Methodenartikel

Ein multimodales Bildgebungs-Framework zur Verbesserung der Phänotypisierung von lebenden markierungsfreien Brustkrebszellen

DOI:

10.3791/68498

⸱

22. August 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 2Laser Biomedical Research Center, G. R. Harrison Spectroscopy Laboratory, Massachusetts Institute of Technology, 3Department of Mechanical Engineering, Politecnico di Milano, 4Klarman Cell Observatory, Broad Institute of MIT and Harvard, 5Department of Molecular Biochemistry and Pharmacology, Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri IRCCS, 6Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll stellt einen multimodalen Ansatz dar, der Raman-Spektroskopie und tomographische Phasenmikroskopie für eine markierungsfreie, nicht-invasive Phänotypisierung lebender menschlicher Brustkrebszellen kombiniert. Es umfasst eine benutzerfreundliche, human-bias-freie Analysepipeline für eine schnelle, quantitative morphochemische Analyse, die detaillierte molekulare und strukturelle Einblicke mit Anwendungen in der Krebsforschung und Zellbiologie liefert.

Zusammenfassung

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Wir präsentieren die multimodale konfokale Raman-Mikrospektroskopie (RS) und die tomographische Phasenmikroskopie (TPM) für die schnelle morphochemische Phänotypisierung menschlicher Brustkrebszellen (MDA-MB-231). Unter Ausnutzung der nicht-perturbativen Natur dieser fortschrittlichen Mikroskopietechniken haben wir detaillierte morphomolekulare Daten von lebenden, markierungsfreien Zellen in ihrer natürlichen physiologischen Umgebung erfasst. Es wurden humane verzerrungsfreie Datenverarbeitungspipelines entwickelt, um hyperspektrale Raman-Bilder (die Raman-Moden von 600 cm-1 bis 1800 cm-1 abdecken und eine breite Palette von molekularen Bindungen und subzellulären Strukturen einzigartig charakterisieren) sowie morphologische Daten aus dreidimensionalen Brechungsindex-Tomogrammen (die Messungen des Zellvolumens, der Oberfläche, des Fußabdrucks und der Sphärizität mit Nanometerauflösung ermöglichen) zu analysieren, neben Trockenmasse und Dichte). Durch die systematische Aufschlüsselung der reichhaltigen Einzelzelldetails, die RS und TPM liefern, zeigen wir auf quantitative Weise den Vorteil einer solchen multimodalen Mikroskopiemethode für die Phänotypisierung von tumoralen Brustkrebszellen. Unsere Tools bieten auch weitere Einblicke in die subzellulären Informationen, ohne dass Markierungen verwendet werden. Schließlich untersuchen und diskutieren wir alle einzigartigen oder korrelierten Informationen, die RS- und TPM-abgeleitete Datensätze enthalten. Wir glauben, dass unsere Tools und quantitativen Datenanalyse-Pipelines die Phänotypisierungsaufgaben in der biomedizinischen Forschung revolutionieren können, wenn eine schnelle und störungsfreie Methode an lebenden Zellen in Kultur benötigt wird, mit dem Potenzial für eine zukünftige Umsetzung in klinische und diagnostische Anwendungen.

Einleitung

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Die Charakterisierung und Phänotypisierung von Zellen sind zentrale Aspekte der biomedizinischen Forschung1. Die Fähigkeit, Zellen sowohl auf morphologischer als auch auf molekularer Ebene zu charakterisieren, ist für das Verständnis der Zellfunktion, Differenzierung und Pathologie von größter Bedeutung 1,2,3. Es ist besonders interessant im Bereich der Onkologie, wo ein genaues Zellprofiling für die Tumordiagnose, die Bestimmung des Krankheitsstadiums und letztendlich die Identifizierung therapeutischer Ziele erforderlich ist2. Traditionelle Zellcharakterisierungsmethoden können keine zeitliche Dynamik liefern und basieren in der Regel auf invasiven Techniken wie Färbung oder Markierung, die den nativen Zustand der Zellen beeinträchtigen und potenzielle Verzerrungen in den Daten einführen können4. Daher werden nicht-invasive Strategien zur genauen und gründlichen Phänotypisierung lebender Zellen in ihrem nativen, ungestörten Zustand zunehmend nachgefragt.

In diesem Zusammenhang haben markierungsfreie multimodale Bildgebungsverfahren die zellbiologische Forschung revolutioniert, indem sie komplementäre Modalitäten kombinieren, um sowohl morphologische als auch molekulare Informationen zu erfassen 2,5. Diese Ansätze ermöglichen eine integrierte und nicht-invasive Charakterisierung der Zellen, die mit herkömmlichen Techniken nicht immer möglich ist 2,5,6. Obwohl beispielsweise Mikroskopietechniken wie die Fluoreszenzmikroskopie in der morphologischen und funktionellen Zellbildgebung weit verbreitet sind, weisen sie inhärente Einschränkungen auf. Fluoreszenzmethoden leiden oft unter Photobleichung, Phototoxizität und geringen Mengen an zielbaren Molekülen, die das analytische Potenzial einschränken4. Darüber hinaus erfordern diese Ansätze häufig die Verwendung von exogenen Markierungen oder Farbstoffen, die den nativen Zellzustand stören oder zu Artefakten führen können7.

Multimodale Bildgebungsplattformen, die die Stärken mehrerer Bildgebungsmodalitäten kombinieren, überwinden diese Einschränkungen, indem sie die Erfassung verschiedener Arten von Daten von lebenden Zellen ermöglichen, ohne dass eine Markierung erforderlich ist. Die Integration der Raman-Spektroskopie (RS) mit anderen bildgebenden Verfahren wie der Phasenkontrastmikroskopie oder der tomographischen Phasenmikroskopie (TPM) war eine vielversprechende Strategie, um die Einschränkungen einzelner Techniken zu überwinden. In der Tat ermöglicht die multimodale Bildgebung ein tieferes Verständnis zellulärer Phänotypen, insbesondere bei komplexen biologischen Erkrankungen und Pathologien wie Krebs, bei denen molekulare und strukturelle Eigenschaften für eine genaue Charakterisierung entscheidend sind 2,5.

Markierungsfreies RS eignet sich gut für die chemische Bildgebung von Zellen8. Durch die Detektion molekularer Schwingungsmoden liefert RS biochemische Fingerabdrücke, die detaillierte Informationen über die molekulare Zusammensetzung von Zellen preisgebenkönnen 9,10,11. Raman-Spektren, die aus biologischen Proben gewonnen wurden, enthalten Informationen über eine Vielzahl von Biomolekülen wie Lipide, Proteine, Nukleinsäuren und Metaboliten, die eine wesentliche Rolle beim Verständnis der molekularen Natur von Zellen spielen 9,12. Eine der Hauptstärken von RS ist, dass es nicht-invasiv ist und die Charakterisierung lebender Zellen in ihrem natürlichen Zustand ermöglicht, ohne ihren physiologischen Zustand zu verändern.

Trotz seiner vielen Vorteile bringt RS auch einige Einschränkungen mit sich. Obwohl RS detaillierte molekulare Informationen liefert, erlaubt es keine quantitativen Informationen über die Morphologie oder Struktur von Zellen2. Hier spielen komplementäre bildgebende Verfahren wie TPM eine entscheidende Rolle.

TPM ist eine Form der quantitativen Phasenbildgebung (QPI)13,14 und ermöglicht die Visualisierung hochauflösender, markierungsfreier quantitativer Informationen über die Zellmorphologie15,16. TPM unterscheidet sich von herkömmlichen Mikroskopietechniken dadurch, dass es keine Kontrastmittel benötigt. Stattdessen misst sie Phasenverschiebungen, die sich aus Schwankungen des Brechungsindex (RI) der Probeergeben 17. Phasenverschiebungen geben Aufschluss über die strukturellen Eigenschaften der Zelle, einschließlich ihres Volumens, ihrer Oberfläche, ihrer Form und ihrer inneren Struktur 2,18. TPM kann eine hohe räumliche Auflösung bis in den Nanometerbereich erreichen und ist daher eine ideale Technik für die Aufzeichnung hochauflösender morphologischer Details lebender Zellen. Darüber hinaus ermöglicht die Möglichkeit, 3D-RI-Tomogramme zu rekonstruieren, die Visualisierung subzellulärer Strukturen in ihrer vivo-Umgebung18, was im Vergleich zu 2D-Projektionen genauere Informationen liefert. Eine der Haupteinschränkungen von TPM ist jedoch seine mangelnde chemische Spezifität, da es in erster Linie Informationen über die Morphologie und Phasenverteilung der Zelle liefert, ohne zwischen verschiedenen chemischen Komponenten unterscheiden oder biochemische Merkmale identifizieren zu können.

Die Kombination von RS und TPM in einer multimodalen Technik bietet Vorteile bei der Zellphänotypisierung. Während RS reichhaltige molekulare Informationen ermöglicht, fügt TPM einen strukturellen Aspekt hinzu, der eine detaillierte Analyse der zellulären Morphologie ermöglicht. In jüngster Zeit wurde die Kombination von RS mit TPM in mehreren Studien zur Krebsforschung erfolgreich nachgewiesen 2,19,20. So wurde in früheren Arbeiten berichtet, dass die Co-Registrierung der Raman-Spektroskopie mit holographischen Phasenmikroskopiedaten komplementäre molekulare und morphologische Informationen liefern kann, die die Unterscheidung zwischen verschiedenen Zelltypen und Tumorentwicklungsstadien ermöglichen2. Diese Untersuchungen haben gezeigt, wie leistungsfähig die multimodale Bildgebung ist, um die Genauigkeit der Zellphänotypisierung zu verbessern, insbesondere im Zusammenhang mit Krebs, wo die molekularen und strukturellen Eigenschaften von Zellen eng mit ihrer Malignität und ihrem Verhalten verbunden sind 2,20.

Trotz der jüngsten Fortschritte im Bereich der multimodalen Bildgebung gibt es noch Herausforderungen, die angegangen werden müssen, insbesondere bei der Datenverarbeitung und -analyse21. Die großen Datenmengen, die multimodale bildgebende Verfahren liefern, können umständlich zu analysieren sein, und es müssen einfache Verfahren angewendet werden, um aussagekräftige Informationen zu extrahieren. Um dieser Herausforderung zu begegnen, müssen benutzerfreundliche Datenverarbeitungspipelines eingerichtet werden, um die Komplexität der Daten zu bewältigen und menschliche Verzerrungen bei der Analyse zu minimieren. Solche Pipelines sind entscheidend für das Erreichen der Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse und die mögliche Umsetzung dieser Ansätze in klinische und diagnostische Anwendungen.

Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, das Potenzial der Fusion von RS mit TPM für die markierungsfreie, schnelle und nicht-perturbative Phänotypisierung lebender einzelner Krebszellen zu veranschaulichen. Durch die Zusammenführung dieser beiden robusten Bildgebungsansätze ermöglichen wir eine umfassende und quantitative Charakterisierung der molekularen und morphologischen Eigenschaften menschlicher Brustkrebszellen (MDA-MB-231). Die Arbeit betont auch, wie wichtig es ist, Datenverarbeitungspipelines ohne menschliche Vorurteile einzurichten, um sicherzustellen, dass die aus den multimodalen Datensätzen extrahierten Informationen korrekt und zuverlässig sind. Hier versuchen wir, eine robuste Plattform für die Phänotypisierung von Krebszellen zu etablieren, die auf andere Zelltypen verallgemeinert werden kann. Die Vielseitigkeit und Empfindlichkeit dieses Ansatzes machen ihn zu einem potenziellen Kandidaten für eine Vielzahl von biomedizinischen Anwendungen, von grundlegenden zellbiologischen Studien bis hin zur Diagnostik.

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Protokoll

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1. Vorbereitung der Probe

  1. MDA-MB-231-Zellen auf Quarz-Petrischalen säen.
    1. Platte MDA-MB-231 humane Brustkrebszellen auf 3,5 cm große Petrischalen mit Quarzglasboden.
    2. Die Zellen werden bei 37 °C in einer Umgebung mit 5 % CO2 inkubiert, bis sie vollständig mit der Oberfläche verbunden sind (mindestens 12 Stunden nach der Aussaat).
  2. Waschen Sie die Zellen und bereiten Sie die Messung vor.
    1. Entfernen Sie das Nährmedium von den Zellen, sobald sie an der Petrischale haften.
    2. Waschen Sie die Zellen vorsichtig mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), um das restliche Medium zu entfernen.
    3. Fügen Sie frisches Zellkulturmedium hinzu und halten Sie die Zellen während des gesamten Messvorgangs mit dem Medium bedeckt, um ihre Lebensfähigkeit zu gewährleisten.
      HINWEIS: Als Nährmedium wurde in dieser Studie phenolrotfreies DMEM/F-12 verwendet, das mit 5 % fötalem Kälberserum (FBS) und Penicillin (100 IE/ml)-Streptomycin (100 μg/ml) ergänzt wurde.

2. Raman-Mikroskopsystem mit hohem Durchsatz

ANMERKUNG: Technische Einzelheiten des selbstgebauten Raman-Mikroskops, das für die aktuelle Arbeit zur Bildgebung lebender Zellen von MDA-MB-231 verwendet wurde, wurden bereits beschrieben22. Kurz gesagt, das verwendete, speziell angefertigte Raman-Mikroskopsystem mit hohem Durchsatz verfügt über einen 785-nm-Ti-Saphir-Laser, der von einem 532-nm-Laser gepumpt wird (Abbildung 1A). Der 785-nm-Raman-Anregungslaser ist an einen inversen IX83-Fluoreszenzmikroskopkörper gekoppelt, wobei die Anregung durch ein Wasserimmersionsobjektiv von UPLSAPO60× 1,2 NA unter Verwendung eines dichroitischen 749-nm-Spiegels auf die Probe gerichtet wird. Ein Polarisator stimmt die durchschnittliche Laserleistung an der hinteren Öffnung des Mikroskops ab. Die Hellfeld-Bildgebung wird durch die Kopplung von weißem Licht auf ähnliche Weise ermöglicht. Das System wechselt zwischen Raman- und Hellfeld-Modus, indem es die dichroitischen Filter automatisch wechselt. Das System kombiniert Galvospiegel-basiertes und Tischscannen für eine Bildgebung mit hohem Durchsatz. Ein benutzerdefiniertes MATLAB-Skript interagiert mit Open-Source-Mikroskopsteuerungssoftware, einer Datenerfassungskarte (DAQ) und Signalerkennungssystemen, um den Datenerfassungsprozess zu automatisieren. Das rückgestreute Raman-Licht wird vom selben Objektiv gesammelt, während das sichtbare Licht von einem dichroitischen 785-nm-Spiegel herausgefiltert und auf einen NIR-Spektrografen und einen CCD-Detektor (Charge-Coupled Device) geleitet wird. Dieser Aufbau ermöglicht eine mehrdimensionale Bildgebung und erfasst Hellfeld-, Fluoreszenz- und Raman-Signale über verschiedene Positionen und Z-Stacks 2,22.

  1. Raman-Bildgebungsverfahren
    1. Vorbereitung der Probe und Konservierung der physiologischen Bedingungen
      1. Installieren Sie die Probe in den Inkubator auf der Bühne, um die physiologischen Bedingungen aufrechtzuerhalten. Stellen Sie sicher, dass der Inkubator auf 37 °C eingestellt ist, mit Echtzeit-Feedback-Regelung für die Temperaturregelung.
      2. Halten Sie die Luftfeuchtigkeit in der Kammer auf >95 % mit der internen peripheren Badeinheit, die mit destilliertem Wasser gefüllt ist. Richten Sie den CO2 -Gasregler so ein, dass er 5 % CO2 mit 95 % Luft mischt und der Inkubatorkammer zuführt.
    2. Automatisiertes Wasserimmersionsmanagement
      1. Schalten Sie den selbstgebauten automatischen Wasserimmersionsdosierer ein, um die Objektivlinse mit einer Durchflussrate von 2 μl/min mit Spritzenpumpen und Spritzennadeln, die auf die Objektivspitze geklebt sind, mit Wasser zu versorgen.
      2. Überprüfen Sie regelmäßig den Wasserstand, um Verdunstung zu vermeiden und konsistente Bildbedingungen während der gesamten Messung zu gewährleisten.
    3. Datenerfassung der Raman-Spektroskopie
      1. Schalten Sie den Pumplaser ein und stellen Sie seine Leistung so ein, dass eine Laserleistung in der Probenebene von 75 mW erreicht wird.
      2. Öffnen Sie die Open-Source-Software zur Steuerung des Mikroskops Micro-manager. Wählen Sie in den Konfigurationseinstellungen BF und klicken Sie auf Live auf der linken Seite des Softwarefensters, um das Hellfeldbild zu visualisieren. Wählen Sie die gewünschte einzelne Zelle aus, von der das Raman-Spektrum erfasst werden soll. Klicken Sie dann auf Stopp , um die Hellfeld-Visualisierung zu beenden.
      3. Stellen Sie die Z-Koordinate der Raman-Bildgebungsebene ein, indem Sie die Signalanzahl auf der CCD-Kamera maximieren.
      4. Öffnen Sie dazu die CCD-Kamerasteuerungssoftware (LightField); in der Experiment-Einstellung die Belichtungszeit auf 1,5 s ein. Klicken Sie dann auf der Werkzeugleiste Experiment auf Ausführen, und aktivieren Sie den Laserstrahl.
      5. Passen Sie dann die Z-Position an, um die Signalanzahl im Fingerabdruckbereich von 600 cm-1 bis 1800 cm-1 zu maximieren und die Visualisierung der Raman-Peaks zu optimieren, die mit biologischen Signaturen verbunden sind. Schalten Sie dann den Laser aus, klicken Sie in der Experimentierleiste der CCD-Kamerasoftware auf Stopp und beenden Sie die Software.
        HINWEIS: Es wurde beobachtet, dass die maximierten Raman-Signalzahlen auf der CCD-Kamera mit der Position entlang der Z-Achse übereinstimmen, die mit +8 μm in Bezug auf die Bildgebungsebene übereinstimmt und keine Spur von zellbezogenen Raman-Peaks zeigt, da ein Brennfleck ziemlich in den Quarz fällt. Dieser Wert kann je nach Zellentyp und -status variieren.
    4. Starten Sie den Datenerfassungsprozess mit dem MATLAB-Skript, das Raman-Kanäle in mehrdimensionalen Messungen automatisch verarbeitet und die hyperspektralen Raman-Daten speichert.
    5. Stellen Sie das Sichtfeld auf 50 × 50 μm2, 40 × 40 Pixel ein, wobei jeder Pixelbereich 1,25 × 1,25μm 2 entspricht. Stellen Sie die Belichtungszeit für jedes Raman-Spektrum auf 1,5 s ein.
      HINWEIS: Führen Sie regelmäßig eine Wellenzahlkalibrierung mit Acetamidophenolproben durch, um bekannte Raman-Peaks zu annotieren. Kalibrieren Sie die Raman-Verschiebungsachse durch quadratische Interpolation.
      ACHTUNG: Gehen Sie vorsichtig mit Lasern um. Verwenden Sie während der Einrichtung und des Betriebs immer eine geeignete Schutzbrille, die für die Laserwellenlänge ausgelegt ist.

3. RS-Datenanalyse

  1. Nachbearbeitung von Raman-Hyperspektralkarten über das webbasierte Tool RamApp (https://ramapp.io/):
    1. Melden Sie sich bei dem webbasierten Tool an.
    2. Importieren Sie die hyperspektralen Daten. Klicken Sie auf der Registerkarte Meine Analysen auf Neu und laden Sie die .mat-Datei hoch, die die räumliche und spektrale Datenvariable und die x-Achsen-Variable (d. h. Raman-Verschiebungswerte) enthält.
    3. Um das Spektrum auf die angegebenen Bereiche in der Raman-Verschiebung zu kürzen, klicken Sie im Dropdown-Menü "Zuschneiden und drehen " auf "Spektrales Zuschneiden " und definieren Sie den unteren Rand und den oberen Rand des Raman-Verschiebungsbereichs auf 600 cm-1 bzw. 1800 cm-1.
      HINWEIS: Durch diese Spektralkürzung wird der breite Peak mit hoher Amplitude, der sich auf das Quarzmaterial der Petrischale bezieht, von der Analyse ausgeschlossen.
    4. Um die Raman-Spektren für kosmische Strahlung zu korrigieren, klicken Sie in den Entrauschungsoptionen auf Despike, wählen Sie Z-Score als Methode und setzen Sie den Schwellenwert auf 8.
      HINWEIS: Die Despike-Vorverarbeitungsfunktion hilft dabei, das Problem von Pixeln zu lösen, die Spitzen in ihrem Signal enthalten, die durch kosmische Strahlung verursacht werden.
    5. Aktivieren Sie die Option Erste Differenz verwenden , um Ausreißer anhand der ersten diskreten Intensitätsdifferenz entlang des Spektrums zu finden, und aktivieren Sie die Option Spitzen korrigieren. Das Spektrum jedes fehlerhaften Pixels wird durch das Medianspektrum seiner benachbarten Pixel ersetzt.
    6. Klicken Sie auf Ausführen , um die Spitzen zu korrigieren.
    7. Um das Rauschen aus den Maps zu entfernen, die jeder Wellenzahl entsprechen, klicken Sie in den Optionen für die Rauschunterdrückung auf Smooth Map, wählen Sie den Median-Filter und legen Sie die Größe der Seite des Quadrats, die beim Anwenden des Filters auf jedes Pixel der Map berücksichtigt wird, auf 3 Pixel fest. Klicken Sie dann auf Ausführen.
    8. Um einen Filter anzuwenden, um das Spektrum jedes Pixels zu glätten, klicken Sie auf Spektrum glätten in der Rauschunterdrückungsauswahl . Wählen Sie den Savitzky-Golay-Filter als Methode aus und legen Sie die Länge des Filterfensters auf 7 und die Polynomordnung des Filters auf 2 fest. Klicken Sie dann auf Ausführen.
      HINWEIS: Für einen Savitzky-Golay-Filter müssen die Länge des Filterfensters (eine positive ungerade ganze Zahl) und die Reihenfolge des Polynoms angegeben werden.
    9. Um das durchschnittliche Hintergrundsignal aus dem Vordergrund zu entfernen, öffnen Sie das Bedienfeld "Optisches Substrat entfernen " und klicken Sie auf "Substrat identifizieren". Legen Sie k-means als Methode und die Anzahl der Cluster auf 2 fest.
      HINWEIS: Diese Funktion segmentiert die Zellen (den "Vordergrund") und ihr Substrat unter Verwendung eines Clustering-Ansatzes. Sie können dann das durchschnittliche Hintergrundsignal aus dem Vordergrund entfernen oder einige Schritte so einschränken, dass sie nur mit Vordergrundpixeln arbeiten. Die Anzahl der auszuwählenden Cluster kann je nach Probe variieren.
    10. Aktivieren Sie in den erweiterten Optionen die Option Morphologische Bereinigung , um einige kleine Kleckse aus dem Vordergrund zu entfernen (z. B. unechte Zellteile usw.). Klicken Sie dann auf Ausführen.
    11. Um das durchschnittliche Hintergrundsignal zu subtrahieren, klicken Sie im Bedienfeld "Entfernen des optischen Substrats " auf "Substrat entfernen", wählen Sie dann "Globaler Durchschnitt (Mittelwert der zentralen 95 % der Werte") und klicken Sie auf "Ausführen".
      HINWEIS: K-Means ist in der Regel schneller, wenn auch nicht deterministisch (da der zufällige Startwert jedoch festgelegt ist, wird bei jedem Lauf das gleiche Ergebnis erzielt, wenn alle anderen gleich sind). Die Anzahl der Cluster kann über 2 hinaus erhöht werden, wenn bestimmte Teile des Vordergrunds weiterhin als Hintergrund erkannt werden. Der Cluster mit dem geringsten durchschnittlichen Signal wird als Hintergrund definiert.
    12. Um die Basislinienfluoreszenz zu korrigieren, öffnen Sie das Bedienfeld "Basislinie " und klicken Sie auf "Basislinie korrigieren". Wählen Sie asPLS (Adaptive Smoothness PLS) und setzen Sie λ auf 5000000. Klicken Sie dann auf Ausführen.
      HINWEIS: Es stehen 7 Methoden zur Auswahl, von denen 5 auf bestraften kleinsten Quadraten (PLS) basieren. Bei diesen PLS-Methoden ist ein Glättungsparameter (λ) erforderlich. Ein höherer Wert von λ führt zu glatteren Grundlinien.
    13. Um jede Raman-Hyperspektralkarte zu normalisieren, indem Sie sie durch ihre Frobenius-Norm dividieren, klicken Sie auf Verschiedenes und wählen Sie die Option Normalisieren . Wählen Sie dann Frobenius als Methode aus und klicken Sie auf Ausführen.
      HINWEIS: Die Frobenius-Norm wird verwendet, um die gesamte Datenmatrix zu normalisieren.
    14. Um ein Falschfarbenbild zu erhalten, das die räumliche Verteilung einer subzellulären Komponente veranschaulicht, klicken Sie im Bedienfeld "Bilder " auf der rechten Seite des Intensitätsbilds auf das Menüsymbol "Öffnen ". Klicken Sie dann auf die Option Bild bearbeiten , um das Bearbeitungsfeld zu öffnen.
    15. Wählen Sie im Bearbeitungsfeld die Option "Einzelband" und definieren Sie dann den Spektralbereich (z. B. 715-725 cm-1 für das Zytoplasma). Wählen Sie auf der Farbkarte die Option Doppelte Farbe aus, definieren Sie die Farbe, den Intensitätsschwellenwert und die Deckkraft und klicken Sie dann auf Bestätigen.
    16. Um ein Einzelpunktspektrum herunterzuladen, klicken Sie auf das gewünschte Pixel auf dem Bild, um es auszuwählen. Klicken Sie dann im Bereich Spektrallegende im Abschnitt Cursor auf Spektrum herunterladen. Wiederholen Sie den gleichen Vorgang für verschiedene subzelluläre Komponenten.
    17. Um die Raman-Spektren des Vordergrunds und des Substrats zu exportieren, klicken Sie im Bereich Spektrallegende im Abschnitt Substratidentifikation auf Spektrum herunterladen für die Abschnitte Vordergrund und Substrat .
      HINWEIS: In dem zuvor beschriebenen Protokoll für die RS-Datenanalyse wurden Vorverarbeitungsschritte und univariate Analysen beschrieben, um Falschfarbenbilder zu erzeugen, die die räumliche Verteilung der wichtigsten subzellulären Komponenten, Raman-Intensitätsspektren sowohl vom Vordergrund als auch vom Substrat und Einzelpunktspektren subzellulärer Strukturen veranschaulichen. Während die nachgelagerte Analyse oft auf die spezifische biologische Fragestellung zugeschnitten ist, werden in dieser Studie nun repräsentative multivariate und Klassifikationsmethoden vorgestellt, die über den Abschnitt Kartenanalyse des verwendeten webbasierten Tools zugänglich sind. Dazu gehören Cluster-Analyse, Hauptkomponentenanalyse (PCA), Multivariate Kurvenauflösung (MCR), N-FINDR und spektrale Anpassung. Die spektrale Anpassung ermöglicht die Quantifizierung und den Vergleich von spektralen Merkmalen mithilfe entfernungsbasierter Ansätze wie dem Pearson Correlation Coefficient oder dem Spectral Angle Mapper. Die Clusteranalyse kann mit Algorithmen wie k-Means, Mini-batch k-Means oder hierarchischem agglomerativem Clustering durchgeführt werden, was die Segmentierung hyperspektraler Daten auf der Grundlage der spektralen Ähnlichkeit erleichtert. PCA kann angewendet werden, um die Dimensionalität der Daten zu reduzieren und Varianzmuster hervorzuheben, während MCR die Zerlegung von gemischten Signalen in reine Komponentenspektren ermöglicht. Der N-FINDR-Algorithmus hilft bei der Extraktion von Endgliedspektren, indem er zunächst PCA anwendet, um die Dimensionalität zu reduzieren, wodurch er sich besonders für hyperspektrale Datensätze eignet. Diese Werkzeuge bieten einen robusten Rahmen für die nachgelagerte Erforschung biologischer Muster, die in Raman-Spektraldaten kodiert sind.

4. TPM-Messprotokoll

  1. Bereiten Sie den Mikroskopaufbau vor.
    1. Geben Sie einen Tropfen destilliertes Wasser auf die Objektivlinse des Mikroskops. Positionieren Sie die Probe auf dem Translationstisch des Mikroskops. Passen Sie die Probenposition an, um sie mit der Objektivlinse auszurichten.
  2. Richten Sie das Objektiv und die Kondensorlinse aus.
    1. Schalten Sie das Mikroskop ein und starten Sie die Bildgebungssoftware TomoStudio. Klicken Sie auf das Mikroskop-Symbol in der Symbolleiste. Klicken Sie nach der Initialisierung auf Konfiguration. Wählen Sie im Bereich "Auftrag" die Option "LiveCell" und "PBS" als Medium aus.
      HINWEIS: Der RI-Wert im Bereich Medium wird automatisch auf 1,337 gesetzt, wenn PBS als Medium ausgewählt wird.
    2. Rufen Sie die Registerkarte Kalibrierung in der Systemsteuerung der Bildgebungssoftware auf. Legen Sie die axialen Positionen des Objektivs und der Kondensorlinsen fest, indem Sie Fokus bzw. Oberfläche auswählen.
    3. Klicken Sie auf Scanmodus , um die Objektive manuell anzupassen und sicherzustellen, dass die Beleuchtungsmuster in der Mitte des Sichtfelds konzentriert sind und fast unbewegt erscheinen.
  3. Suchen Sie die Probe.
    1. Klicken Sie auf Normalmodus und passen Sie die Übersetzungsphase an, um die Zelle im Sichtfeld zu positionieren. Fokussieren Sie auf die Probe, indem Sie die axiale Position der Objektivlinse anpassen, bis die Probengrenze auf dem Bildschirm nahezu unsichtbar wird.
    2. Passen Sie die Verschiebungsstufe an, um einen Bereich ohne Zellen zu lokalisieren und so eine ungehinderte Sicht zu gewährleisten.
  4. Kalibrieren Sie das System.
    1. Wählen Sie in der Bildgebungssoftware die Option Kalibrieren , um mehrere 2D-Hologramme mit unterschiedlichen Beleuchtungswinkeln zu erfassen.
  5. Erfassen Sie das 3D-RI-Tomogramm.
    1. Passen Sie die Verschiebungsstufe an, um die Zelle im Sichtfeld zu zentrieren. Navigieren Sie zur Registerkarte Erfassung und wählen Sie 3D-Schnappschuss aus, um das Tomogramm der Zelle zu erfassen.
      HINWEIS: Die Erfassungszeit für ein 3D-RI-Tomogramm einer einzelnen Zelle ist im Vergleich zu der für RS-Daten erforderlichen Erfassungszeit deutlich kürzer (in der Größenordnung von Sekunden). Daher ist die Einführung eines Inkubators für TPM auf der Bühne in der Regel nicht erforderlich. Wenn jedoch Messungen an einer großen Anzahl von Zellen oder unter bestimmten Bedingungen durchgeführt werden sollen, stehen spezielle kommerzielle Inkubationskammern zur Verfügung, die physiologische Bedingungen bieten und in das TPM-System integriert werden können.

5. TPM-Datenanalyse

  1. Nachbearbeitung von TPM-Karten mit der TomoStudio-Software.
    1. Um die holografischen Tomogramme zu visualisieren, wählen Sie die Daten im Bereich Datennavigation aus, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Daten, und klicken Sie auf Öffnen. Die Registerkarte "Forschung" wird automatisch für weitere Analysen geöffnet. Klicken Sie im Bereich Datenmanager auf RI-Tomogramm.
    2. Wählen Sie im Bereich Volumenvisualisierung die Option RI aus, und zeichnen Sie vier rechteckige Farbfelder innerhalb der RI-Arbeitsfläche.
      HINWEIS: Jedes Farbfeld ermöglicht die Zuordnung zu Zellenkomponenten, die durch den RI-Bereich gekennzeichnet sind, der durch das Feld im RI-Canvas gekennzeichnet ist, auf dem Tomogramm , das auf dem Anzeigefeld angezeigt wird, eine bestimmte Farbe. Nach dem Zeichnen der einzelnen Farbfelder werden die zugehörigen Informationen automatisch in der Tabelle unter der RI-Arbeitsfläche angezeigt.
    3. Legen Sie im Bereich unterhalb der RI-Arbeitsfläche die minimalen und maximalen Werte des RI-Bereichs für jedes Farbfeld fest (d. h. erstes Farbfeld: MinRI = 1,3450 und MaxRI = 1,3499, zweites Farbfeld: MinRI = 1,3506 und MaxRI = 1,3571, drittes Farbfeld: MinRI = 1,3586 und MaxRI = 1,3650, viertes Farbfeld: MinRI = 1,3688 und MaxRI = 1,3866). Verknüpfen Sie mit jedem Feld einen Deckkraftwert und eine Farbe (indem Sie auf jedes Feld doppelklicken und eine Farbe auswählen). Dies ermöglicht die Visualisierung der Tomogramme entsprechend der 3D-RI-Verteilungen.
    4. Klicken Sie auf Speichern , um die definierten RI-Bereiche und Farbfelder zu speichern.
      HINWEIS: Die RI-Bereiche sollten je nach Probe angepasst werden.
    5. Um quantitative Deskriptoren der Zellmorphologie (d. h. Volumen [V], Oberfläche [S], projizierte Fläche [A], mittlere RI, Dichte [D], Trockenmasse [DM] und Sphärizität [Φ]) zu erhalten, verwenden Sie die Analyseschnittstelle .
      HINWEIS: Details zur theoretischen Berechnung der quantitativen Parameter finden Sie hier 2,23.
      1. Klicken Sie in der Symbolleiste auf Analyse. Wählen Sie im Bereich "Analyse" auf der rechten Seite im Bereich "Segmentierung" die Option "Manuell" aus und legen Sie 1,3450 als RI-Schwellenwert fest. Klicken Sie dann auf Übernehmen.
        HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Werte des RII (fl/pg) und des Ausgangs-RI 0,19 (das Refraktionsinkrement, das durch frühere Untersuchungen24 weitgehend festgestellt wurde) bzw. 1,3370 (RI von PBS für RI der PBS-Hintergrundkalibrierung) betragen. Die Bildgebungssoftware führt eine volumetrische Segmentierung der Zielzelle gemäß dem eingestellten RI-Schwellenwert durch, berechnet die morphologischen Indizes (V, S, A, mean RI, D, DM und Φ) und meldet sie in einer Ausgabetabelle im Messbereich .
      2. Klicken Sie auf Speichern , um die berechneten morphologischen Indizes zu speichern.
        HINWEIS: Zusätzlich zur verwendeten Software können mehrere Open-Source-Tools zur Quantifizierung morphologischer Merkmale aus TPM-Daten verwendet werden. CellProfiler (https://cellprofiler.org/) bietet Werkzeuge für die Bildanalyse, einschließlich Segmentierung und Merkmalsextraktion, die mit Phasenkontrastbildern kompatibel sind. Fiji (https://fiji.sc/) ist eine Open-Source-Software mit Plugins für die Segmentierung und die Berechnung morphologischer Parameter25. Napari (https://napari.org/) ist ein mehrdimensionaler Bildbetrachter mit Unterstützung für die Integration von Modellen des maschinellen Lernens für die Segmentierung und Analyse. Ilastik (https://www.ilastik.org/) bietet auf maschinellem Lernen basierende Segmentierungswerkzeuge, und DeepImageJ (https://deepimagej.github.io/) integriert Deep-Learning-Modelle mit ImageJ/Fiji für erweiterte Analysen. Darüber hinaus bietet MorphoLibJ (https://imagej.net/plugins/morpholibj) Werkzeuge für 2D- und 3D-morphologische Operationen in Fidschi. Cellpose326 ist ein weiteres Deep-Learning-basiertes Tool für die Zellsegmentierung, das auf die Phasenkontrastbildgebung angewendet werden kann.

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Ergebnisse

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Wir haben einen Workflow für die markierungsfreie morpho-chemische Charakterisierung lebender Zellen auf Basis von konfokalem RS und TPM beschrieben. Wir testeten die Fähigkeit des vorgeschlagenen Arbeitsablaufs, die molekulare Zusammensetzung und morphologische Parameter der humanen Brustkrebszelllinie MDA-MB-231 zu erreichen (Abbildung 1).

MDA-MB-231-Zellen wurden auf Petrischalen mit Quarzglasboden ausgesät. Ein speziell angefertigtes konfokales Raman-Mikroskop...

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Diskussion

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Wir präsentierten einen multimodalen Ansatz und eine unkomplizierte Analysepipeline, die zwei fortschrittliche, markierungsfreie Bildgebungsverfahren integriert: RS und TPM. Der beschriebene Arbeitsablauf ermöglichte eine schnelle, nicht-invasive morpho-chemische Phänotypisierung von lebenden menschlichen Brustkrebs-Einzelzellen (MDA-MB-231), ohne dass eine externe Markierung erforderlich war.

RS ist eine zerstörungsfreie Technik, die die Charakterisierung der...

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Danksagungen

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Diese Forschung wurde durch das Progetto Rocca der MIT-Italy Foundation, NIH-Stipendien (P41EB015871, UH3CA275687, R01DC021326), Apollon (Seoul, Südkorea) und das National Cancer Center, Korea (NCC-24H1170) finanziert. Leonardo Bianchi würdigt die Verleihung eines Postdoktorandenstipendiums des Progetto Rocca für die Durchführung gemeinsamer Forschungsarbeiten am Massachusetts Institute of Technology und am Politecnico di Milano.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
CCD-KameraPrinceton InstrumentePIXIS 100BR eXcelonDetektor für Raman-Streusignale.
Software zur Steuerung von CCD-KamerasPrinceton InstrumenteLichtFeld
Dauerstrich-Ti-Saphir-Laser (Wellenlänge: 785 nm)Spektren-Physik3900 SEs wird für die Raman-Mikroskopie-Anregung verwendet.
Dichroitischer SpiegelThorLabs (Englisch)DMSP750BSiegroitischer 749-nm-Spiegel, lenkt die 785-nm-Raman-Anregung auf die Probe ab, filtert Fluoreszenz- und Hellfeldsignale heraus.
Fötales RinderserumThermo Fisher ScientificA5256701
Gehäuse des FluoreszenzmikroskopsOlympIX83
Laser (Wellenlänge: 532 nm)Spektren-PhysikJahrtausende eVPumplaser für 785-nm-Ti-Saphir-Lasersystem.
MATLAB-SoftwareMathWorks (Englisch)2023a
MDA-MB-231 ZelllinieATCCHTB-26
NIR-SpektrografAndrorHolospec HS-HSG-785-LFEs wird für die spektrale Analyse von rückgestreutem Licht verwendet.
Objektiv (60-fach; 1,2 NA Wasserimmersion)OlympUPLSAPO60&mal;
Inkubationskammer auf der BühneTokai-Trefferstxg-welsx-set
Open-Source-Software zur Steuerung von Mikroskopen&Mikro; ManagerMikro-Manager-2.0
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)Thermo Fisher Scientific15140122
Phenolfreies DMEM/F-12Thermo Fisher Scientific21041025
Phosphatgepufferte KochsalzlösungGibco10-010-023
Petrischalen mit QuarzglasbodenWaken B TechnikSF-S-D12
Raman-Software zur DatenanalyseRamApp (Englisch)Webbasiertes Tool für die hyperspektrale Datenverarbeitung von Raman.
sCMOS-KameraHamamatsu PhotonikOrca Flash 4.0 v2
SpritzenpumpeChemyxFusion 720
Tomographisches PhasenmikroskopTomocube, Inc.HT-2HKommerzielles System zur Gewinnung quantitativer Phasenbilder.
TPM-Software zur DatenanalyseTomocube, Inc.TomoStudioSoftware zur Analyse von Daten der tomographischen Phasenmikroskopie (TPM).

Referenzen

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