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Methodenartikel

Etablierung von In-vitro-Modellen der Kultur der Spinalganglien: Komplementäre Ansätze zur Untersuchung der Krebs-Nerven-Wechselwirkung

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DOI:

10.3791/68552

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11. Juli 2025

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1Division of Cancer Biology and Genetics, Sinclair Cancer Research Institute, and Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University, 2Laboratory of Mutagenesis and Oncogenetics, Department of General Biology - Center for Biological Science, State University of Londrina

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Etablierung ganzer und dissoziierter Kulturen von dorsalen Wurzelganglien (DRG) der Maus und deren Verwendung zur Beurteilung von Tumor-Nerven-Interaktionen.

Zusammenfassung

Der Beitrag des Nervensystems zur Mikroumgebung des Tumors und die Bedeutung der neuronalen Invasion als Weg zur Krebsverbreitung werden zunehmend anerkannt. Interaktionen von Krebszellen mit Neuronen können deren Invasion um und in Nerven fördern, ein Merkmal vieler Krebsarten mit schlechten klinischen Ergebnissen. In-vitro-Modelle zur Untersuchung wechselseitiger Wechselwirkungen zwischen Neuronen und Krebszellen bieten wertvolle Werkzeuge, um die Ausbreitung von Krebs zu verstehen und Ansätze zu ihrer Eindämmung zu identifizieren.

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Isolierung von murinen dorsalen Wurzelganglien (DRG) und die Etablierung sowohl ganzer als auch dissoziierter Monolayer-Kulturen, die zur Visualisierung der Neuronenmorphologie und des Neuritenauswuchses im Laufe der Zeit verwendet werden können. Ganze DRGs, die in Matrigel montiert sind, bewahren die Nervenarchitektur und die Reaktionen auf Reize in einer heterogenen Umgebung, die dem in vivo-Nerv ähnlicher ist, während dissoziierte Nervenkulturen eine genauere Beurteilung direkter Zell-Zell-Interaktionen ermöglichen. Sobald DRG-Kulturen etabliert sind, können Krebszellen hinzugefügt werden, um Co-Kulturen zu erzeugen, die verwendet werden können, um Veränderungen des Neuritenwachstums und der Nervenmorphologie als Reaktion auf Krebszellen sichtbar zu machen. Das Wachstum oder die Beweglichkeit von Krebszellen als Reaktion auf von Nerven abgeleitete Signale im Laufe der Zeit oder unter Bedingungen der Wachstumsstimulation oder -hemmung kann beurteilt werden, ebenso wie die Visualisierung der Auswirkungen des direkten Kontakts zwischen Krebszellen und Nervenfortsätzen.

Da beide Co-Kulturmodelle gleichzeitig erstellt werden können, bietet dieses Protokoll einen umfassenderen Überblick über die Auswirkungen von Krebs-Neuronen-Interaktionen und erleichtert den Vergleich von Behandlungsbedingungen und die Integration von Informationen aus der zellulären Ebene und ganzen Ganglien. Dieses Protokoll wird die Untersuchung von Nerven-Tumor-Wechselwirkungen erleichtern und kann für eine Vielzahl von Anwendungen verwendet werden, einschließlich Studien zur Zellsignalisierung, zum Wirkstoffscreening oder zur Untersuchung der Heterogenität der Tumor-Nerven-Umgebung und der Mechanismen der Tumorausbreitung entlang der Nerven.

Einleitung

Die Tumorverbreitung durch lokale Invasion und regionale oder ferne Metastasierung ist die Hauptursache für krebsbedingte Todesfälle. Obwohl sich die Forschung auf vaskuläre oder lymphatische Ausbreitungswege konzentriert hat, wird eine neuronale Invasion von Tumorzellen häufig bei vielen soliden Tumoren beobachtet, darunter Bauchspeicheldrüsenkrebs 1,2, Prostatakrebs3, Kopf- und Halskrebs 4, Brustkrebs5 und kolorektaler Krebs6. In den letzten Jahren haben zahlreiche Studien die aufkommende Rolle der Nerven bei der Förderung des Tumorwachstums und der Tumorprogression sowie als Verbreitungswege für die Metastasenbildung hervorgehoben 7,8. In diesem Zusammenhang hat sich die Krebsneurowissenschaft zu einem herausragenden Forschungsgebiet entwickelt, das neue Perspektiven in der Onkologie bietet, indem es die Wechselwirkungen zwischen Tumorzellen und den grundlegenden Komponenten des peripheren Nervensystems (PNS) aufklärt, die zu diesen Prozessen beitragen können 8,9.

Das PNS besteht sowohl aus peripheren Nerven als auch aus Ganglien, bei denen es sich um heterogene Strukturen handelt, die aus verschiedenen Zelltypen bestehen, darunter Neuronen unterschiedlicher Größe und Funktion, Schwann- und andere Gliazellen, Fibroblasten, Makrophagen, Mastzellen, Melanozyten und vaskuläre Endothelzellen, die das lokale Gefäßsystem bilden10. Das PNS ist ein kritischer Bestandteil der Tumormikroumgebung (TME), und die wechselseitige Kommunikation zwischen Krebszellen und Nerven, entweder direkt durch physischen Kontakt oder indirekt durch die Freisetzung von neurotrophen Faktoren, Neurotransmittern, Wachstumsfaktoren und anderen Signalen, kann die neuronale Invasion erleichtern und aggressivere Phänotypen fördern8.

In-vitro-Modelle können zur Charakterisierung der Prozesse verwendet werden, die zur Nervenerhaltung und -reparatur beitragen, und werden zunehmend zur Untersuchung zellulärer Wechselwirkungen zwischen Nerven und Krebszellen verwendet11,12. Ein häufig verwendetes In-vitro-Modell sind extrahierte Spinalganglien (DRG) der Maus, die mit Tumorzellen kokultiviertwurden 11. Diese Modelle verwenden häufig zweidimensionale (2D) Monolayer-Kulturen von dissoziierten DRG-Zellen, um die neuronale Biologie in vitro zu untersuchen, und wurden verwendet, um zelluläre Interaktionen in der PNS zu modellieren13,14. 2D-Kulturen fehlt jedoch die Komplexität der Nervenmikroumgebung und sie repräsentieren ihre In-vivo-Architektur nur schlecht. Dreidimensionale (3D) ganze Halterungen von peripheren Neuronen oder Ganglien bieten eine Alternative, die die Physiologie der peripheren Nerven effektiver rekapituliert, um die Wechselwirkungen zwischen Nerven und Umwelt ganzheitlicher darzustellen 15,16,17,18. Die Heterogenität dieses Modells schränkt jedoch die Fähigkeit ein, Zell-Zell-Interaktionen zu visualisieren oder zu quantifizieren, und diese Modelle sind effektiver für die Beobachtung der gesamten peripheren Nervenreaktionen als für die Erforschung spezifischer zellulärer Interaktionen und mechanistischer Reaktionen auf Reize. Somit ist klar, dass dissoziierte und ganze reitäre neuronale Kulturen komplementär sind und dass die parallele Auswertung von 2D- und 3D-Modellen optimal ist, um sowohl die Gesamteffekte als auch die individuellen Zellreaktionen auf Reize zu bewerten.

Dieses Protokoll beschreibt Verfahren zur Erzeugung komplementärer dissoziierter (2D) und ganzer (3D) Nervenkulturen, die zur Bewertung von Nerven- und Krebszellinteraktionen sowohl auf Zell- als auch auf Gewebeebene verwendet werden können, und bietet einen umfassenderen Überblick über diese Wechselwirkungen als Methoden, die nur einen Kulturtyp verwenden 1,13. Diese Modelle können verwendet werden, um zelluläre Prozesse zu visualisieren und zu bewerten, einschließlich der Morphologie von Nervenzellen und des Neuritenwachstums sowie der Reaktionen von Tumorzellen auf nervensekretierte chemotaktische Wirkstoffe, wie z. B. neurotrophe Faktoren, und der Wechselwirkung zwischen sensorischen Neuronen und Tumorzellen. Es ermöglicht auch die Erforschung potenzieller Wechselwirkungen zwischen Tumorzellen und anderen Komponenten der neuronalen Mikroumgebung, wie Immunzellen, Fibroblasten und Gliazellen. Wir heben die Anwendung dieser Modelle zur Untersuchung von Nerven-Krebszell-Interaktionen im Laufe der Zeit hervor, die durch Lebendzellfärbung oder Immunfluoreszenz sichtbar gemacht werden, als Beispiele für Ansätze zur Bewertung oder Quantifizierung von Zellinteraktionen und -reaktionen. Zusammengenommen können die Ergebnisse, die durch den Einsatz dieser Methoden erzielt werden, unser Verständnis dafür erweitern, wie das Nervensystem das Wachstum und die Ausbreitung von Krebs fördert, und uns helfen, Strategien zu entwickeln, um diese Mechanismen zu bekämpfen.

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Protokoll

Alle Arbeiten an Mäusen wurden vom Office of the University Animal Care Committee an der Queen's University überprüft und genehmigt (Protokollnummer 2524). Die Tiere wurden in Übereinstimmung mit den ethischen Richtlinien des Canadian Council on Animal Care und des National Centre for the Replacement, Refinement & Reduction on Animals in Research (UK) gehalten und für die Gewebeentnahme eingeschläfert. In diesem Protokoll verwendeten wir Gewebe, das aus C57BL/6-Tieren isoliert wurde, aber auch erfolgreich andere Genotypen, einschließlich Rag2IL2Rγc KO-Tiere. Die Abschnitte 1-6 können in einer sauberen Umgebung auf einem oberflächensterilisierten Labortisch durchgeführt werden (siehe Abbildung 1), während die Abschnitte 7-9 in einer biologischen Sicherheitswerkbank durchgeführt werden müssen. Zum besseren Verständnis wurden schematische Darstellungen der genannten Schritte erstellt (Abbildung 1).

1. Herstellung von Stammlösungen

  1. Bereiten Sie die Papain-Lösung und die Kollagenase IV/Dispase II-Lösung vor. Papain wird in steriler PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) in einer Konzentration von 30 U/ml gelöst; In 1 ml Aliquot bei -20 °C lagern. Löse Kollagenase Typ IV bei 1,25 mg/ml und Dispase II bei 2,5 mg/ml in PBS auf. In 1 ml Aliquot bei -20 °C lagern.
  2. Bereiten Sie den Neurobasal-Nährboden (F12) vor, der mit 2 % B27-Supplement (50-fache Stammlösung), 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin (Pen-Streptomycin) (100-fache Stammlösung) ergänzt wird.
  3. Bereiten Sie Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) mit 1% Penicillin-Streptomycin (100x Stammlösung) zu.
    HINWEIS: Um das anfängliche Überleben und die Bindung der Zellen zu unterstützen, wird F12-Medium verwendet, das mit 10 % FBS ergänzt ist, um die Etablierung der Kulturen zu verbessern. FBS fördert jedoch auch die Proliferation von nicht-neuronalen Zellen, einschließlich Fibroblasten. Reduzierte oder serumfreie Medienbedingungen (z. B. F12 nur mit B27 supplementiert) können verwendet werden, um das nicht-neuronale Zellwachstum in der DRG-Kultur und der Krebs-Co-Kultur zu minimieren, können aber das Überleben beeinflussen, insbesondere von dissoziierten Neuronenkulturen. Serumfreie Medien sollten auch bei der Sammlung von DRG-konditionierten Medien in Betracht gezogen werden, um deren Auswirkungen auf das Verhalten von Krebszellen zu bewerten.

2. Vorbereitung von Reagenzien und Materialien für die Dissektion von DRGs (Abbildung 1A)

  1. Autoklavieren Sie chirurgische Instrumente. Sterilisieren Sie das Präpariermikroskop mit 70 % Ethanol und stellen Sie es auf eine Reinbank.
  2. 6-8 mL HBSS-Pen-Strep (Schritt 1.3) auf zwei 10 cm große Kulturplatten geben und auf Eis legen.
    HINWEIS: Diese Platten werden verwendet, um Wirbelsäulen nach der Dissektion zu sammeln. Abhängig von der Anzahl der zu präparierenden Rückenmark können zusätzliche Platten erforderlich sein.
  3. Geben Sie 8-10 mL HBSS-Pen-Strep in ein konisches 15-ml-Röhrchen und legen Sie es auf Eis.
  4. 3 mL HBSS-Pen-Strep auf eine 3 cm große Kulturplatte geben und auf Eis legen.
    HINWEIS: Das in Schritt 2.3 vorbereitete 15-ml-Röhrchen wird zur Entnahme von DRGs für die Dissoziation verwendet, während die 3-cm-Kulturplatte (Schritt 2.4) zur Entnahme von DRGs für das Modell mit ganzer Montierung verwendet wird.

3. Vorbereitung von Reagenzien und Materialien für die DRG-Kultur

HINWEIS: Einige Schritte in diesem Abschnitt erfordern möglicherweise eine Vorbereitung über Nacht. Obwohl jede Art von Gewebekulturplatte für DRG-Kulturen verwendet werden kann, wurden die Volumina und Anweisungen in diesem Protokoll für 8-Well-Glasbodenobjektträger optimiert, was eine optimale Bildgebungsqualität für unsere Analysen lieferte. Bewahren Sie den 8-Well-Glasbodenobjektträger, die Pipettenspitzen und das Matrigel immer auf Eis auf.

  1. Tauen Sie die Matrigel-Lösung vor Gebrauch über Nacht (oder mindestens 3 Stunden) bei 4 °C auf. Achten Sie darauf, dass das Matrigel immer mit Eis bedeckt ist.
  2. Kühlen Sie die Pipettenspitzen und den 8-Well-Glasbodenschieber über Nacht bei -20 °C, um das Anhaften von Matrigel an den Spitzen zu minimieren und eine vorzeitige Polymerisation von Matrigel in der Platte zu verhindern.
  3. Ergänzte Medien (Stufe 1.2) im Wasserbad auf 37 °C erwärmen.

4. Vorbereitung von Reagenzien und Materialien für die dissoziierte DRG-Kultur

  1. Tauen Sie die Papain-Lösung und die Kollagenase IV/Dispase II-Lösung (Schritt 1.1) in einem Wasserbad bei 37 °C auf, bis sie gebrauchsfertig sind.
    HINWEIS: Verwenden Sie für jede präparierte Maus jeweils 1 Aliquot (1 ml) Papain und Kollagenase IV/Dispase II-Lösung.
  2. Warm ergänzte Nährmedien (Schritt 1.2).

5. Entnahme der Wirbelsäule (Abbildung 1B) und Präparierung der DRGs (Abbildung 1C)

  1. Euthanasieren Sie 4-8 Wochen alte Mäuse durch Isofluran-Überdosierung, gefolgt von Gebärmutterhalsluxation. Legen Sie das eingeschläferte Tier auf den Bauch und rasieren Sie sein Fell, wobei Sie sich auf den Bereich über der Wirbelsäule konzentrieren (Abbildung 1B, Schritte 1,2).
  2. Besprühen Sie den Rücken des Tieres mit 70% Ethanol und entfernen Sie loses Fell, wischen Sie es mit Papiertüchern vom Schwanz bis zum Schädel ab, um zu verhindern, dass das Fell die Sektion verunreinigt.
  3. Machen Sie mit einer sterilisierten Schere einen geraden Schnitt entlang der rasierten Rückenfläche, vom Schwanz bis zum Schädel. Ziehen Sie die Haut auf beiden Seiten des Schnitts mit einer stumpfen Pinzette zurück, um die Wirbelsäule freizulegen (Abbildung 1B, Schritt 3).
  4. Nehmen Sie mit einer frischen Pinzette und einer Schere einen horizontalen Schnitt an der Basis (Schwanzende) der Wirbelsäule vor, um eine Kontamination mit Fell zu verhindern (Abbildung 1B, Schritt 4).
  5. Machen Sie zwei parallele Längsschnitte auf jeder Seite der Wirbelsäule, um sie zu lösen. Heben Sie die Wirbelsäule mit einer Pinzette sanft an, um das umgebende Bindegewebe zu entfernen (Abbildung 1B, Schritt 5).
  6. Um die Wirbelsäule vollständig zu lösen, machen Sie einen Schnitt am oberen Ende der Wirbelsäule (proximal zum Schädel). Übertragen Sie die Wirbelsäule auf die vorgekühlten 10-cm-Platten, die HBSS-Pen-Strep auf Eis enthalten (Schritt 2.2) (Abbildung 1C, Schritt 6).
    HINWEIS: Es ist zweckmäßig, alle Wirbelsäulen in derselben 10-cm-Platte zu sammeln und die einzelnen Säulen nacheinander auf eine separate Platte zu verschieben, um weitere Präparierschritte durchzuführen.

6. Präparieren der Spinalganglien (DRGs)

  1. Entfernen Sie mit einer Federschere das restliche Bindegewebe um die Wirbelsäule und legen Sie die Wirbel frei (Abbildung 1C, Schritt 7). Dies ermöglicht eine klarere Visualisierung des Wirbels und erleichtert den Schnitt entlang der Mittellinie. Die abgeschnittenen Säulen in einer frischen, vorgekühlten 10 cm Platte auffangen (Schritt 2.2).
  2. Übertragen Sie das getrimmte Rückenmark nacheinander zur Dissektion auf den Mikroskoptisch. Teilen Sie die Wirbelsäule vorsichtig in der Sagittalebene mit einer Federschere (Abbildung 1D, Schritt 8).
  3. Entfernen Sie mit einer Pinzette mit feiner Spitze das Rückenmark aus der Wirbelsäule und legen Sie die DRGs beidseitig entlang der Wurzeln der Spinalnerven frei (Abbildung 1D, Schritt 9).
    HINWEIS: Bei diesem Schritt ist besondere Vorsicht geboten, da DRGs mit dem Rückenmark entfernt werden können, wenn es zu grob gehandhabt wird.
  4. Schneiden Sie mit einer Federschere die Spinalnerven ab und entfernen Sie das Bindegewebe um die DRGs herum (Abbildung 1D, Schritt 10).
    HINWEIS: Durch das Entfernen von Bindegewebe in diesem Schritt werden Ablagerungen in den DRG-Kulturen minimiert.
  5. Ziehen Sie mit einer feinen Pinzette vorsichtig an der DRG, um sie aus der Rückenwurzel zu ziehen. Für die gesamte Montierungskultur legen Sie die DRGs in die 3-cm-Platte (vorbereitet in Schritt 2.4) (Abbildung 1D, Schritt 11). Die restlichen DRGs werden in einem konischen 15-ml-Röhrchen (vorbereitet in Schritt 2.3) zur Dissoziation zusammengefasst.
    HINWEIS: Bewahren Sie Platten und Röhrchen während des gesamten Präpariervorgangs auf Eis auf.
  6. Wiederholen Sie die Schritte 6.4 bis 6.5, bis alle DRGs extrahiert sind. Wiederholen Sie alle oben genannten Schritte für alle weiteren Wirbelsäulen.
    HINWEIS: Mäuse haben je nach Stamm 30-31 DRG-Paare, was die Entnahme von bis zu 60 DRGs von jedem Tier ermöglicht. Wenn DRGs nur aus dem lumbalen Teil des Rückenmarks entnommen werden, können 10 DRGs extrahiert werden. Die Verwendung von DRGs aus demselben Tier zur Etablierung beider Kulturmodelle reduziert die intraexperimentelle Variabilität und gewährleistet konsistente und vergleichbare Ergebnisse zwischen komplementären Experimenten.
    HINWEIS: Alle Schritte nach der Extraktion der DRGs müssen in einer biologischen Sicherheitswerkbank durchgeführt werden.

7. DRG-Kultur für ganze Halterungen (Abbildung 2)

  1. Pipettieren Sie mit vorgekühlten Spitzen (Schritt 3.2) 2 μl gekühltes Matrigel, um in jeder Vertiefung eines auf Eis gestellten 8-Well-Glasbodenobjektträgers ein Tröpfchen zu bilden (Abbildung 2A, Schritt 1). Um zu verhindern, dass Matrigel vor der Zugabe des DRG vorzeitig polymerisiert, pipettieren Sie jeweils nur ein einzelnes Tröpfchen. Um Kratzer auf der Rutschenoberfläche zu vermeiden, legen Sie die Rutsche in eine 10 cm dicke Platte, bevor Sie sie auf Eis legen.
  2. Übertragen Sie mit einer Pinzette mit feiner Spitze ein DRG auf eine trockene Platte und bewegen Sie es vorsichtig, um überschüssiges HBSS zu entfernen, um eine weitere Verdünnung des Matrigels zu verhindern, wenn das DRG zum Matrigel-Tröpfchen hinzugefügt wird. Übertragen Sie das DRG auf den Matrigel-Tropfen (Abbildung 2A, Schritt 2).
    HINWEIS: Verwenden Sie eine Pinzette mit feiner Spitze, um das DRG vorsichtig in das Matrigel-Tröpfchen zu drücken, und stellen Sie sicher, dass das DRG vollständig eingetaucht und mittig im Tröpfchen positioniert ist.
  3. Wiederholen Sie die Schritte 7.1 bis 7.2 für jedes DRG, das zu einem Matrigel-Tröpfchen hinzugefügt wird.
  4. Inkubieren Sie den 8-Well-Glasbodenobjektträger 5 Minuten lang bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator, damit das Matrigel polymerisieren kann (Abbildung 2A, Schritt 3).
  5. Geben Sie vorsichtig 200 μl warmes supplementiertes Nährmedium in jede Vertiefung und inkubieren Sie bei 37 °C mit 5 % CO2 (Abbildung 2B, Schritt 4). Ersetzen Sie das Medium alle 72 Stunden durch frische, ergänzte Nährmedien.
  6. Überwachen Sie das DRG mit Hilfe der Hellfeldmikroskopie, um seine Lebensfähigkeit und sein neuronales Wachstum alle 24 Stunden zu beurteilen (Abbildung 2C und Abbildung 3).
    ANMERKUNG: Die Lebensfähigkeit kann durch eine Zunahme der Länge und Dichte der Neuriten angezeigt werden. Bilder können im Zeitverlauf aufgenommen werden, um die Entwicklung der DRG-Zellverlängerungen zu demonstrieren (Abbildung 3).

8. Dissoziierte DRG-Kultur (Abbildung 4)

HINWEIS: Jede Multiwell-Platte kann verwendet werden, um die dissoziierten DRG-Neuronen zu säen. In diesem Protokoll wurden jedoch 8-Well-Objektträger mit Glasboden verwendet, da sie eine bessere Zellkonfluenz und Bildgebungsqualität für Immunfluoreszenzanalysen boten.

  1. Überziehen von Kulturplatten mit Kollagen
    1. Eine 50 μg/mL Arbeitslösung aus angesäuertem Kollagen I in sterilem 0,01 M HCl in einer biologischen Sicherheitswerkbank herstellen.
    2. Pipettieren Sie 100 μl Kollagen-I-Lösung in jede Vertiefung des 8-Well-Glasbodens. Kippen und drehen Sie den Objektträger vorsichtig, um sicherzustellen, dass die Kollagenlösung die gesamte Unterseite jeder Vertiefung gleichmäßig bedeckt. Inkubieren Sie den Objektträger bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator für 1 h, um die Polymerisation von Kollagen I zu gewährleisten.
      HINWEIS: Fahren Sie während der Inkubationszeit mit den Schritten 8.2 und 8.3 fort.
    3. Pipettieren Sie nach der Inkubation vorsichtig alle verbleibenden unpolymerisierten Kollagen-I-Lösungen aus jeder Vertiefung ab. Spülen Sie jede gut mit 100 μl PBS aus. Pipettieren Sie überschüssiges PBS ab und hinterlassen Sie eine dünne Restschicht, um ein Austrocknen des Kollagens zu verhindern.
      HINWEIS: Der 8-Well-Glasbodenschieber kann in der biologischen Sicherheitswerkbank verbleiben, bis die dissoziierten DRGs für den Aussaatschritt bereit sind.
  2. Enzymatischer Aufschluss
    1. Das 15-ml-Röhrchen mit den extrahierten DRGs (Schritt 6.5) wird 5 Minuten lang bei 200 × g bei Raumtemperatur vorsichtig zentrifugiert, um die DRGs zu pelletieren. Das HBSS wird vorsichtig mit einer Pipette entfernt.
    2. Spülen Sie die DRGs in vorgewärmten Ergänzungsmedien, klopfen Sie vorsichtig auf das Röhrchen, um sicherzustellen, dass der gesamte Inhalt gewaschen wird, und zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 200 × g , um die DRGs zu pelletieren.
    3. Pipettieren Sie das Medium ab und fügen Sie 1 ml Papain-Lösung hinzu (Abbildung 4A, Schritt 1). Vorsichtig mischen und 20 min bei 37 °C in einem Gewebekultur-Inkubator inkubieren. Schütteln Sie die Tube vorsichtig, um sie alle 5 Minuten zu bewegen.
    4. Nach 20 Minuten fügen Sie 4,5 ml ergänztes Medium hinzu und mischen Sie es vorsichtig, um Papain zu neutralisieren. Das Zentrifugeröhrchen 5 min lang bei 400 × g zentrifugieren, um DRGs zu pelletieren. Den Überstand vorsichtig mit einer Pipette entfernen.
    5. 1 ml Kollagenase IV/Dispase II-Lösung zugeben und 20 Minuten bei 37 °C im Inkubator inkubieren. Schütteln Sie das Röhrchen alle 5 Minuten vorsichtig (Abbildung 4A, Schritt 1).
    6. Nach 20 Minuten fügen Sie 4,5 ml des supplementierten Mediums hinzu und mischen Sie es vorsichtig, um die Kollagenase IV/Dispase II-Lösung zu neutralisieren. Das Zentrifugenröhrchen 5 min lang bei 400 × g zentrifugieren, um DRGs zu pelletieren. Den Überstand vorsichtig mit einer Pipette entfernen.
    7. Fügen Sie 2 ml supplementiertes Medium hinzu und fügen Sie DNase I bis zu einer Endkonzentration von 0,2 mg/ml hinzu. Zu diesem Zeitpunkt sind die DRGs gründlich verdaut und können als loser Klumpen erscheinen (Abbildung 4A, Schritt 2).
  3. Mechanische Dissoziation
    1. Zerreiben Sie das DRG vorsichtig und pipetieren Sie mit einer 1000-μl-Filterpipettenspitze 4-5x auf und ab (Abbildung 4A, Schritt 2).
    2. Führen Sie einen zweiten Verreibungsschritt mit einer 200 μL Pipettenspitze 4-5x durch. Nach diesem Schritt erscheint die Probe trüb mit einigen sichtbaren Gewebeklumpen, die zurückbleiben (Abbildung 4A, Schritt 2).
    3. Filtrieren Sie die Zellsuspension durch ein 70 μm Zellsieb in ein konisches 50 mL Röhrchen. Spülen Sie das Sieb nach und nach mit 10 ml Medien, um eine vollständige Filtration der Zellen durch das Sieb sicherzustellen (Abbildung 4A, Schritt 3).
    4. Zentrifugenröhrchen für 5 min bei 1.000 × g zu Pelletzellen. Entfernen Sie das Medium aus dem Pellet und resuspendieren Sie es in 500 μl ergänztem Medium (Abbildung 4A, Schritt 4).
    5. Entfernen Sie alle PBS-Reste aus den Vertiefungen des 8-Well-Glasbodens. Verteilen Sie die dissoziierte DRG-Suspension zwischen den kollagenbeschichteten Vertiefungen. Inkubieren Sie die Objektträger bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2. Fügen Sie bei Bedarf weitere Medien hinzu und ersetzen Sie sie alle 48 Stunden durch frische, ergänzte Nährmedien (Abbildung 4B, Schritt 5).
      HINWEIS: DRG-dissoziierte Zellen können mit einem Hämozytometer oder einer Zellzählkammer und einer Trypanblau-Färbung gezählt werden, um eine konsistente Anzahl von Zellen pro Vertiefung zu gewährleisten. Für dieses Protokoll wurden etwa 1 × 105 Zellen in jede Vertiefung ausgesät.
    6. Überwachen Sie DRG-abgeleitete Zellen mit Hilfe der Hellfeldmikroskopie, um die Lebensfähigkeit und das Wachstum der Neuronen zu beurteilen (Abbildung 4C und Abbildung 5).
      HINWEIS: Neuronen erscheinen als abgerundete Zellkörper mit definierten Rändern und es kann 24 Stunden oder länger dauern, bis sie haften, während sich nicht-neuronale Zellen typischerweise vor den Neuronen absetzen. Ein gewisser Neuritenauswuchs kann nach 24 Stunden beobachtet werden und nimmt im Laufe der Zeit bis zu 7 Tagen in Kultur zu. Dissoziierte DRG-abgeleitete Zellen und Whole-Mount-DRG werden 72 Stunden lang vorinkubiert, bevor Krebszellen hinzugefügt und Co-Kulturen etabliert werden.

9. Herstellung von Krebszellsuspensionen und Etablierung von Co-Kulturen

HINWEIS: Adhärente Krebszellen vieler Arten können verwendet werden. Wachstumsmedien und Zellzahlen für Co-Kulturen sind abhängig von der Zelllinie. Wir empfehlen Voruntersuchungen vor dem Experiment, um den Zeitpunkt für die Zellentnahme und die optimale Anzahl von Zellaussaaten zu bestimmen. Das hier beschriebene Protokoll basierte auf der Verwendung der humanen Pankreaskarzinomzelllinien PanC1 und MiaPaCa2 sowie der Prostatakrebszelllinie DU-145.

  1. Waschen Sie die Zellen mit serumfreien Medien und trypsinisieren Sie sie ca. 3 min lang mit 2 mL Trypsin/10 cm Platte.
  2. Neutralisieren Sie das Trypsin, indem Sie 6 ml supplementiertes Medium hinzufügen und vorsichtig auf und ab pipettieren, um eine Einzelzellsuspension zu gewährleisten. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und einer Trypanblau-Färbung.
  3. Die Krebszellen werden in einer Konzentration von 2 × 105 Zellen/ml in supplementierten Medien suspendiert (Schritt 1.2).
    HINWEIS: Die optimale Zelldichte kann je nach Zellgröße, Verdopplungszeit und Dauer der Co-Kultur variieren und kann bei Bedarf angepasst werden.
  4. Ganzmount-DRG und Co-Kultur von Krebszellen (Abbildung 6B)
    1. Aspirieren Sie das Medium von der gesamten DRG-Kultur in der 8-Well-Glasbodenführung.
    2. Pipettieren Sie vorsichtig 200 μl der Krebszellsuspension (Schritt 9.3) auf das Matrigel-Tröpfchen, das die gesamte Halterung DRG enthält.
      HINWEIS: Dies gewährleistet eine gleichmäßige Verteilung der Krebszellen um das Tröpfchen herum. Achten Sie darauf, das Matrigel-Tröpfchen nicht mit der Pipettenspitze zu stören.
    3. Inkubieren Sie den Co-Kultur-Objektträger in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO2. Frischen Sie das Medium täglich auf, indem Sie es einmal mit 200 μl erwärmtem supplementiertem Medium waschen und dann 300 μl supplementiertes Medium in jede Vertiefung geben.
      HINWEIS: Saugen Sie das Medium vorsichtig mit einer Pipette ab, um eine Störung der Co-Kultur von DRG-Krebszellen zu vermeiden. Im Laufe der Zeit, wenn die Co-Kulturen komplexer und organisierter werden, werden sie auch anfälliger für Störungen, die sich auf die zellulären Interaktionen und die Integrität der Co-Kultur auswirken können.
    4. Überwachen Sie die Co-Kultur mit einem Hellfeld- oder Fluoreszenzmikroskop in 24-Stunden-Intervallen, um das Verhalten von Krebszellen und die neuronalen Interaktionen zu beurteilen (Abbildung 6B).
      HINWEIS: Die Beobachtungshäufigkeit kann basierend auf dem experimentellen Zeitplan und den interessierenden Zellinteraktionen angepasst werden.
  5. Dissoziierte DRG- und Krebszell-Co-Kultur (Abbildung 6C)
    1. Aspirieren Sie das Medium aus den dissoziierten Kulturen im 8-Well-Objektträger mit Glasboden.
    2. Verteilen Sie vorsichtig 200 μl der Krebszellsuspension (Schritt 9.3) in jede Vertiefung. Befolgen Sie die gleichen Schritte für die Inkubation, Medienaktualisierung und Überwachung wie für Whole-Mount-Cokulturen (Schritte 9.4.3 und 9.4.4).
      HINWEIS: Zur besseren Visualisierung von zellulären Prozessen und Interaktionen zwischen Krebszellen und Neuronen können der Kultur fluoreszierende Zelltracker gemäß dem Protokoll des Herstellers hinzugefügt werden.

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Ergebnisse

Unser Protokoll beschreibt die Isolierung von primären DRG-abgeleiteten Mauszellen und die Etablierung von zwei komplementären Kulturmodellen: dissoziierte DRG- und ganz-montierte DRG-Kulturen, die es uns ermöglichen, Nerven-Krebszell-Interaktionen auf unterschiedlichen Komplexitätsstufen zu untersuchen. Ein wesentlicher Vorteil dieses Protokolls besteht darin, dass beide Arten von Kulturen mit DRGs erzeugt werden können, die aus demselben Tier isoliert wurden, was die Variabilität zwisch...

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Diskussion

Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt verbesserte Methoden zur Etablierung von 2D- und 3D-DRG-Primärnervenkulturen und deren Anwendung in Co-Kultur mit Krebszellen. Dieses Protokoll entwickelt frühere Methoden weiter, indem es die beiden Modelle parallel etabliert. Da 2D- und 3D-Modelle gleichzeitig erstellt werden und Primärnerven verwendet werden, die von denselben Tieren isoliert wurden, wird die Variation zwischen Tieren und zwischen Experimenten minimiert, und die Daten aus bei...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch Betriebskostenzuschüsse der Canadian Institutes for Health Research (PJT-178274) (LMM) und durch ein Ontario Graduate Scholarship (LCBO) sowie durch ein Stipendium der Coordination for the Improvement of Higher Education Personnel - Brazil (CAPES) - Finance Code 001 (ERP) unterstützt. LMM ist der Bracken-Lehrstuhl für Genetik und Molekulare Medizin an der Queen's University. Einige Bilder wurden zum Teil mit Biorender erstellt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Werkzeuge
70 & Mikro; m Cell SiebProgen71-229483-ULTWird zum Filtern der Zellsuspension verwendet
8-Well-Glasboden-ObjektträgerIBidi, München, Deutschland80807
Dumont #5 - Feine PinzetteFine Science Tools, Foster City, USA11254-20
Dumont #5 PinzetteFine Science Tools, Foster City, USA11252-20
Feine SchereFine Science Tools, Foster City, USA91460-11
Muster PinzetteFine Science Tools, Foster City, USA91121-12
FederschereFine Science Tools, Foster City, USA91500-09
Reagenzien
1x Phosphat gepufferte KochsalzlösungSigma, St. Louis, Vereinigte Staaten von AmerikaArtikel-Nr.: D8662-500MLWird zum Auflösen von Enzymen verwendet
B-27 Zuschlag (50x)Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, Vereinigte Staaten von Amerika17504044Verwendung in einer Konzentration von 2 % in F12-Medien
Rinder Typ I KollagenCorning Incorporated, New York, USA354231Wird zum Beschichten von Platten, Arbeitslösung 50 & Mikro; g/mL in 0,01 M HCl
Kollagenase Typ IVSigma-Aldrich, St. Louis, USAC4-BIOCIn PBS bei 1,25 mg/ml auflösen, aliquotieren, bei -20 & deg lagern; C
Dispase IIRoche, Basel, Schweiz4942078001In PBS bei 2,5 mg/ml auflösen, aliquotieren, bei -20 & deg lagern; C
DNase IRoche, Basel, Schweiz.11284932001Zugabe in der Endkonzentration von  0,2 mg/ml während der Dissoziation
Fötales Rinderserum (FBS)Sigma-Aldrich, St. Louis, USANr. F1051Verwendung in einer Konzentration von 10 % in F12-Medien
HBSS (Hank's ausgewogene Salzlösung)Sigma, St. Louis, Vereinigte Staaten von AmerikaH6648-500MLZubereitet mit 1% Penicillin-Streptomycin
Matrigel Wachstumsfaktor reduziertCorning Incorporated, New York, USA356231Tauwetter bei 4 Grad; C über Nacht, auf Eis bleiben
Nährstoffmischung F-12 SchinkenSigma-Aldrich, St. Louis, USANr. N6658-500MLBasalmedium zur Herstellung von supplementierten Nährmedien
PapainRoche, Basel, Schweiz.10108014001In PBS bei 30 U/ml auflösen, aliquotieren, lagern bei -20 μg; C
Penicillin-Streptomycin (100x)Sigma-Aldrich, St. Louis, USANr. P4333-100MLVerwendung in einer Konzentration von 1 % in Medien
Trypanblau-LösungSigma-Aldrich, St. Louis, USAT8154-100MLZur Beurteilung der Lebensfähigkeit von Zellen
TrypLE ExpressThermo Fisher Scientific, Massachusetts, Vereinigte Staaten von Amerika12605-028Für die Entnahme von Krebszellen
Antikörper
β-Tubulin III AntikörperAbcam (Cambridge, Vereinigtes Königreich)AB15568Verdünnung 1:200
Alexa Fluor 488Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, Vereinigte Staaten von AmerikaNr. A-11008Verdünnung 1:2000
Alexa Fluor 594Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, Vereinigte Staaten von AmerikaNr. A-21442Verdünnung 1:2000
Alexa Fluor 647Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, Vereinigte Staaten von AmerikaNr. A-21245Verdünnung 1:2000
NeuN AntikörperSigma-Aldrich, St. Louis, USAMAB377Verdünnung 1:100
Fluoreszierende Farbstoffe & Sonden
ActinGreen 488 ReadyProbes Reagenz (Phalloidin)Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, Vereinigte Staaten von AmerikaNr. R37110Verdünnung 1:40
CellTrace Calcein rot-orangeThermo Fisher Scientific, Massachusetts, Vereinigte Staaten von AmerikaNr. C34851Zell-Tracker zur Visualisierung von Neuronen unter dem Fluoreszenzmikroskop
Hoechst 33342Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, Vereinigte Staaten von AmerikaNr. H3570Verdünnung 1:5000

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