernen. Speichern Sie Mikrobilddateien in Ordnern, die mit dem Subtraktionswert verknüpft sind (Ergänzende Abbildung S5).
      HINWEIS: Die Threshold.ijm-Makros enthalten einen Größenfilter, um kleinere Partikel zu eliminieren.
    5. Plugins auswählen | Makros | Bearbeiten | Schwellenwert.ijm.
    6. Bearbeiten Sie die input_path und output_path Zeilen sowie die BlockGröße und subtrahieren Sie die Zeilen im Makroskript (Ergänzende Abbildung S6).
    7. Klicken Sie auf Ausführen.
  5. Detektion von Spaltungs- und Fusionsereignissen durch das MEL-Plugin (Mitochondrial Event Localizer)
    HINWEIS: MEL ist so konzipiert, dass es eine Zeitraffersequenz von Z-Stacks verarbeitet, die aus einem einzelnen Kanal bestehen und jeweils als einzelnes Tiff gespeichert werden. Obwohl dies durch Ändern der Eingabezeile in die gewünschte Tiff-Datei mit Schwellenwert erreicht werden kann, werden wir auch eine Methode zur gleichzeitigen Verarbeitung mehrerer Tiff-Dateien mit der Verkettungsfunktion in ImageJ demonstrieren.
    1. Öffnen Sie bis zu 10 Mikroskopaufnahmen mit Schwellenwerten, die zu denselben Behandlungsbedingungen gehören.
      HINWEIS: Die Mikrographen müssen die gleiche Anzahl von Z-Scheiben haben, damit dies funktioniert.
    2. Gehe zu Bild | Stapel |Werkzeuge | Verketten und drücken Sie OK.
    3. Um die verbleibenden kleinen Punkte zu entfernen, die durch das Thresholding zurückbleiben, gehen Sie zu Plugins | Integrierte Bildfilter | Entfernen Sie Ausreißer. Verwenden Sie die Vorschau , um die X- und Y-Größen festzulegen und die erforderlichen Fragmente zu entfernen.
    4. Speichern Sie die verkettete Datei als TIFF-Datei.
    5. Gehe zu Plugins | Makros | Bearbeiten | Quicktest_new.ijm und bearbeiten Sie die Ein- und Ausgabepfade nach Bedarf (Ergänzende Abbildung S7).
      HINWEIS: Nach Abschluss des Vorgangs befindet sich im Ausgabeordner ein Ordner mit dem Namen "MEL_results" mit allen MEL-Ergebnissen. Diese werden als Spaltungs- und Fusionsereignisse angezeigt, die zu jedem Zeitpunkt detektiert wurden, und der letzte Zeitpunkt sollte aufgrund der Art und Weise, in der MEL funktioniert, immer entfernt werden18.

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Results

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Geeignete Zellen auswählen
Benutzer sollten sich darüber im Klaren sein, dass sich das mitochondriale Netzwerk je nach mitotischem Zustand der Zelle ändert. Erscheint der Zellkern hantel- oder U-förmig oder befindet sich in der Nähe des Zellkerns ein Raum ohne Fluoreszenzsignal, kann dies darauf hindeuten, dass sich die Zelle der Mitose nähert. In diesem Zustand werden die Mitochondrien wahrscheinlich aufgrund der Zellteilung und nicht aufgrund der Behandlungsintervention und ihrer Wirkung auf das Net...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obwohl es eine wachsende Anzahl von Ansätzen zur Beschreibung der mitochondrialen Morphologie gibt, stehen nur begrenzte Techniken zur Verfügung, um die mitochondriale Dynamik angemessen und quantitativ zu erfassen. Darüber hinaus ist zu beachten, dass die Morphologie des mitochondrialen Netzwerks sowie die Mechanismen, die diese Morphologie steuern, unterschiedlicher Natur sind. Dies führt zu Netzwerken, die mit den Bedürfnissen der Zelle verknüpft sind, von einer verzweigten Formation ...

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Disclosures

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Forschung wurde von der Stellenbosch University, Südafrika, dem South African Medical Research Council (SAMRC) und der National Research Foundation (NRF) von Südafrika sowie den Canadian Institutes of Health Research (CIHR) und dem Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) finanziert.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
8 KammerschüsselnThermoFisher#Z734853
Angepasster Schwellenwerthttps://sites.google.com/site/qingzongtseng/adaptivethreshold
Bafilomycin A1LKT Labore#B0026
Carbonylcyanid-Chlorphenylhydrazon (CCCP)Merck#C2759
Konfokales MikroskopCarl Zeiss AGLSM780 ELYRA PS.1 Super-Resolution-Plattform
Dulbeccos modifizierter Eagle Medium (DMEM)ThermoFisher#341956062
Fötales Rinderserum (FBS)Sigma-Aldrich#F0679
Github-Linkhttps://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin
GraphPad Prism v7.06
GT1-7 ZellenATCCSCC116
HoecshtSigma-AldrichNr. H6024
ImageJ v1.53tFidschi
Macroshttps://github.com/rensutheart/FMPP/tree/master/Sections
MetforminEuropäisches ArzneibuchM06050000
Penicillin/Streptomycin (PenStrep)Sigma-Aldrich#P4333
T25sBio-Smart Scientific#70025
TMREThermoFisher#T669
TrypsinSigma-Aldrich#T4049

References

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