Induktion gezielter milder Hyperthermie in murinen Tumormodellen durch photothermische Umwandlung von Nahinfrarotlicht durch intratumorale Gold-Nanostäbchen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt Techniken und Methoden vor, die für eine gezielte hyperthermische Therapie in soliden Tumormodellen erforderlich sind. Der Ansatz nutzt die photothermische Umwandlung von Nahinfrarotlicht durch intratumoral injizierte Goldnanostäbchen, um eine lokale Erwärmung innerhalb der Tumormikroumgebung zu induzieren.

Zusammenfassung

Milde Hyperthermie (42-48 °C) ist eine gut etablierte therapeutische Modalität, die einen kontrollierten Zelltod von Tumoren induzieren und Immunantworten gegen Krebs stimulieren kann. Die präzise Wärmeabgabe an das Tumorgewebe bei gleichzeitiger Schonung des umgebenden gesunden Gewebes bleibt jedoch eine große Herausforderung. Traditionelle Hyperthermiemethoden, wie z. B. die isolierte Perfusion der Gliedmaßen, erfordern komplexe, invasive Verfahren und bergen ein erhebliches Risiko für lokale Toxizität und Morbidität des Patienten. Im Gegensatz dazu hat sich die photothermische Therapie mit Goldnanopartikeln, die durch Nahinfrarotlicht (NIR) aktiviert werden, als vielversprechende, weniger invasive Strategie zur Erzielung einer lokalisierten Hyperthermie erwiesen. Insbesondere Gold-Nanostäbchen (GNRs) weisen einstellbare optische Eigenschaften und einen hohen photothermischen Umwandlungswirkungsgrad auf, was sie zu idealen Kandidaten für die präzise thermische Modulation von Tumorstellen macht. Obwohl sich diese Technik als vielversprechend erwiesen hat, insbesondere bei oberflächlichen und zugänglichen Tumoren, bleiben die reproduzierbare Verabreichung, die räumliche Begrenzung und die Sicherheit aktive Verfeinerungsbereiche. In diesem Protokoll stellen wir unsere validierte und optimierte Methode zur Erzielung einer lokalisierten, milden Hyperthermie durch intratumorale Injektion biokompatibler GNRs vor, gefolgt von einer kurzzeitigen, gezielten NIR-Laserexposition. Dieser Ansatz ermöglicht eine schnelle, kontrollierbare Erwärmung im therapeutischen Bereich, fördert den immunogenen Zelltod von Tumoren und stimuliert die angeborene Immunantwort, Mechanismen, die besonders für immunologisch "kalte" Tumoren relevant sind. Die Echtzeit-Temperaturüberwachung und die lokale Bereitstellung gewährleisten Reproduzierbarkeit, Sicherheit und minimale systemische Exposition. Dieses optimierte Protokoll bietet eine robuste und zugängliche Plattform für präklinische Studien und unterstützt breitere Bemühungen, die milde Hyperthermie in der Krebsimmuntherapie zu nutzen.

Einleitung

Bei der Krebsbehandlung gibt es nach wie vor erhebliche Herausforderungen, darunter Arzneimittelresistenz, Immunevasion und Off-Target-Toxizität, die alle den langfristigen Erfolg konventioneller Therapien untergraben. Diese Einschränkungen haben die Entwicklung komplementärer therapeutischer Strategien vorangetrieben, die darauf abzielen, Resistenzmechanismen zu überwinden und gleichzeitig Kollateralschäden an gesundem Gewebe zu minimieren. Die milde Hyperthermie, definiert als die Erhöhung der Gewebetemperatur auf 42-48 °C, ist seit langem als wirksame Ergänzung zu Standard-Krebstherapien anerkannt¹. In der Vergangenheit wurde die milde Hyperthermie in Kombination mit Operationen, Chemotherapien oder Strahlentherapien eingesetzt, um die Wirksamkeit dieser Therapien zu verbessern, indem sie die Tumorperfusion erhöhte, die Stromaarchitektur störte und bösartige Zellen für zytotoxische Wirkstoffe sensibilisierte¹. In jüngster Zeit, mit dem zunehmenden Erfolg der Immuntherapie in der Onkologie, besteht ein wachsendes Interesse daran, das inhärente immunmodulatorische Potenzial der milden Hyperthermie zu nutzen, um die Immunantwort gegen Tumore zu verbessern ^1,2,3.

Trotz des nachgewiesenen klinischen Nutzens ist die breitere Anwendung der Tumorhyperthermie nach wie vor begrenzt, da es schwierig ist, eine lokale, kontrollierbare und reproduzierbare Erwärmung von Tumoren zu erreichen und gleichzeitig eine Schädigung des Gewebes außerhalb des Ziels^{zu vermeiden 4}. Aktuelle klinische und experimentelle Hyperthermietechniken, wie z. B. die regionale Perfusion der Gliedmaßen oder systemisch verabreichte Nanopartikel-basierte Ansätze, leiden oft unter einer begrenzten räumlichen Präzision, einer variablen Tumoraufnahme und dem Potenzial für systemische Toxizität 2,5,6,7,8,9 . Die gezielte hyperthermische Therapie ist eine aufstrebende Modalität in diesem Bereich der Krebsbehandlung, die darauf abzielt, die Tumortemperaturen selektiv zu erhöhen und gleichzeitig die Schädigung des umgebenden gesunden Gewebes zu minimieren. Genauer gesagt ist die gezielte Verabreichung von Gold-Nanostäbchen (GNRs) eine vielversprechende Methode, um die derzeitigen Einschränkungen der Präzision und Toxizität milder Tumorhyperthermie zu überwinden. GNRs eignen sich aufgrund ihrer einstellbaren Oberflächenplasmonenresonanz im NIR-Bereich, ihrer hohen photothermischen Umwandlungseffizienz und ihrer günstigen Bioverteilungsprofile im Vergleich zu anderen Goldnanostrukturen besonders gut für photothermische Anwendungen^10,11. Ihre Reaktionsfähigkeit auf NIR-Wellenlängen ermöglicht eine effiziente Lichtabsorption und eine lokale Erwärmung auch in tieferen Geweben bei minimaler Schädigung der umgebenden Strukturen. Auf diese Weise können GNRs eine verbesserte Wirksamkeit, Zielgenauigkeit und Sicherheit bei hyperthermischen Therapien bieten.

Ziel dieser Methode ist es, ein hocheffizientes, ressourcenschonendes und reproduzierbares Protokoll zur Erzielung einer milden, Gold-Nanostäbchen-vermittelten Hyperthermie in soliden Tumoren bereitzustellen. Diese Technik, die als GNR-vermittelte zielgerichtete Hyperthermietherapie (THT) bezeichnet wird, überwindet die wichtigsten Einschränkungen herkömmlicher Hyperthermieansätze, indem sie die direkte intratumorale GNR-Injektion mit der Aktivierung von externem NIR-Licht kombiniert. Dies gewährleistet eine hohe lokale Nanopartikelkonzentration und verbessert die Reproduzierbarkeit und Sicherheit, insbesondere bei kleinen oder schlecht vaskularisierten Tumoren, die systemisch verabreichte Wirkstoffe möglicherweise nicht effizient akkumulieren. Darüber hinaus gewährleistet die direkte intratumorale Injektion von GNRs, gefolgt von der Exposition gegenüber Nahinfrarotlicht (NIR), eine präzise, kontrollierte und lokalisierte Erwärmung von Tumoren bei gleichzeitiger Minimierung der systemischen Exposition, Toxizität und Off-Target-Effekte, die mit herkömmlichen regionalen Hyperthermietechniken verbunden sind.

Viele Krebsarten weisen komplexe und vielfältige Mechanismen der Immunflucht auf, die es ihnen ermöglichen, der Immuntherapie auf verschiedene Weise zu widerstehen, am offensichtlichsten durch eine schlechte Infiltration der Immunzellen in der Mikroumgebung des Tumors ^2,4,5. Die milde Hyperthermie bietet eine synergistische Lösung, wenn sie in Kombination mit Immuntherapien eingesetzt wird. Zusätzlich zu den direkten zytotoxischen Effekten induziert die milde Hyperthermie bevorzugt den immunogenen Zelltod (ICD), der zur Freisetzung von tumorassoziierten Antigenen (TAAs) und schadensassoziierten molekularen Mustern (DAMPs^{) führt1,2}. Diese Signale aktivieren die angeborenen Immunwege, verbessern die Präsentation von Tumorantigenen, fördern die Reifung dendritischer Zellen und verbessern das T-Zell-Priming, wodurch letztendlich die Infiltration von Immunzellen in die Mikroumgebung des Tumors erhöht^{wird 1,6,12}. In unseren eigenen präklinischen Modellen funktionierte diese GNR-vermittelte THT-Technik, um lokale Immunantworten zu aktivieren und die Immuninfiltration des Tumors zu verstärken¹³. In Kombination mit einer intratumoralen Interleukin-2 (IL-2)-Therapie oder einer systemischen Anti-PD1-Checkpoint-Hemmung verbesserte diese GNR-vermittelte THT-Technik die Anti-Tumor-Immunität weiter und übertraf die Monotherapie allein bei Brustkrebs- und Melanommodellen¹³. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit einer wachsenden Zahl von Beweisen, die die Synergie zwischen Nanopartikel-vermittelter Hyperthermie und Immuntherapie bei soliden Tumoren, einschließlich Brustkrebs 14,15,16 und Hirntumoren^17,18, unterstützen. Kurz gesagt, durch die Umwandlung immunologisch "kalter" Tumoren in "heiße" Tumoren kann GNR-vermitteltes THT das Ansprechen auf Immuntherapien, einschließlich Checkpoint-Inhibitoren, verbessern ^1,2,12.

Das hier vorgestellte GNR-vermittelte THT-Protokoll ist ressourcenarm, technisch unkompliziert und weitgehend an subkutane oder oberflächliche Tumoren anpassbar. Diese Technik eignet sich besonders für Forscher, die mit Mausmodellen von subkutanen oder oberflächlichen Tumoren, einschließlich Melanom und Brustkrebs, arbeiten. Mit geringfügigen Modifikationen kann es jedoch auf andere Tumorarten und anatomische Lokalisationen ausgedehnt werden. Darüber hinaus bietet diese Technik eine vielseitige Plattform für die Integration räumlich kontrollierter Hyperthermie in präklinische Krebsstudien, insbesondere in solche, die immuntherapieverbessernde Strategien untersuchen und die Milde Hyperthermie erforschen, um das Ansprechen auf Immuntherapien zu verbessern oder Resistenzen gegen Immuntherapien zu überwinden. Darüber hinaus sind das Wissen und die Ausrüstung, die für die Implementierung dieser Technik erforderlich sind, für eine Vielzahl von Gesundheitseinrichtungen zugänglich und anpassbar, was ihre Machbarkeit in einer breiteren klinischen Anwendung verbessert³.

In diesem Manuskript geben wir eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Implementierung unseres GNR-vermittelten THT-Protokolls in Mausmodellen mit einem NIR-Lasersystem, das bei 860 nm arbeitet. Der Erfolg dieses Protokolls hängt von der effizienten Aktivierung von Gold-Nanostäbchen im Tiefengewebe unter Verwendung der geeigneten Wellenlänge des nahen Infrarotlichts ab. Wir beleuchten auch verfahrenstechnische Überlegungen zur Erzielung einer konsistenten, sicheren und effektiven milden hyperthermischen Dosierung in murinen Tumormodellen, wie z. B. eine genaue Echtzeitüberwachung der internen Tumortemperatur während des gesamten Eingriffs. Diese Methode baut auf den bisher berichteten Nanopartikel-Hyperthermie-Ansätzen auf und führt diese zusammen, um eine umfassende, validierte, hochpräzise und reproduzierbare Alternative für die präklinische Krebsforschung zu bieten. Insgesamt bietet dieses Protokoll eine biologisch sichere, kostengünstige und geringe Toxizitätsmethode für die Verabreichung von tumorlokalisierter Hyperthermie mit großem Potenzial, die Wirksamkeit bestehender Krebsimmuntherapien zu verbessern und den klinischen Nutzen der Hyperthermie in der Onkologie zu erweitern.

Protokoll

Alle Versuchsprotokolle wurden vom University Committee on Laboratory Animals an der Dalhousie University nach den Richtlinien der ethischen Standards des Canadian Council on Animal Care genehmigt. Alle geltenden internationalen, nationalen und institutionellen Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Tieren wurden befolgt. In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, die in diesem Protokoll verwendet werden.

1. Anforderungen an Laser- und Behandlungsanlagen

1. Sichern Sie sich den Zugang zu einem vollständig kalibrierten Lasersystem, das Licht mit einer Wellenlänge von 860 ± 10 nm und einer Intensität von bis zu 4.000 mA liefern kann. Stellen Sie sicher, dass das Lasersystem über ordnungsgemäße Abschaltmechanismen verfügt.
   HINWEIS: In dieser Studie haben wir einen speziell entwickelten Laser verwendet. Das in diesem Protokoll verwendete Modell verfügt über einen Laser-Aktivierungsschlüssel, einen Not-Aus-Knopf und einen Verriegelungs-Jumper (der angeschlossene Jumper kann auch mit einem Sicherheitsschalter verdrahtet werden, der für die Einhaltung der Sicherheit verwendet wird, z. B. für den Türzugang zu einem Laserraum der Klasse 4).
2. Bringen Sie einen einführbaren, kalibrierten Temperaturfühler für die intratumorale Temperaturüberwachung an, der in der Lage ist, Live-Temperaturdaten über die entsprechende Thermoelement-Aufzeichnungssoftware zu übertragen.
3. Bereiten Sie einen ausgewiesenen Laserraum vor, der die erforderlichen Sicherheitsstandards für die Laserklasse erfüllt. Stellen Sie sicher, dass es einen freien Arbeitsbereich mit guter Belüftung, angemessener Beleuchtung und abgedeckten reflektierenden Oberflächen gibt. Beschränken Sie den Zugang zum Raum während des Laserbetriebs, um eine unbeabsichtigte Exposition zu verhindern. Stellen Sie sicher, dass das gesamte an der Studie beteiligte Personal umfassend in den Laserbetriebs- und Sicherheitsprotokollen geschult ist und geeignete PSA und Augenschutz trägt.
4. Richten Sie im Laserraum einen Arbeitsbereich ein, in dem sich ein Anästhesiegerät in unmittelbarer Nähe des Laseraufbaus befindet. Stellen Sie sicher, dass der Laser sicher montiert, aber verstellbar ist, wobei die Versuchsperson etwa 1-2 cm von der Laserstrahlquelle entfernt positioniert werden kann, um eine genaue Ausrichtung auf die Tumorstelle zu gewährleisten.
5. Verwenden Sie eine Wärmebildkamera auf einem Stativ, das so positioniert ist, dass die Temperaturmesswerte von der Oberfläche des Motivs während der gesamten Laserbelichtung erfasst werden.

2. Zellkultur und Inokulation (Tumorzellinjektion)

1. Wählen Sie geeignete Mausmodelle basierend auf dem interessierenden Tumortyp nach standardisierten Techniken zur Vorbereitung und Pflege von Laborzellkulturen aus. Um diesem Protokoll zu folgen, wählen Sie 6-8 Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse für die CT26-Tumorinokulation aus.
   HINWEIS: Je nach den Anforderungen der Studie können immunkompetente oder immungeschwächte Mäuse unterschiedlichen Alters und unterschiedlicher Stämme verwendet werden.
2. Kultivieren Sie die CT26-Krebszelllinie in RPMI 1640-Medium, das mit 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS), 100 μg/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 2 mM Glutamin ergänzt wird. Halten Sie die Zellen bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO₂. Erneuern Sie das Medium alle 2-3 Tage und subkultivieren Sie Zellen mit 70-80 % Konfluenz bei einem Split-Verhältnis von 1:4 bis 1:10. Verwenden Sie Zellen innerhalb früher Passagen (z. B. ≤10 Passagen), um ein konsistentes Wachstum und eine effiziente Inokulation zu gewährleisten. Erweitern Sie die Kulturen nach Bedarf, um die erforderliche Anzahl von Zellen für die Inokulation zu erhalten.
   HINWEIS: Die Anzahl der pro Maus benötigten Zellen variiert je nach Modell, z. B. benötigten wir für das CT26-Modell für kolorektales Karzinom der Maus 5 × 10⁵ Zellen pro Maus.
3. Adhärente Zellen mittels Trypsinisierung ablösen und 2x mit sterilem 1x PBS waschen. Resuspendieren Sie in einer sterilen 1x PBS-Lösung, um die gewünschte Konzentration von 5 × 10⁶ Zellen/ml zu erreichen. Lagern Sie die Zellsuspension in einem sterilen 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis für maximal 1 h vor der Injektion.
4. Vor der Injektion werden die Mäuse in einer Induktionskammer mit 4 % verdampftem Isofluran bei einer Flussrate von 0,8 l/min anästhesiert. Reduzieren Sie nach der Betäubung den Isofluran auf 2% und halten Sie die Narkose mit einem Nasenkegel während des Impfvorgangs aufrecht. Bestätigen Sie die Narkosetiefe mit einem Zehenquetschtest, um sicherzustellen, dass keine Schmerzreaktion auftritt. Tragen Sie Augenschmiermittel auf beide Augen auf, um ein Austrocknen zu verhindern und mögliche Laserschäden zu minimieren.
5. Rasieren Sie die Injektionsstelle (z. B. die linke Flanke bei diesem heterotopen CT26-Modell) mit einem Elektrorasierer und reinigen Sie den Bereich mit einem Alkoholtuch, um Ablagerungen zu entfernen und die Haut zu desinfizieren. Drücken Sie die Haut an der Injektionsstelle zusammen und injizieren Sie 100 μl der Zellsuspension in 5 × 10⁶ Zellen/ml subkutan mit einer 26-g-Nadel und 1 ml-Spritze. Nehmen Sie die Maus nach der Injektion aus dem Nasenkonus und bringen Sie sie zur Erholung auf einer wärmenden Decke für 1 h in ihren Käfig zurück.

3. Tumorwachstum und -messung

1. Beginnen Sie mit täglichen Tumormessungen, in der Regel ab Tag 7 nach der Injektion, mit einem Tumormessschieber. Messen Sie die Tumordimensionen in drei Achsen: Breite, Länge und Höhe und berechnen Sie das Tumorvolumen mit einer ellipsoiden Tumorvolumenformel von π/6 × Länge × Breite × Höhe.
2. Planen Sie die Initiierung einer GNR-vermittelten THT, sobald die Tumoren ein ungefähres Volumen von 50 mm³ (± 20 mm³) erreichen.
   HINWEIS: Für unser CT26-Modell wurde dieses Tumorvolumen zwischen dem 10. und 12. Tag nach der Tumorzellinjektion erreicht.
3. Stellen Sie vor der Laserbehandlung sicher, dass die Mäuse nach dem Zufallsprinzip in Kontroll- und Behandlungsgruppen eingeteilt werden. Die Behandlungsgruppe erhält eine intratumorale GNR-Injektion, gefolgt von einer Laserexposition; und die Kontrollgruppe erhält eine intratumorale PBS-Injektion (gleiches Volumen wie die GNR-Injektion) anstelle von GNRs, gefolgt von einer Laserexposition.

4. Photothermische Umwandlung von NIR-Licht mit intratumoralen GNRs

1. Verwenden Sie in einer sterilen biologischen Sicherheitswerkbank eine 0,3-1 ml-Spritze mit einer 31-g-Nadel, um das entsprechende Volumen an GNRs basierend auf jedem Tumorvolumen zu entnehmen.
2. Betäuben Sie die Maus auf die gleiche Weise wie bei der Injektion von Krebszellen (mit einem Nasenkonus, der 2 % Isofluran bei einer Flussrate von 0,8 l/min liefert, und bestätigen Sie eine angemessene Anästhesietiefe mit dem Zehenquetschtest).
3. Reduzieren Sie nach der Betäubung den Isofluran auf 2 % und platzieren Sie die Maus in Bauchlage auf der Laserplattform, während Sie die Anästhesie mit einem Nasenkonus aufrechterhalten. Tragen Sie Augenschmiermittel auf beide Augen auf, um ein Austrocknen zu verhindern und mögliche Laserschäden zu minimieren.
4. Rasieren Sie bei Bedarf überschüssiges Fell um den Tumor herum, um sicherzustellen, dass die Hautoberfläche dem Laser ausgesetzt ist. Verwenden Sie Ethanol, um die Tumoroberfläche zu desinfizieren und alle Fell/Ablagerungen abzuwischen.
   HINWEIS: In dieser Studie haben wir GNRs verwendet, die für die Absorption bei 860 nm optimiert sind. Wenn Sie ein anderes GNR-Produkt als das hier vorgeschlagene verwenden, stellen Sie sicher, dass die NIR-Wellenlängenabgabe des Lasers entsprechend dem Absorptionsspektrum der GNR optimiert ist.
5. Vor der Laserexposition sind GNRs intratumoral in einer Konzentration von 1 μg/^mm3 des Tumorvolumens zu injizieren. Falls erforderlich, teilen Sie die Injektion auf zwei intratumorale Stellen auf, um eine effiziente Verteilung der GNRs im Tumor zu gewährleisten.
   HINWEIS: In diesem Protokollvideo wurden GNRs in einer Konzentration von 2 μg/μl verwendet; daher wurden bei einem 50 mm³ Tumor 25 μl GNRs in den Tumor injiziert. Achten Sie darauf, überschüssige GNRs auf der Hautoberfläche nach den jeweiligen Injektionen abzuwischen.
6. Bei Mäusen der Kontrollgruppe ist eine intratumorale Injektion von sterilem PBS in Höhe des äquivalenten Volumens zu verabreichen, das für die GNR-Injektionsgruppe(n) verwendet wird (z. B. 25 μl PBS im Falle eines 50 mm 3-Tumors injizieren).
7. Desinfizieren Sie die intratumorale Temperatursonde mit Ethanol und führen Sie sie vorsichtig in die Mitte der Tumormasse ein.
8. Tragen Sie eine gleichmäßige Schicht Aloe Vera Gel mit einer Dicke von ca. 5 mm auf die Tumoroberfläche auf, um Hautgeschwüre zu verhindern und das Risiko thermischer Verletzungen während der Behandlung zu minimieren.
9. Stellen Sie sicher, dass der Laser so eingestellt ist, dass er direkt über der Mitte des Tumors ausgerichtet ist. Verwenden Sie die Bestrahlungsstärke-Nachschlagetabelle (Tabelle 1), um die geeignete Laserhöhe basierend auf dem erforderlichen Laserstrahldurchmesser zur Abdeckung der Tumoroberfläche zu bestimmen. Optimieren Sie die Laserhöhe basierend auf dem Tumordurchmesser, um eine gleichmäßige Energieabgabe zu gewährleisten.
   HINWEIS: In unserem Experiment erforderte ein Tumor mit einem Durchmesser von 1,3 cm eine Laserhöhe von 1,5 cm).
10. Schalten Sie die elektrische Kühlquelle (TEC) des Lasers und der Thermoskanne ein und schließen Sie das Lasersystem an die Stromquelle an (angepasst an das Protokoll des Herstellers). Schalten Sie die elektrische Kühlquelle der Thermoskanne ein. Warten Sie, bis die blaue LED aufleuchtet und sich die Temperatur der TEC-Quelle des Lasers nach 30 s bei 25 °C stabilisiert.
11. Verwenden Sie die Bestrahlungsstärke-Nachschlagetabelle (Tabelle 1), um eine Zielbestrahlungsstärke von 1 W/cm² ± 0,2 W/cm² zu erreichen, indem Sie die Laserstromausgabe einstellen (drehen Sie den Laserquellenknopf auf den gewünschten Stromsollwert).
    HINWEIS: In unserem Experiment ergab eine Laserhöhe von 1,5 cm, ein Strahldurchmesser von 1,3 cm und der Laserstrom von 1.800 mA einen Bestrahlungsstärkewert von 0,82 W/cm², der für dieses Tumormodell optimiert wurde.
    Stellen Sie ab diesem Zeitpunkt sicher, dass alle Personen im Laser-OP-Saal eine zertifizierte Laserschutzbrille für die verwendete Lichtwellenlänge tragen.
12. Richten Sie die Thermokamera neben der Laserplattform ein, die auf die Maus gerichtet ist, um die Hautoberflächentemperatur während des Laservorgangs zu überwachen.
13. Erstellen Sie in der Thermoelement-Aufnahmesoftware eine neue Datei und klicken Sie auf die Aufnahmetaste. Stellen Sie sicher, dass das Diagramm der internen Tumortemperatur in Echtzeit angezeigt wird.
14. Drehen Sie den Sicherheitsschlüssel, um die Ausgabe der Laserquelle zu aktivieren. Starten Sie die Laserverabreichung, indem Sie das Fußpedal nach unten drücken.
    HINWEIS: In diesem Protokoll ist ein Raspberry Pi-Controller die interne Schnittstelle zwischen dem Fußpedal und der Laserquelle.
15. Überprüfen und stellen Sie sicher, dass die Computersoftware einen Anstieg der Tumortemperatur erkennt, sobald der GNR-injizierte Tumor dem Laserstrahl ausgesetzt ist.
    HINWEIS: Die innere Tumortemperatur beginnt zum Zeitpunkt des Laserstarts anzusteigen, wobei es je nach Größe und Art des Tumormodells etwa 15 s bis 2 Minuten dauert, bis der angestrebte Hyperthermiebereich von 42 °C eintritt.
16. Halten Sie die Temperatur des inneren Tumors für volle 5 Minuten im hyperthermischen Bereich (zwischen 42 °C und 48 °C). Überwachen Sie kontinuierlich die innere Tumortemperatur, und wenn sie sich 48 °C nähert, nehmen Sie den Fuß vom Pedal und lassen Sie die Temperatur wieder sinken. Suchen Sie nach diesem Temperaturabfall in Echtzeit in der Temperatur-Zeit-Anzeigegrafik. Sobald die innere Tumortemperatur auf ~43 °C gesunken ist, aktivieren Sie die Laserverabreichung wieder, indem Sie erneut auf das Pedal drücken. Setzen Sie dieses Muster des Ein-/Ausschaltens des Laserpedals fort, um die innere Tumortemperatur für volle 5 Minuten im entsprechenden hyperthermischen Bereich zu halten, und überwachen Sie das Diagramm der Temperatur-Zeit-Anzeige.
    1. Wenn die Tumortemperatur zu irgendeinem Zeitpunkt während der 5-minütigen Hyperthermiephase unter 42 °C fällt, erhöhen Sie die Zeit der Hyperthermie, um die verlorene Zeit auszugleichen. Wenn die Temperatur beispielsweise für 20 s unter 42 °C fällt, fügen Sie am Ende der anfänglichen 5-Minuten-Zeit 20 s hinzu. Einige Tumoren, die mit GNRs injiziert wurden, erreichen möglicherweise nicht 48 °C, und ein Laser-Ein- und Aus-Zyklus ist nicht erforderlich.
       HINWEIS: Bei Kontrollmäusen, denen intratumoral PBS injiziert wurde, erreichen die Tumore nicht den hyperthermischen Bereich. Falls gewünscht, sollte das Ein- und Ausschalten des Lasers für Kontrollmäuse trotz des erwarteten Mangels an hyperthermischer Reaktion dem gleichen Muster folgen, das für die GNR-behandelte Gruppe etabliert wurde.
17. Überwachen Sie während der Aufrechterhaltung der Tumorhyperthermie kontinuierlich die Oberflächentemperatur der Haut, um sicherzustellen, dass sie unter 50 °C bleibt. Unabhängig von der inneren Temperatur des Tumors sollte der Laser ausgeschaltet werden, wenn die Oberflächentemperatur der Haut 50 °C erreicht, um eine Kühlung zu ermöglichen. Wenn die Innentemperatur nicht den gewünschten hyperthermischen Bereich erreichen kann, ohne dass die Hauttemperatur 50 °C überschreitet, reduzieren Sie die Laserleistung und/oder tragen Sie zusätzliche Aloe Vera auf die Tumorstelle auf, um die Wärmeableitung zu unterstützen. Lassen Sie nach 5 Minuten im hyperthermischen Bereich das Fußpedal los, um die Laserverabreichung zu stoppen, lassen Sie die innere Tumortemperatur auf ~37 °C absinken und schalten Sie die Lasersicherheitstaste aus.
    HINWEIS: Es ist wichtig, Hautschäden, die zu Tumorgeschwüren führen könnten, zu minimieren, indem die Hauttemperatur unter 50 °C^{gehalten wird 19}.
18. Überwachen Sie die interne Tumortemperatursonde, damit die Tumortemperatur wieder auf ca. 37 °C sinkt. Entfernen Sie vorsichtig die Temperatursonde vom Tumor und wischen Sie das restliche Aloe Vera Gel auf der Tumoroberfläche ab.
19. Entfernen Sie die Maus aus dem Nasenkonus-Anästhetikum und überwachen Sie die Erregung der Tiere, bevor Sie sie in den Käfig zurückbringen. Stellen Sie den Käfig während der Erholungsphase nach dem Eingriff teilweise auf ein 37 °C heißes Heizkissen, damit sich die Mäuse je nach Bedarf zwischen wärmeren und kühleren Bereichen bewegen können, um ihre Körpertemperatur zu regulieren. Überwachen Sie jede Maus, um sicherzustellen, dass sie wieder zu normalem Verhalten zurückkehrt, bevor Sie sie in ihre Wohneinrichtung zurückbringen.

Ergebnisse

Ziel dieses GNR-vermittelten THT-Protokolls ist es, solide Tumore konstant und zuverlässig auf den gewünschten milden hyperthermischen Bereich von 42-48 °C zu erwärmen. Die wichtigsten Schritte dieses Verfahrens sind in Abbildung 1 dargestellt. Der Erfolg dieses Protokolls hängt von der Etablierung und Aufrechterhaltung einer kontrollierten und reproduzierbaren milden Hyperthermie innerhalb eines gegebenen soliden Tumormodells ab. Die verwendeten GNRs wurden mit einem patentierten CTAB-freien Verfahren synthetisiert, bei dem Goldsalz in einer proprietären Tensidlösung reduziert wurde, um das stäbchenförmige Kristallwachstum zu fördern. Nach der Synthese wurden native Tenside weitgehend durch niedermolekulare PEG ersetzt, um die Biokompatibilität zu verbessern. Die resultierenden GNRs waren einheitlich groß (51,1 ± 10,8 nm x 12,2 ± 1,9 nm), hatten eine optimale Anregungswellenlänge von 860 ± 10 nm und waren frei von nachweisbaren Endotoxinen.

Um eine ordnungsgemäße Tumorerwärmung und eine genaue Temperaturüberwachung zu gewährleisten, muss eine intratumorale Temperatursonde in die Mitte des Tumors eingeführt werden. Darüber hinaus ist die Überwachung der Hautoberflächentemperatur während des gesamten Eingriffs mit einer Wärmebildkamera von entscheidender Bedeutung. Es ist möglich, insbesondere bei Tumoren mit kleinerem Volumen, dass intratumoral injizierte GNRs in den peritumoralen und/oder subkutanen Raum um den Tumor diffundieren. Bei Einwirkung von NIR-Licht kann dies zu einer Erwärmung der Haut über das physiologische Grundniveau hinaus führen, und wenn die Haut Temperaturen über einem milden hyperthermischen Niveau (mehr als 50 °C) erreicht, kann dies zu Hautschäden wie Schorf und/oder Geschwüren führen¹⁹. Das Auftragen einer Schicht Aloe Vera Gel auf die Oberfläche des Tumors ist eine wichtige Vorsichtsmaßnahme, um die Oberflächentemperatur der Haut zu regulieren und thermische Schäden während der NIR-Laserexposition zu vermeiden. In jedem Fall wird empfohlen, den behandelten Bereich über die 48 Stunden nach der THT auf Anzeichen von Geschwüren zu überwachen. Abbildung 2 zeigt eine visuelle Darstellung des vorgeschlagenen Aufbaus zur Optimierung des Tumortemperaturmanagements und zeigt die Position der internen Tumortemperatursonde und der Aloe-Vera-Gelschicht in Bezug auf die NIR-Lasersonde.

Der relative Erfolg dieses experimentellen Protokolls kann durch die Beobachtung des internen Tumortemperatur-Zeit-Diagramms während des gesamten Laserbetriebs bestimmt werden. Bei Mäusen, die intratumoral mit GNRs injiziert wurden, wird erwartet, dass sich die Tumore innerhalb von 15 s bis 2 min in den milden hyperthermischen Bereich (42-48 °C) erwärmen. Sobald die innere Tumortemperatur in den milden hyperthermischen Bereich eingetreten ist, wird erwartet, dass sie entweder im entsprechenden Bereich einpendelt oder einen Ein- und Ausschaltzyklus der Laserverabreichung erfordert, um sicherzustellen, dass die innere Tumortemperatur nicht über 48 °C ansteigt (wie in Abbildung 3A gezeigt). Die erfolgreiche Aufrechterhaltung einer milden Hyperthermie für 5 Minuten wird als positives Ergebnis gewertet. Bei Mäusen, die intratumoral mit PBS injiziert wurden, ist nicht zu erwarten, dass sich die Tumore in den hyperthermischen Bereich erwärmen. Die Exposition gegenüber NIR-Licht bei einer Wellenlänge von 860 nm allein reicht nicht aus, um eine Erwärmung des Gewebes in den milden hyperthermischen Bereich zu verursachen, und es wird erwartet, dass Kontrolltumoren ein Plateau von etwa 39-40 °C erreichen. Abbildung 3B zeigt ein internes Tumortemperatur-Zeit-Diagramm zwischen GNR und Kontrollmäusen (PBS-injiziert) während des 5-minütigen Verfahrens. Wenn ein GNR-injizierter Tumor nicht in der Lage ist, den hyperthermischen Bereich zu erreichen, wenn er NIR-Licht ausgesetzt wird, oder wenn er nicht in der Lage ist, den entsprechenden hyperthermischen Bereich für volle 5 Minuten zu halten, wird dies als negatives Ergebnis angesehen.

Eine zusätzliche nachgelagerte Analyse, um den Erfolg dieses GNR-vermittelten THT-Protokolls zu bestimmen, umfasst die Messung von Veränderungen des Tumorvolumens nach dem Verfahren. Erfolgreich durchgeführte GNR-vermittelte THT bewirkt den gezielten Tod von Tumorzellen und die Aktivierung von Immunantworten gegen Krebs, was zu einer Tumorregression und einer damit verbundenen Tumorvolumenreduktion führt¹³. Abbildung 4 zeigt Veränderungen des Tumorvolumens nach GNR-vermittelter THT für zwei Modelle des subkutanen Flankenkarzinoms von Mäusen (B16-Melanom und CT26-heterotopes kolorektales Karzinommodell) und ein Mammafettpolster-Mauskarzinommodell (4T1-Brustkrebs). In jedem Modell ist eine signifikante Reduktion des Tumorvolumens im Vergleich zu den Kontrollen 48-72 Stunden nach dem GNR-vermittelten THT-Verfahren offensichtlich. Es wird erwartet, dass der Zeitplan und das Ausmaß der Tumorvolumenreduktion nach dem Eingriff je nach Mausstamm und Krebsmodell variieren werden. Zusätzlich zur Tumorreduktion beobachteten wir eine starke angeborene Immunantwort innerhalb von 48 Stunden nach GNR-vermitteltem THT, die durch eine erhöhte Expression von Genen, die am STING-cGAS-Signalweg beteiligt sind, und die Hochregulierung und Aktivierung von dendritischen Zellen, Makrophagen und NK-Zellen sowohl in den B16F10- als auch in den 4T1-Modellen^{gekennzeichnet war 13}. Bemerkenswert ist, dass in einem bilateralen 4T1-Tumormodell GNR-fähiges THT eine systemische Immunantwort induzierte, was durch eine erhöhte Infiltration von CD8⁺ T-Zellen in unbehandelte kontralaterale Tumoren belegt^{wurde 13}. Diese Ergebnisse untermauern das Potenzial dieses Ansatzes, sowohl direkte zytotoxische als auch breitere immunmodulatorische Antikrebswirkungen hervorzurufen.

Tabelle 1: Nachschlagetabelle für die Bestrahlungsstärke. Tabelle mit Bestrahlungsstärkewerten (W/cm²) für verschiedene Laserstromausgangseinstellungen (mA) und Arbeitsabstände (cm). Die Tabelle dient dazu, anhand des erforderlichen Strahldurchmessers die geeignete Laserhöhe zu bestimmen, um die Tumoroberfläche abzudecken und eine Zielbestrahlungsstärke von 1 W/cm² ± 0,2 W/^cm2 zu erreichen. Grün hervorgehobene Werte zeigen optimale Bestrahlungsstärken nahe 1 W/cm² an. Diese Bestrahlungsstärketabelle ist spezifisch für den LDX Laser und wurde vom Hersteller zur Verfügung gestellt. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Abbildung 1: Grafisches Schema des GNR-vermittelten THT-Verfahrens. Methodik der Gold-Nanostäbchen-vermittelten zielgerichteten hyperthermischen Therapie bei subkutanen Flankentumoren im Mausmodell. Nach der Etablierung eines tastbaren Tumors (ca. 50 mm³) und der Anästhesierung der Maus (1) intratumorale GNRs in einer Konzentration von 1 μg/mm³ injizieren, (2) eine intratumorale Temperatursonde in der Mitte der Tumormasse einführen, (3) eine ~5 mm dicke Schicht Aloe Vera Gel auf die Tumoroberfläche auftragen, (4) mit der NIR-Laserverabreichung beginnen und (5) die innere Tumortemperatur 5 Minuten lang in einem milden hyperthermischen Bereich (42 °C-48 °C) halten. Abkürzungen: GNR = Gold-Nanostäbchen; THT = gezielte hyperthermische Therapie; NIR = Nahinfrarot. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Visuelle Darstellung des Versuchsaufbaus. Eine BALB/c-Maus mit einem heterotopen kolorektalen Tumor mit einer zentral eingeführten intratumoralen Temperatursonde und einer topischen Aloe-Vera-Gelschicht, die direkt unter der Exposition gegenüber Nahinfrarot-Laserstrahlen aufgetragen wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Echtzeit-Diagramme der internen Temperatur. Repräsentatives internes Tumortemperaturprofil über die Zeit (in ms), das von der internen Temperatursonde während der Tumorexposition mit dem NIR-Laser aufgezeichnet wurde. (A) Ein/Aus-NIR-Laser-Cycling-Muster in einer GNR-injizierten Maus, das erforderlich ist, um die innere Tumortemperatur für 5 Minuten in einem milden hyperthermischen Bereich (42 °C-48 °C) zu halten. Dies unterstreicht, wie wichtig es ist, die innere Tumortemperatur und den Zyklus der Laserverabreichung genau zu überwachen, um den hypothermischen Bereich während des gesamten Eingriffs aufrechtzuerhalten. (B) Durchschnittliche Differenz der inneren Tumortemperatur zwischen GNR-injizierten (n = 15) und Kontrollmäusen (PBS-injiziert) (n = 8) während einer 5-minütigen NIR-Laserexposition. Tumore von PBS-injizierten Mäusen werden nicht in einen milden hypothermischen Bereich erhitzt und pendeln sich bei etwa 39-40 °C ein, obwohl sie die gleiche lange NIR-Laser-Exposition erhalten wie die GNR-injizierte Gruppe, deren Tumoren hyperthermische Temperaturen von 42-48 °C erreichen. Abkürzungen: GNR = Gold-Nanostäbchen; NIR = Nahinfrarot. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Tumorvolumendiagramme nach GNR-vermittelter THT. GNR-vermitteltes THT induziert eine Schrumpfung des Tumorvolumens bei mehreren murinen Krebsmodellen innerhalb von 48-72 Stunden nach der Behandlung. (A) Tumorvolumenmessungen im 4T1-Modell (Brustkrebs) nach GNR-vermittelter THT (n= 24 PBS, n = 28 THT). (B) Tumorvolumenmessungen im B16-F10 (Melanom) Modell nach GNR-vermittelter THT (n = 19 PBS, n = 23 THT). (C) Tumorvolumenmessungen im CT26-Modell (kolorektales Karzinom) nach GNR-vermittelter THT (n = 9 PBS, n = 9 THT). Eine Verringerung oder Verlangsamung des Tumorvolumenwachstums innerhalb von 48-72 Stunden nach der Behandlung ist ein Hinweis auf ein positives Ergebnis. Die Tumorvolumendaten für das CT26-Modell zum Zeitpunkt "24 h pre" werden nicht zusammengeführt - die Werte sind ähnlich und überlappen sich. Fehlerbalken stellen SEM dar. * p < 0,05. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Kritische Schritte innerhalb des Protokolls
Das Design und die Implementierung dieser GNR-vermittelten THT-Technik bieten die Möglichkeit, eine gezielte, genaue, ressourcenschonende und reproduzierbare Erwärmung von soliden Tumoren in vivo durchzuführen. Ein wesentlicher Vorteil dieses Systems liegt in seiner räumlichen Präzision und thermischen Kontrolle, die eine lokalisierte Behandlung ermöglicht, ohne das umgebende Gewebe zu schädigen. Ein entscheidender Schritt für eine erfolgreiche photothermische Umwandlung ist die Sicherstellung der Kompatibilität zwischen den verwendeten GNRs und der NIR-Lichtquelle. In dieser Studie haben wir GNRs verwendet, die für die Absorption bei 860 nm optimiert sind. Bei dieser Wellenlänge dringt Licht effektiv in das Gewebe ein, und in GNR-haltigen Tumoren wird selektiv Wärme erzeugt, während das umgebende gesunde Gewebe in der Nähe der physiologischen Temperatur^{20 bleibt}. Darüber hinaus ist bei der Durchführung dieses Protokolls eine genaue Echtzeitüberwachung der inneren Tumortemperatur von entscheidender Bedeutung, um zu bestätigen, dass ein milder hyperthermischer Bereich erreicht wird und dass die Behandlung konsistent durchgeführt wird. Die Platzierung einer Intratumor-Temperatursonde, wie in Abbildung 2 gezeigt, ermöglicht eine Echtzeitüberwachung der thermischen Dosis des Tumors, wie in Abbildung 3B zu sehen ist.

Fehlerbehebung der Technik
Abhängig vom In-vivo-Modell und der Tumorart können geringfügige Modifikationen des Protokolls erforderlich sein, um die Ergebnisse zu optimieren. In den in Abbildung 4 genannten Modellen für murines Melanom, Darmkrebs und Brustkrebs haben wir beispielsweise die GNR-zu-Tumor-Volumenkonzentration bei 1 μg/mm^{optimiert 3}. Wir haben auch die Effizienz dieses Protokolls optimiert, indem wir eine NIR-Laserbelichtung direkt nach der GNR-Injektion durchgeführt haben, da beim Vergleich dieser Injektion und des Behandlungszeitpunkts in längeren Intervallen von 0,5, 1, 4, 18 oder 24 Stunden keine Unterschiede in der Wirksamkeit der Behandlung beobachtet wurden. Für Tumormodelle, die sich in Bezug auf die Tumorpathophysiologie oder die Körperlokalisation von unserem/unseren Modell(en) unterscheiden, kann eine andere GNR-Konzentration, die zu einem anderen Zeitpunkt injiziert wird, optimal sein, um einen hyperthermischen Bereich zu erreichen und/oder zu halten. Im Anschluss an dieses Verfahren sollten tägliche Tumorvolumenmessungen durchgeführt werden, um Veränderungen des Tumorvolumens zu erfassen. Eine Tumorregression innerhalb von 2-3 Tagen ist ein positiver Indikator für den Behandlungserfolg.

Aufgrund der Art des Laserprotokolls sind oberflächliche Hautverbrennungen und Geschwüre ein potenzieller Risikofaktor, insbesondere bei pigmentierter oder empfindlicher Haut. Anpassungen der Laserstromabgabe können erforderlich sein, um ein angemessenes Gleichgewicht zwischen Hautoberfläche und innerer Tumortemperatur aufrechtzuerhalten, abhängig vom verwendeten In-vivo-Modell . Zum Beispiel haben wir herausgefunden, dass C57Bl/6-Mäuse aufgrund von Unterschieden im Wassergehalt und Melaninpigment in der Haut²¹ eine NIR-Laserverabreichung bei einem niedrigeren Strom im Vergleich zu BALB/c-Mäusen benötigen, um die Hauttemperatur unter 50 °C zu halten. Wenn Sie die Laserstromabgabe ändern, stellen Sie sicher, dass die Laserhöhe entsprechend angepasst ist, um eine Zielbestrahlungsstärke von 1 W/cm² ± 0,2 W/cm² beizubehalten, während der größte Teil der Tumoroberfläche weiterhin mit dem Laserstrahldurchmesser bedeckt bleibt. Alternativ kann das Auftragen von zusätzlichem Aloe Vera Gel dazu beitragen, die Hauttemperatur während des Eingriffs zu senken, ohne die innere Tumortemperatur drastisch zu beeinflussen. Die Aufrechterhaltung einer angemessenen Hautoberflächentemperatur durch notwendige Modifikationen ist wichtig, um das Risiko von Geschwüren zu minimieren, die als mögliche Nebenwirkung dieser Behandlung beobachtet wurden. Wenn Sie Änderungen an der Aloe-Vera-Gelschicht vornehmen, stellen Sie sicher, dass die Verabreichung des NIR-Laserstrahls vorübergehend gestoppt wird. Stellen Sie in den Tagen nach dem Laserprotokoll sicher, dass die Mäuse engmaschig auf mögliche Verbrennungen und/oder Geschwüre überwacht werden.

Grenzen von GNR-vermitteltem THT
Ein wichtiges Sicherheitsproblem, das bei der Durchführung dieses Verfahrens berücksichtigt werden muss, ist die Verwendung von zertifizierten Laserschutzbrillen für die Wellenlänge des Lichts, die während des Laserbetriebs verwendet wird. Das Lasersystem sollte über integrierte Sicherheitsfunktionen verfügen, wie z. B. eine Schlüsselsperre, um eine versehentliche Aktivierung zu verhindern. Es ist jedoch zusätzliche persönliche Schutzausrüstung erforderlich -- insbesondere eine geeignete Laserschutzbrille -- zum Schutz vor einer möglichen Exposition durch reflektierte oder gestreute Strahlen. Das Auge ist am anfälligsten für Verletzungen durch einen Laserstrahl, wobei Verbrennungen der Netzhaut bei NIR-Lasern ein großes Problem darstellen²². Schließlich muss das gesamte Personal, das den Laser bedient, über eine entsprechende Schulung verfügen.

Dieses Protokoll entschied sich für die intratumorale Injektion von GNRs gegenüber einer systemischen Injektion, um die Systemtoxizität zu minimieren, die Verteilung von Nanopartikeln in Off-Target-Organen wie Leber, Milz und Nieren zu begrenzen und die Genauigkeit, Wirksamkeit und das Sicherheitsprofil der hyperthermischen Behandlung zu verbessern. Da dieses Protokoll jedoch intratumorale Injektionen von GNRs erfordert, kann es in seiner Fähigkeit, Hyperthermie in bestimmten Tumormodellen zu induzieren, eingeschränkt sein. Bisher haben wir die Wirksamkeit dieser Methode bei subkutanen und mammären Fettpolstertumoren nachgewiesen, die sich beide nahe der Hautoberfläche befinden und in Bezug auf die GNR-Injektion und die Exposition gegenüber NIR-Licht leicht zugänglich sind. Logistische Schwierigkeiten können bei der Behandlung von Tumoren auftreten, die sich in Körperhöhlen befinden, wie z. B. dem Peritoneum, oder bei dem Versuch, metastasierende Stellen eines Primärtumors zu erreichen. Eine mögliche Modifikation dieses Protokolls könnte eine systemische GNR-Injektion beinhalten, vorausgesetzt, die Nanopartikel werden so konstruiert oder modifiziert, dass sie eine effiziente Akkumulation in Tumorstellen vor der NIR-Exposition gewährleisten²³. Darüber hinaus ist es möglich, dass die intratumorale GNR-Injektion zu einer ungleichmäßigen Verteilung der Nanopartikel im Tumor führen könnte, was die Gleichmäßigkeit der Erwärmung beeinträchtigt. Es ist jedoch nicht zu erwarten, dass eine ungleichmäßige Tumorerwärmung einen großen Einfluss auf den Grad der Behandlungswirksamkeit hat, da das primäre Ergebnis dieses GNR-vermittelten THT-Protokolls die Induktion von ICD zur Aktivierung der Immunität gegen Krebs ist. Schließlich hängt die intratumorale Temperaturanzeige von der Position der Temperatursonde innerhalb des Tumors ab. Die Mitte des Tumors ist die optimalste Position für die Sonde, um die durchschnittliche Gesamttemperatur des Tumors genau widerzuspiegeln. Wenn es jedoch aufgrund der Größe und/oder Form des Tumors schwierig ist, eine zentrale Sondeninsertion sicherzustellen und/oder zu bestätigen, kann es erforderlich sein, mit zwei oder mehr Temperaturfühlern an verschiedenen Stellen aufzuzeichnen.

Bedeutung im Hinblick auf bestehende Methoden
Dieses Manuskript bietet ein umfassendes, optimiertes und reproduzierbares Protokoll für GNR-vermittelte THT in soliden und oberflächlich zugänglichen Tumoren. Im Vergleich zu anderen Verfahren zur Induktion von Hyperthermie bietet diese Technik deutliche Vorteile, nämlich sie ist ressourcenarm, räumlich präzise und mit minimaler systemischer Toxizität verbunden. Während die Verwendung von GNRs für die photothermische Therapie gut dokumentiert ist, gibt es in der Literatur nach wie vor erhebliche Unterschiede in der Art und Weise, wie diese Protokolle implementiert werden. Wichtige Verfahrenselemente wie die Dauer der NIR-Bestrahlung, die Wahl der thermischen Überwachungsinstrumente (Thermoelementsonden oder Wärmebildkamera), die GNR-Lösungsvorbereitung und die GNR-Injektionsmethoden variieren oft zwischen den Studien.

Bei anderen Methoden war beispielsweise eine längere (20 min)²⁴ oder mehrere Dosen (4 x 15 min)²⁵ NIR-Exposition erforderlich, um ähnliche Ergebnisse wie bei uns zu erzielen. Darüber hinaus verwenden die meisten Protokolle entweder Thermoelementsonden oder Wärmebildkameras, kombinieren jedoch selten beide Werkzeuge^26,27. Darüber hinaus werden GNR-Lösungen häufig mit CTAB 28,29,30 hergestellt, und ihre Verabreichungsmethode variiert zwischen systemischen Injektionen^24,30 und intratumoralen Injektionen³¹, was sich auf ihre Dispersion/Lokalisation innerhalb der TME auswirken kann. Daher muss eine umfassende und anpassungsfähige Methode für GNR-vermittelte THT, die die aktuellen Protokolle optimiert und verbessert, erst noch etabliert werden.

Unser Protokoll behebt diese Mängel, indem es die effektivsten und reproduzierbarsten Komponenten aus der Literatur in einen einzigen, standardisierten Ansatz integriert. Insbesondere verwenden wir eine duale Wärmeüberwachung (sowohl Thermoelement als auch Wärmebildkamera), um eine präzise und sichere Wärmeabgabe zu gewährleisten. wir setzen die intratumorale Injektion von CTAB-freien GNRs ein, um die Tumorlokalisation zu maximieren und die Toxizität zu minimieren; Und wir verwenden Aloe Vera Gel, um vor oberflächlichen Hautverbrennungen zu schützen. Darüber hinaus sind die in diesem Protokoll verwendeten GNRs für eine effiziente photothermische Umwandlung bei 860 nm NIR optimiert, was ein schnelles Erreichen milder hyperthermischer Temperaturen innerhalb von Sekunden ermöglicht. Sobald dieser Temperaturbereich erreicht ist, kann er für die Behandlungsdauer von 5 Minuten stabil gehalten werden, die wir als ausreichend für die Induktion des immunogenen Zelltods und der Immunaktivierung eingestuft haben. Die NIR-Wellenlänge von 860 nm selbst bietet auch ein günstiges Gleichgewicht zwischen Gewebeeindringtiefe und Sicherheit, wodurch das therapeutische Fenster dieser Methode weiter vergrößert wird.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass unser Protokoll eine konsolidierte, validierte und biologisch wirksame Alternative zu bestehenden GNR-vermittelten Hyperthermie-Ansätzen bietet und eine kritische Lücke in diesem Bereich schließt, indem es eine vollständig detaillierte und anpassungsfähige Methode bietet, die für die präklinische Krebsforschung und die Entwicklung von Kombinationstherapien geeignet ist.

Zukünftige Anwendungen der Technik
Obwohl dieses Protokoll problemlos mit verschiedenen Krebsbehandlungen kombiniert werden kann, eignet es sich jedoch besonders gut, um die Wirksamkeit von Immuntherapien zu verbessern, da THT die inhärente Fähigkeit hat, die Immunität gegen Krebs zu stimulieren. Durch die Induktion des immunogenen Zelltods, die Förderung der Freisetzung tumorspezifischer Antigene und die Erhöhung der Anzahl der angeborenen Immunzellen, die innerhalb von 48 Stunden nach der Behandlung für die TME rekrutiert werden, hilft die GNR-vermittelte THT, immunologisch kalte Tumore für die Erkennung und den Angriff durch das Immunsystem zu "resensibilisieren"¹³. Infolgedessen kann diese Technik verwendet werden, um die Wirksamkeit von Immuntherapien bei der Behandlung von Krebserkrankungen zu verbessern, die zuvor möglicherweise Resistenzen entwickelt haben, und bietet eine potenzielle Strategie zur Überwindung von Barrieren bei der Krebsbehandlung und des Fortschreitens der Krankheit¹³.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,25% Trypsin	Thermo Fisher Scientific	25200-056
10 mL Stripette	Fisher Scientific	7200574
15 mL Falcon Röhrchen	Corning	352095
1 mL Spritze	BD Biowissenschaften	3331431
28 G Nadel	BD Biowissenschaften	1298811
4T1 Brustkrebs-Zelllinie	Sammlung amerikanischer Schriftkultur	CRL-2539
5 mL Stripette	Fisher Scientific	7200573
50 mL Falcon Röhrchen	Fisher Scientific	14-432-22
70% Ethanol	Kommerzielle Alkohole	36195
Aloe Vera Gel	Life-Marke	57800985495
B16-F10 Melanom-Zelllinie	Sammlung amerikanischer Schriftkultur	CRL-6475
Biorender	BioRender	N/A
Bisafety-Schrank	Nuaire	N/A
Laserschutzbrille der Klasse 4	Laservision	F22. Nr. P5P18.5000	Wir haben einen P22-Rahmen mit einem P5P18-Filter verwendet
CO2-Inkubator (37 &Grad; C, 5% CO2)	Nuaire	N/A
Corning 1-200 & Mikro; L Universal Fit Rack-Pipet  Tipps	Corning	4865
Corning gefilterte Pipette  Tipps, 30 & Mikro; L	Fisher Scientific	07-200-265
CT26 kolorektale Zelllinie der Maus	Sammlung amerikanischer Schriftkultur	CRL-2638
DPBS (Englisch)	Thermo Fisher Scientific	10010-049
Eppendorf Röhren	Thermo Fisher Scientific	3451
Weibliche BALB/c-Mäuse	Charles River Laboratories (Montreal, Kanada)	028
Buchse C57Bl/6	Charles River Laboratories (Montreal, Kanada)	027
Fötales Rinderserum	Thermo Fisher wissenschaftliches Invitrogen	12483020
GNR	Sona Nanotech Inc	N/A
Intratumorale Temperatursonde	OMEGA	HYP1-30-1/2-T-G-60-SMP-M	Thermoelement-Sonde Modell HYP-1
IsoTip 1000 & Mikro; L Universell gefilterte Pipet  Tipps	Corning	4809
LDX Laser (Modell: LDX-3520-860-HHLFC)	Minnetronix	N/A	Laserstrom mit maximalem Sollwert bei 4600 mA
Optixcare Augenschmiermittel	Aventix	N/A
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140148
Prisma 10.6.0	Grafikblock	N/A
RPMI 1640 Mittel	Thermo Fisher Scientific	11875119
TC-08 Thermoelement-Datenlogger Software	Pico-Technologie	PicoLog V5.25.3
Wärmebildkamera	HIKmicro	EA-1086922
Gewebekulturschale 100 x 20 mm	Fisher Scientific	877222
Trypanblau-Lösung 0,4%	Thermo Fisher Scientific	15250061
Messschieber für Tumore	Giles scientificMitutoyo Corporation	500-321