Methodenartikel

High-Plex-Bildgebung mittels spektral-konfokaler Mikroskopie zur Minimierung unspezifischer Gewebefluoreszenz

DOI:

10.3791/68644

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28. Oktober 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1McMaster Immunology Research Centre, Department of Medicine, Faculty of Health Sciences, McMaster University, 2Schroeder Allergy and Immunology Research Institute, Faculty of Health Sciences, McMaster University, 3Carl Zeiss Canada MicroImaging, 4Division of Otolaryngology, Department of Surgery, McMaster University Medical Centre, McMaster University Medical Centre

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Spectral Iterative Bleaching Extends Multiplexity (IBEX) baut auf der Basis-IBEX-Technik auf, indem es Heparin-Blocking hinzufügt, um unspezifische Bindungen zu minimieren, und die spektrale Detektion mit computergestützter Entmischung nutzt, um die Autofluoreszenz zu unterdrücken. Dieser Ansatz beschleunigt die Bildaufnahme bei gleichzeitiger Reduzierung von Hintergrundquellen und ermöglicht robuste mehrstufige räumliche Proteomanalysen mit hohen Parametern.

Zusammenfassung

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Die hochgradig gemultiplexte Bildgebung ermöglicht die Untersuchung funktionell vielfältiger Zellen und ihrer Nischen in ihrer nativen Gewebeumgebung. Iterative Bleaching Extends Multiplexity (IBEX) ist eine zyklische Immunmarkierungs- und Fluorophor-Inaktivierungstechnik, die es ermöglicht, mehrere Marker auf demselben Gewebeschnitt sichtbar zu machen. Die aufgenommenen Bilder können anschließend analysiert werden, um Einzelzelldaten zu erfassen und Zellcluster, ihre Lokalisierungen und benachbarte Zelltypen zu definieren. Die Interpretation dieser Daten beruht auf der Fähigkeit, echte Markerexpressionen von Hintergrundquellen zu unterscheiden, die der Fluoreszenzmikroskopie eigen sind. Spectral IBEX, eine Adaption des IBEX-Protokolls, integriert die spektrale konfokale Detektion mit computergestützter Entmischung und beinhaltet Heparin-Blockierung, um die ladungsbasierte Off-Target-Bindung zu reduzieren. Diese Kombination verbessert das Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis, unterdrückt die Autofluoreszenz des Gewebes, minimiert das Durchscheinen und reduziert gleichzeitig die Erfassungszeit im Vergleich zur herkömmlichen konfokalen Mehrspur-Bildgebung. Die Anwendung auf humanes Nasenpolypengewebe, ein Modell, das sich durch einen hohen Eosinophilengehalt und eine starke Autofluoreszenz auszeichnet, zeigte eine zuverlässige Bildgebung von 26 Markern über Struktur-, Immun- und Zellzustandskompartimente über sechs Bildgebungsrunden. Der daraus resultierende Workflow generiert hochdimensionale, räumlich aufgelöste proteomische Informationen, die komplexe Gewebearchitekturen und zelluläre Nischen erfassen. Zusammen bietet dieser optimierte Ansatz eine robuste und breit anwendbare Strategie für die Multiplex-Bildgebung, die sich besonders für Gewebe eignet, bei denen Autofluoreszenz und unspezifische Färbung herkömmliche Ansätze einschränken.

Einleitung

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Gewebe bestehen aus einer Vielzahl von Zellen mit spezialisierten Funktionen, die sich zu dreidimensionalen Strukturen organisieren und durch Interaktion die biologischen Prozesse koordinieren, die für das Leben notwendig sind. Eine Pathologie entsteht, wenn Störungen der zellulären Zusammensetzung oder der Gewebearchitektur diese Wechselwirkungen beeinträchtigen und die Homöostase des Gewebes beeinträchtigen1. Das Wissen darüber, wie sich die zahlreichen spezialisierten Zelltypen in unserem Gewebe lokalisieren und interagieren, ist erforderlich, um die Biologie zu verstehen, die der menschlichen Gesundheit und Krankheit zugrunde liegt.

Fortschritte bei der Erstellung von Einzelzellprofilierungstechnologien auf transkriptomischer, epigenomischer und proteomischer Ebene haben eine außergewöhnliche Vielfalt an spezialisierten Zelltypen aufgedeckt. 2,3 Technologien wie die Einzelzell-RNA-Sequenzierung und die spektrale Durchflusszytometrie können die Anzahl der Parameter messen, die zur Charakterisierung dieser heterogenen Populationen erforderlich sind. Diesen Ansätzen mangelt es jedoch an räumlicher Information, da Zellen von ihrer nativen Gewebeumgebung in Einzelzellsuspensionen dissoziiert werdenmüssen 4,5. Daher wurden Zelltypen identifiziert, die mit verschiedenen Krankheitskontexten assoziiert sind, aber ihre Wechselwirkungen innerhalb des Gewebes und ihr Beitrag zur Aufrechterhaltung der Krankheit bleiben unklar.

Um einige dieser Einschränkungen zu beheben, wurden mehrere Spatial-Omics-Technologien entwickelt, um die zelluläre Heterogenität innerhalb eines Gewebes zu erfassen und gleichzeitig die Position jeder Zelle zu erhalten6. Zum Beispiel kann die Gentranskription entweder durch Amplifikation von RNA an gerasterten Punkten in einem Gewebeschnitt (z. B. Visium) oder durch die Verwendung von RNA-Hybridisierungssonden gemessen werden, die auf ein Panel spezifischer Gene abzielen, die mit Einzelzellauflösung abgebildet werden (z. B. Xenium)7,8. Diese Methoden sind effektiv, um Transkriptionsmuster und Regulationsmechanismen innerhalb von Geweben zu verfolgen. Transkriptionsprofile korrelieren jedoch oft schlecht mit der Proteinexpression, die die funktionellen Fähigkeiten einer Zelle direkter widerspiegelt9. Die Proteinexpression kann mit spezifischen Antikörpern identifiziert werden, die an Fluorophore konjugiert sind, die mittels Fluoreszenzmikroskopie nachgewiesen werdenkönnen 10,11. Die Verwendung der herkömmlichen Fluoreszenzmikroskopie kann die diskrete Bildgebung von mehr als sechs solcher Antikörper-konjugierten Fluorophore ermöglichen. Die sich überschneidenden Anregungs- und Emissionsprofile dieser Fluorophore führen jedoch zu einer Unsicherheit hinsichtlich des Ursprungs des Fluoreszenzsignals in einem gegebenen Kanal12.

Iterative Bleaching Extends multipleXity (IBEX) ist ein High-Content-Bildgebungsverfahren, das entwickelt wurde, um diese Einschränkung der Fluoreszenzmikroskopie zu überwinden 13,14,15. IBEX verwendet Lithiumborhydrid (LiBH4), um Fluorophore nach der Bildgebung chemisch zu inaktivieren, so dass dieselbe Gewebeprobe vor der erneuten Bildgebung mit einer nachfolgenden Runde von Fluorophor-konjugierten Antikörpern erneut gefärbt werden kann. IBEX bewahrt die Integrität des Gewebes und ermöglicht viele Bildgebungsrunden, um eine theoretisch unbegrenzte Anzahl von Markern auf demselben Gewebeschnitt sichtbar zu machen. Die computergestützte Ausrichtung der aufgenommenen Bilder ermöglicht eine Charakterisierung auf Omics-Ebene mit Einzelzellauflösung unter Beibehaltung räumlicher Daten, um zelluläre Nischen aufzudecken. Diese Daten können auch mutmaßliche zelluläre Wechselwirkungen aufdecken, obwohl diese mit anderen Techniken validiert werden sollten16. IBEX ist eine Open-Source-Methode, die mit kommerziell erhältlichen Fluorophoren kompatibel ist und von einer internationalen Gemeinschaft von Forschern unterstützt wird, die Reagenzien validiert und Daten öffentlich geteilt haben, um die Zugänglichkeit, schnelle Einführung und qualitativ hochwertige Datengenerierung zu fördern17,18.

In dieser Arbeit wurde ein modifiziertes Protokoll von IBEX entwickelt, um zwei große Herausforderungen der Technik zu überwinden: die Gewebeautofluoreszenz und die unspezifische Bindung von Fluorophor-konjugierten Antikörpersonden (zusammenfassend als Hintergrund bezeichnet). Autofluoreszenz tritt auf, wenn die Anregung von fluoreszierenden Molekülen, die endogen zu einem Gewebe gehören, Licht emittiert, das sich mit dem gewünschten Signal überschneidet, das von Antikörper-konjugierten Fluorophoren erhalten wird19,20. Eine Off-Target- oder unspezifische Bindung von Fluorophor-konjugierten Antikörpern führt zu einer Fluoreszenz von Zellen oder Strukturen, die das Zielprotein nicht exprimieren21,22. Diese Artefakte können zu der ungenauen Schlussfolgerung führen, dass eine Zelle einen Marker exprimiert, den sie nicht wirklich exprimiert, was Computeranalysen und eine genaue Zuordnung des Zelltyps erschwert. Durch die Kombination von Heparin-basierter Ladungsneutralisation von Off-Target-Signalen mit vollspektraler Erfassung und rechnerischer Entmischung reduziert spektrales IBEX das Durchbluten deutlich, verbessert das Signal-Hintergrund-Verhältnis (SBR) und halbiert die Erfassungszeit pro Runde.

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Protokoll

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Nasenpolypengewebe, das in dieser Studie verwendet wurde, wurde während einer Nasennebenhöhlenoperation bei Hamilton Health Sciences mit ethischer Genehmigung des Hamilton Integrated Research Ethics Board entnommen. Von allen Teilnehmern wurde eine Einverständniserklärung eingeholt.

1. Probenentnahme

  1. Entnahme von Proben bei routinemäßigen Polypektomien, die bei Patienten mit chronischer Rhinosinusitis durchgeführt werden. Legen Sie die Proben nach der chirurgischen Entnahme für den Transport in ein Fläschchen mit medizinischer Kochsalzlösung auf Eis und bereiten Sie sie sofort für die Bildgebung auf, um die Integrität des Gewebes zu erhalten.

2. Vorbereitung der Reagenzien

  1. Bereiten Sie die Fixierungs- und Permeabilisierungslösung vor, indem Sie die erhaltene Fixier- und Permeabilisierungslösung im Verhältnis 1:4 in PBS verdünnen. Bereiten Sie die Kryokonservierungslösung als 30%ige Saccharose in PBS vor. Bereiten Sie den Verdünnungspuffer als 0,1 % v/v Triton X-100 in PBS vor.
  2. Bereiten Sie das BSA-Blockreagenz als 1 % w/v Rinderserumalbumin in Verdünnungspuffer vor. Bereiten Sie das Heparinblockreagenz als 10KU Heparin-Natriumsalz in 1 ml PBS vor. Bereiten Sie den Blockierungspuffer vor, indem Sie das Heparinblockreagenz (1:50) mit dem Fc-Blockreagenz (1:100) im BSA-Blockreagenz mischen.
  3. Bereiten Sie die Färbemischung als Antikörper vor, der bei geeigneten Verdünnungen in Blockierungspuffer titriert ist. Bereiten Sie die Bleichlösung vor, indem Sie 10 mg LiBH4 in 10 ml Reinstwasser hinzufügen.

3. Gewebeverarbeitung und -vermehrung

  1. Untersuchen Sie das Gewebe unter einem Präpariermikroskop (in der Regel mit ~15-facher Vergrößerung, obwohl dies je nach Probe und Mikroskop variieren kann) und entfernen Sie Fett und Knochen mit einer Pinzette und einem Skalpell. Um das Gewebe bestmöglich zu erhalten, verwenden Sie saubere Instrumente, arbeiten Sie auf einer kalten und nassen Oberfläche und minimieren Sie die Verarbeitungsdauer.
  2. Das grobe Gewebe > 0,5 cm dick mit dem Skalpell in 4-5 mm dicke Scheibengeschnitten 23. Tauchen Sie die Scheiben in Fixier- und Permeabilisierungslösung und drehen Sie sie 16 h lang bei °C.
    HINWEIS: Das Volumen dieser Lösung und der anderen in Schritt 3.3 beschriebenen Lösung sollte ungefähr das 20-fache des Volumens der Probe in einem entsprechend großen Röhrchen betragen.
  3. Bewegen Sie das Tuch in PBS und spülen Sie es 5 Minuten lang. Tauchen Sie das Gewebe in Kryokonservierungslösung und inkubieren Sie es 16 Stunden lang bei °C. Waschen Sie sich nach diesem Schritt nicht mehr, da dadurch wieder Wasser in das Gewebe gelangen würde.

4. Einfrieren von Gewebe

  1. Beschriften Sie eine 6-Well-Platte mit dem Experiment und den Probendetails über jeder Vertiefung und stellen Sie sie mindestens 20 Minuten lang in einen -20 °C-Gefrierschrank.
  2. Füllen Sie eine Kryoform in geeigneter Größe mit der Mischung für optimale Schnitttemperatur (OCT). Vermeiden Sie die Bildung von Blasen im OCT. Ziehen Sie große Blasen mit einer Nadel oder Pipettenspitze an die Ränder des Kryomolds.
    HINWEIS: Ein Kryoguss kann mit Aluminiumfolie hergestellt werden, die um ein kleines Fläschchen oder Röhrchen mit flachem Boden gewickelt ist.
  3. Entfernen Sie das Gewebe aus der Kryokonservierungslösung. Tupfen Sie das Taschentuch vorsichtig auf ein fusselfreies Taschentuch, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, da dies das Einfrieren beeinträchtigen kann.
  4. Füllen Sie ein 250-ml-Becherglas mit ca. 100-150 mL Isopentan in einen Abzug und legen Sie es in eine Schaumstoffbox oder einen Kühler, die teilweise mit flüssigem Stickstoff gefüllt sind.
    HINWEIS: Das Isopentan verdampft, wenn es länger als 2 h offen gelassen wird; Nach dem Öffnen sofort aufbrauchen. Das Isopentan ermöglicht ein gleichmäßiges und schnelles Einfrieren des Gewebes. Das Isopentan kann mit der Zeit langsam gefrieren. Wenn er fest gefriert, nehmen Sie das Becherglas aus dem flüssigen Stickstoff und lassen Sie es auftauen. Das Isopentan kann in eine Glasflasche mit Verschluss gegossen werden, um bis zu 5x wiederverwendet zu werden. Der Gehalt des Isopentans sollte höher sein als der des flüssigen Stickstoffs, um ein Aufschwimmen oder Umkippen des Becherglases zu verhindern.
  5. Passen Sie die Ausrichtung des Gewebes innerhalb des OCT unter einem Dissektionsmikroskop wie gewünscht an.
    HINWEIS: Bei Nasenpolypengeweben richten wir die Probe in der Regel entlang ihrer Längsachse aus, um symmetrische Schnitte zu erhalten, die die größtmögliche Querschnittsfläche erfassen. Konsultieren Sie die Histologiehandbücher für das Gewebe von Interesse, um eine optimale Einbettungsausrichtung zu gewährleisten.
  6. Tauchen Sie den Boden des Kryomolds in das Isopentan. Entfernen Sie das Kryomold aus dem Isopentan, wenn die Mitte des Gewebes vollständig weiß und undurchsichtig ist. Vermeiden Sie es, die Kryoform vollständig einzutauchen; Der Block kann reißen und die Schnittbildung beeinträchtigen.
  7. Nehmen Sie den Block vorsichtig aus der Kryoform, indem Sie Druck auf die Rückseite ausüben, und legen Sie ihn in die vorgekühlte 6-Well-Platte bei -20 °C. Nachdem Sie alle Proben eingefroren haben, stellen Sie die Platte zur Langzeitlagerung in einen -80 °C-Gefrierschrank.
    HINWEIS: Dies ist ein Pausenpunkt. Taschentücher können jahrelang bei -80 °C gelagert werden.

5. Vorbereitung des Objektträgers und Kryoschnitt

  1. Pipettieren Sie 10-1 μl Chrom-Alaun-Gelatinekleber auf Objektträger; Gleichmäßig verteilen und 15 Min. an der Luft trocknen lassen. Für eine optimale Haftung 2x-3x Chrom-Alaun-Gelatinekleber auf die gekammerten Deckgläser auftragen und pro Anwendung 5 μl (insgesamt 15 μl) hinzufügen.
  2. Nach dem Trocknen die Objektträger für 1 h bei 80 °C in den Ofen stellen, um eine vollständige Trocknung zu gewährleisten. Wenn Sie ein Kammer-Deckglas verwenden, lassen Sie es über Nacht bei 37 °C trocknen, da der Kunststoff bei 80 °C schmelzen kann.
    HINWEIS: Sobald die Objektträger beschichtet und getrocknet sind, können sie tagelang bei Raumtemperatur gelagert werden, bis sie verwendet werden. Sie sollten abgedeckt werden, um Staub zu vermeiden.
  3. Übertragen Sie das Gewebe von -80 °C auf -20 °C (oder bei der Schnitttemperatur in den Kryostaten), um es auszugleichen, und kühlen Sie es 1 Stunde lang vor, bevor Sie schneiden. Schneiden Sie 10-2 μm Abschnitte auf einem Kryostaten24.
    1. Wenn Sie in ein gekammertes Deckglas schneiden, nehmen Sie den Abschnitt vorsichtig mit einer Pinzette auf, nachdem Sie die Abrollschutzplatte angehoben haben. Lege es mit einem Pinsel flach auf das Glas in der Kammer. Drücken Sie mit dem Daumen unter die Probe auf der Unterseite des Deckglases, um den Abschnitt auf das Glas zu schmelzen.
  4. Trocknen Sie die Objektträger bei 3 °C für 1 h oder bei Raumtemperatur für 24 h.
    HINWEIS: Wenn die Objektträger sofort verwendet werden, können sie vorübergehend bei Raumtemperatur in einer Objektträgerbox gelagert werden, um sie vor Staub zu schützen, während sie für die Färbung vorbereitet werden. Wenn sie jedoch nicht sofort verwendet werden, lagern Sie sie bei -80 °C, um die Integrität des Gewebes zu erhalten. Dies ist ein Pausenpunkt. Werden Objektträger bei -80 °C gelagert, kann der Vorgang hier pausiert werden.

6. Blockierung und Immunmarkierung von Antikörpern

  1. Zeichnen Sie mit einem PAP-Stift einen Kreis um das Gewebe herum, um eine hydrophobe Barriere zu schaffen, die die Flüssigkeit während des Färbens oder anderer Schritte zurückhält. Zeichnen Sie nicht über das OCT, da die hydrophobe Tinte beim Auflösen des OCT wegwäscht.
    HINWEIS: Dieser Schritt ist für das Kammer-Deckglas nicht erforderlich, da die Wände die Flüssigkeit in der Vertiefung halten.
  2. Geben Sie ~100 μl PBS zu jedem Gewebe und inkubieren Sie es ~2 Minuten lang bei Raumtemperatur, um das Gewebe zu rehydrieren und OCT abzuwaschen. Verwenden Sie ~1 ml PBS für gekammertes Deckglas.
    HINWEIS: Um zu vermeiden, dass sich das Gewebe vom Glas abhebt, pipettieren Sie keine Flüssigkeit direkt auf die Probe.
  3. Aspirieren Sie das PBS und fügen Sie 100 μl des Blockierungspuffers hinzu. Bei Raumtemperatur in einer abgedeckten Feuchtigkeitskammer 1 h inkubieren. Verwenden Sie ~400 μl Blockierungspuffer für gekammertes Deckglas.
  4. Aspirieren Sie den Blockierungspuffer und fügen Sie 100 μl der Färbemischung hinzu. In einer abgedeckten Feuchtigkeitskammer über Nacht im Kühlschrank (4 °C) inkubieren. Verwenden Sie ~400 μL der Färbemischung für gekammertes Deckglas. Bereiten Sie Schnitte vor, die nur mit einem der Fluorophore im Panel gefärbt wurden, und eine Negativkontrolle ohne Färbungen, um das Spektrum der Fluorophore und die Autofluoreszenz des Gewebes zu definieren.
    HINWEIS: Antikörperverdünnungen sollten experimentell optimiert werden, indem eine Titration auf 1:50, 1:100 und 1:200 oder eine andere Verdünnung nach Bedarf vorgenommen wird. Wählen Sie die Mindestmenge an Antikörpern, die das optimale Signal liefert. Streben Sie an, dass die Intensitäten aller Antikörper im Panel in etwa gleich sind, um die Wirksamkeit der spektralen Entmischung zu maximieren. Schützen Sie die Proben vor Licht, das über diesen Schritt hinausgeht, um das Photobleichen von Fluorophoren zu minimieren.
  5. Aspirat-Färbemischung und 3x mit PBS (10 μL, je 2 min) waschen, zwischen jedem Waschgang Flüssigkeit ansaugen. Verwenden Sie ~1 mL PBS für gekammertes Deckglas.
  6. Fügen Sie ~10 μl Eindeckmedium zu jedem Abschnitt hinzu. Pipettieren Sie langsam, um Luftblasen zu vermeiden, die während der Bildgebung optische Aberrationen erzeugen. Saugen Sie alle Blasen, die sich bilden, mit einer Pipette ab. Bei gekammertem Deckglas geben Sie 1 ml Eindeckmedium in jede Vertiefung.
    HINWEIS: Die folgenden Schritte 6.7 und 6.8 sind für das gekammerte Deckglas nicht erforderlich.
  7. Vorsichtig das Deckglas Nr. 1 22 mm x 50 mm auf die Probe legen.
    HINWEIS: Blasenbildung kann minimiert werden, indem ein Ende des Deckglases fest auf das Eindeckmedium gedrückt wird und das Glas auf die Probe fällt, wodurch das Medium gleichmäßig verteilt wird. Die Dicke des Deckglases sollte den Spezifikationen der Objektivlinse entsprechen (z. B. #1,5 Deckglas für die meisten Objektive mit hoher numerischer Apertur). Wenn die Objektivlinse über einen Korrekturring verfügt, stellen Sie sicher, dass er auf die richtige Deckglasgröße eingestellt ist. Die Verwendung der falschen Dicken- oder Krageneinstellung kann zu sphärischen Aberrationen führen und zu verschwommenen oder verzerrten Bildern führen.
  8. Drehen Sie den Schieber um und drücken Sie ihn vorsichtig auf ein fusselfreies Tuch, um überschüssiges Einbettmedium herauszudrücken.
    HINWEIS: Vermeiden Sie es, mit zu viel Kraft auf den Schlitten zu drücken. Übermäßige Krafteinwirkung kann das Gewebe beschädigen oder verformen, was sich auf die Ausrichtung zwischen den Bildgebungsrunden auswirken kann.

7. Mikroskopaufbau und Bildgebung

HINWEIS: Dieses Protokoll bezieht sich speziell auf das ZEISS LSM980 und andere ZEISS Systeme. Diese Schritte können auf anderen Systemen unterschiedlich sein. Es werden zwei Arbeitsabläufe detailliert beschrieben: traditionelle konfokale + Entmischung (Mehrspurerfassung mit rechnerischer spektraler Entmischung nach der Migration), die verwendet werden kann, wenn kein Spektraldetektor verfügbar ist, aber längere Erfassungszeiten und ein gewisses Restdurchscheinen aufweist; und die vollständige spektrale Detektion (Single-Pass, 34-Kanal-Spektralerfassung), unsere bevorzugte Methode, da sie den besten SBR, ein Übersprechen nahe Null und schnellste Bildgebungszeiten bietet.

  1. Traditionelle konfokale Mikroskopie
    1. Schalten Sie das Mikroskopsystem (einschließlich Laser, Detektoren und Computer) ca. 30 Minuten vor der Bildgebung ein.
    2. Wählen Sie auf dem Bildschirm zur Steuerung des Mikroskops, zu dem Sie durch Klicken auf Mikroskop > Objektive gelangen, die entsprechende Objektivlinse (z. B. 20x 0,8 NA) aus und reinigen Sie sie bei Bedarf mit einem objektivsicheren Tuch.
    3. Montieren Sie die Probe sicher auf dem Tisch. Versuchen Sie, die Glas- oder Deckglaskammer an der gleichen Ecke/dem gleichen Ende des Objektträgers auszurichten, um die X-Y-Ausrichtung aufeinanderfolgender Runden zu erleichtern. Dies hängt von der installierten Halterung ab.
    4. Fokussieren Sie die Probe mit den Okularen an der GFP-, YFP- oder RFP-Beleuchtung und wechseln Sie dann auf dem Computerbildschirm zur Registerkarte Erfassung.
      HINWEIS: Verwenden Sie den DAPI-Filter nicht, wenn Sie die Probe mit den Okularen fokussieren, da die Bestrahlung des DAPI-Farbstoffs mit UV-Licht (unter Verwendung des DAPI-Filterwürfels) dazu führt, dass er in ein grün fluoreszierendes Molekül photokonvertiert (Ergänzende Abbildung 1A).
    5. Konfigurieren Sie Bildgebungsspuren, die Überlappungen und Cross-Laser-Anregungen minimieren (Ergänzende Tabelle 1, Ergänzende Tabelle 2 berichtet über Erfassungseinstellungen für herkömmliche konfokale Mikroskopie-Experimente, wie hier gezeigt).
      HINWEIS: Ideale Kombinationen beinhalten unterschiedliche Anregungs- und Emissionsspitzen, wie z. B. DAPI oder AF488 zusammen mit AF594, AF647 oder AF700.
      1. Weisen Sie jeder Spur den/die optimalen Anregungslaser zu. Stellen Sie die Lochblendengröße für jede Spur auf 1 AU oder Airy Unit ein, um eine optimale optische Schnittbildung zu erzielen.
      2. Passen Sie den Erfassungswellenlängenbereich für jeden abstimmbaren Detektor in der Spur separat entsprechend den Fluorophoren für die Spur an.
      3. Passen Sie die Einstellungen für die Laserleistung und die Detektorverstärkung an, um den SBR zu maximieren. Stellen Sie sicher, dass nur sehr wenige Pixel, wenn überhaupt, die maximale Intensität erreichen.
        HINWEIS: Um Photobleaching und/oder eine Überbelichtung der Detektoren zu vermeiden, halten Sie die Laserleistung so gering wie möglich. Optimieren Sie die Antikörperverdünnung, sodass ein starkes Signal über dem Hintergrund erkannt wird.
    6. Drücken Sie die Taste für den kontinuierlichen Scanmodus, um eine Vorschau der Probe anzuzeigen und die Scanparameter (Scangeschwindigkeit, Auflösung und ggf. Mittelwertbildung) einzustellen.
      HINWEIS: Für kleine Kacheln und zur Minimierung des Hintergrunds wird eine Verweilzeit zwischen 0,2 und 0,3 μs mit 1-2 Mittelungsrunden empfohlen. Um die Geschwindigkeit zu maximieren und gleichzeitig die Segmentierung und die Auflösung einer einzelnen Zelle beizubehalten, verwenden Sie die schnellste Scangeschwindigkeit ohne Mittelwertbildung und eine Pixelgröße von 0,2 bis 0 μm/Pixel. Eine Bildgebung mit 2048 x 2048 Pixeln pro Kachel mit einem 20x/0,80 NA-Objektiv ergibt beispielsweise 0,20 μm/Pixel über ein Feld mit 424,26 x 424,2 μm2.
    7. Führen Sie Testscans für jede Spur durch, um sie auf Übersprechen oder Durchscheinen zu überprüfen.
      1. Starten Sie auf dem Objektträger, der mit allen Markern befleckt ist, im kontinuierlichen Scanmodus jeden Laser mit geringer Leistung und heben Sie ihn nur an, bis der Marker ohne Sättigung deutlich sichtbar ist (verwenden Sie den LUT/Sättigungsindikator).
        HINWEIS: Wenn möglich, wird empfohlen, eine replizierte Probe oder einen unerwünschten Bereich zu verwenden, um die Mikroskopeinstellungen zu optimieren, bevor die experimentelle Probe abgebildet wird. Dies ist besonders wichtig bei der Färbung mit DAPI (um das Risiko einer Photokonversion zu vermeiden) oder Fluorophoren, die schnell photobleichen (z. B. PE).
      2. Gehen Sie zur einfach gefärbten Kontrolle für dieses Fluorophor über. Passen Sie die Laserleistung und die Detektorverstärkung so an, dass das Signal hell und ungesättigt ist.
      3. Scannen Sie auf demselben einfach gefärbten Objektträger alle anderen Detektionskanäle. Wenn die Intensität außerhalb des Kanals den Hintergrund übersteigt, verkleinern Sie das Erkennungsfenster und/oder verringern Sie die Anregung/Verstärkung.
      4. 7.1.7.1-7.1.7.2 für jedes Fluorophor wiederholen. Überprüfen Sie nach jeder Anpassung kurz zuvor optimierte Flecken, um die Intensitäten vergleichbar zu halten, insbesondere bei Markern, die kolokalisieren.
    8. Aktivieren Sie die Funktion Kacheln, und definieren Sie einen Kachelerfassungsbereich.
      1. Optimieren Sie den Fokus für den Kachelerfassungsbereich in der Mitte des Gewebes. Suchen Sie ein einzigartiges Merkmal (einen Satz von Zellen in einer bestimmten Anordnung) als Referenz für die Ausrichtung in späteren Runden.
    9. Aktivieren Sie die Z-Stack-Funktion und wechseln Sie zur Registerkarte Z-Stack. Gehen Sie zur Registerkarte Mitte. Legen Sie die Anzahl der Slices im Z-Stapel auf mindestens 6 fest, mit einem Abstand von mindestens 1 μm zwischen den Slices. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Mitte , um den aktuellen Fokuspunkt (bestimmt in Schritt 6.1.8.1) als mittleres Segment des Stapels zu positionieren.
    10. Klicken Sie auf die Schaltfläche Experiment starten , um mit dem Erfassen der Bilder zu beginnen. Speichern Sie die Aufnahmeeinstellungen und sichern Sie die Bilddaten, indem Sie mit der rechten Maustaste auf die Miniaturansicht des Bildes klicken und Speichern unter auswählen. Wählen Sie dann den Dateispeicherort aus und benennen Sie das Bild.
    11. Entmischen Sie das Bild mit den gleichen optimierten Einstellungen wie bei der Erfassung des gekachelten Bereichs, erfassen Sie einen Snap von jedem einfach gefärbten Regler, um das wahre Signalspektrum zu erhalten, und von dem nicht gefärbten Regler, um Hintergrund-/Autofluoreszenz zu erfassen, der in Schritt 6.4 vorbereitet wurde.
      1. Diese Bilder werden für die spektrale Entmischung verwendet. Wählen Sie kein wahres Signal aus gemultiplexten Samples. Bestätigen Sie, dass die ausgewählte Region das Signal wirklich darstellt, indem Sie zunächst sicherstellen, dass die Intensität/Morphologie in der ungefärbten Kontrolle nicht vorhanden ist oder dem Hintergrund entspricht, und dann die erwartete Lokalisation des Markers abgleichen (z. B. Membran vs. Kern vs. zytoplasmatische vs. sekretierte Muster).
      2. Öffnen Sie das Snap-Bild. Klicken Sie auf die Registerkarte Unmixing . Verwenden Sie eines der Tools zur Auswahl von Regionen auf der Registerkarte "Unmix-Tools", um einen ROI um das positive Signal zu zeichnen (ein Spektrum dieser Region wird angezeigt). Wiederholen Sie diesen Vorgang für jedes Schnappbild jedes Fluorophors, um Referenzspektren für die Entmischung zu erstellen.
        1. Vergleichen Sie dieses Spektrum mit dem theoretischen Spektrum des Fluorophors, um sicherzustellen, dass die ausgewählte Region repräsentativ für das wahre Signal ist. Benennen Sie das Spektrum entsprechend jedem Fluorophor und speichern Sie es in der Spektraldatenbank.
          HINWEIS: Ein Spektrum für die Autofluoreszenz kann identifiziert und als separates Fluorophor behandelt werden, um es von anderen Signalen zu entmischen. Nach vollständiger Panel-Optimierung ist die Erfassung neuer Referenzen nicht erforderlich, da die gleichen Einstellungen wiederverwendet werden können, solange das gleiche Protokoll und der gleiche Gewebetyp verwendet werden.
      3. Laden Sie das gekachelte Bild und navigieren Sie zum Werkzeug Entmischung. Verwenden Sie die Taste "+", um die Referenzspektren für jedes Fluorophor zur Entmischungsliste hinzuzufügen, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche "Lineare Entmischung ".
    12. Speichern Sie das ungemischte Bild für eine spätere Analyse.
      HINWEIS: Die Ausgabe ist ein mehrfach gekacheltes Bild mit einem Kanal für jede Markierung. Hier kann das Experiment pausiert werden, bevor es fortgesetzt wird.
    13. Erfassen eines Schattierungsreferenzbildes
      1. Erfassen Sie mit der gleichen Einstellung, die auch für die Abbildung der Probe verwendet wurde, ein Bild eines DAPI-Kalibrierungsobjektträgers. Speichern Sie das Bild, und extrahieren Sie dann nur den DAPI-Kanal, der als Schattierungsreferenz dienen soll. Die Ausgabe ist ein Flatfield-Bild (Ergänzende Abbildung 1B).
        HINWEIS: Es muss nicht für jede Probe ein Referenzbild aufgenommen werden. Solange das gleiche Instrument mit den gleichen Einstellungen verwendet wird, sollte die Referenz dieselbe sein. Diese Referenz ist nicht erforderlich, wenn die erfassten Bilder keine Schattierungsartefakte aufweisen, wie in der ergänzenden Abbildung 1C gezeigt.
  2. Spektralkonfokale Mikroskopie
    1. Schalten Sie das Mikroskopsystem ein (einschließlich Laser, Detektoren und Computer). Wählen Sie das geeignete Objektiv (z. B. 20x 0,8 NA oder ein anderes Objektiv) und reinigen Sie es gegebenenfalls.
    2. Montieren Sie die Probe sicher auf dem Tisch. Stellen Sie sicher, dass das Deckglas zum Ziel zeigt.
    3. Fokussieren Sie die Probe mit Hellfeld oder DIC und wechseln Sie dann in den Fluoreszenzmodus. Konfigurieren Sie die spektrale Erfassung. Die ergänzende Tabelle 3 zeigt die Aufnahmeeinstellungen für spektrale konfokale Mikroskopie-Experimente, die hier gezeigt werden.
      1. Weisen Sie die richtigen Laser zu.
        HINWEIS: Einige Laser können mehrere Fluorophore anregen. Es ist also möglicherweise nicht erforderlich, für jedes Fluorophor einen eindeutigen Laser zu haben.
      2. Wählen Sie einen Strahlteiler, der für die verwendeten Laserlinien geeignet ist. Ermöglichen Sie es allen Detektoren, so viel wie möglich vom Spektrum zu erfassen. Stellen Sie die Lochblendengröße auf 1 AU ein, um eine optimale optische Schnittbildung zu erzielen.
    4. Optimieren Sie die Lasereinstellung
      1. Starten Sie unter Verwendung eines Abschnitts, der mit allen Markern gefärbt ist, den kontinuierlichen Scanmodus mit Lasern mit geringer Leistung. Stimmen Sie die Intensität für jeden Laser ab, bis Marker bei einem guten SBR identifiziert werden können.
        HINWEIS: Dies ermöglicht zwar keine präzise Einstellung für spektral überlappende Fluorophore, trägt jedoch dazu bei, die Anzahl der Male zu minimieren, mit denen die einfach gefärbten Objektträger auf das Mikroskop geschaltet werden müssen.
      2. Verwenden Sie Einzelfärbeabschnitte, um die Laserintensität für jedes Fluorophor fein abzustimmen. Wechseln Sie iterativ von Single-Stain-Abschnitten zurück zu der Sektion mit allen Markern, bis das Signal jedes Markers ohne Übersättigung visualisiert werden kann.
        HINWEIS: Jedes Mal, wenn eine Laserintensitäts- oder Verstärkungseinstellung angepasst wird, überprüfen Sie die zuvor optimierten Einzel-Flecken-Objektträger, um sicherzustellen, dass das Signal optimal bleibt. Für eine optimale Entmischung sollten die Signalintensitätspegel zwischen den Markern so ähnlich wie möglich sein, insbesondere bei Markern, die kolokalisieren. Wenn möglich, wird empfohlen, eine replizierte Probe oder einen unerwünschten Bereich zu verwenden, um die Mikroskopeinstellungen zu optimieren, bevor die experimentelle Probe abgebildet wird. Dies ist besonders wichtig bei der Färbung mit DAPI (um das Risiko einer Photokonversion zu vermeiden) oder Fluorophoren, die schnell photobleichen (z. B. PE).
    5. Führen Sie die Schritte 7.1.8 - 7.1.14 aus.

8. Entfernen des Deckglases (gilt nur für Objektträger, nicht für Kammer-Deckglas)

  1. Tauchen Sie das Objektträger in PBS ein und lassen Sie das Deckglas ablösen. Versuchen Sie nicht, das Deckglas mit Gewalt abzudrücken, da dies das Gewebe verformen und in nachfolgenden Bildgebungsrunden zu Ausrichtungsproblemen oder zu einer vollständigen Ablösung vom Objektträger führen kann. Verwenden Sie einen Behälter, der groß genug ist, um die Rutsche aufzunehmen, und stellen Sie sicher, dass sie vollständig in PBS eingetaucht werden kann.

9. Fluorophorbleiche und Radfahren

  1. Nur für gekammertes Deckglas: Saugen Sie so viel Eindeckmedium wie möglich mit einer Pipette ab und achten Sie darauf, das Gewebe nicht zu beschädigen.
    HINWEIS: Das Kippen der Kammer zur Seite kann die Aspiration erleichtern.
  2. 3x mit ~1 mL (gekammertes Deckglas) oder ~100 μL (Objektträger) PBS für 2 min waschen, bis das Eindeckmedium vollständig entfernt ist.
  3. Bereiten Sie die Bleichlösung im Abzug vor. 10 mg LiBH4 mit einem Mikrospatel direkt in ein trockenes Becherglas wiegen. Vorsichtig 10 ml Reinstwasser direkt in das Becherglas mit LiBH4 geben und mischen, bis es sich vollständig aufgelöst hat, um die Bleichlösung herzustellen.
    HINWEIS: Unmittelbar vor der Anwendung für maximale Reaktivität vorbereiten.
    ACHTUNG: LiBH4 ist hochentflammbar, daher erfordert dieser Schritt äußerste Sorgfalt - stellen Sie sicher, dass der Abzug ordnungsgemäß verwendet wird (d. h. Flügel in geeigneter Höhe, geeignete PSA usw.) und arbeiten Sie nur mit <10 mg LiBH4 auf einmal. Stellen Sie sicher, dass das Becherglas vollständig trocken ist, bevor Sie LiBH4 hinzufügen - andernfalls kann es zu einem Brand kommen.
  4. Geben Sie ~100 μl Bleichlösung mit einer Pasteur-Glaspipette in jeden Gewebeschnitt und inkubieren Sie ihn 15 Minuten lang bei Raumtemperatur im Abzug. Verwenden Sie 2 ml Bleichlösung für Objektträgerkammern.
  5. Wenn BV-Farbstoffe (z. B. BV421, BV510 usw.) gebleicht werden, stellen Sie die Vertiefung vorsichtig in ein Epifluoreszenzmikroskop. Wählen Sie den DAPI-Filter aus, fokussieren Sie das Sample und beleuchten Sie es mit voller Leistung.
    1. Verwenden Sie das 5-fach-Objektiv für ein größeres Beleuchtungsfeld. Senken Sie den Tisch so tief wie möglich ab, um Schäden an den Objektiven und dem Gehäuse zu vermeiden.
  6. Die LiBH4-Lösung mit einer Pasteurpipette aus Glas aus der Vertiefung umfüllen und wieder in das Becherglas mit der LiBH4-Lösung geben.
    HINWEIS: Dies ist jetzt Abfall LiBH4; Die Lösung kann nicht für die zukünftige Verwendung gespeichert werden.
  7. Waschen Sie die Objektträger 3x mit Verdünnungspuffer und inkubieren Sie sie für ~3 min. Das Gesamtvolumen der Objektträger beträgt 2 ml.
  8. Fügen Sie den Antikörpermix hinzu und färben Sie ihn gemäß dem normalen Protokoll (Schritte 6.3 - 6.8).
  9. Geben Sie 2N H2SO4 tropfenweise in den Abfall LiBH4 im Abzug und mischen Sie es regelmäßig.
    ACHTUNG: LiBH4 sprudelt aggressiv. Bei diesen Blasen handelt es sich um H2 -Gas, das aus dem LiBH4 freigesetzt wird; H2 ist sehr entflammbar, seien Sie also bei diesem Schritt äußerst vorsichtig und fügen Sie H2SO4 sehr langsam hinzu.
  10. Gießen Sie es in eine saugfähige Unterlage, wenn die Lösung nicht mehr sprudelt. Spülen Sie das Becherglas mit Reinstwasser aus und gießen Sie es in die saugfähige Unterlage.
    ACHTUNG: Legen Sie die saugfähige Unterlage in einen Beutel für Chemikalien/biologische Gefahren, sichern Sie ihn und entsorgen Sie ihn gemäß den örtlichen Richtlinien zur Chemikalienbelastung.

10. Verarbeitung der Bilder nach der Aufnahme

  1. Öffnen Sie das Referenzbild (aus Schritt 7.1.14) in der Zen-Software, indem Sie auf Datei > Öffnen > Referenzbild auswählen klicken.
    HINWEIS: Die Bildverarbeitungsschritte nach der Aufnahme können alternativ in Open-Source-Softwarepaketen durchgeführt werden. (z. B. ImageJ).
  2. Passen Sie Helligkeit und Kontrast an, um den Dynamikbereich zu optimieren, indem Sie auf Verarbeitung > Intensität > Kontrastdehnung > Automatisch > Anwenden klicken.
  3. Ändern Sie den Pixeltyp in 32-Bit, indem Sie auf Verarbeitung > Bild > Pixeltyp > 32-Bit (Gleitkomma) konvertieren klicken.
  4. Normalisieren Sie das Referenzbild, indem Sie auf Verarbeitungsintensität > > Normalisieren (gesättigte Pixel = 0 %) > Anwenden klicken.
  5. Glätten Sie das Referenzbild, indem Sie auf Verarbeitung > Gaußscher > glätten klicken > den Radius (z. B. 2-5 px) eingeben > anwenden (ergänzende Abbildung 1B).
    HINWEIS: Optimieren Sie den Gaußschen Weichzeichnungsradius, indem Sie andere Werte ausprobieren. Um den richtigen Wert zu ermitteln, dividieren Sie (Process > Image-Rechner) sollte das rohe Referenzbild durch das verarbeitete Bild und das resultierende Bild eine gleichmäßige Intensität haben (alle Pixel ungefähr den gleichen Wert).
  6. Öffnen Sie das zu korrigierende Bild mit mehreren Kacheln, indem Sie auf Datei > Öffnen klicken > Bild mit mehreren Kacheln auswählen.
  7. Wenden Sie die Stitching- und Schattierungskorrektur anhand der verarbeiteten Referenz an, indem Sie mit den folgenden Parametern auf Verarbeitung > Stitching klicken.
    1. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen für die Überblendung. Aktivieren Sie das richtige Schattierungsfeld und wählen Sie aus dem Dropdown-Menü das bearbeitete Referenzbild aus (Schritt 10.5). Alle anderen Parameter bleiben gleich.
      HINWEIS: Die Parameter müssen möglicherweise angepasst werden, um die besten Ergebnisse zu erzielen.
    2. Wählen Sie im Menü Eingabe/Ausgabe das mehrfach gekachelte Bild als Eingabe und die Schattierungsreferenz als Referenz aus.
    3. Drücken Sie oben auf die Schaltfläche Anwenden , und es wird ein neues Bild mit korrigiertem Stitching und Schattierung erzeugt (Ergänzende Abbildung 1D).
      HINWEIS: Eine Stitching-Korrektur (Ergänzende Abbildung 1I-J) ist erforderlich, um die Genauigkeit der Bildausrichtung im späteren Verlauf des Prozesses zu gewährleisten.
    4. Speichern Sie das korrigierte Bild, indem Sie auf Datei > Speichern > Ordner auswählen klicken.

11. Bildausrichtung

  1. Konvertieren Sie die verarbeiteten Bilder aus dem Format, in dem sie vorliegen (.czs, .tif usw.) in das Imaris-Format mit dem Imaris File Converter Tool.
    HINWEIS: Das Tool kann heruntergeladen und installiert werden, indem Sie den Anweisungen auf dieser Website folgen (https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial#file-converter).
  2. Starten Sie das Registrierungstool für die Imaris-Erweiterungen, um die Bilder aus allen Runden in einem Bild mit allen Kanälen zu registrieren (auszurichten).
    HINWEIS: Um das Tool zu installieren und die Bilder erfolgreich auszurichten, befolgen Sie die Anweisungen auf der folgenden Website (https://github.com/niaid/imaris_extensions).
  3. Klicken Sie auf die Schaltfläche Imaris Extensions . Wählen Sie SimpleITK Utilities > Kanaleinstellungen in CSV exportieren.
  4. Klicken Sie auf Durchsuchen, navigieren Sie zu einem IMS-Bild (aus einer der Runden), wählen Sie es aus und klicken Sie auf Öffnen.
  5. Klicken Sie auf Exportieren und wählen Sie einen Speicherort für die CSV-Datei aus. Geben Sie einen Namen ein und klicken Sie auf Speichern.
  6. Öffnen Sie die gespeicherte CSV-Datei und überprüfen Sie, ob die Kanalnamen korrekt sind. Bearbeiten Sie bei Bedarf.
  7. Wenn Änderungen vorgenommen werden, gehen Sie zu Imaris Extensions > SimpleITK Utilities > Batch Configure Channel Settings.
    HINWEIS: Dieser Schritt ist nicht erforderlich, wenn im vorherigen Schritt keine Änderungen vorgenommen wurden.
  8. Klicken Sie auf Durchsuchen, navigieren Sie zur CSV-Datei, wählen Sie sie aus und klicken Sie auf Öffnen. Klicken Sie auf Weiter und dann erneut auf Durchsuchen , um dasselbe IMS-Bild auszuwählen, und klicken Sie auf Öffnen.
  9. Klicken Sie auf Konfigurieren , um die Änderungen zu übernehmen. Wiederholen Sie die Schritte 11.3-11.8 für alle Bilder aus verschiedenen Runden.
  10. Nachdem die Kanäle korrekt benannt sind, gehen Sie zu Imaris Extensions > SimpleITK Algorithms > Affine Registration of Z-Stacks Using a Common Channel.
  11. Klicken Sie auf Durchsuchen, navigieren Sie zu dem Ordner mit allen Runden, wählen Sie alle Bilder aus und klicken Sie auf Öffnen.
  12. Klicken Sie auf Weiter, wählen Sie den Registrierungskanal (Passermarkenkanal) aus. Für dieses Protokoll wurde der DAPI-Kanal verwendet. Wählen Sie dann das fixierte Bild aus.
    HINWEIS: Wählen Sie einen Kanal/Marker, der über Runden konstant bleibt und beständig gegen chemisches oder Photobleichen ist (z. B. nukleare Farbstoffe wie DAPI). Wählen Sie dann das fixierte Bild aus.
  13. Klicken Sie auf Erweiterte Registrierungseinstellungen, aktivieren Sie alle Kontrollkästchen außer "Automatische Maske" und legen Sie das Gaußsche Glättungs-Sigma auf 5.0 fest.
  14. Klicken Sie auf Fertig und dann auf Registrieren , um die Ausrichtung durchzuführen. Sobald die Registrierung abgeschlossen ist, klicken Sie auf Neu berechnen und kombiniertes Bild speichern.
  15. Wählen Sie nach der Neuabtastung den Passermarkenkanal aus und klicken Sie auf Korrelation berechnen. Zu den Ausgabedateien gehören ein ausgerichtetes output.ims-Bild, zwei PDFs, die die Ausrichtungsqualität vor und nach der Registrierung anzeigen, eine JSON-Datei mit den für die Registrierung verwendeten Einstellungen und eine TXT-Datei mit dem Protokoll des gesamten Prozesses.

12. Bildausrichtung

  1. Segmentieren von Zellen/Objekten mit CellPose (v2.5)25
  2. Generieren Sie für jeden Einzelfleckendatensatz eine Segmentierungsmaske aus dem eigenen Detektionskanal des Markers (Beispiel: Generieren Sie für den CD20-Einzelfleck die Maske aus dem Detektionskanal AF488 (dem vorgesehenen Kanal für CD20)).
  3. Wenden Sie die Segmentierungsmaske aus Schritt 2 auf jeden Kanal im selben Datensatz an (Im CD20-Beispiel wird die von AF488 abgeleitete Maske auf AF488 angewendet, um das wahre Signal zu messen, und auf alle anderen Detektionskanäle, um das Durchscheinen zu messen).
  4. Extrahieren Sie Intensitäten und Bereiche pro Objekt in Python mit scikit-image (regionprops_table) und NumPy.
  5. Signal-Hintergrund-Verhältnis (SBR)
    1. Berechnen Sie die mittlere Objektintensität über alle segmentierten ROIs im beabsichtigten Erkennungskanal des Markers.
    2. Definieren Sie die Hintergrundintensität als die mittlere Intensität aller Pixel außerhalb der ROIs im selben Sichtfeld, mit Ausnahme von Nullwert-Padding oder Pixeln außerhalb des Grenzens.
      Berechnen Sie SBR als:
      figure-protocol-1
    3. Visualisieren Sie SBR-Verteilungen mit Violinplots, die die Werte pro Objekt als Punkte (oder Werte pro Feld, sofern angegeben) anzeigen.
  6. Quantifizierung des Durchschlagens
    1. Berechnen Sie für jeden nicht beabsichtigten Kanal das Durchscheinen (%) mit den gleichen ROIs aus der Maske in Schritt 12.2:
      figure-protocol-2
    2. HINWEIS: Die diagonalen Einträge entsprechen 100 %, da im vorgesehenen Kanal eines Einzelfleckenbildes Zähler und Nenner identisch sind (echtes Markersignal, gemessen in einem eigenen Kanal).

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zwei grundlegende Herausforderungen für Immunfluoreszenz-Bildgebungsverfahren sind die unspezifische Bindung von Fluorophor-konjugierten Antikörpersonden und die Autofluoreszenz des Gewebes. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um ein echtes Signal vom Hintergrund zu unterscheiden, um Multiplex-Immunfluoreszenztechniken zu optimieren.

Die Heparinblockierung reduziert die unspezifische Fluo...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spectral IBEX, eine Adaption des IBEX-Protokolls, adressiert erfolgreich zwei Schlüsselprobleme in der Immunfluoreszenzbildgebung: unspezifische Bindung und Autofluoreszenz. Die Behandlung von stark eosinophilen Geweben mit Heparin und die Verwendung von spektraler Entmischung zur Eliminierung von Autofluoreszenz und spektraler Überlappung zwischen den Kanälen erhöhten die Detektion des wahren Signals über dem Hintergrund erheblich. Die Erfassung aller Marker in einem einzigen Durchgang ...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

JFEK und MJ erhalten eine Finanzierung von ALK Abello A/S. JFEK erhält Beratungshonorare von Merida Biosciences.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken Dr. Andrea Radtke und Ziv Yaniv für ihre Unterstützung beim Onboarding und bei der Iteration von IBEX. Wir danken Dr. João Bronze de Firmino und Dr. Mouhanad Babi für die Unterstützung und Fehlerbehebung bei der Mikroskopie sowie dem Centre for Advanced Light Microscopy an der McMaster University für den Zugang zu ihren Mikroskopen. Wir danken Tina Walker, Jianping Wen und Rangana Talpe Guruge für den technischen Support. Diese Arbeit wird durch einen von Experten begutachteten Food Allergy Research Grant unterstützt, der gemeinsam vom CIHR Institute of Infection and Immunity (CIHR-III), CIHR Institute of Circulatory and Respiratory Health (CIHR-ICRH) und der Canadian Allergy, Asthma and Immunology Foundation (CAAIF) finanziert wird. Diese Arbeit wurde von den Canadian Institutes of Health Research (PJT-198169; JFEK), J.P. Bickell Foundation Medical Research Grant (JFEK), Canadian Allergy Asthma and Immunology Foundation (JFEK, MJ), Canadian Society of Allergy and Clinical Immunology (VO, MJ), Schroeder Foundation (JFEK, SW, MJ), Food Allergy Canada (JFEK, SW, MJ), ALK Abello A/S (JFEK, MJ), Zych Family (SW, MJ), Buckrell Family (JFEK), Ontario Graduate Scholarship (SD) und das Bachelor of Health Sciences Program an der McMaster University (VO).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2N-Schwefelsäure (H2SO4)-LösungN/AN/AWas auch immer im Labor verfügbar oder verwendet wird
500-mL-BecherN/AN/AWas auch immer im Labor verfügbar oder verwendet wird
6-Well-PlatteN/AN/AWas auch immer im Labor verfügbar oder verwendet wird
Bcl-6 - Alexa Fluor 647BD Biosciences561525Verdünnungsfaktor 1:100
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization KitBD Biosciences554722
Tisch-SektionsmikroskopN/AN/AWas auch immer im Labor verfügbar oder verwendet wird
Rinderserum-Albumin (BSA)SIGMA-ALDRICHA4503
CD11c - Alexa Fluor 700BD Biosciences561352Verdünnungsfaktor 1:100
CD138/Syndecan-1 - PEBioLegend356503Verdünnungsfaktor 1:200
CD20 - Alexa Fluor 488Invitrogen53020282Verdünnungsfaktor 1:100
CD21 - Alexa Fluor 532NovusBioNBP2-60733AF532Verdünnungsfaktor 1:100
CD23 - PEBioLegend338507Verdünnungsfaktor 1:200
CD3 - iFluor 594AAT Bioquest100320C0Verdünnungsfaktor 1:100
CD31 - Alexa Fluor 700BioLegend303134Verdünnungsfaktor 1:100
CD34 - iFluor 594AAT Bioquest103400C0Verdünnungsfaktor 1:100
CD38 - Alexa Fluor 700BioLegend303523Verdünnungsfaktor 1:100
CD4 - Alexa Fluor 647BioLegend300520Verdünnungsfaktor 1:100
CD45 - Alexa Fluor 532ThermoFisher Scientific58045942Verdünnungsfaktor 1:100
CD54/ICAM-1 - Alexa Fluor 647BioLegend353113Verdünnungsfaktor 1:100
Chrom-Alum-Gelatine-KlebstoffNeuankömmling-Versorgung1033A
CryomoldFisher Scientific NC9511236Außerdem Katalognummer 50-465-347 für größere Samples
DAPI-KalibrierungsfolieAgar ScientificAG2273
DAPI-Lösung, 1 mg/mLThermoFisher Scientific62248Verdünnungsfaktor 1:3000
E-Cadherin/CD324 - Alexa Fluor 647BioLegend147307Verdünnungsfaktor 1:100
EpCAM/CD326 - Alexa Fluor 594BioLegend324228Verdünnungsfaktor 1:100
Eppendorf/FalkenröhrenN/AN/AWas auch immer im Labor verfügbar oder verwendet wird
Fluoromount-GSouthernBiotech0100-01
PinzetteN/AN/AWas auch immer im Labor verfügbar oder verwendet wird
FoxP3 - eFluor 660ThermoFisher Scientific50577382Verdünnungsfaktor 1:100
Objektträger mit frostigen EndenChemiewissenschaftGEW45-2575-W
GL7 - Alexa Fluor 488ThermoFisher Scientific53590282Verdünnungsfaktor 1:100
HeparinnatriumsalzSIGMA-ALDRICHH339310KU
HLA-DR – PENovusBioNB100-77855PEVerdünnungsfaktor 1:200
Humanes TruStain FcX (Fc-Rezeptor-Blockierlösung)BioLegend422302Verdünnungsfaktor 1:100
FeuchtigkeitskammerN/AN/AWas auch immer im Labor verfügbar oder verwendet wird
Eiskübel mit DeckelN/AN/AWas auch immer im Labor verfügbar oder verwendet wird
IgD - Alexa Fluor 488BioLegend348215Verdünnungsfaktor 1:100
IL4Ra/CD124 - PEBioLegend144803Verdünnungsfaktor 1:200
Imaris-DateikonverterOXFORD-InstrumenteN/AUmstellung eines beliebigen Bilddateiformats auf .ims-Format (https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial#file-converter)
Isopentan (2-Methylbutan)N/AN/AWas auch immer im Labor verfügbar oder verwendet wird
Ki-67 - Alexa Fluor 488BD Biosciences558616Verdünnungsfaktor 1:100
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Sensitive Task Wischer, einlagigKimtech-Wissenschaft06-666
Große (d. h. 25 cm lange) PinzettenN/AN/AWas auch immer im Labor verfügbar oder verwendet wird
Flüssiger StickstoffN/AN/AWas auch immer im Labor verfügbar oder verwendet wird
Lithiumborhydrid (LiBH4)SIGMA-ALDRICH222356
MECA-79 – Alexa Fluor 488Invitrogen53603680Verdünnungsfaktor 1:100
Mikroskop-Objektträger-Deckglas Nr. 1 22x50 mmFisher Scientific 12-542A
Milli-Q-WasserN/AN/AWas auch immer im Labor verfügbar oder verwendet wird
MUC2 - Alexa Fluor 488NovusBioNB120-11197AF488Verdünnungsfaktor 1:100
Nunc Lab-Tek KammerdeckglasThermoFisher Scientific155380
PAP-StiftabcamAB2601
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) LösungN/AN/AWas auch immer im Labor verfügbar oder verwendet wird
SkalpellN/AN/AWas auch immer im Labor verfügbar oder verwendet wird
SimpleITK Imaris-ErweiterungenN/AN/ASoftware, die verwendet wird, um Bilder aus verschiedenen Runden auszurichten (https://github.com/niaid/imaris_extensions)
SucroseSIGMA-ALDRICHS0389
Tissue-Tek O.C.T.-CompoundSakura Finetek USA4583
Triton X-100SIGMA-ALDRICHX100
Zeiss LSM 980ZEISS-MikroskopieN/ADas in dieser Studie verwendete Bildgebungssystem
Zen BlueZEISS-MikroskopieN/ADie für die Nachbearbeitung verwendete Bildverarbeitung

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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