Erzeugung schneller Sauerstoffoszillationen in der mikrobiellen Einzelzellwachstumsanalyse mit einem mikrofluidischen Doppelschichtgerät

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt ein Verfahren zur Herstellung eines doppelschichtigen mikrofluidischen Chips und zur Analyse des mikrobiellen Wachstums unter schnellen Sauerstoffoszillationen vor. Die Leistung des Geräts wurde durch Sauerstoffmessung in Flüssigkeitskanälen und mikrobielle Kultivierung validiert.

Zusammenfassung

Die mikrobielle Einzelzellanalyse mittels Mikrofluidik in Verbindung mit Zeitraffermikroskopie ist vielversprechend für die Untersuchung des mikrobiellen Wachstumsverhaltens in begrenzten Umgebungen mit raumzeitlicher Auflösung und bietet Erkenntnisse, die mit herkömmlichen Kultivierungs- und Analyseplattformen nicht gewonnen werden können. Sauerstoff spielt eine entscheidende Rolle bei der Bestimmung des mikrobiellen Wachstums. Eine zeitliche Kontrolle im Sekundenbereich ist in der mikrobiellen Analyse mittels Mikrofluidik jedoch nicht implementiert. Wir haben kürzlich einen doppelschichtigen PDMS-Mikrofluidik-Chip entwickelt, der eine zeitliche Sauerstoffkontrolle im Zehn-Sekunden-Bereich ermöglicht. Der Chip besteht aus einer oberen Schicht für die Begasung und einer unteren Schicht für die Kultivierung und Flüssigkeitsperfusion. Die beiden Schichten sind durch eine dünne PDMS-Zwischenmembran getrennt, die einen schnellen Gasaustausch zwischen den beiden Schichten ermöglicht. In diesem methodischen Artikel erläutern wir das Verfahren zur Chipherstellung, Charakterisierung und mikrobiellen Kultivierung mit dem Chip. Als repräsentative Ergebnisse demonstrieren wir die schnelle Sauerstoffschaltfähigkeit in Dutzenden von Sekunden, die mikrobielle Kultivierung und die zeitaufgelöste Wachstumsanalyse unter konstanten und oszillierenden Sauerstoffbedingungen. Dieses Protokoll soll Forschern helfen, die an der Implementierung einer zeitlichen Sauerstoffkontrolle in ihrem mikrofluidischen Aufbau interessiert sind.

Einleitung

Sauerstoff ist eng mit dem mikrobiellen Wachstum und der Physiologie verschiedener Umweltfaktoren verbunden, die insbesondere zelluläre Prozesse wie oxidative Stressreaktion, Eisenhomöostase und pathogene Infektionen beeinflussen ^1,2,3. Herkömmlicherweise wurde die mikrobielle Kultivierung unter Umgebungsbedingungen oder mit minimaler Kontrolle bei einem bestimmten Sauerstoffgehalt durchgeführt. In realistischen Szenarien hingegen sind die Sauerstoffumgebungen in vielen Fällen oft nicht konstant, sondern schwanken über die Zeit. So können Mikroben beispielsweise in aquatischen Systemen innerhalb von Sekunden bis Minuten einem wechselnden Sauerstoffgehalt ausgesetzt sein, wenn sie sich aufgrund von Flüssigkeitsbewegungen und mikrobieller Motilität in der Umwelt bewegen ^4,5,6. In ähnlicher Weise schaffen auch industrielle Bioreaktoren aufgrund unzureichender Durchmischung inhomogene Sauerstoffumgebungen, was sich auf das mikrobielle Wachstum und die Endausbeute auswirkt ^7,8. Die Untersuchung mikrobieller Reaktionen auf solche dynamischen Bedingungen ist entscheidend für das Verständnis ökologischer Prozesse und die Verbesserung biotechnologischer Anwendungen.

Fakultative Anaerobier wie Escherichia coli (E. coli) können je nach Sauerstoffverfügbarkeit zwischen aeroben und anaeroben Wegen wechseln ^9,10. Obwohl frühere Forschungen diese metabolische Anpassungsfähigkeit untersucht haben, konzentrieren sich die meisten Studien auf einzelne Sauerstoffverschiebungen mit herkömmlichen Kultivierungssystemen, die die schnellen Veränderungen, mit denen Mikroben häufig konfrontiert sind, nicht replizieren^können 9,11,12,13,14. Infolgedessen ist nur begrenzt bekannt, wie Mikroben physiologisch auf häufig wechselnde Sauerstoffwerte reagieren.

Wie bereits erwähnt, fehlt es herkömmlichen Laboreinrichtungen an der Präzision und Geschwindigkeit, die erforderlich ist, um schnelle Sauerstoffschwankungen nachzuahmen, und sie unterstützen keine kontinuierliche, hochauflösende Überwachung. Um dieses Problem zu lösen, haben wir kürzlich eine spezielle mikrofluidische Plattform mit einem Doppelschicht-Polydimethylsiloxan (PDMS)-Chip entwickelt, der eine schnelle Sauerstoffkontrolle und Einzelzell-Bildgebung ermöglicht¹⁵. Hier stellen wir Protokolle für die Herstellung eines doppelschichtigen mikrofluidischen Chips zur Verfügung, der schnelle Sauerstoffoszillationen erzeugt und die Analyse des mikrobiellen Einzelzellwachstums unter kontrollierten Sauerstoffbedingungen ermöglicht. Der Chip besteht aus zwei Schichten – einer oberen Schicht für die Gasperfusion und einer unteren Schicht für die flüssige Perfusion und mikrobielle Kultivierung. Die dünne Zwischenmembran zwischen den beiden Schichten ermöglicht einen schnellen Gasaustausch. Zur Demonstration wurde E. coli MG1655 in dem entwickelten Chip kultiviert. Das Wachstum unter konstanten und oszillierenden Sauerstoffbedingungen wurde analysiert.

Protokoll

1. Vorbereitung der Form

1. Bereiten Sie eine Form für die oberste Schicht durch 3D-Druck vor. Stellen Sie die Oberschichtform mit einer glatten Oberfläche her, um eine glatte Oberfläche der resultierenden PDMS-Deckschicht zu gewährleisten. Wir empfehlen den Einsatz von Stereolithographie (SLA) 3D-Druck.
   1. Entwerfen Sie die Form mit einer 3D-CAD-Software (Abbildung 1A). Stellen Sie sicher, dass das Design Gaskanäle enthält, die sich mit den unteren Flüssigkeitskanälen überlappen. Führen Sie diesen Designprozess parallel zum Entwerfen der unteren Schicht durch (Schritt 1.2.1).
   2. Drucken Sie die Form mit dem SLA-3D-Druck. Entfernen Sie das restliche Harz aus der gedruckten Form und waschen Sie sie 30 Minuten lang in einem Isopropylalkoholbad (IPA) (Abbildung 1B).
   3. Führen Sie eine Nachhärtung durch, indem Sie die Form je nach Harztyp und -geometrie mit angemessener Dauer und Temperatur 405 nm Licht aussetzen.
   4. Lassen Sie die Form 15 Minuten lang in einem Ultraschallbad in IPA einweichen, um nicht ausgehärtetes Harz in der Form zu entfernen, das sonst die PDMS-Aushärtung behindern könnte.
2. Bereiten Sie eine Silikonwaferform für die untere Schicht vor.
   1. Entwerfen Sie den mikrofluidischen Chip mit dem CAD-Layout-Editor (Abbildung 1C). Stellen Sie sicher, dass das Design Einlässe, Flüssigkeitskanäle und -auslässe umfasst.
   2. Erstellen Sie eine Siliziumwaferform mit Hilfe der Zweischicht-Photolithographie, wie in der vorherigen Arbeit beschrieben (Abbildung 1D)¹⁶.
      HINWEIS: Die Kanäle auf der unteren Schicht haben die Größe von μm und erfordern eine präzise Fertigung, während die Kanäle auf der oberen Schicht die Größe von mm haben. Da der SLA-3D-Druck eine kürzere Fertigungszeit und damit ein schnelleres Prototyping bietet, wurde der SLA-Druck für die Herstellung ziemlich großer Strukturen für die Form der Deckschicht verwendet. Die untere Schicht wurde durch Fotolithographie hergestellt, um eine präzise Fertigung zu gewährleisten. Falls die Kanäle in der obersten Schicht ebenfalls im μm-Bereich liegen und Präzision erfordern, sollten Sie auch die Herstellung einer Form mittels Fotolithographie in Betracht ziehen.

2. Herstellung von PDMS-Doppelschicht-Mikrofluidik-Chips

1. Bereiten Sie die PDMS-Vorhärtungslösung vor, indem Sie die Basis und das Härter im Verhältnis 10:1 gründlich mischen. Entgasen Sie das Gemisch 1 h lang in einem Exsikkator.
2. Reinigen Sie die Form der Deckschicht mit IPA und trocknen Sie sie mit Druckluft.
3. Gießen Sie das PDMS in die Form der Deckschicht und härten Sie es anschließend 20 Minuten lang bei 80 °C thermisch aus (1. Aushärtungsschritt, Abbildung 1E). Der 1^. Aushärtungsschritt ermöglicht das Schälen, Schneiden und Stanzen von PDMS, während es nicht vollständig ausgehärtet ist.
4. Überprüfen Sie die PDMS-Klebrigkeit von Hand oder mit einer Pinzette nach 20 min Erhitzen. Wenn das PDMS immer noch klebrig ist, passen Sie die Aufheizzeit an.
5. Schälen Sie das PDMS aus der Deckschichtform und schneiden Sie es in einzelne Stücke (hier 20 mm x 18 mm). Stanzen Sie Löcher (Durchmesser = 0,75 mm) für Gaseinlässe (Abbildung 1F). Reinigen Sie die Unterseite der oberen Schicht, indem Sie sie mit IPA abspülen, mit Druckluft trocknen und mit Klebeband anbringen.
6. Reinigen Sie die Form der unteren Schicht mit IPA und trocknen Sie sie mit Druckluft. Fixieren Sie die untere Schichtform auf einem Schleudercoater und gießen Sie PDMS in die Mitte der Form. Gießen Sie PDMS in die Nähe des Wafers, um Luftblasen zu reduzieren. Wenn nach dem Gießen von PDMS Luftblasen gefunden werden, bewegen Sie diese mit einer sauberen Pinzette oder Nadel nach außen.
7. Schleudern Sie das PDMS 60 s lang bei 1000 U/min auf die untere Schichtform, gefolgt von einer thermischen Aushärtung bei 80 °C für 10 min (1^. Aushärtungsschritt, Abbildung 1G). Kontrollieren Sie die PDMS-Klebrigkeit nach 10 min von Hand oder mit einer Pinzette und passen Sie die Aufheizzeit bei Bedarf an.
8. Legen Sie die PDMS-Teile der oberen Schicht auf die untere PDMS-Schicht auf der Form und drücken Sie sie fest von oben, um die Oberflächenbefestigung der oberen und unteren Schicht sicherzustellen (Abbildung 1H).
9. Härten Sie das PDMS mindestens 1 h lang bei 80 °C vollständig thermisch aus (2^. Aushärtungsschritt). Der 2^. Aushärtungsschritt ermöglicht die abschließende PDMS-Aushärtung, bei der die obere und untere Schicht irreversibel miteinander verbunden werden (Abbildung 1H).
10. Schneiden Sie die PDMS-Unterlage vorsichtig in Stücke. Ziehen Sie den gesamten PDMS-Chip vorsichtig aus der Form ab (Abbildung 1H).
    HINWEIS: Wenn sich die PDMS-Späne nur schwer von der Form abziehen lassen, sollten Sie eine weitere Oberflächenbehandlung der Unterschichtform in Betracht ziehen, z. B. Silanisierung und chemische Oberflächenbeschichtung, um den Schälvorgang zu erleichtern. Wenn sich die obere und untere Schicht beim Abziehen lösen, sollten Sie die Zeit für den 1. Aushärtungsschritt verkürzen.
11. Stanzungen (Durchmesser = 0,5 mm) für Flüssigkeitsein- und -auslässe an beiden Enden der Flüssigkeitskanäle (Abbildung 1H). Reinigen Sie die Unterseite des Chips vorsichtig, indem Sie ihn mit IPA abspülen, mit Druckluft trocknen und Klebeband anbringen.
12. Verkleben Sie den Chip mit einem 0,175 mm dicken Deckglas, nachdem Sie die Oberfläche durch Plasmaoxidation aktiviert haben (25 s, Abbildung 1H).
13. Nachdem Sie den Chip auf das Glassubstrat gelegt haben, spülen Sie die obere Schicht mit Druckluft, um sicherzustellen, dass die untere Schicht der PDMS-Membran richtig mit dem Glas verbunden ist.
14. Erhitzen Sie den gebondeten Chip 10 s bis 1 min bei 80 °C, um die Bondstabilität zu erhöhen.
    HINWEIS: Der oben erwähnte PDMS-Aushärtungsschritt und die erforderliche Aushärtungszeit können von verschiedenen Parametern beeinflusst werden, wie z. B. Formdicke, Ausrüstung und Umgebungsbedingungen. Passen Sie daher die Aushärtungszeit entsprechend an, falls das vorgeschlagene Protokoll nicht für die Anwendung geeignet ist.

3. Versuchsaufbau

HINWEIS: Als Standard-Versuchsaufbau wird ein inverses Mikroskop verwendet, das mit einer CMOS-Kamera (Complementary Metal Oxide Semiconductor), einer FLIM-Kamera (Fluoreszenzlebensdauer-Bildgebungsmikroskopie) (Frequenzbereich) und einem Temperaturinkubator ausgestattet ist. Eine modulierte Anregungslaserquelle (445 nm, 100 mW) ist an die FLIM-Kamera angeschlossen. Für die Gasregelung werden drei Massendurchflussregler (Stickstoff, Sauerstoff und Kohlendioxid) verwendet. Spritzenpumpen werden für die mittlere Perfusion eingesetzt.

1. Bereiten Sie die Schläuche für die Perfusion von Gas (Einlass) und Flüssigkeit (Einlass und Auslass) vor. Schalten Sie den Inkubator ein, um vor dem Experiment die gewünschte Temperatur (hier 37 °C) zu erreichen.
2. Wählen Sie ein gewünschtes Objektiv aus (hier 20x für die Sauerstoffmessung und 100x für die mikrobielle Beobachtung) und fügen Sie bei Bedarf Immersionsöl hinzu. Befestigen Sie den Doppelschicht-Chip mit Klebstoffen auf einem Chiphalter.

4. On-Chip-Sauerstoffkontrolle und -messung

1. Bereiten Sie eine sauerstoffempfindliche Farbstofflösung mit geeigneter Konzentration vor (hier 3 mM Tris(2,2'-bipyridyl)dichlororuthenium(II)hexahydrat, RTDP).
2. Kalibrieren Sie die FLIM-Kamera anhand eines Referenzdias mit bekannter Lebensdauer (hier 3,75 ns). Messen Sie die Signalintensität mit der FLIM-Kamera und passen Sie die Belichtungszeit oder die Mikroskopblende an, um eine Signalintensität von 0,68 - 0,72 für eine bessere Kalibrierung zu erreichen.
3. Befestigen Sie den Chiphalter auf dem Mikroskoptisch. Schließen Sie die entsprechenden Schläuche an den Flüssigkeitseinlass und -auslass an. Beginnen Sie mit der Perfusion der sauerstoffempfindlichen Farbstofflösung bei konstanter Durchflussrate mit einer Spritzenpumpe (hier 100 nL/min).
4. Verbinden Sie den Gaseinlass und die Massendurchflussregler mit den entsprechenden Schläuchen. Beginnen Sie mit dem Spülen des Gases mit kontrollierter Sauerstoffkonzentration (hier 0 % oder 21 % Sauerstoff, Gesamtmassendurchfluss 600 mL/min).
5. Die Lebensdauer der Phase in Abwesenheit von Sauerstoff (τ₀) und bei einer anderen bekannten Sauerstoffkonzentration (hier bei 21 %) wird gemessen. Berechnen Sie die Quenchkonstante (K_q) mit der Stern-Volmer-Gleichung, die die Fluoreszenzlöschung in Gegenwart von Sauerstoff beschreibt. Alternativ kann die Fluoreszenzintensität (I) verwendet werden; Die intensitätsbasierte Messung kann jedoch durch Schwankungen der Lichtquellenintensität, Photobleichen usw. beeinflusst werden.
   
   HINWEIS: Es wird empfohlen, nach Beginn der Gasspülung einige Minuten zu warten, um eine genaue Kalibrierung zu gewährleisten, insbesondere wenn ein Sauerstoffmangel von nur 0 % angestrebt wird. Um die Präzision zu verbessern, sollten Sie den Prozess durch zusätzliche Sauerstoffentzugsmethoden ergänzen, z. B. durch den Einsatz von Sauerstofffängern oder eine zusätzliche geschlossene Kammer.
6. Messen Sie die Lebensdauer der Phase und berechnen Sie die entsprechende Sauerstoffkonzentration mit der Stern-Volmer-Gleichung. Um oszillierende Sauerstoffbedingungen zu erzeugen, verwenden Sie ein beliebiges Instrumentensteuerungssystem, um die Volumenströme für Stickstoff und Sauerstoff automatisch anzupassen.

5. Vorbereitung der Bakterienkultur

1. . Starten Sie eine Vorkultur, indem Sie einen gewünschten Organismus (hier E. coli MG1655, einzelne gebrauchsfertige Kügelchen aus einem Kryo-Fläschchen pro Kolben) in ein gewünschtes Medium (hier LB-Medium bestehend aus 10 g/L Pepton, 5 g/L Hefeextrakt und 10 g/L NaCl) inokulieren und über Nacht inkubieren (hier 37 °C bei 150 U/min).
2. Messen Sie die resultierende optische Dichte mit einem Photometer bei 600 nm (OD₆₀₀).
3. Initiieren Sie die nächste Kultur im LB-Medium, indem Sie die Vorkultur inokulieren (hier anfänglicher OD₆₀₀ = 0,3 oder 0,0001). Inkubieren Sie die Kultur, bis sie die exponentielle Wachstumsphase erreicht.
   ANMERKUNG: Wenn sich das Medium für die On-Chip-Kultivierung von dem ersten Vorkulturmedium unterscheidet, ist es wünschenswert, eine zweite Vorkultur mit dem Medium für die On-Chip-Kultivierung durchzuführen, damit sich die Organismen mit einem neuen Medium¹⁶ vertraut machen können.
4. Bereiten Sie eine Aussaatlösung vor, indem Sie die Kultur auf eine geeignete optische Dichte verdünnen. Füllen Sie die Aussaatlösung für den nächsten Schritt in eine 1-ml-Spritze um. Für E. coli betrug die optische Dichte (OD₆₀₀) der Aussaatlösung etwa 0,5.

6. Mikrobielle Kultivierung auf dem Chip und Zeitraffer-Bildgebung unter kontrollierten Sauerstoffbedingungen

1. Befestigen Sie den Chiphalter auf dem Mikroskoptisch. Lassen Sie den Chiphalter und den PDMS-Chip im Inkubator (hier 37 °C) mehrere Stunden aufwärmen, da dies das Risiko einer Defokussierung während der Zeitrafferaufnahme aufgrund temperaturbedingter Verschiebung verringert.
2. Bevor Sie mit der Kultivierung beginnen, beginnen Sie mit der Begasung mit der gewünschten anfänglichen Sauerstoffkonzentration, indem Sie den volumetrischen Prozentsatz des Sauerstoff- und Stickstoffmassenstroms anpassen, während die Gesamtdurchflussrate und der Kohlendioxiddurchfluss konstant bleiben.
3. Verbinden Sie den Gaseinlass des Chips mit den Massendurchflussreglern.
4. Säen Sie den Organismus in den Chip ein, indem Sie die Spritze mit der Aussaatlösung mit dem Flüssigkeitsauslass verbinden und die Spritze manuell drücken. Prüfen Sie durch das Mikroskop, ob Zellen erfolgreich in den Kultivierungskammern gefangen werden.
5. Entfernen Sie nach der Zellinokulation die Spritze und verbinden Sie eine weitere Spritze mit dem frischen Medium mit dem Flüssigkeitseinlass. Drücken Sie die Spritze manuell, um alle verbleibenden Zellen im Zuführkanal des Mediums zu spülen.
6. Beginnen Sie mit der Perfusion des Mediums bei einer konstanten Durchflussrate (hier 100 nL/min) mit der Spritzenpumpe. Sorgen Sie für eine ausreichende Durchflussmenge, da eine unzureichende Durchflussmenge zum Austrocknen der Kammer führen kann. Die ausreichende Durchflussrate kann in Abhängigkeit von mehreren Faktoren variieren, einschließlich der Geometrie des Flüssigkeitskanals und der Gasdurchflussrate im Kanal der obersten Schicht.
7. Starten Sie die Zeitraffer-Bildaufnahme. Für die Kultivierung unter oszillierenden Sauerstoffbedingungen ist die automatische Steuerung der Massendurchflussregler gleichzeitig mit dem Start der Bildaufnahme zu starten. Falls es zu einer Verzögerung beim Start der Gasregelung und der Bildaufnahme kommt, berücksichtigen Sie die Verzögerung bei der späteren Bilddatenanalyse.

7. Analyse von Bilddaten

1. Speichern Sie das Zeitrafferbild als einen Bildstapel pro Position.
2. Verarbeiten Sie das Bild vor, um die kultivierte Kolonie mithilfe von Bildanalyseprogrammen zu drehen, auszurichten und zu beschneiden. Beispiele für vorverarbeitete . TIF-Bilder finden Sie hier: https://doi.org/10.5281/zenodo.13982747¹⁵
3. Segmentieren Sie Zellen und extrahieren Sie relevante Werte wie Zellzahl, Länge, Fläche, Fluoreszenzintensität usw. Analysieren Sie das Wachstumsverhalten weiter. Beispiel-Python-Skripte finden Sie hier: https://github.com/JuBiotech/Supplement-to-Kasahara-et-al.-2025¹⁵

Ergebnisse

PDMS-Doppelschicht-Chip-Herstellung
Der gefertigte Doppelschicht-Chip ist in Abbildung 2A dargestellt, mit farbigen Gaskanälen (rot) und Flüssigkeitskanälen (blau) zur Visualisierung. Der Chip verfügt über drei identische Flüssigkeitskanäle und überlappende Gaskanäle, um parallele Experimente zu ermöglichen. Der Fluidkanal hat einen Kultivierungsbereich mit einer Reihe von Kultivierungskammern (Abbildung 2A(i)). Die Zellen werden in den Kultivierungskammern gefangen und in einem Monolayer-Format wachsen gelassen, was eine hochauflösende Zeitrafferbildgebung mit einer hohen Bildaufnahmerate ermöglicht. Der Querschnitt des Chips zeigt eine 3 mm dicke Deckschicht und eine 65 μm dicke Unterschicht, die eine schnelle Gasdiffusion vom Gaskanal zum Fluidkanal durch die intermediäre PDMS-Membran ermöglicht (Abbildung 2A (ii-ii')).

Sauerstoffkontrolle auf dem Chip
Die Gasaustauschfähigkeit des entwickelten Chips wurde mit FLIM und dem sauerstoffempfindlichen Farbstoff¹⁵ getestet. Wie in Abbildung 2B gezeigt, zeigte die Sauerstoffkonzentration im Flüssigkeitskanal innerhalb von zehn Sekunden entweder eine entsprechende Abnahme oder einen Anstieg, wenn die Sauerstoffkonzentration zwischen 21 % und 0 % verschoben wurde. Diese Ergebnisse der Sauerstoffmessung zeigen, dass die schnelle Sauerstoffoszillation in Dutzenden von Sekunden in dem entwickelten doppelschichtigen Mikrofluidik-Chip repliziert werden kann.

Mikrobielle Kultivierung unter konstanten Sauerstoffbedingungen
Der Chip wurde zunächst eingesetzt, um das fakultative Wachstum von anaeroben E. coli unter konstanten gasförmigen Bedingungen mit verschiedenen Sauerstoffkonzentrationen zu charakterisieren. Kohlendioxid wurde dem Versorgungsgas immer zugesetzt, da wir in vorläufigen Experimenten ein begrenztes Wachstum von E. coli unter Abreicherung von Kohlendioxid beobachteten (Daten nicht gezeigt). Abbildung 3A und Abbildung 3B zeigen repräsentative Phasenkontrastbilder von E. coli unter aeroben (21 % Sauerstoffversorgung) bzw. anaeroben (0 % Sauerstoffversorgung) Bedingungen. Nach 3 Stunden Kultivierung führten E. coli, die unter aeroben Bedingungen gezüchtet wurden, zu größeren Kolonien im Vergleich zu anaeroben Bedingungen. Die quantitative Analyse zeigt auch unterschiedliche Anstiegsraten der Koloniegröße (_A-Kolonie) in Abhängigkeit von der Sauerstoffverfügbarkeit, wie in den Wachstumskurven in Abbildung 3C dargestellt. Beachten Sie, dass eine_Kolonie nach Anfangsfläche normalisiert wird, um einen Vergleich über verschiedene Kolonien und Bedingungen hinweg zu ermöglichen. Die exponentielle Wachstumsrate μ kann aus der Wachstumskurve wie folgt ermittelt und in Abbildung 3D zusammengefasst werden.

Die Ergebnisse bestätigen die Fähigkeit des Geräts, den Sauerstoff in bestimmten Konzentrationen zu kontrollieren und das entsprechende mikrobielle Wachstum aus den aufgenommenen Zeitrafferbildern effektiv zu analysieren.

Mikrobielle Kultivierung unter oszillierenden Sauerstoffbedingungen
Schließlich wurde E. coli unter oszillierenden Sauerstoffbedingungen kultiviert, wobei zwischen aeroben und anaeroben Begasungsphasen mit einem Schaltintervall T' gewechselt wurde. Verschiedene T' zwischen 60 min und 1 min wurden untersucht, um die Fähigkeit zur zeitaufgelösten Wachstumsanalyse in Korrelation mit oszillierenden Sauerstoffbedingungen zu testen. Abbildung 4 zeigt das quantifizierte Wachstum von E. coli unter oszillierenden Sauerstoffbedingungen mit T' = 60, 30, 10, 5, 2 und 1 min. Neben der Wachstumskurve basierend auf der_A-Kolonie wird auch die momentane Wachstumsrate μ_Δt bestimmt, um zeitaufgelöste Erkenntnisse wie folgt zu gewinnen.

Die Wachstumsraten unter konstanten aeroben und anaeroben Bedingungen sind ebenfalls mit gestrichelten Linien (μ_{21 %,} μ_{0 %)} in Abbildung 4 als Wachstumsreferenzen dargestellt. Das Wachstum von E. coli zeigte eine ausgeprägte Dynamik als Reaktion auf oszillierende gasförmige Bedingungen. Zum Beispiel, nachdem die Begasungsphase von aeroben auf anaerobe Bedingungen umgestellt worden war (T' = 60 min), zeigte das Wachstum (i) Reaktionsphase: plötzliche Abnahme der Wachstumsrate, gefolgt von (ii) Erholungsphase: allmähliche Zunahme der Wachstumsrate und (iii) Stabilisierungsphase: Wachstumsstabilisierung um μ₀%. Die Wachstumsdynamik von E. coli wurde unter verschiedenen T' in nur 1 Minute zeitlich erfolgreich aufgelöst, wobei E. coli aufgrund der begrenzten Zeit für die Anpassung des Wachstums an sich verändernde gasförmige Bedingungen eine monotone Wachstumsrate auf und ab zeigte. Darüber hinaus kann das Wachstumsverhalten nicht nur auf Kolonieebene, sondern auch auf Einzelzellebene analysiert werden. Abbildung 5 veranschaulicht die Entwicklung des einzelligen Bereichs unter Sauerstoffschwingungen in verschiedenen Schaltintervallen T'. Das Wachstum einzelner Zellen kann abgeleitet werden, indem benachbarte Diagramme verfolgt werden, ohne die Analyse zu verfolgen. Das Wachstumsverhalten auf Einzelzellebene ähnelt dem, was auf Kolonieebene in Abbildung 4 beobachtet wurde; eine schnellere Flächenvergrößerung während der aeroben Begasungsphase und eine deutliche Änderung der Wachstumsgeschwindigkeit beim Gaswechsel. Die Ergebnisse zeigen die Fähigkeit, Mikroben unter oszillierenden gasförmigen Bedingungen zu kultivieren und das mikrobielle Wachstum in Korrelation mit der Sauerstoffverfügbarkeit zeitaufgelöst zu analysieren.

Abbildung 1: Verfahren zur Herstellung von Doppelschichtchips. Das Verfahren beginnt mit der Konstruktion von (A, C), der Herstellung von Formen (B, D), dem PDMS-Formgebung (E-G) und der Montage von (H). Diese Zahl wurde von¹⁵ geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Gefertigter Doppelschicht-Chip und seine Fähigkeit zur Sauerstoffkontrolle. (A) Es wird das repräsentative Bild des hergestellten Chips dargestellt, mit farbigen Gaskanälen (rot) und Flüssigkeitskanälen (blau) zur Visualisierung. Das REM-Bild ist in (i) dargestellt und zeigt eine Reihe von Kultivierungskammern, die auf beiden Seiten mit Flüssigkeitskanälen verbunden sind (Maßstabsbalken 100 μm). Der Querschnitt des Chips ist in (ii-ii') dargestellt, das die 3 mm dicke Deckschicht und die 65 μm dicke Unterschicht darstellt. (B) Die gemessene Sauerstoffkonzentration im Flüssigkeitskanal nach dem Umschalten zwischen aeroben (21 % Sauerstoff) und anaeroben (0 % Sauerstoff) Bedingungen. Diese Zahl wurde von¹⁵ geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Kultivierung von E. coli unter konstanten Sauerstoffbedingungen. (A) Die Zellen werden 3 h lang aerob kultiviert (21 % Sauerstoffversorgung) und Zeitrafferbilder werden mit Hilfe der Phasenkontrastmikroskopie aufgenommen. (B) Die Zellen werden anaerob kultiviert (0% Sauerstoffversorgung) und Zeitrafferbilder werden für 3 Stunden aufgenommen. (C) Das Zellwachstum unter verschiedenen konstanten Sauerstoffbedingungen wird auf der Grundlage einer_A-Kolonie aufgetragen. (D) Die exponentielle Wachstumsrate wird berechnet und zusammengefasst. Alle Maßstabsleisten = 5 μm. Die Daten werden als Mittelwert ± S.D. n = 35 Kolonien (0 %), 27 (0,1 %), 21 (0,5 %), 16 (1 %), 13 (5 %), 13 (10 %), 29 (21 %) ausgedrückt. Diese Zahl wurde von¹⁵ geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Kultivierung von E. coli unter oszillierenden Sauerstoffbedingungen. Es wird das Zellwachstum unter verschiedenen oszillierenden Sauerstoffbedingungen untersucht (T', Schaltintervall zwischen aeroben und anaeroben Bedingungen). Das Zellwachstum basierend auf der_A-Kolonie wird über die Zeit aufgetragen (oben), und μ_Δt wird über die Zeit aufgetragen, um eine zeitaufgelöste Dateninterpretation zu ermöglichen (unten). Die Daten werden als Mittelwert ± S.D. n = 5 Kolonien (60 min), 3 (30 min), 4 (10 min), 4 (5 min), 4 (2 min), 5 (1 min) ausgedrückt. Diese Zahl wurde von¹⁵ geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Einzellige Fläche (eine _{einzelne Zelle} ) von E. coli , kultiviert unter oszillierenden Sauerstoffbedingungen. Die Daten stammen von einer repräsentativen Kolonie aus jedem Schaltintervall T'. Diese Zahl wurde von¹⁵ geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Das Protokoll für die Herstellung und den Betrieb eines zweischichtigen mikrofluidischen Systems wurde zur Verfügung gestellt, um das mikrobielle Wachstum unter schnell oszillierenden Sauerstoffbedingungen mit hoher raumzeitlicher Auflösung zu beobachten. In Verbindung mit der Zeitraffer-Bildgebung ermöglicht diese Plattform die On-Chip-Kultivierung und Echtzeitüberwachung von Mikroorganismen unter kontrollierten Sauerstoffbedingungen, wodurch das mikrobielle Wachstum in Korrelation mit der Sauerstoffverfügbarkeit analysiert werden kann.

Bei diesem Protokoll werden die obere und untere Schicht separat vorbereitet und dann zu einem einzigen Chip zusammengefügt. Dieses modulare Konzept ermöglicht verschiedene Chip-Designs, indem einfach die zweischichtigen Konfigurationen ausgetauscht werden. Für die Formen der oberen und unteren Schicht wurden unterschiedliche Herstellungsmethoden verwendet - SLA-3D-Druck für die Oberseite und Fotolithografie für die Unterseite - basierend auf ihren jeweiligen Größen- und Genauigkeitsanforderungen. Dieser Ansatz verbessert die Gesamteffizienz des Herstellungsprozesses. Die Montage der beiden Schichten erfolgt durch einen zweistufigen PDMS-Härtungsprozess. Es ist wichtig, die Aufheizzeit für den ersten Aushärtungsschritt entsprechend der Konstruktion zu optimieren, da die Formdicke und die lokalen Heizbedingungen die PDMS-Härtungsergebnisse beeinflussen können.

Wir nutzen die Natur des PDMS, das sehr luftdurchlässig ist, um eine schnelle Sauerstoffumschaltung zu erreichen. Andererseits kann die Präzision der Sauerstoffregelung auch durch die passive Diffusion von Sauerstoff durch PDMS beeinträchtigt werden, insbesondere bei niedrigeren Sauerstoffgehalten. Um diese Einschränkung zu kompensieren, können weitere Verbesserungen am Protokoll vorgenommen werden. So bietet beispielsweise die Kalibriermethode für den Sauerstoffsensor Verbesserungspotenziale. Im demonstrierten Protokoll wird der Sensor an zwei Referenzpunkten, 0 % und 21 % Sauerstoffgehalt, unter Verwendung des PDMS-Doppelschichtchips kalibriert. Folglich hängt die Präzision der Sauerstoffmessung von der Fähigkeit ab, genaue sauerstoffarme Bedingungen für die Kalibrierung zu schaffen. Wie im Protokoll erwähnt, wird empfohlen, nach Beginn der Gasspülung einige Minuten zu warten, um eine genaue Kalibrierung zu gewährleisten, insbesondere wenn ein Sauerstoffmangel von nur 0 % angestrebt wird. Dennoch ist diese Aufgabe aufgrund möglicher Leckagen oder Luftrückhalte im luftdurchlässigen PDMS-Chip eine Herausforderung. Die Kalibriergenauigkeit kann weiter verbessert werden, indem sauerstoffabsorbierende Chemikalien verwendet oder der Chip in einer dicht verschlossenen, gasarmen Kammer^{eingeschlossen wird 17,18}. Diese Nahrungsergänzungsmittel könnten eine robustere und präzisere Analyse des mikrobiellen Verhaltens unter streng anaeroben und sauerstoffarmen Bedingungen ermöglichen.

Das demonstrierte Gerät wäre für verschiedene Forschungsbereiche von Interesse. Zum Beispiel wäre es nützlich, um die Sauerstoffbedingungen in industriellen Bioreaktoren zu replizieren, bei denen davon ausgegangen wird, dass die Sauerstoffverfügbarkeit räumlich und zeitlich inhomogen ist 7,8,19,20. Die Verwendung des Doppelschicht-Chips ermöglicht es den Forschern, das mikrobielle Verhalten unter schnell fluktuierenden Sauerstoffumgebungen zu charakterisieren und zu verstehen, was in herkömmlichen Kultivierungsanlagen nicht möglich war.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Clewin 5	WieWeb software, Niederlande	N/A	Layout-Editor
CMOS-Kamera	Nikon, Japan	DS-Qi2
Deckglas	Schott AG, Deutschland	D263 Bio	39,5 mm x 34,5 mm x 0,175 mm
Femto-Plasma-Reiniger	Diener Electronics, Deutschland	-	Chip-Plasma-Bonding
Formular 3B	Formlabs, USA	-	3D-Drucker
Lebenslange Referenz	Starna Scientific, Großbritannien	UMM-SFG
Massendurchflussregler	Vö gtlin Instruments GmbH, Schweiz	GSC-A9SA-BB22	Stickstoff, Sauerstoff
Massendurchflussregler	Vö gtlin Instruments GmbH, Schweiz	GSC-A9SA-BB21	Kohlendioxid
Modell v3 Harz	Formlabs, USA	RS-F2-DMBE-03	3D-Druck-Harz
NaCl	Carl Roth, Deutschland	3957.1	LB mittlere Komponente
Nikon Eclipse Ti-E 2	Nikon, Japan	-	Inverses Mikroskop
pco.flim Kamera	PCO AG, Deutschland	-
pco.flim Laser	Omicron-Laserprodukte GmbH, Deutschland	-
Pepton	Carl Roth, Deutschland	8986.1	LB mittlere Komponente
Plan Apo λ	Nikon, Japan	-	100x Öl, 20x
Polydimethylsiloxan (PDMS)	Dow Chemical Company, USA	Sylgard 184 Silikon-Elastomer-Kit
Stanzwerkzeug, Φ 0,50 mm	World Precision Instruments, USA	504528
Stanzwerkzeug, Φ 0,75 mm	World Precision Instruments, USA	504529
ROTI Store Kryo-Fläschchen	Carl Roth, Deutschland	-
Solidworks 2016 x64 Edition	Dassault Systems, Frankreich	N/A	3D-CAD
Substrat-Schleuderbeschichter	APT Automation, Deutschland	SPIN150i	PDMS-Schleuderbeschichtung
Spritzenpumpe	CETONI, Deutschland	neMESYS
Temperatur-Inkubator	Okolab, Italien	-	Ausrüstung für Mikroskope
Tris(2,2'-bipyridyl)dichloruthenium(II)hexahydrat, (RTDP)	Acros Organics, Belgien	208750010
Verrohrung	Saint-Gobain, Frankreich	Tygon F-4040-A	Schlauch für Gaseinlass
Verrohrung	Saint-Gobain, Frankreich	Tygon AAD04103	Schläuche für Flüssigkeiten
Hefeextrakt	Carl Roth, Deutschland	2363.3	LB mittlere Komponente