Generierung ganzer bakterieller Genome aus klinischen Proben unter Verwendung eines Target Enrichment-Workflows

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die Sequenzierung des gesamten Genoms von bakteriellen sexuell übertragbaren Infektionen aus klinischen Proben mittels Zielanreicherung ermöglicht. Diese neuartige, syndromische Panel-basierte Methode überwindet die Herausforderungen des reichlich vorhandenen menschlichen DNA-Spektrums und der geringen bakteriellen Belastung und erleichtert die genomische Überwachung von Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum und Mycoplasma genitalium.

Zusammenfassung

Die Gewinnung vollständiger Genome von bakteriellen sexuell übertragbaren Infektionen (STIs) direkt aus klinischen Proben ist aufgrund des Vorhandenseins von menschlicher DNA, Mikrobiota und einer sehr geringen Belastung durch bakterielle Krankheitserreger eine Herausforderung. Eine Kultur ist oft keine Option, da diese Spezies wählerisch sind und die meisten Proben in Transportmedien entnommen werden, die Mikroorganismen lysieren, was sie für die Kultur unbrauchbar macht. Um diese Probleme zu lösen, verwendeten wir ein Sondenpanel, das über vier Spezies hinweg konzipiert war, um Gesamtgenomsequenzen von bakteriellen STIs zu generieren, und führten eine Zielanreicherung durch, ein zwei- bis dreitägiges Hybridisierungsverfahren vor der Genomsequenzierung. Unsere ersten Ergebnisse lieferten hervorragende genomische Daten mit Proben, bei denen die direkte Sequenzierung nicht erfolgreich war. Die Zielanreicherung erwies sich als hochwirksam für die Sequenzierung bakterieller STI-Genome, insbesondere bei hoher Erregerlast (Ct < 30). Getestete Proben, die Mycoplasma genitalium enthielten, wiesen häufig Ct-Werte über 30 auf, was zu niedrigeren Erfolgsraten bei der Wiederherstellung des Genoms führte. Verbesserungen wurden nach der Optimierung der Hybridisierungstemperatur von 65 °C auf 62,5 °C beobachtet. Neben der genomischen Überwachung kann die Verfügbarkeit vollständiger Genome wertvolle Einblicke in die Antibiotikaresistenz liefern, wie z. B. die Identifizierung erworbener Resistenzdeterminanten im Zusammenhang mit Neisseria gonorrhoeae. Diese Methode hat bereits zur Identifizierung einer neuen Linie von Chlamydia trachomatis lymphogranuloma venereum in Buenos Aires, dem ompA-Genotyp L4, geführt, was das Potenzial dieses Ansatzes für die Aufdeckung neuer genomischer Diversität und die Verbesserung der STI-Überwachung unterstreicht.

Einleitung

Das Aufkommen von Next-Generation-Sequencing-Techniken (NGS) hat die bakterielle Ganzgenomsequenzierung (WGS) erleichtert und ermöglicht die Sequenzierung klinischer Isolate in vielen Arten menschlicher bakterieller Krankheitserreger. Die Technologie hat zahlreiche vergleichende Studien durch die Generierung vollständiger Genome in einem noch nie dagewesenen Umfang ermöglicht. Dies hatte große Auswirkungen auf die Mikrobiologie in der Klinik und im öffentlichen Gesundheitswesen, da der Zugriff auf Genomdaten aus klinischen Proben über WGS die Typisierung und den Nachweis von antimikrobiellen Resistenzgenen ermöglicht. Darüber hinaus ermöglichen metagenomische Ansätze den direkten Nachweis von krankheitsassoziierten Erregern aus klinischen Proben. Solche Informationen schaffen neue Möglichkeiten für personalisierte Behandlungsstrategien für Patienten. Darüber hinaus ist WGS ein leistungsfähiges Instrument, das Einblicke in die Evolution zirkulierender Stämme eines bestimmten Erregers sowie in ihre Übertragungsmuster bietet und es den Gesundheitsbehörden ermöglicht, Krankheitserregerausbrüche besser zu verstehen und darauf zu reagieren ^1,2,3.

Um eine ausreichende Sequenzierungsqualität für WGS zu erreichen, ist in der Regel eine bakterielle Isolierung durch Kultur erforderlich, um die erforderlichen mikrobiellen DNA-Mengen^{zu erhalten 4,5,6}. Dies stellt einen limitierenden Faktor für Organismen dar, die schwer zu kultivieren sind, die aufgrund einer nicht lebensfähigen diagnostischen Probenverarbeitung nicht kultiviert werden können oder die während der Patientenbehandlung Antibiotika ausgesetzt sind. Beispiele für solche schwer zu kultivierenden Mikroorganismen sind sexuell übertragbare bakterielle Krankheitserreger wie Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum und Mycoplasma genitalium ^7,8,9. Diese Spezies sind aufgrund mehrerer Faktoren schwierig zu kultivieren, darunter ihre intrazelluläre Natur, ihre Zerbrechlichkeit, ihre anspruchsvollen Wachstumsanforderungen und ihre langsamen Replikationsraten. Aus diesen Gründen ist die Entwicklung und Implementierung von Techniken, die WGS trotz niedrigem DNA-Gehalt ermöglichen – wie es bei Patientenproben oft der Fall ist – entscheidend für die Durchführung von Genomanalysen im klinischen Umfeld.

Die Zielanreicherung ist die vielversprechendste Methode zur Genomsequenzierung, wenn die mikrobielle DNA knapp ist¹⁰. So stammt beispielsweise im Zusammenhang mit Krankheitserregern, die sexuell übertragbare Infektionen (STIs) verursachen, nur ein kleiner Teil der in einer Patientenprobe vorhandenen DNA von dem Erreger. Im Falle von C. trachomatis-Infektionen wurde festgestellt, dass die Erreger-DNA bis zu einem Maximum von 0,6 % der Gesamt-DNA ausmacht, aber die Werte sind in der Regel viel niedriger¹¹. Die Methode der Zielanreicherung besteht darin, die interessierende mikrobielle DNA vor der NGS selektiv zu erfassen. Dies wird durch die Verwendung von speziell entwickelten Biotin-markierten RNA-Sonden erreicht, die komplementär zur mikrobiellen Ziel-DNA sind. Die Adapterligation wird durchgeführt, um vor der Hybridisierung eine genomische Bibliothek zu generieren, bei der diese Sonden an die komplementäre mikrobielle DNA binden. Anschließend werden Streptavidin-beschichtete magnetische Kügelchen verwendet, um die Biotin-markierten Nukleinsäurekomplexe einzufangen, wobei die starke Biotin-Streptavidin-Wechselwirkung ausgenutzt wird. Schließlich werden die ausgewählten DNA-Fragmente durch eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert. Diese wichtigen konzeptionellen Schritte sind notwendig, um die Strategie zur Zielanreicherung zu verstehen. Aber auch zusätzliche Verfahrensschritte wie Waschen und Qualitätskontrolle sind Teil des vollständigen Protokolls^10,12.

Vor Beginn des Sequenzierungsprotokolls ist es wichtig, die Menge der Eingangs-DNA zu bewerten und sicherzustellen, dass die Bedingungen während des gesamten Arbeitsablaufs ihre Integrität bewahren. Gemäß den Empfehlungen des Herstellers erfordert das Standardprotokoll 10-200 ng DNA in einem Volumen von 7 μL, was einem Konzentrationsbereich von ca. 1,4 bis 28,6 ng/μL entspricht. Wenn die DNA-Konzentration niedriger ist, wird eine modifizierte Version des Protokolls mit 17 μl empfohlen, die Konzentrationen zwischen 0,6 und 11,8 ng/μl unter Beibehaltung der erforderlichen Eingabemenge^{zulässt 12}. Angesichts der niedrigen Konzentrationen, die oft aus klinischen Proben gewonnen werden, haben wir routinemäßig die 17 μL-Protokollvariante implementiert. Die Leistung von Hybridisierung und Sequenzierung hängt mit der DNA-Qualität zusammen und unterstreicht die Bedeutung geeigneter Probenlagerungs- und Transportbedingungen, um die Integrität der Nukleinsäuren zu erhalten. Daher sind die richtigen Handhabungspraktiken wie die Stabilisierung von Sammelmedien, die schnelle Verarbeitung, die Aufrechterhaltung von Kühlkettenbedingungen und die Minimierung von Gefrier-Tau-Zyklen wichtige Maßnahmen zur Optimierung der DNA-Qualität. Neben den erforderlichen DNA-Konzentrationen ist auch die Länge der DNA-Fragmente ein Indikator für die Integrität. Wir empfehlen, den DNA-Abbau während der Probenhandhabung und -lagerung zu minimieren, um längere Fragmente zu erhalten und die Sequenzierungsergebnisse zu optimieren. Dies ist besonders relevant im klinischen Umfeld, wo Variabilität in Bezug auf Entnahmemethoden, Medium und Handhabung üblich ist. Wir haben dieses Protokoll erfolgreich auf DNA angewendet, die sowohl aus 2-SP-Medium als auch aus NAAT-Transportmedien extrahiert wurde, mit mittleren Fragmentlängen von bis zu 1 kb, wie in den repräsentativen Ergebnissen beschrieben. Schließlich wurde eine erfolgreiche Sequenzierung definiert als das Erreichen einer Genomabdeckung von mehr als 95 % mit einer mittleren Lesetiefe von mehr als 10x¹⁰.

Bisher wurde die Target-Anreicherung von verschiedenen Forschungsgruppen erfolgreich auf ein breites Spektrum von Mikroorganismen und Viren angewendet, darunter Krankheitserreger, die STIs verursachen, Noroviren, Viehviren und Pflanzenpathogene 10,13,14,15,16. Bisher war das Sondendesign jedoch im Allgemeinen auf einzelne Krankheitserreger beschränkt und nicht auf ein Panel, das auf vollständige Genome mehrerer syndromal verknüpfter Krankheitserreger abzielt. Ideale Ziele sind Organismen mit kleinen, konservierten Genomen, zu denen tatsächlich C. trachomatis, T. pallidum und M. genitalium gehören. Während N. gonorrhoeae ein vielfältigeres Genom und ein größeres Pangenom hat, können die Sonden, um es abzudecken, immer noch in einem Design mit den anderen drei Bakterien rationalisiert werden. Es gibt eine gewisse Divergenz in %G+C zwischen diesen Bakterien und anderen, die möglicherweise syndromal miteinander verbunden sind, was bedeutet, dass die Bedingungen möglicherweise optimiert werden müssen.

Ziel dieses Protokolls ist es, vollständige Genome direkt aus klinischen Proben zu gewinnen, um phylogenetische und epidemiologische Analysen zu ermöglichen. Wir demonstrieren eine neuartige und effektive Strategie mit einem auf C. trachomatis, N. gonorrhoeae, T. pallidum und M. genitalium zugeschnittenen Sondenpanel, um vollständige Genome unter Verwendung von extrahierter DNA aus klinischen Proben wie urogenitalen und anorektalen Abstrichen zu gewinnen. Dieser Ansatz hat sich als erfolgreich erwiesen und wurde bei der Charakterisierung des Ausbruchs des Lymphogranuloma venereum (LGV) in Buenos Aires angewendet, was die Beschreibung einer neuen Linie von C. trachomatis LGV^{ermöglichte 10,13}.

Das Verfahren zur Anreicherung des Ziels wird beschrieben, einschließlich der Verwendung einer kommerziell erhältlichen DNA-Capture-Methode mit Post-Capture-Pooling für Next-Generation-Sequencing (NGS), die zur Gewinnung vollständiger Genome direkt aus klinischen Proben von Patienten mit C . trachomatis, N. gonorrhoeae, T. pallidum und/oder M. genitalium eingesetzt wird infektionen. Für einen optimalen Erfolg wird empfohlen, Proben mit einem Ct-Wert unter 30 auszuwählen, da höhere Ct-Werte eine geringere Erregerlast widerspiegeln und es weniger wahrscheinlich ist, dass sie vollständige Genome liefern. Der DNA-Extrakt für die Methode kann aus klinischen Proben verschiedener Probentypen und Entnahmemedien gewonnen werden. DNA-Extraktionsverfahren können entweder manuell oder mit automatisierten Systemen durchgeführt werden, wobei Kits für die Isolierung von Erreger- oder Virus-DNA aus menschlichen Abstrichproben verwendet werden (siehe Materialtabelle).

Das Sondenset, das bei der Target-Anreicherung verwendet wird (siehe Materialtabelle), wurde speziell entwickelt, um die genomische Diversität von C. trachomatis, N. gonorrhoeae, T. pallidum und M. genitalium zu erfassen. Benutzerdefinierte Sonden wurden unter Verwendung mehrerer vollständiger Genome für jede Spezies generiert, um die Abdeckung ihrer bekannten Pangenome zu optimieren¹⁰. Zu den Designkriterien gehörten eine minimale Sequenzhomologie von 90 % zu den Referenzsequenzen und eine Kachelfrequenz von 1x-2x, um die Effizienz der Zielerfassung zu erhöhen. Um die Kosteneffizienz zu optimieren, minimierte der bei der Sondenentwicklung verwendete Algorithmus die Anzahl der Sonden bei gleichzeitiger Beibehaltung einer umfassenden genomischen Repräsentation. Das endgültige Sondenset bestand aus 242.000 Sonden für die Multiplex-Designs, die auf C. trachomatis, N. gonorrhoeae, M. genitalium und T. pallidum abzielen. Das gesamte Zielanreicherungsprotokoll kann in 2 oder 3 Tagen durchgeführt werden. Sowohl für die zweitägige als auch für die dreitägige Workflow-Option werden klare Angaben zu den Haltepunkten gegeben.

ETHIK-ERKLÄRUNG
In dieser Studie werden methodische Verbesserungen auf der Grundlage zuvor veröffentlichter Protokolle vorgeschlagen^10,13. Die beschriebenen Verfahren beziehen sich nur auf anonymisierte Proben und umfassen keine Patientendaten. Daher war für die methodischen Aspekte keine spezifische ethische Genehmigung erforderlich. Die repräsentativen Ergebnisse wurden aus zwei Sätzen zuvor untersuchter Proben gewonnen: argentinische Proben, die nach dem genehmigten Protokoll Detección de C. trachomatis en pacientes con rectitis infecciosa: prevalencia y tipificación (Gobierno de la Ciudad de Buenos Aires, Zulassung Nr. 201723) entnommen wurden, mit schriftlicher Einverständniserklärung aller Teilnehmer; und anonymisierte finnische Proben, für die keine besondere ethische Genehmigung erforderlich war. Vor der Datenbankübermittlung der resultierenden Sequenzierungsdaten müssen humane Lesevorgänge entfernt werden.

Protokoll

HINWEIS: Der Arbeitsbereich sollte in eine Prä-PCR-Zone (amplikonfreier Arbeitsbereich) und eine Post-PCR-Zone (Amplikon-Handhabungsarbeitsbereich) unterteilt werden, um eine Kontamination zu vermeiden. Sofern nicht ausdrücklich anders angegeben, müssen alle Schritte in einem der beiden gesteuerten Arbeitsbereiche ausgeführt werden. Alle Mastermixe und PCR-Reaktionsmischungen sollten im amplikonfreien Arbeitsbereich hergestellt werden, während alle nachfolgenden Schritte mit amplifizierter DNA im Arbeitsbereich für die Amplikonhandhabung durchgeführt werden sollten. Alle Mengen in diesem Protokoll sind für die Verarbeitung von acht Proben berechnet.

1. DNA-Fragmentierung

1. Messen Sie die DNA-Konzentration der DNA-Extrakte aus klinischen Proben, die Zielerreger-DNA (DNA) enthalten, mit einer empfindlichen, genauen, fluoreszenzbasierten Methode (doppelsträngiger DNA-Assay [dsDNA]) unter Verwendung von 1 μl Probe mit einem Nachweisbereich von bis zu 120 ng/μl; siehe Materialtabelle). Diese Quantifizierungsmethode wird im gesamten Protokoll einheitlich verwendet, wenn die DNA-Konzentration gemessen wird.
2. Verdünnen Sie jede DNA-Probe auf eine Konzentration von 10 - 200 ng mit nukleasefreiem Wasser, wobei ein Endvolumen von 17 μl in jedem PCR-Röhrchenstreifen sichergestellt wird. Um optimale Sequenzierungsergebnisse zu erzielen, verwenden Sie die höchstmögliche Menge an Eingangs-DNA innerhalb des empfohlenen Bereichs.
   HINWEIS: In Fällen, in denen die Gesamt-DNA-Konzentration unter dem empfohlenen Minimum von 10 ng in 17 μl liegt, kann eine Supplementierung mit Hintergrund-DNA (z. B. humane genomische DNA) verwendet werden, um die vom Hersteller empfohlenen Eingabeanforderungen zu erfüllen. Dies kann dazu beitragen, die Reaktion der Bibliotheksvorbereitung zu stabilisieren und die Sequenzierungsleistung bei klinischen Proben mit geringem Input zu verbessern.
3. Tauen Sie den Fragmentierungspuffer (5x) auf, wirbeln Sie ihn und legen Sie ihn auf Eis.
4. Programmieren Sie den Thermocycler gemäß Tabelle 1. Starten Sie das Programm und pausieren Sie es sofort.
   HINWEIS: Die Dauer des Inkubationsschritts bei 37 °C kann je nach der anfänglichen Größe des DNA-Fragments und der gewünschten NGS-Leselänge variieren. Für hochwertige DNA-Proben wird eine Inkubationszeit von 15 min empfohlen, um Fragmente von 150 bis 200 bp zu erhalten, die für 2 100x Reads geeignet sind, und 10 min, um Fragmente von 180 bis 250 bp für 2 150x Reads zu erhalten.
5. Entnehmen Sie die benötigten Fläschchen für den Fragmentierungs-Mastermix aus der -20 °C-Lagerung. Bereiten Sie den Mastermix anhand von Tabelle 2 vor. Verschließen Sie das Rohr und den Wirbel bei hoher Geschwindigkeit für 5-10 s. Kurz schleudern, um Blasen zu entfernen und den Mastermix auf Eis zu halten.
6. Geben Sie 3 μl Fragmentierungs-Mastermix in jede Vertiefung mit 17 μl Eingangs-DNA. Mischen Sie, indem Sie 20x auf und ab pipettieren, versiegeln Sie den PCR-Röhrchenstreifen, wirbeln Sie ihn 5-10 s lang mit hoher Geschwindigkeit vor und drehen Sie ihn kurz.
7. Legen Sie den PCR-Röhrchenstreifen in den Thermocycler (siehe Materialtabelle) und setzen Sie das in Tabelle 1 zu Beginn von Schritt 1 dargestellte Programm fort.
8. Sobald der Halteschritt von 4 °C erreicht ist, entfernen Sie den PCR-Röhrchenstreifen aus dem Thermocycler und fügen Sie 30 μl nukleasefreies Wasser hinzu. Legen Sie den PCR-Röhrchenstreifen auf Eis.

Tabelle 1: Thermocycler-Programm für die enzymatische Fragmentierung. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Vorbereitung des Fragmentierungs-Mastermixes Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

2. Vorbereitung der Bibliothek

1. Vorbereitung des Ligatur-Mastermixes
   HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt sollte der Ligations-Mastermix zubereitet werden, da er 30-45 Minuten benötigt, um sich auf Raumtemperatur auszugleichen.
   1. Ligationspuffer aus der Lagerung bei -20 °C holen und auf Eis auftauen. Nehmen Sie die T4-DNA-Ligase aus der Lagerung bei -20 °C, mischen Sie das Fläschchen durch Umdrehen und bewahren Sie es auf Eis auf.
   2. Bereiten Sie den Ligations-Mastermix gemäß Tabelle 3 vor. Tube und Wirbel bei hoher Geschwindigkeit 10-20 s verschließen, kurz schleudern und vor Gebrauch 30-45 min bei Raumtemperatur aufbewahren.
2. Endreparatur und dA-Tail-Fragmente
   1. Programmieren Sie den Thermocycler gemäß Tabelle 4.
   2. Holen Sie den Endreparatur-Abraumpuffer aus der -20 °C-Lagerung und tauen Sie ihn auf Eis auf. Nach dem Auftauen mit hoher Geschwindigkeit wirbeln, kurz drehen. Holen Sie die Endreparatur-A-Tailing-Enzymmischung heraus, mischen Sie, indem Sie das Fläschchen umdrehen, und bewahren Sie es auf Eis auf.
   3. Bereiten Sie den Endreparatur-/dA-Tailing-Mastermix gemäß Tabelle 5 vor (siehe Materialtabelle). Mischen Sie, indem Sie die Tube sicher verschließen und bei hoher Geschwindigkeit 10-20 s lang vortexen, kurz drehen und auf Eis halten.
   4. Pipettieren Sie 20 μl Endreparatur-/dA-Tailing-Mastermix in jede Vertiefung mit 50 μl DNA-Fragmenten (aus den Schritten 1.1-1.8). Versiegeln Sie den PCR-Röhrchenstreifen, mischen Sie ihn gründlich, indem Sie ihn 5-10 s lang bei hoher Geschwindigkeit vortexen. Schleudern Sie den PCR-Röhrchenstreifen kurz und legen Sie ihn in den Thermocycler. Nehmen Sie das Programm von Tabelle 4 wieder auf.
3. Ligation von MBC-getaggten Adaptern
   1. Sobald das Programm in Tabelle 4 seinen letzten Schritt abgeschlossen hat, legen Sie den PCR-Röhrchenstreifen auf Eis. Richten Sie den Thermocycler gemäß den Parametern in Tabelle 6 ein. Starten Sie das Programm und pausieren Sie es sofort.
   2. 25 μl Ligations-Mastermix bei Raumtemperatur zu jeder in Schritt 2.1 vorbereiteten Probe geben. Den PCR-Röhrchenstreifen verschließen, 5-10 s vortexen und kurz schleudern.
   3. Entnehmen Sie den Adapter-Oligo-Mix für MBC-getaggte Bibliotheken (siehe Materialtabelle) aus der Lagerung bei -20 °C und tauen Sie ihn auf Eis auf. Nach dem Auftauen 5-10 s lang mit hoher Geschwindigkeit wirbeln. Kurz drehen und auf Eis halten.
   4. Geben Sie 5 μl Adapter-Oligo-Mix für MBC-markierte Bibliotheken zu jeder Probe. PCR-Röhrchenstreifen versiegeln und bei hoher Geschwindigkeit 5-10 s vortexen, kurz schleudern. Legen Sie den PCR-Röhrchenstreifen sofort in den Thermocycler und setzen Sie das Programm wie in Tabelle 6 beschrieben fort.
4. Reinigung der Ligatur
   1. Führen Sie die DNA-Aufreinigung mit magnetischen Kügelchen durch. Nehmen Sie die Kügelchen aus dem 4 °C-Lager und lassen Sie sie vor dem Gebrauch Raumtemperatur erreichen.
   2. Bereiten Sie 4 ml 70%iges Ethanol mit nukleasefreiem Wasser vor. Bei Raumtemperatur aufbewahren.
      HINWEIS: Es wird dringend empfohlen, eine 70%ige Ethanollösung für die Verwendung in den Reinigungsschritten frisch zuzubereiten, um eine optimale Leistung zu gewährleisten. Für die Zubereitung von 70 % Ethanol verwenden Sie unmittelbar vor der Verwendung nukleasefreies Wasser.
   3. Wirbeln Sie die magnetische Bead-Suspension gründlich ein, bis die Mischung gleichmäßig ist und die Farbe konsistent erscheint.
   4. Wenn das Programm in Tabelle 6 die Haltestufe von 4 °C erreicht, überführen Sie den PCR-Röhrchenstreifen aus dem Thermocycler auf Raumtemperatur. Geben Sie 80 μl Bead-Suspension in jede Vertiefung. PCR-Röhrchenstreifen und Wirbel 5-10 s verschließen, kurz schleudern.
   5. Inkubieren Sie die Perlensuspensionen 5 Minuten lang bei Raumtemperatur. Übertragen Sie den PCR-Röhrchenstreifen auf einen Magnetständer (siehe Materialtabelle) und warten Sie 5-10 Minuten, bis die Lösung klar wird.
   6. Während Sie den PCR-Röhrchenstreifen im Magnetständer aufbewahren, entfernen und entsorgen Sie die geklärte Lösung vorsichtig aus jeder Vertiefung, wobei Sie den Kontakt mit den Kügelchen vermeiden sollten.
   7. Führen Sie mit dem PCR-Röhrchenstreifen im Magnetständer zwei Waschgänge mit 70 % Ethanol auf folgende Weise durch: Fügen Sie jeder Probe 200 μl 70 % Ethanol hinzu. Warten Sie 1 Minute und entfernen Sie 70% Ethanol. Vermeiden Sie es, die Kügelchen zu berühren, während Sie die Lösung entfernen.
   8. Versiegeln Sie nach dem zweiten Waschen den PCR-Röhrchenstreifen und schleudern Sie die Proben kurz, um Restethanol zu sammeln. Legen Sie den PCR-Röhrchenstreifen für 30 s in den Magnetständer.
   9. Entfernen Sie das gesammelte Ethanol und vermeiden Sie es, die Kügelchen zu berühren. Um das restliche Ethanol zu entfernen, entfernen Sie den PCR-Röhrchenstreifen vom Magnetständer und bewahren Sie ihn bis zu 5 Minuten lang unverschlossen auf (idealerweise in einer Haube). Stellen Sie sicher, dass die Perlen vollständig getrocknet, aber nicht rissig aussehen; Dies würde die Effizienz des Elutionsprozesses verringern.
   10. Eluieren Sie die DNA, indem Sie 35 μl nukleasefreies Wasser in jede Probenvertiefung geben. Gründlich mischen, indem Sie 10x-15x auf und ab pipettieren, die Röhrchen verschließen und 5-10 s lang vortexen. Vergewissern Sie sich, dass keine sichtbaren Klumpen vorhanden sind. Falls vorhanden, den Wirbel aufwirbeln, bis er sich aufgelöst hat.
   11. Inkubieren Sie die Proben 5 Minuten lang bei Raumtemperatur. Legen Sie den PCR-Röhrchenstreifen in einen magnetischen Ständer und warten Sie ca. 5 Minuten, bis die Lösung klar ist.
   12. Entfernen Sie vorsichtig den gereinigten Überstand (~34 μL) aus jeder Vertiefung und geben Sie ihn in einem frischen PCR-Röhrchenstreifen in eine entsprechende Vertiefung. Bewahren Sie die Proben auf Eis auf und entsorgen Sie die Kügelchen.
       HINWEIS: Bei einem 3-Tage-Protokoll markiert dies das Ende von Tag 1. Lagern Sie die Proben über Nacht bei 4 °C.
5. Verstärkung und dualer Index
   HINWEIS: Wählen Sie für jede Probe das geeignete Index-Primer-Paar aus, um eine korrekte Identifizierung während der Sequenzierung zu gewährleisten. Jede Indexsequenz besteht aus einem 8-bp-Tag, der in die Primer integriert ist, die für die Amplifikation der Pre-Capture-Bibliotheken verwendet werden.
   1. Holen Sie den High-Fidelity-DNA-Polymerase-Puffer mit dNTPs (5x) aus der -20 °C-Lagerung und tauen Sie ihn auf Eis auf. Holen Sie die ausgewählten indizierten Sequenzierungsprimer aus der Lagerung bei -20 °C und bewahren Sie sie auf Eis auf.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der jeder Probe zugewiesene Barcode aufgezeichnet wird, um eine genaue Identifizierung und Rückverfolgbarkeit während des gesamten Sequenzierungsprozesses zu gewährleisten.
   2. Programmieren Sie den Thermocycler gemäß Tabelle 7. Starten Sie das Programm und pausieren Sie es sofort.
      HINWEIS: Der Hersteller empfiehlt, je nach Qualität und Quantität der Eingangs-DNA 8 bis 14 Pre-Capture-PCR-Zyklen durchzuführen. In diesem Protokoll wurden 11 Zyklen nach den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt, was zu qualitativ hochwertigen Sequenzierungsdaten führte^10,12.
   3. Holen Sie das High-Fidelity-Fusionsenzym für die PCR-Amplifikation aus einer Lagerung bei -20 °C. Pipettieren Sie das Enzym zum Mischen auf und ab, ohne übermäßige Bewegung, und wirbeln Sie den High-Fidelity-DNA-Polymerase-Puffer vortex, um die Homogenität zu gewährleisten. Bereiten Sie die PCR-Reaktionsmischung vor der Aufnahme vor (wie in Tabelle 8 beschrieben). Den finalen Mix vortexen und kurz runterdrehen, auf Eis halten.
   4. Geben Sie 11 μl des PCR-Reaktionsgemisches vor der Erfassung (wie in Tabelle 8 beschrieben hergestellt) in jede Probenvertiefung, die die gereinigte DNA-Bibliothek enthält. Fügen Sie jeder Reaktion 5 μl des ausgewählten Index-Primerpaares hinzu. Versiegeln Sie den PCR-Röhrchenstreifen und den Wirbel 5 s lang und drehen Sie ihn dann schnell nach unten.
   5. Setzen Sie das Thermocycler-Programm wie in Tabelle 7 beschrieben fort. Sobald die Temperatur 98 °C erreicht hat, legen Sie den PCR-Röhrchenstreifen in den Thermocycler und schließen Sie den Deckel fest.
6. Aufräumen der Bibliothek
   1. Lassen Sie die magnetischen Beads vor der Verwendung mindestens 30 Minuten lang auf Raumtemperatur ausgleichen. Bereiten Sie 4 ml 70%iges Ethanol mit nukleasefreiem Wasser vor. Bei Raumtemperatur aufbewahren.
   2. Wirbeln Sie die magnetische Bead-Suspension gründlich ein, bis die Mischung gleichmäßig ist und die Farbe konsistent erscheint.
   3. Wenn das Programm in Tabelle 7 den Halteschritt von 4 °C erreicht, übertragen Sie den PCR-Röhrchenstreifen aus dem Thermocycler auf Raumtemperatur. Geben Sie 50 μl Bead-Suspension zu jeder Probe. Den PCR-Röhrchenstreifen und den Wirbel 5-10 s versiegeln, kurz drehen (ohne die Magnetkügelchen zu pelletieren).
   4. Inkubieren Sie die Perlensuspensionen 5 Minuten lang bei Raumtemperatur. Übertragen Sie den PCR-Röhrchenstreifen auf einen Magnetständer und warten Sie 5-10 Minuten, bis die Lösung klar wird.
   5. Während Sie den PCR-Röhrchenstreifen im Magnetständer aufbewahren, entfernen und entsorgen Sie die klare Lösung vorsichtig aus jeder Vertiefung. Vermeiden Sie es, die Kügelchen zu berühren, während Sie die Lösung entfernen.
   6. Führen Sie mit dem PCR-Tubenstreifen im Magnetständer zwei Wäschen mit 70% Ethanol auf folgende Weise durch. Geben Sie 200 μl 70 % Ethanol in jede Probe. Warten Sie 1 Minute und entfernen Sie 70% Ethanol. Vermeiden Sie es, die Kügelchen zu berühren, während Sie die Lösung entfernen.
   7. Nach dem zweiten Waschen versiegeln Sie den PCR-Röhrchenstreifen und schleudern ihn kurz, um das restliche Ethanol aufzufangen. Legen Sie den PCR-Röhrchenstreifen für 30 s in den Magnetständer. Entfernen Sie das restliche Ethanol und vermeiden Sie dabei das Berühren der Kügelchen.
   8. Um das restliche Ethanol zu entfernen, entfernen Sie den PCR-Röhrchenstreifen vom Magnetständer und bewahren Sie ihn bis zu 5 Minuten lang unverschlossen auf (idealerweise in einer Haube). Stellen Sie sicher, dass die Kügelchen vollständig getrocknet, aber nicht rissig aussehen, da dies die Effizienz des Elutionsprozesses verringern würde.
   9. Eluieren Sie die Bibliotheks-DNA, indem Sie jedem Probenröhrchen 15 μl nukleasefreies Wasser hinzufügen. Gründlich mischen, indem Sie 10x-15x auf und ab pipettieren, den PCR-Röhrchenstreifen versiegeln und 5-10 s lang vortexen. Vergewissern Sie sich, dass keine sichtbaren Klumpen vorhanden sind. Falls vorhanden, den Wirbel aufwirbeln, bis er sich aufgelöst hat.
   10. Inkubieren Sie die Proben 5 Minuten lang bei Raumtemperatur. Legen Sie den PCR-Röhrchenstreifen in einen magnetischen Ständer und warten Sie ca. 5 Minuten, bis die Lösung klar ist.
   11. Entfernen Sie vorsichtig den gereinigten Überstand (~15 μL) aus jeder Vertiefung und geben Sie ihn in einem frischen PCR-Röhrchenstreifen in eine entsprechende Vertiefung. Bewahren Sie die Proben auf Eis auf und entsorgen Sie die Kügelchen.
7. Qualitätskontrolle
   1. Messen Sie die DNA-Konzentration der aufgereinigten Bibliotheks-DNA. Aufgrund der höheren Empfindlichkeit verwenden Sie eine fluoreszenzbasierte Methode, um die DNA in 1 μL zu quantifizieren.

Tabelle 3: Vorbereitung des Ligatur-Mastermixes. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 4: Thermocycler-Programm für die Endreparatur/dA-Tailing. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 5: Vorbereitung der Endreparatur/dA-Tailing-Mastermix. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 6 Thermocycler-Programm für die Ligation. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 7: Pre-Capture-PCR-Thermocycler-Programm. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 8: Vorbereitung des Pre-Capture-PCR-Reaktionsmixes. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

3. Hybridisierung/Abscheidung der Probe

1. Hybridisierungsbibliotheken zur Untersuchung
   1. Programmieren Sie den Thermocycler gemäß Tabelle 9. Starten Sie das Programm und pausieren Sie es sofort.
      HINWEIS: Der Hersteller empfiehlt eine Hybridisierungstemperatur von 65°C. Diese Temperatur wurde auf 62,5 °C gesenkt, was zu verbesserten Ergebnissen führte.
   2. Den Hybridisierungspuffer aus der Lagerung bei -20 °C holen, auf Eis auftauen und bis zur Verwendung bei Raumtemperatur aufbewahren. Sowohl der RNase-Blocker als auch der Oligonukleotid-Blocker-Mix werden aus der Lagerung bei -20 °C entnommen und auf Eis aufgetaut. Bewahren Sie diese Fläschchen bis zur Verwendung auf Eis auf.
   3. Berechnen Sie das Volumen, das für jede Probe erforderlich ist, um 500-1000 ng DNA-Bibliothek zu enthalten, basierend auf der in Schritt 2.7 gemessenen DNA-Konzentration. Übertragen Sie das berechnete Volumen in einen neuen PCR-Röhrchenstreifen und stellen Sie das Gesamtvolumen mit nukleasefreiem Wasser auf 12 μL ein.
   4. Den Oligonukleotid-Blocker-Mix vortexen und schnell drehen. Geben Sie 5 μl in jedes Probenröhrchen. Versiegeln Sie den PCR-Röhrchenstreifen und übertragen Sie ihn in den Thermocycler. Setzen Sie das in Tabelle 9 beschriebene Temperaturwechselprogramm fort und führen Sie es bis Schritt 3 aus, wo zusätzliche Reagenzien direkt zu den Probenvertiefungen im Thermocycler hinzugefügt werden müssen.
   5. Bereiten Sie die 25%ige RNase-Blocklösung gemäß Tabelle 10 vor. Verschließen Sie die Röhre und den Wirbel bei hoher Geschwindigkeit für 10-20 s, drehen Sie sie kurz und halten Sie sie bis zum Gebrauch auf Eis.
      HINWEIS: Vermeiden Sie eine längere Exposition von sondenhaltigen Lösungen bei Raumtemperatur. Nur während der Zubereitungsschritte bei Raumtemperatur aufbewahren.
   6. Nehmen Sie das Sondenfläschchen aus der Lagerung bei -80 °C und bewahren Sie das Fläschchen bei Nichtgebrauch in einem Kühlgestell auf. Zum Auftauen auf Eis legen. Es wird empfohlen, Sonden wie vorgesehen zu verwenden, können aber verdünnt werden, wenn sie getestet werden^10,13.
   7. Sobald alle in Tabelle 11 aufgeführten Reagenzien Raumtemperatur erreicht haben, kombinieren Sie sie, um die Sondenhybridisierungsmischung vorzubereiten. Mischen Sie die Lösung, indem Sie sie 5 s lang bei hoher Geschwindigkeit vortexen, kurz herunterschleudern und sofort mit dem nächsten Schritt fortfahren.
   8. Wenn der Thermocycler Schritt 3 des in Tabelle 9 beschriebenen Programms erreicht, geben Sie 13 μl des Raumtemperatursonden-Hybridisierungsgemisches in jede Probenvertiefung, wobei die Röhrchen während des gesamten Prozesses im Thermocycler verbleiben. Gründlich mischen, indem Sie langsam 8x-10x auf und ab pipettieren.
   9. Verschließen Sie den PCR-Röhrchenstreifen sicher, wirbeln Sie ihn kurz durch und schleudern Sie die Röhrchen nach unten. Stellen Sie sicher, dass keine Blasen vorhanden sind, und geben Sie die Streifenrohre sofort wieder in den Thermocycler zurück. Vergewissern Sie sich, dass die Schläuche ordnungsgemäß abgedichtet sind.
   10. Setzen Sie das Temperaturwechselprogramm fort, um eine Hybridisierung der vorbereiteten DNA-Proben mit den Sonden durchzuführen. Die Hybridisierung schreitet über Nacht voran
       HINWEIS: Bei einem 2-Tage-Protokoll markiert dies das Ende von Tag 1. Bei einem 3-Tage-Protokoll markiert dies das Ende von Tag 2.
2. Aufbereitung von Streptavidin-Kügelchen
   1. Entnehmen Sie die mit Streptavidin beschichteten Magnetkügelchen (Streptavidin-Kügelchen) aus der 4 °C-Lagerung. Wirbeln Sie das Fläschchen gründlich ein, um sicherzustellen, dass die Kügelchen vollständig resuspendiert sind. Die Suspension muss homogen sein.
   2. Für jede Hybridisierungsprobe werden 50 μL der vollständig resuspendierten Kügelchen in einzelne Röhrchen eines neuen PCR-Röhrchenstreifens überführt.
   3. Waschen Sie die Streptavidin-Kügelchen wie folgt: Geben Sie 200 μl Bindepuffer in jedes Röhrchen und mischen Sie es durch Auf- und Abpipettieren. Die Schläuche verschließen, mit hoher Geschwindigkeit 5-10 s wirbeln und kurz herunterschleudern. Legen Sie den PCR-Röhrchenstreifen in einen Magnetständer. Lassen Sie die Lösung 5 Minuten lang klären, entfernen Sie dann vorsichtig den Überstand und entsorgen Sie ihn. Wiederholen Sie die Schritte 2x und führen Sie insgesamt drei Wäschen durch.
   4. Resuspendieren Sie die Kügelchen in 200 μl Bindungspuffer.
3. Erfassung hybridisierter Bibliotheken
   1. Sobald das in Tabelle 9 angegebene Programm zur thermischen Hybridisierung seinen letzten Schritt abgeschlossen hat, wird der PCR-Röhrchenstreifen auf Raumtemperatur gebracht.
   2. Übertragen Sie das gesamte Volumen (~30 μl) aus jedem Röhrchen in die entsprechenden Röhrchen mit 200 μl vorgewaschenen Streptavidin-Kügelchen. Mischen Sie gründlich, indem Sie 5x-8x auf und ab pipettieren und dann das Streifenröhrchen sicher verschließen.
   3. Legen Sie das Streifenröhrchen auf einen 96-Well-Plattenmischer und mischen Sie es 30 Minuten lang bei Raumtemperatur kräftig bei 1800 U/min. Stellen Sie sicher, dass die Flüssigkeit in den Vertiefungen richtig gemischt wird.
      HINWEIS: Wenn kein 96-Well-Plattenmischer verfügbar ist oder sich die Proben nicht effektiv mischen, sollten Sie alternative Methoden in Betracht ziehen, wie z. B. das horizontale Befestigen der Streifenröhrchen auf der Oberseite des Mischers oder die Verwendung eines temperaturgesteuerten Schüttlers (mit ausgeschalteter Heizoption), um eine gründliche Probenbewegung zu gewährleisten.
   4. Während dieser Inkubationszeit werden für jede Probe sechs Aliquots mit 200 μl Hochtemperatur-Waschpuffer vorbereitet (d. h. in diesem Fall 6 x 8 Streifenröhrchen mit je 200 μl). Verschließen Sie die Röhrchen und inkubieren Sie sie bis zur Verwendung im Thermocycler bei 70 °C.
   5. Sobald die 30-minütige Capture-Inkubation abgeschlossen ist, drehen Sie den PCR-Röhrchenstreifen kurz, um die Flüssigkeit aufzufangen. Legen Sie den PCR-Röhrchenstreifen in einen Magnetständer, um die Kügelchen zu sammeln. Warten Sie, bis die Lösung klar ist (ca. 2 Minuten), entfernen und entsorgen Sie dann vorsichtig den Überstand, wobei Sie vermeiden sollten, die Kügelchen zu berühren.
   6. Nachdem Sie den PCR-Röhrchenstreifen vom Magnetständer entfernt haben, fügen Sie 200 μl Waschpuffer bei Raumtemperatur hinzu. Pipettieren Sie auf und ab, bis die Streptavidin-Kügelchen vollständig resuspendiert sind (15x-20x).
   7. Legen Sie den PCR-Röhrchenstreifen in den Magnetständer und warten Sie, bis sich die Suspension geklärt hat (ca. 1 min). Entfernen Sie dann den Überstand und entsorgen Sie ihn.
      HINWEIS: Um die Spezifität der Erfassung zu gewährleisten, ist es wichtig, die Raupensuspension während des unten beschriebenen Waschvorgangs auf 70 °C zu halten. Vergewissern Sie sich daher, dass der Hochtemperatur-Waschpuffer vor der Verwendung auf 70 °C vorgewärmt wird.
   8. Waschen Sie die Streptavidin-Kügelchen 6x mit aliquotiertem und auf 70 °C vorgewärmtem Hochtemperatur-Waschpuffer wie unten beschrieben.
      1. Entfernen Sie das PCR-Streifenröhrchen mit den Kügelchen vom Magnetständer. Geben Sie 200 μl vorgewärmten Hochtemperatur-Waschpuffer mit 70 °C in jedes Röhrchen mit den Kügelchen. Pipettieren Sie auf und ab, bis die Perlen vollständig resuspendiert sind (15x-20x). Versiegeln Sie den PCR-Röhrchenstreifen vorsichtig, wirbeln Sie 8 s lang mit hoher Geschwindigkeit vor und drehen Sie ihn schnell, ohne die Kügelchen zu pelletieren.
      2. Das Probenstreifenröhrchen mit den resuspendierten Kügelchen wird 5 Minuten lang bei 70 °C in den Thermocycler-Block gelegt. Übertragen Sie das Streifenrohr bei Raumtemperatur vom Thermocycler auf das Magnetstativ.
      3. Warten Sie 1 Minute, bis die Lösung klar ist. Entfernen Sie dann den Überstand und entsorgen Sie ihn. Wiederholen Sie dies 5x für insgesamt sechs Wäschen.
   9. Stellen Sie sicher, dass alle Waschpuffer vollständig entfernt wurden, und geben Sie dann 25 μl nukleasefreies Wasser in jedes Probenröhrchen. Suspendieren Sie die Kügelchen langsam, indem Sie 8x auf und ab pipettieren, um Blasenbildung zu vermeiden.
   10. Bewahren Sie den PCR-Streifen mit den Proben auf Eis auf, bis sie für die unten beschriebenen PCR-Reaktionen verwendet werden können.
4. Mit Amplifikation angereicherte Bibliotheken
   1. Programmieren Sie den Thermocycler gemäß Tabelle 12. Starten Sie das Programm und pausieren Sie es sofort.
      HINWEIS: Der Hersteller empfiehlt, je nach Größe des Sondendesigns 10 bis 16 PCR-Zyklen nach der Erfassung durchzuführen. In diesem Protokoll wurden 22 Zyklen implementiert, die zu einer erfolgreichen Wiederherstellung des Erregergenoms führten^10,12.
   2. Holen Sie sowohl den High-Fidelity-DNA-Polymerase-Puffer mit dNTPs (5x) als auch die Primermischung nach dem Capture (siehe Materialtabelle) aus der Lagerung bei -20 °C, tauen Sie sie auf und bewahren Sie sie auf Eis auf. Mit hoher Geschwindigkeit vortexen und vor Gebrauch schnell herunterdrehen.
   3. Entnehmen Sie das High-Fidelity-Fusionsenzym für die PCR-Amplifikation (siehe Materialtabelle) aus der Lagerung bei -20 °C. Um die Enzymlösung richtig zu mischen, pipettieren Sie die Flüssigkeit auf und ab, um übermäßige Bewegung zu vermeiden. Bereiten Sie dann die PCR-Reaktionsmischung nach der Erfassung vor, indem Sie alle Reagenzien gemäß Tabelle 13 kombinieren. Den finalen Mix vortexen und kurz runterdrehen, auf Eis halten.
   4. Geben Sie 25 μl des PCR-Reaktionsgemisches nach der Erfassung in jedes Probenröhrchen (jedes enthält 25 μl beadgebundene, zielangereicherte DNA). Pipettieren Sie auf und ab, um die Reaktionen zu mischen, bis die Bead-Suspension gleichmäßig ist. Verschließen Sie den PCR-Röhrchenstreifen sicher. Schleudern Sie den PCR-Röhrchenstreifen zu diesem Zeitpunkt nicht herunter.
   5. Legen Sie den PCR-Röhrchenstreifen in den Thermocycler und setzen Sie das Thermocycler-Programm wie in Tabelle 12 beschrieben fort. Sobald das Programm seinen letzten Schritt erreicht hat, drehen Sie den PCR-Röhrchenstreifen kurz. Legen Sie den PCR-Röhrchenstreifen in den Magnetständer und warten Sie ca. 2 Minuten, bis die Lösung klar ist.
   6. Übertragen Sie ca. 50 μl Überstand aus jedem PCR-Röhrchenstreifen in die entsprechende Vertiefung eines neuen PCR-Röhrchenstreifens. Das Streifenröhrchen mit den Streptavidin-Kügelchen kann verworfen werden.
5. Bereinigung der endgültigen Bibliotheken
   1. Lassen Sie die magnetischen Beads vor der Verwendung mindestens 30 Minuten lang auf Raumtemperatur ausgleichen. Bereiten Sie 4 ml 70%iges Ethanol mit nukleasefreiem Wasser vor. Bei Raumtemperatur aufbewahren.
   2. Wirbeln Sie die magnetische Bead-Suspension gründlich ein, bis die Mischung gleichmäßig ist und die Farbe konsistent erscheint.
   3. Geben Sie 50 μl Bead-Suspension in jedes Probenröhrchen. Röhrchen und Wirbel 5-10 s verschließen, kurz schleudern (ohne die Magnetkügelchen zu pelletieren).
   4. Inkubieren Sie die Perlensuspensionen 5 Minuten lang bei Raumtemperatur. Übertragen Sie den PCR-Röhrchenstreifen auf einen Magnetständer und warten Sie 5-10 Minuten, bis die Lösung klar wird.
   5. Während Sie den PCR-Röhrchenstreifen im Magnetständer aufbewahren, entfernen und entsorgen Sie die klare Lösung vorsichtig aus jeder Vertiefung. Vermeiden Sie es, die Kügelchen zu berühren, während Sie die Lösung entfernen.
      1. Führen Sie mit dem PCR-Röhrchenstreifen im Magnetständer zwei Waschgänge mit 70 % Ethanol auf folgende Weise durch: Fügen Sie jeder Probe 200 μl 70 % Ethanol hinzu. Warten Sie 1 Minute, damit sich gestörte Kügelchen absetzen und das 70%ige Ethanol entfernt werden kann. Vermeiden Sie es, die Kügelchen zu berühren, während Sie die Lösung entfernen.
   6. Nach dem zweiten Waschen verschließen Sie die Röhrchen und schleudern den PCR-Röhrchenstreifen kurz, um das restliche Ethanol aufzufangen. Legen Sie den PCR-Röhrchenstreifen für 30 s auf das Magnetstativ.
   7. Um das restliche Ethanol zu entfernen, entfernen Sie den PCR-Röhrchenstreifen vom Magnetständer und bewahren Sie ihn maximal 5 Minuten lang unversiegelt auf (idealerweise in einer Haube). Stellen Sie sicher, dass die Kügelchen vollständig getrocknet, aber nicht rissig aussehen, da dies die Effizienz des Elutionsprozesses verringern würde.
   8. Eluieren Sie die Bibliotheks-DNA, indem Sie jedem Probenröhrchen 25 μl nukleasefreies Wasser hinzufügen. Gründlich mischen, indem Sie 10x-15x auf und ab pipettieren, den PCR-Röhrchenstreifen versiegeln und 5-10 s lang vortexen. Vergewissern Sie sich, dass keine sichtbaren Klumpen vorhanden sind.
   9. Inkubieren Sie die Proben 5 Minuten lang bei Raumtemperatur. Legen Sie den PCR-Röhrchenstreifen in einen magnetischen Ständer und warten Sie ca. 5 Minuten, bis die Lösung klar ist.
   10. Entfernen Sie vorsichtig den gereinigten Überstand (ca. 25 μl) aus jeder Vertiefung und geben Sie ihn in einem frischen PCR-Röhrchenstreifen in eine entsprechende Vertiefung. Bewahren Sie die Proben auf Eis auf und entsorgen Sie die Kügelchen.
6. Qualitätskontrolle
   1. Messen Sie die DNA-Konzentration der aufgereinigten Bibliotheks-DNA. Um eine bessere Empfindlichkeit zu erreichen, verwenden Sie eine fluoreszenzbasierte Methode, um die DNA in 1 μL zu quantifizieren.
7. Sequenzierung der nächsten Generation
   HINWEIS: Abhängig von der Kapazität der verwendeten Plattform und der Menge der pro Probe benötigten Sequenzierungsdaten können indizierte Bibliotheken aus mehreren Chargen in einem einzigen Sequenzierungslauf gemultiplext werden.
   1. Bevor Sie die Proben poolen, stellen Sie die DNA-Konzentration jeder Probe auf 5 ng/μl ein. Poolen Sie die Bibliotheken in äquimolaren Mengen, um eine ausgewogene Darstellung zu erhalten.
   2. Sequenzieren Sie die vorbereiteten Bibliotheken mit einem Short-Read-Sequenzierungssystem mit hohem Durchsatz, z. B. mit einer 150-bp-Paired-End-Read-Konfiguration (siehe Materialtabelle).

Tabelle 9: Thermocycler-Programm für die Hybridisierung. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 10: Herstellung der RNase-Blocklösung. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 11: Vorbereitung des Sondenhybridisierungsmixes. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 12: Post-Capture-PCR-Thermocycler-Programm. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 13: Vorbereitung des PCR-Reaktionsmixes nach der Aufnahme. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergebnisse

Eine Studie über den Ausbruch von C. trachomatis LGV in Buenos Aires, Argentinien, zeigte einige neue Merkmale in den Proben, nämlich 10 Nukleotidsubstitutionen im ompA-Gen im Vergleich zum ompA-Genotyp L1 und eine ungewöhnliche Multi-Locus Sequence Typing (MLST) Sequenz Typ 2 17,18,19. Unser Ziel war es, die Genome dieser klinischen Proben zu untersuchen und sie in den Kontext globaler Daten zu stellen. Um dies zu erreichen, verglichen wir die Leistung eines Target-Enrichment-Ansatzes mit der direkten metagenomischen Sequenzierung für WGS von bakteriellen STIs aus klinischen Proben, um die Herausforderungen zu überwinden, die sich aus der geringen bakteriellen Belastung und der reichlich vorhandenen menschlichen und mikrobiellen DNA ergeben.

Die verwendete DNA stammte entweder aus rektalen Abstrichproben, die zwischen 2017 und 2023 in Buenos Aires, Argentinien, entnommen und in 2-SP-Medium (Saccharose-Phosphat-Medium) gegeben wurden, das mit 2 % fötalem Kälberserum (FCS) und Antibiotika (Gentamicin 25 μg/ml, Vancomycin 0,5 mg/ml und Amphotericin B 2,5 μg/ml) ergänzt und bei -80 °C gelagert wurde, oder gepoolte Harnröhren-, anorektale, und Rachenabstriche, die am Universitätsspital Zürich (USZ) in NAATs (Nucleic Acid Amplification Tests) gesammelt wurden. Die DNA aus den Proben von Buenos Aires wurde mit einem manuellen Extraktionskit auf Siliziumdioxidbasis extrahiert, während die DNA aus den USZ-Proben mit einem automatisierten System auf Basis von magnetischen Beads extrahiert wurde.

Alle klinischen Proben, die in diese Studie eingeschlossen waren, wurden durch einen intern entwickelten Multiplex-Real-Time-PCR-Assay (siehe Materialtabelle) mit qPCR-Zyklus-Schwellenwerten (Ct) wie folgt bestätigt: C. trachomatis: 17-34, N. gonorrhoeae:  24-31, T. pallidum: 27-36 und M. genitalium:  30-37. Die DNA-Konzentration wurde vor der Sequenzierung mit einem hochempfindlichen fluorometrischen Assay quantifiziert, um das Eingangsmaterial der klinischen Proben zu charakterisieren (siehe Materialtabelle).

Um die direkte metagenomische Sequenzierung mit der Zielanreicherung zu vergleichen, verwendeten wir 32 Proben, von denen 29 positiv für C. trachomatis, neun für N. gonorrhoeae, fünf für T. pallidum und drei für M. genitalium waren. Die direkte metagenomische Sequenzierung führte zu keinem vollständigen Genom und erreichte in der Tat kaum Zieldaten, die über dem Ausgangswert der negativen Proben lagen. Die Zielanreicherung mit Hybridisierung bei 65 °C führte zu deutlich besseren Ergebnissen für jeden Erreger, und in vielen Fällen wurden mit dieser Methode erfolgreiche Genome erzielt (Abbildung 1).

Um die optimale Probenauswahl für die Zielanreicherung zu bewerten, untersuchten wir die Beziehung zwischen diagnostischen qPCR-Ct-Werten und der Effizienz der Genomwiederherstellung, gemessen am Prozentsatz der On-Target-Reads (%OTR). Diese Metrik spiegelt den Anteil der Sequenzierungs-Reads wider, die dem Genom des Zielorganismus zugeordnet sind, und wird häufig zur Bewertung der Anreicherungsleistung verwendet. Es wurde eine signifikante Korrelation zwischen der Erregerlast und dem Sequenzierungserfolg für C. trachomatis gefunden, mit einem Ct-Cut-off für den Erfolg um Ct30. Obwohl die Daten für die anderen Zielerreger begrenzt waren, wurde ein ähnlicher Trend beobachtet, bei dem der Erfolg der Genomsequenzierung überwiegend in Proben mit einer Erregerlast unter Ct30 auftrat (Abbildung 2).

Dieses Experiment mit einer Hybridisierungstemperatur von 65 °C ergab Erfolgsraten bei der Genomsequenzierung mit einer angestrebten Anreicherung von 75 % bis 80 % für C. trachomatis, N. gonorrhoeae und T. pallidum, basierend auf Proben mit Ct-Werten unter 30. Die drei M . genitalium-positiven Proben wiesen Ct-Werte von 30-37 auf und erreichten eine geringere Genomabdeckung und mittlere Lesetiefe. Um diese Ergebnisse zu verbessern, experimentierten wir mit der Reduzierung der Hybridisierungstemperatur, was die Hybridisierung aufgrund des niedrigen %G+C-Gehalts im M . genitalium-Genom verbessert. Durch die Verwendung niedrigerer Hybridisierungstemperaturen, wie z. B. der jetzt empfohlenen Temperatur von 62,5 °C, können wir die Wiederherstellung von M. genitalium-Genomen verbessern, ohne die Wiederherstellung anderer Genome zu beeinträchtigen (Abbildung 3). Diese Ergebnisse zeigen, dass die Target-Anreicherung ein effektiver Ansatz ist, um wertvolle genomische Informationen aus klinischen Proben zu gewinnen, und dass sie an eine Vielzahl von Genomen angepasst werden können, auch über ein panelbasiertes Design hinweg.

Die phylogenetische Analyse der erfolgreich angereicherten C. trachomatis-Genome zeigte, dass sich die Mehrzahl der Proben aus Buenos Aires innerhalb der ompA-Genotyp-L2b-Klade gruppiert, was auf eine erfolgreiche Abstammungslinie mit globaler Zirkulation hindeutet. Die Analyse ergab auch das Vorhandensein einer neuen, eigenständigen Abstammungslinie in Argentinien, die LGV verursacht. Die Proben aus dieser Gruppe unterscheiden sich um etwa 600 SNPs von den anderen LGV-Linien, und diese Linie wird als ompA-Genotyp L4 vorgeschlagen (Abbildung 4). Eine detaillierte Beschreibung der in Abbildung 1, Abbildung 2 und Abbildung 4 verwendeten Beispiele finden Sie in der ergänzenden Tabelle 1.

Diese Ergebnisse unterstreichen den Wert der Zielanreicherung bei der Untersuchung der Erregerdiversität und zeigen einen hohen Grad an Erfolg bei der Genomsequenzierung aus klinischen Proben.

Abbildung 1: Anreicherung von Genomen mittels Zielanreicherung im Vergleich zur direkten metagenomischen Sequenzierung. Der Prozentsatz der On-Target-Reads (%OTR), definiert als der Prozentsatz der Sequenzierungs-Reads, die dem Genom des Zielorganismus zugeordnet werden, zeigt den Grad der Anreicherung, der mit der Zielanreicherung erreicht wird. Die Linie stellt den Median aller Datenpunkte dar, und das Feld gibt den Interquartilsabstand (IQR) von 50 % an. Die Farben der Datenpunkte entsprechen der Probenquelle: Hellblau für Argentinien und Rot für die Schweiz. Der Erfolg der Genomsequenzierung, definiert als Abdeckung >95 % und mittlere Lesetiefe >10, wird durch große Punkte dargestellt, während das Scheitern durch kleine Punkte angezeigt wird. Beachten Sie die unterschiedlichen Maßstäbe auf der y-Achse. Abkürzungen: CT = C. trachomatis, NG = N. gonorrhoeae, TP = T. pallidum, MG = M. genitalium. Diese Zahl wurde von¹⁰ geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Korrelation von %OTR aus der Zielanreicherung mit diagnostischen qPCR-Ct-Werten. Die Farben der Datenpunkte stellen die Stichprobenquelle dar: Hellblau für Argentinien und Rot für die Schweiz. Der Erfolg der Genomsequenzierung, definiert als Abdeckung >95 % und mittlere Lesetiefe >10, wird durch große Punkte angezeigt, während das Scheitern durch kleine Punkte dargestellt wird. Beachten Sie die unterschiedlichen Maßstäbe auf der y-Achse. Abkürzungen: CT = C. trachomatis, NG = N. gonorrhoeae, TP = T. pallidum, MG = M. genitalium. Diese Zahl wurde von¹⁰ geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Einfluss der Hybridisierungstemperatur auf die Wiederfindung vollständiger Genome über alle bakteriellen STI-Krankheitserreger in zehn Proben. Menschliche DNA im Bereich der in klinischen Proben wurde mit bekannten Konzentrationen von bakterieller Ziel-DNA separat (einzeln) und auch insgesamt versetzt, um eine Probe mit mehreren Infektionen (gepoolt) darzustellen. Es wurden zwei Experimente mit jeweils den fünf Erregern/Kombinationen durchgeführt: 0,01 % und 0,03 %, um den ungefähren Prozentsatz der DNA jedes Mikroorganismus im Verhältnis zur Gesamt-DNA in der Probe darzustellen (die verbleibende DNA entspricht der menschlichen DNA). Die Rückgewinnung von M. genitalium wird bei niedrigeren Temperaturen verbessert. C. trachomatis Die DNA wurde in einer niedrigen Konzentration gespickt; weitere Experimente zeigen, dass die Temperaturen die Wiederherstellung des Genoms von C. trachomatis nicht beeinflussten (Daten nicht gezeigt). Abkürzungen: CT = C. trachomatis, MG = M. genitalium, NG = N. gonorrhoeae, TP = T. pallidum. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Rekombinationsadjustierte Phylogenie von LGV-Stämmen aus Argentinien. Die Analyse umfasst alle verfügbaren LGV-Genome mit veröffentlichten Daten. Zu den Metadaten, die rechts neben der Phylogenie angezeigt werden, gehören doppelte Patientenproben, die Bayes'sche Analyse der Populationsstruktur (BAPS; Cluster = Klade, wobei der polyphyletische BAPS-Cluster 6 die genetische Vielfalt der Population darstellt), die Genomsequenzierungsmethode (Daten aus dieser Studie), der ompA-Genotyp , das Land und das Jahr, wie im Schlüssel oben links angegeben. Fehlende Daten werden weiß dargestellt. Die Genomnamen aus dieser Studie sind für Argentinien hellblau und für Finnland dunkelblau hervorgehoben (nicht durch Zielanreicherung erhalten). Diese Farben werden ausschließlich zur Unterscheidung der in dieser Studie generierten Genome verwendet. Bootstrap-Werte von 1000 ultraschnellen Bootstraps werden als Prozentsätze auf den Hauptzweigen angezeigt. Diese Zahl wurde von¹³ geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Tabelle 1: Beschreibung der in der Studie verwendeten Materialien, Reagenzien, Instrumente und Geräte. Die Tabelle enthält detaillierte Informationen über den Handelsnamen, den Hersteller und die Katalognummer der Komponenten, die für die DNA-Extraktion, die Bibliothekserstellung, die Zielanreicherung und die Sequenzierung verwendet werden. Es umfasst auch Artikel, die für hauseigene qPCR-Assays und allgemeine molekularbiologische Verfahren verwendet werden. Gleichwertige Alternativen können für Elemente verwendet werden, die mit einem Sternchen (*) gekennzeichnet sind. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Diskussion

Die Generierung vollständiger bakterieller Genomdaten aus klinischen Proben ist eine besondere Herausforderung. Dennoch benötigen wir diese Daten, um Informationen über zirkulierende Klone zu gewinnen und antimikrobielle Resistenzprofile zu untersuchen, insbesondere bei anspruchsvollen und schwer zu kultivierenden Bakterien. Mit alternativen Methoden wie der Tiefensequenzierung oder der adaptiven Sequenzierung mit Oxford Nanopore Technologies können keine ausreichenden Daten für die Analyse der Gesamtgenomsequenz gewonnen werden. In Fällen wie STI-Proben ist die Zielanreicherung die optimale Technik, um auf das gesamte Genom zuzugreifen, und diese Methode kann auf eine Reihe von bakteriellen STI-Krankheitserregern angewendet werden. Es handelt sich zwar nicht um ein billiges Verfahren, aber die Ergebnisse, die es bieten kann, können auf keine andere Weise erzielt werden¹⁰.

Geeignete Proben sollten sorgfältig ausgewählt werden, idealerweise um relevante und wichtige Fragen in Diagnostik und Forschung zu beantworten. Das Medium, das für die Entnahme verwendet wird, spielt nicht unbedingt eine entscheidende Rolle, da erfolgreiche Sequenzen sowohl von 2-SP- als auch von NAAT-Medien erhalten werden. Die Lagerung von Proben ist wichtig, um die DNA-Integrität zu erhalten. Es wurde festgestellt, dass der wichtigste Faktor die diagnostische Belastung ist, wobei auf ungefähre Ct-Werte unter Ct30 abgezielt wird. Bei Proben mit Ct-Werten über 30 ist der Erfolg der vollständigen Genomsequenzierung weniger wahrscheinlich, aber Teildaten können in einigen Fällen relevante Informationen liefern.

Das Verfahren ist nicht trivial und umfasst viele Schritte, darunter PCR-Zyklen, Hybridisierung und viele Bead-Washes. Für optimale Ergebnisse ist eine sorgfältige Beachtung des Verfahrens erforderlich. Die kritischen Schritte des Protokolls – DNA-Fragmentierung, Hybridisierung mit Capture-Sonden und magnetische Bead-basierte Capture mit Waschen – erfordern eine sorgfältige Ausführung und ordnungsgemäße Handhabung. Das Protokoll kann von Forschern und Technikern nach ein paar Versuchen erlernt werden. In den ersten Runden, während des Lernens, kann das 3-Tage-Protokoll von Vorteil sein; Bei erfahreneren Benutzern kann das 2-Tage-Protokoll die Ergebnisse beschleunigen. Da die Reagenzien teuer sind, kann es sich lohnen, einen Testlauf ohne die teuren Komponenten, zum Beispiel die Sonden, durchzuführen. Bei alternativen Ködersets kann die Hybridisierungstemperatur angepasst werden, was die Sensitivität oder Spezifität der Anreicherung verbessern kann. Wenn ausreichend Daten generiert werden und ein erheblicher Anteil an PCR-Duplikaten beobachtet wird, kann auch die Anzahl der Pre-Capture- und Post-Capture-PCR-Zyklen angepasst werden.

Die aus diesen Experimenten gewonnenen Daten können für die Typisierung verwendet werden, wobei MLST und andere relevante Ziele extrahiert werden. Es kann darüber hinaus in einem epidemiologischen Kontext, global oder lokal, analysiert und mit relevanten Genomen verglichen werden, um aktuelle Erkenntnisse zu gewinnen. Die Analyse von Rekombinationen und mobilen Elementen im gesamten Genom leitet auch Veränderungen im Laufe der Zeit und unter Selektionsdruck sowie mögliche Koinfektionen ab. Mit ausreichenden Daten und zugehörigen Metadaten können zeitliche Berechnungen durchgeführt und Rückschlüsse auf die Vorfahren bestimmter Merkmale und Abstammungslinien sowie auf mögliche Übertragungswege und -mechanismen gezogen werden. All diese Fortschritte in unserem Wissen über eine wichtige Gruppe von Krankheitserregern können in Strategien für die öffentliche Gesundheit einfließen. Unser Protokoll und die repräsentativen Ergebnisse zeigen die Verwendung von syndromischen Panel-Target-Sondensets, die in bakteriellen STI-Proben wirksam sind und auf weitere Probentypen ausgeweitet werden könnten.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
8-Kanal-Pipette 0,5-10 &Mikro; L	Eppendorf	3125000010	Eppendorf Research  Plus, 8-Kanal, 0,5-10 & Mikro; L, mittelgrau, variables Volumen.
8-Kanal-Pipette 10-100 & Mikro; L	Eppendorf	3125000036	Eppendorf Research  Plus, 8-Kanal, 10-100 & Micro; L, gelb, variables Volumen.
Adapter Oligo Mix für MBC-getaggte Bibliotheken	Agilent Technologien	5500-0147	Teil des SureSelect XT HS2 Library Preparation Kit für ILM (Pre-PCR).
Automatisiertes Nukleinsäure-Extraktionssystem unter Verwendung eines DNA-Extraktionskits für Viren/Krankheitserreger	Qiagen	937036 (Bausatz) / 9001297 (Instrument)	Das QIAsymphony SP/AS-Instrument wird mit dem QIAamp DSP Virus/Pathogen Kit für die automatisierte DNA-Extraktion verwendet.
Bindungs-Puffer	Agilent Technologien	5190-9687	Teil des SureSelect Target Enrichment Kit ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR).
DNA-Extraktionskit und automatisiertes Instrument	Zymo Research Corporation	Nr. D3024/D3025	Quick-DNA Miniprep Kit für die vollständige DNA-Extraktion aus klinischen Proben. Kompatibel mit manuellem oder automatisiertem Workflow.
End Repair - Eine Tailing-Enzymmischung	Agilent Technologien	5500-0147	Teil des SureSelect XT HS2 Library Preparation Kit für ILM (Pre-PCR).
Endreparatur-Tailing-Puffer	Agilent Technologien	5500-0147	Teil des SureSelect XT HS2 Library Preparation Kit für ILM (Pre-PCR).
Ethanol	VWR Chemicals BDH	20816.298	Ethanol absolut ≥ 99,5% Ph. Eur., USP
Fluorometer mit hochempfindlichem dsDNA-Assay / Fluoreszenzbasierte Methode zur Quantifizierung von DNA	Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)	Q33238, Q33231	Qubit 4 Fluorometer mit 1X dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit.
Fragmentierungs-Puffer	Agilent Technologien	5191-4080	Teil des SureSelect Enzymetic Fragmentation Kit mit dem Namen ''5X Fragmentation Buffer''.
Fragmentierungs-Enzym	Agilent Technologien	5191-4080	Teil des SureSelect Enzymetic Fragmentation Kit.
High-Fidelity-DNA-Polymerase-Puffer	Agilent Technologien	5500-0147	Teil des SureSelect XT HS2 Library Preparation Kit für ILM (Pre PCR) mit dem Namen ''Herculase II Buffer''.
High-Fidelity-DNA-Polymerase-Puffer mit dNTPs (5X)	Agilent Technologien	5190-9687	Teil des SureSelect Target Enrichment Kit ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) mit dem Namen ''Herculase II Buffer''.
High-Fidelity-Fusionsenzym für die PCR-Amplifikation	Agilent Technologien	5191-5688	Teil des SureSelect Target Enrichment Kit ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) mit dem Namen ''Herculase II''.
Hochtemperatur-Waschpuffer	Agilent Technologien	5190-9687	Teil des SureSelect Target Enrichment Kit ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) mit dem Namen ''Wash buffer 2''.
Hybridisierungs-Puffer	Agilent Technologien	5500-0147	Teil des SureSelect XT HS2 Library Preparation Kit für ILM (Pre-PCR).
Indizierte Sequenzierungsprimer	Agilent Technologien	5500-0147	Teil des SureSelect XT HS2 Index Primer Paares 1-96 für ILM (Prä-PCR).
Hauseigener Multiplex-Real-Time-PCR-Assay	Tib Molbiol	N/A	Eigenentwickelter und akkreditierter Assay auf Basis von Lightmix Kits für den STI-Nachweis
Ligations-Puffer	Agilent Technologien	5500-0147	Teil des SureSelect XT HS2 Library Preparation Kit für ILM (Pre-PCR).
Magnetische Kügelchen für die Reinigung	Agilent Technologien	5191-5740	SureSelect DNA AMPure XP Perlen.
Magnetischer Ständer	Permagen Laborgeräte	MSRLV08	0,2 mL PCR 8 Streifen Magnetabscheider 5 & Mikro; L ~ 0,2 ml Volumen.
Next-Generation-Sequencing (NGS): Kurz-Read-Sequenzierungssystem mit hohem Durchsatz	Illumina, Inc.	N/A	Paired-End-Sequenzierung mit 150 bp (PE150), die auf den Plattformen Illumina NextSeq1000 und MiSeq durchgeführt wird.
Nukleasefreies Wasser	BioConcept	3-07F04-H	Wasser für die Molekularbiologie, DNA/DNAse/RNase-frei, steril, frei von PCR-Inhibitoren.
Oligonukleotid-Blocker-Mix	Agilent Technologien	5500-0147	Teil des SureSelect XT HS2 Library Preparation Kit für ILM (Pre-PCR).
PCR-Röhrchen-Streifen	avantor, geliefert von VWR	732-3608	PCR-Röhrchenstreifen mit aufgesetzten Schieberkappen.
Post-Capture Primer Mix	Agilent Technologien	5190-9687	Teil des SureSelect Target Enrichment Kit ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR).
RNA-Sonde	Agilent Technologien	5191-6916	SureSelect Custom Tier4 6Mb-11.9Mb Sonde, z. B. Design-ID S3465164).
RNase Blocker	Agilent Technologien	5500-0147	Teil des SureSelect XT HS2 Library Preparation Kit für ILM (Pre-PCR).
Waschpuffer bei Raumtemperatur	Agilent Technologien	5190-9687	SureSelect Target Enrichment Kit ILM Hyb Modul Box 1 (Post PCR) mit dem Namen ''Wash buffer 1''.
Streptavidin-Kügelchen	Agilent Technologien	5191-5742	SureSelect Streptavidin Perlen.
T4-DNA-Ligase	Agilent Technologien	5500-0147	Teil des SureSelect XT HS2 Library Preparation Kit für ILM (Pre PCR) .
Methode zur Anreicherung von Zielen / Methode zur DNA-Erfassung	Agilent Technologien	Nr. G9983-90000	SureSelect XT HS2 DNA-Kit mit Bibliotheksvorbereitung, schneller Hyb-Zielanreicherung und Pooling-Workflow nach der Aufnahme. Protokoll Version F0, Mai 2023. Für Illumina Platform NGS
Zielanreicherungssonde für C. trachomatis, N. gonorrhoeae, T. pallidum und M. genitalium	Agilent Technologies / Enriching Microbiology Laboratory (IMM, UZH)	Design-ID-S3465164	Kundenspezifisches Sondenset (~242.000 Sonden) für die Multiplex-Erfassung von vier STI-Erregern. Design basierend auf mehreren Referenzgenomen.
Thermocycler	Thermofischer	4375305	Veriti 96-Well-Thermocycler.