Multimodale räumliche Metabolomik mit mikroskopisch geführter Massenspektrometrie-Bildgebung im mittleren Infrarot

Summary

Wir präsentieren einen multimodalen räumlichen Metabolomik-Workflow, der massenspektrometrische Bildgebung (MSI) und Bildgebung im mittleren Infrarot (MIR) auf demselben Gewebeschnitt für eine ortsaufgelöste metabolische und biochemische Analyse integriert.

Abstract

Die räumliche Metabolomik ist ein sich schnell entwickelndes Gebiet, um die Verteilung von Metaboliten in Geweben, Organen und sogar einzelnen Zellen abzubilden. Dieser Ansatz liefert kontextuelle metabolische Informationen, die für das Verständnis der biochemischen Heterogenität biologischer Systeme entscheidend sind. Die Bildgebung im mittleren Infrarot (MIR) und die Massenspektrometrie-Bildgebung (MSI) haben sich als leistungsstarke Ansätze für die räumliche Metabolomik herausgestellt, die jeweils einzigartige und komplementäre Vorteile bieten. In dieser Studie stellen wir einen Arbeitsablauf für die Durchführung von MIR-Bildgebung und matrixgestützter Laserdesorptionsionisations-MSI (MALDI-MSI) am selben Gewebeschnitt vor, der experimentelle Verfahren, die Co-Registrierung der Bildgebung, die Datenintegration und die bioinformatische Analyse umfasst. Als vorgeschaltete Modalität wird die MIR-Bildgebung eingesetzt, die eine zerstörungsfreie biochemische Analyse von Geweben ermöglicht. Anschließend wird eine Matrix für MALDI-MSI im Gewebe abgelagert, die sich an den räumlichen Informationen orientiert, die aus der MIR-Bildgebung gewonnen werden. Die Bilder werden nach der Co-Registrierung integriert, was eine multimodale räumliche Metabolomik-Analyse mit fortschrittlichen Bioinformatik-Tools wie Seurat ermöglicht. Die Integration von MIR-Bildgebung und MSI stellt einen transformativen Fortschritt in der räumlichen Metabolomik dar und bietet beispiellose Möglichkeiten, die räumliche und chemische Komplexität von Stoffwechselprozessen sowohl bei Gesundheit als auch bei Krankheit zu erforschen. Dieser multimodale Ansatz birgt ein erhebliches Potenzial für die Förderung von Innovationen in der Biomarkerforschung, der Krankheitsdiagnostik und der therapeutischen Entwicklung.

Introduction

Bei der räumlichen Metabolomik werden Metaboliten in ihrem nativen Gewebekontext kartiert, indem massenspektrometrische Bildgebung (MSI) oder andere ortsaufgelöste Techniken mit der Stoffwechselanalyse integriert werden, um Einblicke in den Stoffwechsel mit subgewebelicher, zellulärer oder subzellulärer Auflösung zu erhalten 1,2,3,4,5,6,7,8 . Unter diesen Bildgebungsmodalitäten gewinnt die Mikroskopie im mittleren Infrarot (MIR) zunehmend an Aufmerksamkeit, da sie Biomoleküle auf der Grundlage des molekularen Schwingungskontrasts chemisch kartieren^kann 4,7,9,10,11,12. Die zerstörungsfreie, markierungsfreie, hohe Geschwindigkeit und Kosteneffizienz 4,7,9,10,11,12 macht die MIR-Bildgebung besonders geeignet für die Integration mit MSI und bildet einen vielversprechenden multimodalen Ansatz für eine umfassende räumliche Analyse.

Die matrixgestützte Laserdesorptionsionisations-MSI (MALDI-MSI) ist eine der am weitesten verbreiteten Techniken in der räumlichen Metabolomik (Abbildung 1A)¹³. Es ermöglicht den Nachweis eines breiten Spektrums von Metaboliten, einschließlich Lipiden, Aminosäuren, Zuckern, Nukleotiden und Sekundärmetaboliten, mit hoher Empfindlichkeit¹. Fortschritte bei der Matrixauswahl (z. B. 2,5-Dihydroxybenzoesäure [DHB], 9-Aminoacridin [9AA] oder N-(1-Naphthyl)-ethylendiamindihydrochlorid [NEFZ]) und Ionisationstechniken (z. B. Nachionisationsmethoden) haben die Nachweisabdeckung weiter erweitert, insbesondere für Spezies mit geringer Abundanz und schlecht ionisierbare^{Spezies 14}. Moderne MALDI-MSI-Systeme unterstützen Abbildungsgeschwindigkeiten von typischerweise 5 bis 50 Pixeln pro Sekunde, abhängig von der räumlichen Auflösung und der Art des verwendeten Massenanalysators (z. B. Time-of-Flight [TOF], Orbitrap oder Fourier-Transformations-Ionenzyklotronresonanz [FT-IRC]). Bemerkenswert ist, dass die Hochgeschwindigkeits-MALDI-TOF-Instrumente Raten von mehr als 100 Pixeln pro Sekunde erreicht haben, was eine großflächige Bildgebung innerhalb weniger Stunden ermöglicht¹⁵. Die räumliche Auflösung von MALDI-MSI liegt im Allgemeinen zwischen 5 und 50 μm, was ausreicht, um zelluläre und sogar subzelluläre Strukturen aufzulösen^16,17. Eine höhere räumliche Auflösung geht jedoch in der Regel auf Kosten längerer Erfassungszeiten, eines geringeren Signal-Rausch-Verhältnisses und eines höheren Rechenaufwands bei der Datenverarbeitung.

Im Gegensatz zu MSI handelt es sich bei der MIR-Bildgebung um einen optischen Weitfeldansatz⁴, der von Natur aus zerstörungsfrei und mit hohem Durchsatz ausgestattet ist. Jüngste Fortschritte bei Hochleistungs-Quantenkaskadenlasern (QCLs) ermöglichen ein neues Framework, das als diskrete Frequenzinfrarot-Bildgebung (DFIR) bekannt ist und die Bildgebungsgeschwindigkeit bis zur Videorate erheblich erhöht (Abbildung 1B)^12,18. Darüber hinaus haben QCL-Quellen ungekühlte Mikrobolometer-Detektoren für die MIR-Bildgebung nutzbar gemacht, was die Verwendung von größeren Focal Plane Array (FPA)-Detektoren ermöglicht¹². Als Ergebnis kann ein einfrequentes MIR-Bild über einen Bereich von 1 cm² mit einer zellulären Auflösung (~5 μm) in nur wenigen Sekunden aufgenommen werden. Die MIR-Bildgebung kann sowohl im markierungsfreien als auch im markierten Modus betrieben werden. In früheren Studien ^4,19,20 wurden kleine IR-aktive Schwingungssonden eingeführt, um die Kinetik verschiedener Stoffwechselaktivitäten in situ zu überwachen. Diese Sonden ermöglichen die Echtzeit-Verfolgung von Stoffwechselwegen, indem sie globale chemische Umwandlungen über einzigartige MIR-Spektralbänder melden⁴. So bietet die MIR-Bildgebung sowohl statische biochemische Profilerstellung als auch dynamisches metabolisches Monitoring mit hoher räumlicher Auflösung und schneller Erfassungsgeschwindigkeit.

In diesem Manuskript stellen wir einen umfassenden Workflow zur Durchführung von MIR-gesteuerter räumlicher MALDI-MSI-Metabolomik vor und demonstrieren die Machbarkeit, beide Modalitäten aus derselben Probe zu erfassen (Abbildung 2, Abbildung 3). Durch die Integration von MIR-Bildgebung mit MSI etablieren wir einen multimodalen Ansatz, der die komplementären Stärken der einzelnen Techniken nutzt. Die MIR-Bildgebung ermöglicht eine schnelle, markierungsfreie biochemische Kartierung des gesamten Objektträgers mit zellulärer Auflösung und dient als wertvoller Leitfaden für die Auswahl der Region of Interest (ROI) bei der anschließenden MSI-Erfassung. Diese Strategie ermöglicht einen gezielteren und effizienteren MSI-Workflow, reduziert die Erfassungszeit und -kosten und verbessert gleichzeitig die Interpretierbarkeit und biologische Relevanz der räumlichen Metabolomik-Daten. Im Gegenzug liefert MSI hochdetaillierte molekulare Annotationen der MIR-Hyperspektralbilder, die ein tieferes Verständnis der Gewebebiochemie ermöglichen. Insgesamt birgt dieser integrierte Ansatz ein großes Potenzial für die Weiterentwicklung der Biomarkerforschung, der Krankheitsdiagnostik und der therapeutischen Entwicklung.

Protocol

Das Protokoll wurde in Übereinstimmung mit dem Tierversuchsprotokoll (DSF-2024-004) durchgeführt, das vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Laboratory Animal Resources Center an der Universität Fudan genehmigt wurde.

HINWEIS: Diese Studie bietet einen Arbeitsablauf für die Durchführung von MIR-Bildgebung und MALDI-MSI am selben Gewebeschnitt. Dieser integrierte Ansatz umfasst experimentelle Verfahren, Bildkoregistrierung, Datenfusion und nachgelagerte bioinformatische Analyse (Abbildung 1C). Die MIR-Bildgebung wird als vorgeschaltete Modalität verwendet und ermöglicht eine zerstörungsfreie, markierungsfreie biochemische Kartierung des Gewebes. Geleitet von den räumlichen Informationen aus der MIR-Bildgebung wird anschließend eine Matrix für die MALDI-MSI-Erfassung aufgebracht. Nach einer präzisen Co-Registrierung werden die Datensätze für eine multivariate Co-Analyse integriert (Abbildung 4), die eine umfassende räumliche Metabolomik durch fortschrittliche Berechnungswerkzeuge ermöglicht.

1. Vorbereitung der Probe

1. Vorbereitung von Gewebeproben
   1. Entnahme von Gewebe bei Mäusen
      1. Haltung von C57BL/6J-Mäusen (20 Wochen alt, 40 g) unter spezifischen pathogenfreien (SPF) Bedingungen, die in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus gehalten werden und ad libitum Zugang zu Futter und Wasser erhalten, um eine optimale Gesundheit vor dem Experiment zu gewährleisten.
      2. Betäuben Sie die Maus durch intraperitoneale Injektion von Pentobarbital-Natrium in einer Dosis von 50 mg/kg Körpergewicht, um eine tiefe Anästhesie zu gewährleisten. Überwachen Sie das Tier und bestätigen Sie das Fehlen von Pedal- und Hornhautreflexen, bevor Sie mit der Perfusion fortfahren.
      3. Perfundieren Sie etwa 20–30 ml heparinhaltiges kaltes PBS (5 IE/ml) 6 Minuten lang bei einem kontrollierten Druck von 150 mmHg durch den linken Ventrikel, um das Blut auszuspülen und das Organ vor der Entnahme zu entbluten.
      4. Alle gesammelten Gewebe werden sofort mit flüssigem Stickstoff abgeschreckt und für die weitere Analyse bei -80 °C gelagert.
         HINWEIS: Schnelles Einfrieren ist unerlässlich, um die Bildung von Eiskristallen zu verhindern, die die Gewebemorphologie verfälschen können.
   2. Gewebeeinbettung und Kryo-Schnitte
      1. Stellen Sie das Mikrotom auf -20 °C ein und dekontaminieren Sie die Kammer und die Klinge mit Ethanol (EtOH), um das restliche Einbettungsmedium zu entfernen. Lassen Sie den CaF_{2-Objektträger} , den Objektträger-Versandbehälter, den Probenhalter und die Gewebeprobe im Kryostaten äquilibrieren.
      2. Schneiden Sie das Gewebe auf ca. 5 mm × 5 mm × 3 mm ab. Betten Sie es in 10 % Gelatine in einem Standard-Kryomold bei -20 °C ein und sorgen Sie so für die richtige Ausrichtung beim Schneiden. Frieren Sie die eingebettete Probe auf Trockeneis ein und lagern Sie sie bis zur Kryosektion bei -80 °C.
      3. Extrahieren Sie das Gewebe aus der Form, schneiden Sie überschüssiges Material ab, um die Schnittbildung zu optimieren, und befestigen Sie es mit Reinstwasser auf dem Probenhalter, um eine stabile Haftung zu gewährleisten.
      4. Schneiden Sie 10 μm dicke Profile und immobilisieren Sie die Profile auf vorbeschichteten CaF_2-Substraten und lagern Sie sie bei -80 °C.
      5. Legen Sie die montierten Gewebeschnitte vor der Bildgebung im mittleren Infrarot in einen Vakuum-Gefriertrockner. Stellen Sie den Kammerdruck auf 0,1 mPa und die Temperatur auf -100 °C ein. Trocknen Sie die Proben 30 Minuten lang.
2. Vorbereitung von Zellproben
   1. 1,25 × 10⁵ HeLa-Zellen auf kreisförmige CaF_2-Substrate mit einem Durchmesser von 13 mm säen, die in Standardkulturplatten platziert werden. Verwenden Sie Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) mit hohem Glukosegehalt, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin. Die Zellen werden unter Standardkulturbedingungen (37 °C, 5 % CO₂) 24 h lang inkubiert.
   2. Entfernen Sie nach 24 Stunden vorsichtig das Medium und fixieren Sie die Zellen, indem Sie sie 20 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) in 4 % Paraformaldehyd (PFA) inkubieren, das in PBS-Puffer gelöst ist.
   3. Spülen Sie die fixierten Zellen dreimal mit HBSS-Puffer und waschen Sie sie dann drei weitere Male mit ddH₂O.
   4. Trocknen Sie die CaF_2-Substrate vollständig an der Luft, bevor Sie mit der MIR-Bildgebung fortfahren.

2. Multimodale Bilderfassung

1. Quantenkaskadenlaser (QCL) MIR-Bilderfassung
   1. Führen Sie QCL MIR-Bildgebungsmikroskopie mit einem QCL-MIR-Mikroskop durch, das mit einem Nicht-N 2-Flüssigkeits-gekühlten Mikrobolometer 520 × 480 FPA-Detektor (Focal Plane Array) und einer Technologie zur Reduzierung der räumlichen Kohärenz ausgestattet ist.
   2. Wählen Sie einen Spektralbereich von 950 ^cm-1 bis 1800 ^cm-1.
   3. Verwenden Sie ein 4×-Objektiv mit einer numerischen Apertur (NA) von 0,6, was zu einer nominalen Pixelgröße von 4,25 μm führt.
   4. Erfassen Sie ein Hintergrundspektrum auf einem sauberen CaF_2-Substrat mit einer spektralen Auflösung von 4 ^cm-1 .
   5. Wählen Sie den Aufnahmebereich basierend auf der Gewebemorphologie aus und sammeln Sie spektrale Daten mit einer spektralen Auflösung von 4 ^cm-1. Bei dieser spektralen Auflösung beträgt die Bildaufnahmegeschwindigkeit ca. 0,3 mm²/s.
      HINWEIS: Alle Messungen werden im Transmissionsmodus mit CaF_2-Dias mit manueller Fokuseinstellung durchgeführt.
2. Massenspektrometrie-Bilderfassung
   1. Matrix-Anwendung
      1. Verwenden Sie die Post-MIR-Gewebeschnitte für MALDI-MSI, bringen Sie mit einem Tippex-Stift Passermarkenmarker um das Gewebe herum an und erfassen Sie ein optisches Prä-MSI-Bild mit einem Flachbettscanner zur Bildregistrierung.
      2. Bereiten Sie die NEFZ-Matrix mit 7 mg/ml in Methanol/Acetonitril/deionisiertem Wasser (V/V/V=75:25:5) vor und filtrieren Sie dann durch eine 0,2-μm-Membran, um Partikel zu entfernen.
      3. Laden Sie die markierten Gewebeobjektträger in einen automatisierten Matrixsprüher. Dosieren Sie die NEFZ-Matrix mit den vordefinierten Parametern auf die Probe.
   2. MALDI-MSI-Messung
      1. 0,2 μl roter Phosphorsuspension werden auf den Objektträger CaF₂ abgeschieden, der als externer Massenkalibrierstandard dient.
      2. Sichern Sie den matrixbeschichteten Objektträger im Gleitadapter und sorgen Sie so für einen optimalen elektrischen Kontakt mit dem Halter. Legen Sie die Platte in ein MALDI-MSI-System ein.
      3. Richten Sie das optische Bild des Objektträgers mit Hilfe von Passermarken an den XY-motorischen Koordinaten des MALDI-Tisches aus. Definieren Sie ROIs für die Gewebeanalyse und schließen Sie einen "Nur-Matrix"-Bereich als Negativkontrolle ein.
      4. Konfigurieren Sie das Gerät im Negativ-Ionen-Modus mit einer Pixelgröße von 20 × 20^{μm 2} und decken Sie einen m/z-Bereich von 50-1000 ab. Führen Sie die Massenkalibrierung mit dem roten Phosphorfleck durch, bevor Sie die Datenerfassung starten. Führen Sie die Datenerfassung mit einer kommerziellen Datenanalyseplattform durch.

3. Vorverarbeitung und Analyse von Bilddaten

HINWEIS: Die benutzerdefinierten MATLAB-Codes werden als ergänzende Datei 1 hochgeladen.

1. QCL-MIR-Datenvorverarbeitung und -analyse
   1. Vorverarbeitung von Daten
      1. Exportieren Sie hyperspektrale Daten in einem geeigneten Format für die weitere Analyse.
      2. Führen Sie die Datenvorverarbeitung mit CytoSpec und MATLAB durch, indem Sie die folgenden Schritte ausführen 3.1.1.3-3.1.1.8
      3. Importieren Sie die MIR-Spektraldaten in CytoSpec v2.00.07 zur Vorverarbeitung.
      4. Bewerten Sie die spektrale Qualität mit dem integrierten Qualitätstestmodul in CytoSpec. Wählen Sie Kriterium 2 (Probendicke), um die Konsistenz der Probe zu beurteilen. Stellen Sie den spektralen Integrationsbereich auf 950-1800 ^cm-1 ein. Definieren Sie die Absorptionsschwellen zwischen 50 und 1000 Einheiten, um Spektren aus Bereichen auszuschließen, die übermäßig dünn oder dick sind.
      5. Reduzieren Sie das Rauschen durch PCA-basierte Filterung in CytoSpec. Behalten Sie die ersten 10 Hauptkomponenten (PCs) bei, um hochfrequentes Rauschen zu eliminieren und gleichzeitig die wichtige biochemische Varianz zu erhalten.
      6. Exportieren Sie die vorverarbeiteten Spektraldaten aus CytoSpec im .mat-Format für die weitere Analyse in MATLAB.
      7. Führen Sie die Basislinienkorrektur in MATLAB mit einem Gummibandkorrekturalgorithmus über den Spektralbereich von 950 bis 1800 ^cm-1 durch, um Basisliniendrift zu eliminieren und die spektrale Genauigkeit zu verbessern.
      8. Wenden Sie die spektrale Normalisierung mit Min-Max-Skalierung über denselben Spektralbereich an, um die Intensitäten über alle Spektren hinweg zu standardisieren und die Vergleichbarkeit im gesamten Datensatz zu gewährleisten.
   2. Datenanalyse
      1. Identifizieren Sie proteinassoziierte Merkmale bei 1.550 ^cm-1 und 1.650 ^cm-1, die den Amid-II- bzw. Amid-I-Banden entsprechen. Identifizieren Sie lipidassoziierte Merkmale bei 1.740 ^cm-1, die die Dehnungsschwingung des Esters C=O darstellen.
      2. Berechnen Sie das Intensitätsverhältnis der Amid-I-Bande (1650 ^cm-1) zur Ester-C=O-Dehnung (1740 ^cm-1) und erstellen Sie Verhältniskarten, um die räumliche Lipid-Protein-Verteilung zu visualisieren.
      3. Unüberwachte Clusteranalyse: Führen Sie eine hierarchische Clustering-Analyse (HCA) für hyperspektrale Daten unter Verwendung der euklidischen Distanz und der Ward-Verknüpfung durch, um Regionen basierend auf spektraler Ähnlichkeit zu klassifizieren. Generieren Sie Cluster-Karten, um biochemisch unterschiedliche Regionen zu identifizieren und strukturelle oder pathologische Unterschiede aufzudecken.
2. MSI-Datenvorverarbeitung und -analyse
   1. Importieren Sie die MSI-Rohdaten in eine kommerzielle Datenanalyseplattform.
   2. Führen Sie die Spitzenkommissionierung mit einer relativen Intensität > 0,01 % durch.
   3. Schließen Sie von der Matrix abgeleitete Peaks aus der experimentellen Peakliste aus, indem Sie sie mit dem Spektrum vergleichen, das aus einer reinen Matrix-Kontrollregion erhalten wurde. Entfernen Sie alle Peaks, die im Kontrollspektrum auftreten und ein Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) von weniger als 3 aufweisen.
   4. Normalisieren Sie den Datensatz auf das mittlere Quadrat (Root Mean Square, RMS), um die Variabilität der Ionensignalintensität über Pixel und Abtastungen hinweg zu berücksichtigen.
   5. Verfeinern Sie die Identifizierung von Metaboliten durch Filterung von Merkmalen auf der Grundlage ihrer Gewebeverteilung, der Übereinstimmung mit Einträgen in der Human Metabolome Database (HMDB) und der Übereinstimmung mit theoretischen m/z-Werten.
   6. Auswahl relevanter Metaboliten auf der Grundlage der experimentellen Ziele und des Gewebekontexts.
   7. Exportieren Sie die Intensitäten der ausgewählten Features für alle Pixel als CSV-Datei.
   8. Wenden Sie Techniken zur Dimensionalitätsreduktion (z. B. PCA, T-SNE oder UMAP) an, um die Datenkomplexität zu reduzieren und Pixelcluster mit ähnlichen metabolischen Signaturen mithilfe von Bioinformatik-Tools wie Seurat und Banksy zu identifizieren, um die Visualisierung der räumlichen metabolischen Heterogenität zu erleichtern.

4. Multimodale Bild-Co-Registrierung und Co-Analyse

1. Wählen Sie das MIR-Bild, das bei 1650 ^cm-1 aufgenommen wurde, als Raumbezug für die Koregistrierung aus. Diese spezifische Wellenzahl hebt die Amid-I-Proteinbande hervor und bietet einen starken Gewebekontrast.
2. Normalisieren Sie die Intensitätswerte sowohl der MIR- als auch der MSI-Bilder, um die visuelle Vergleichbarkeit zu verbessern. Wenden Sie Techniken zur Kontrastverbesserung an, wie z. B. den Histogrammausgleich mit der histeq-Funktion in MATLAB, um die Bildintensität neu zu verteilen und die Sichtbarkeit von Strukturmerkmalen zu verbessern, die für die Auswahl von Orientierungspunkten entscheidend sind.
3. Laden Sie sowohl die MIR- als auch die MSI-Bilder mit der cpselect-Funktion aus der Image Processing Toolbox in MATLAB. Diese Funktion öffnet eine interaktive Oberfläche für die Auswahl von Orientierungspunkten.
4. Kommentieren Sie fünf bis zehn anatomisch relevante und gut verteilte Kontrollpunkte sowohl auf den MIR- als auch auf den MSI-Bildern manuell mit der cpselect-Funktion . Diese Orientierungspunkte sollten unterschiedlichen morphologischen Merkmalen wie Gewebegrenzen entsprechen.
   HINWEIS: Verteilen Sie die Kontrollpunkte gleichmäßig über das Bildfeld, um lokale Verzerrungen zu minimieren.
5. Exportieren und notieren Sie die Koordinaten der kommentierten Kontrollpunkte aus beiden Bildern. Speichern Sie sie als zwei übereinstimmende Arrays für die Transformationsberechnung (z. B. movingPoints und fixedPoints).
6. Berechnen Sie eine affine Transformationsmatrix mit der MATLAB-Funktion fitgeotrans im affinen Modus . Diese Transformation berücksichtigt Skalierung, Rotation, Translation und Scherung.
7. Wenden Sie die berechnete Transformation mithilfe der Funktion imwarp in MATLAB auf das MSI-Bild an. In diesem Schritt wird ein räumlich registriertes MSI-Bild generiert, das geometrisch am MIR-Referenzrahmen ausgerichtet ist.
8. Überprüfen Sie die Ausrichtung visuell mit der imshowpair-Funktion im Mischmodus , um die MSI- und MIR-Bilder zu überlagern und die korrekte Registrierung von Strukturmerkmalen zu bestätigen.
9. Konvertieren Sie sowohl das registrierte MSI-Image als auch das Referenz-MIR-Image mit der Funktion imbinarize in MATLAB in binäre Masken.
10. Berechnen Sie den Würfelähnlichkeitskoeffizienten (DSC), um die räumliche Überlappung zwischen den beiden Binärmasken zu quantifizieren. Der DSC ist definiert als: DSC = 2 × (Überlappungsbereich)/(Gesamtfläche beider Masken). Ein DSC-Wert nahe 1,0 deutet auf eine hohe räumliche Überlappung und Registrierungsgenauigkeit hin.
    HINWEIS: Verfeinern Sie bei Bedarf die Registrierung, indem Sie die Anzahl oder Platzierung der Kontrollpunkte anpassen und den Transformationsvorgang wiederholen. Erwägen Sie nicht-starre Registrierungsmethoden, wenn lokale Fehlausrichtungen bestehen bleiben.
11. Speichern Sie das registrierte Bild, die Transformationsparameter und die Koordinaten der Landmarke für die nachgelagerte multimodale Bildanalyse, z. B. die räumliche Korrelation biochemischer und struktureller Merkmale.

Results

Um die oben beschriebene multimodale räumliche Metabolomik-Strategie zu validieren, haben wir sie in einem Mausmodell von Krebs implementiert. Tumorzellen wurden genetisch so verändert, dass sie grün fluoreszierendes Protein (GFP) exprimieren, was eine präzise Lokalisierung der Tumorregion durch Fluoreszenzbildgebung ermöglicht. Abbildung 2A zeigt markierungsfreie QCL-MIR-Bildgebungsergebnisse mit einer spektralen Abdeckung von 950-1800 ^cm-1, die als "Fingerabdruckbereich" bezeich...

Discussion

Hier stellen wir eine multimodale räumliche Metabolomik-Strategie vor, die MSI- und MIR-Bildgebung integriert, um ein molekularspezifisches metabolisches Profiling mit hohem Durchsatz an denselben Proben zu ermöglichen. Die MIR-Bildgebung ermöglicht eine markierungsfreie, zerstörungsfreie chemische Kartierung auf der Grundlage molekularer Schwingungen und liefert detaillierte Informationen über strukturelle und funktionelle Gruppen. Im Gegensatz dazu bietet MSI eine hohe Sensitivität und...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% Paraformaldehyd, Gewebefixierungslösung	Sangon Biotech
Rinderserumalbumin	Sigma Aldrich	126615
C57BL/6JNifdc Mäuse	Charles River	219
CaF2 Objektträger	Crystran	CAFP25-1
Kryostat-Mikrotom	Dakewe Biotech	CT520
Cytospec	Peter Lasch	Version 2.10.01	Software für die Analyse von MIR-Daten, einschließlich Baseline-Korrektur, Normalisierung, Bilderzeugung und Hyperspektralanalyse.
DPBS Puffer	Fisher Scientific	14-190-250
Fötales Rinderserum	Gibco	10270106
Gefriertrockner	LABCONCO	FreeZone
Gelatine	Sigma-Aldrich	G1890	Typ A, aus
Schweinehaut HBSS-Puffer	Sangon Biotech
ThermoFisher Scientific	mit hohem Glukosegehalt
Matlab	MathWorks	Matlab R2024a	Software für die MIR-Datenanalyse, einschließlich Baseline-Korrektur, Normalisierung, Bildgenerierung und Hyperspektralanalyse.
Matrix-unterstütztes Laser-Desorptions-Ionisations-Massenspektrometrie-Bildgebungssystem (MALDI-MSI) Bruker	Daltonics GmbH	timsTOF fleX MALDI-2
Methanol	Sinopharm Chemisches Reagenz	10014108
mMass	Institut für Entomologie, Biologiezentrum der Tschechischen Akademie der Wissenschaften, Tschechische Republik	Version 5.5.0	Software für die MSI-Datenanalyse. Importieren Sie die MSI-Rohdaten zur Vorverarbeitung in SCILS Lab. Peak-Picking in mMass mit einer relativen Intensität > 0,01 % durchführen.
N-(1-Naphthyl)-ethylendiamin-dihydrochlorid (NEFZ)-Matrix	Sigma Aldrich	222488
Penicillin-Streptomycin	ThermoFisher Scientific
Quantenkaskadenlaser (QCL-MIR) für die Mikroskopie im mittleren Infrarot (QCL-MIR	) Bruker Optics GmbH	LUMOS II ILIM
Roter Phosphor	Sigma-Aldrich	8.0727
SCiLS Lab	Bruker Daltonics	SCiLS Lab 2024b	Software für die MSI-Datenanalyse. Importieren Sie die MSI-Rohdaten zur Vorverarbeitung in SCILS Lab. Peak-Picking in mMass mit einer relativen Intensität > 0,01 % durchführen.
Sprühgerät	HTX Technologies	TM
Trypsin, 0,25 % EDTA	ThermoFisher Scientific