Methodenartikel

Fortschritte bei der metabolischen Profilerstellung von dreidimensionalen Hirntumor-Sphäroiden für das Wirkstoffscreening

DOI:

10.3791/68833

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5. September 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Medical Innovation and Research, Peking University Third Hospital, 2Cancer Center of Peking University Third Hospital, 3Biobank, Peking University Third Hospital

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier etablieren wir eine metabolische Profiling-Plattform, die dreidimensionale (3D) Gliom-Sphäroide und bildgebende Normalisierung mittels extrazellulärer Flussanalyse integriert. Dieser Ansatz ermöglicht eine genauere Bewertung der metabolischen Reaktionen von Tumoren auf medikamentöse Behandlungen und gibt Einblicke in mögliche Resistenzmechanismen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hirntumoren, insbesondere Gliome, sind aufgrund ihrer aggressiven Natur, ihrer komplexen Tumormikroumgebung und ihrer Resistenz gegen konventionelle Therapien schwierig zu behandeln. Herkömmliche zweidimensionale (2D) Zellkulturen sind oft nicht in der Lage, die wahre Tumorumgebung zu replizieren, was zu ungenauen Vorhersagen über die Wirksamkeit von Medikamenten führt. Die Technologie zur Analyse des extrazellulären Flusses, die typischerweise für die Echtzeit-Stoffwechselanalyse in 2D-Kulturen verwendet wird, misst wichtige Stoffwechselparameter wie die extrazelluläre Ansäuerungsrate (ECAR) und die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) und bietet Einblicke in den zellulären Stoffwechsel. Die Verwendung von 3D-Modellen stellt einen bedeutenden Fortschritt dar, da sie die In-vivo-Tumorumgebung genauer nachahmen. Der extrazelluläre Flussanalysator wurde an dreidimensionale (3D) Gliomzellmodelle angepasst und ermöglicht so die Analyse kritischer Stoffwechselwege, einschließlich Glykolyse und oxidativer Phosphorylierung, in einem physiologisch relevanteren Kontext.

U87-Zellen wurden in geeigneter Dichte in einer 96-Well-Platte mit geringer Bindung ausgesät und 5 Tage lang kultiviert. An Tag 5 wurde die 3D-Sphäroidbildung mittels High-Content-Bildgebung beobachtet. Die erfolgreich gebildeten Sphäroide wurden dann zur Stoffwechselanalyse auf eine mit Poly-L-Lysin beschichtete metabolische Assay-Platte übertragen. Um die Genauigkeit dieser Messungen zu verbessern, bewerten High-Content-Bildgebungssysteme die 3D-Zellgröße, was eine präzise Normalisierung der extrazellulären Flussdaten ermöglicht und metabolische Schwankungen aufgrund von Unterschieden in der Zellgröße minimiert. Dieser integrierte Ansatz ermöglicht eine zuverlässigere Analyse der metabolischen Reaktionen von Gliomzellen auf medikamentöse Behandlungen und deckt mögliche Mechanismen der Arzneimittelresistenz auf. Letztendlich bietet diese Methodik wertvolle Einblicke in die metabolische Dynamik von Gliomen und unterstützt die Entwicklung neuartiger, klinisch relevanter Therapiestrategien.

Einleitung

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Gliome, eine weit verbreitete und aggressive Form von Hirntumoren, stellen aufgrund ihres schnellen Fortschreitens, ihrer sehr heterogenen Tumormikroumgebung und ihrer ausgeprägten Resistenz gegen konventionelle Therapien eine große klinische Herausforderung dar1. Diese Komplexität erfordert physiologisch relevantere experimentelle Modelle, um die Genauigkeit der therapeutischen Bewertungen zu verbessern. Herkömmliche zweidimensionale (2D) Zellkultursysteme sind nicht in der Lage, die in vivo Tumorarchitektur und die Zell-Zell-Interaktionen zu rekapitulieren2, was oft zu irreführenden Schlussfolgerungen hinsichtlich der Wirksamkeit von Medikamenten und der Tumorbiologie führt3.

Um diese Einschränkungen zu beheben, haben sich dreidimensionale (3D) Tumormodelle als überlegene Alternative herausgestellt, die eine erhöhte biologische Relevanz bieten, indem sie die strukturellen und funktionellen Eigenschaften von Tumoren in vivo nachahmen 4,5. Gleichzeitig wird die metabolische Reprogrammierung zunehmend als Kennzeichen des Fortschreitens des Glioms und der Behandlungsresistenz anerkannt 6,7,8. Die extrazelluläre Flussanalyse hat sich zu einer weit verbreiteten Technik für die Echtzeitmessung wichtiger metabolischer Parameter entwickelt, wie z. B. der extrazellulären Ansäuerungsrate (ECAR, Messung des Protonenausflusses hauptsächlich aus der glykolytischen Laktatproduktion) und der Sauerstoffverbrauchsrate (OCR, Quantifizierung der mitochondrialen Sauerstoffverwertung bei der oxidativen Phosphorylierung), die wichtige Einblicke in die glykolytischen und oxidativen Phosphorylierungswege bietet 9,10,11.

In dieser Studie wurde die extrazelluläre Flussanalyse an die Analyse von 3D-Gliom-Sphäroiden angepasst, was die Untersuchung von Stoffwechselwegen in einem Kontext ermöglicht, der den in vivo Tumorzuständen sehr ähnlich ist. U87-Gliomzellen wurden mit einer Dichte von 1.500 Zellen pro Well in transparenten 96-Well-Platten mit rundem Boden und extrem geringer Bindung ausgesät und 5 Tage lang bei 37 °C mit 5 % CO2 kultiviert, um die Sphäroidbildung zu erleichtern. High-Content-Imaging wurde eingesetzt, um die Sphäroidmorphologie zu bestätigen und die Zellgröße zu beurteilen. Vor der metabolischen Analyse wurden dichte und zirkuläre 3D-Zellsphäroide mit einem Durchmesser von ca. 220 μm auf mit Poly-L-Lysin vorbeschichtete Assay-Platten überführt, um die Adhäsion und Messstabilität zu gewährleisten. Wichtig ist, dass die Normalisierung der Stoffwechseldaten auf der Grundlage der Sphäroidgröße durch integrierte High-Content-Bildgebung durchgeführt wurde, um die Variabilität zu reduzieren und die Zuverlässigkeit der Daten zu erhöhen.

Diese integrierte Plattform, die 3D-Kultur, extrazelluläre Flussanalysetechnologie und bildgebende Normalisierung kombiniert, ermöglicht eine genauere Bewertung der metabolischen Reaktionen von Gliomen auf therapeutische Eingriffe. Diese Studie bietet einen robusten Rahmen für die Untersuchung der metabolischen Grundlagen von Arzneimittelresistenzen und trägt zur Entwicklung effektiverer, klinisch übertragbarer Behandlungsstrategien für Gliome bei.

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Protokoll

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HINWEIS: Die vollständigen Spezifikationen aller Reagenzien und Verbrauchsmaterialien sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. 2D-Zellkultur

  1. U87-Zellen werden unter sterilen Bedingungen in einem Minimum an essentiellem Medium (MEM) aufbewahrt, das mit 10 % (v/v) fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt wird. Führen Sie Standard-Passaging-Verfahren durch, sobald die Zellen eine Konfluenz von 80 % erreicht haben.
    HINWEIS: Überwachen Sie während des gesamten Kulturprozesses den Zellstatus genau und schließen Sie Zellen mit abnormalem Wachstum oder morphologischen Veränderungen von nachfolgenden Experimenten aus.
  2. U87-Zellen in 10 cm Zellkulturschalen aussäen und in einem sterilen Zellkultur-Inkubator bei 37 °C mit 5 % (v/v) CO2 und 90-95 % relativer Luftfeuchtigkeit inkubieren.
    HINWEIS: Das Medium sollte regelmäßig ausgetauscht werden, um optimale Wachstumsbedingungen zu gewährleisten.

2. 3D Bildung von Sphäroiden in Zellen

  1. Experimentelle Vorbereitung
    1. Überprüfen Sie den gesamten Arbeitsablauf in Abbildung 1 , bevor Sie mit experimentellen Verfahren beginnen.
      VORSICHT: Halten Sie sich während des gesamten Experiments strikt an aseptische Techniken, um die Zellgesundheit zu gewährleisten und eine Kontamination zu verhindern.
  2. Zelldissoziation und -zählung
    1. Nehmen Sie das verbrauchte Medium aus der Zellkulturschale und waschen Sie die U87-Zellen dreimal mit 9 mL phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (3 mL pro Waschgang). Entsorgen Sie gebrauchte Reagenzien in einer 20-25%igen (v/v) Bleichlösung, um alle bioaktiven Materialien zu inaktivieren.
    2. 1 ml Trypsinlösung in die Schale geben und bei 37 °C 2-3 min inkubieren. Neutralisieren Sie Trypsin mit 2 ml DMEM mit 10 % FBS, das auf 37 °C vorgeheizt wird, sobald alle Zellen unter mikroskopischer Beobachtung abgelöst wurden.
    3. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie sie 3 Minuten lang bei 200 × g . Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml DMEM, ergänzt mit 10 % FBS. Pipettieren Sie die Zellen vorsichtig, um eine gleichmäßige Zellsuspension zu gewährleisten. Zählen Sie dann über ein Hämozytometer oder einen automatisierten Zellzähler und zeichnen Sie die anfängliche Zellzahl auf.
      HINWEIS: Gehen Sie während des Waschens und der Medienzugabe vorsichtig mit den Zellen um, um mechanische Beschädigungen zu vermeiden. Die Pipettierkraft kann gesteuert werden, um die Blasenbildung zu verhindern, die die Lebensfähigkeit der Zellen und die Zählgenauigkeit beeinträchtigen kann.
  3. Verdünnung der Zellsuspension
    1. Heizen Sie das nicht verwendete Medium auf 37 °C vor. Halten Sie die Zellsuspensionen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT; 25 ± 2 °C).
    2. Auf der Grundlage der anfänglichen Zellzahl verdünnen Sie die Zellsuspension mit DMEM mit 10 % FBS auf ein Endvolumen von 20 ml, wodurch etwa 200.000 Zellen sichergestellt werden.
      HINWEIS: Vor der endgültigen Verdünnung pipettieren Sie die Zellsuspension vorsichtig, um eine Sedimentation zu verhindern. Das unbenutzte Medium wurde bei 37 °C gehalten, und die Zellsuspensionen wurden bei RT inkubiert. Wurden 96 Wells mit 1.500 Zellen pro Well ausgesät, wurde ein Gesamtvolumen von 22 mL vorbereitet, um den Überschuss zu berücksichtigen. Die verdünnte Zellsuspension wurde in ein steriles 50-ml-Zentrifugenröhrchen überführt und gründlich gemischt.
  4. Zellaussaat in 96-Well-Platten mit extrem geringer Bindung
    1. Mischen Sie die endgültige Zellsuspension gründlich mit einer 200-μl-Pipette. Geben Sie 200 μl der Suspension (1.500 Zellen/Well) langsam in jede Vertiefung einer transparenten 96-Well-Platte mit rundem Boden und ultraniedriger Bindung entlang des Randes.
      HINWEIS: Um die Effizienz zu erhöhen, sollten Sie die Verwendung einer Mehrkanalpipette in Betracht ziehen.
    2. Entsorgen Sie alle verbleibenden Suspensionen, nachdem alle Vertiefungen gefüllt sind, um eine Kontamination zu vermeiden.
  5. Zentrifugation
    1. Verschließen Sie die Platte fest mit Parafilm, um ein Auslaufen während der Zentrifugation zu verhindern. Die Mischung wird 2 Minuten lang bei 200 × g zentrifugiert, um die Zellen am Boden jeder Vertiefung zu pelletieren.
    2. Nehmen Sie die Platte aus der Zentrifuge, entfernen Sie vorsichtig den Parafilm und stellen Sie die Platte in einen 37 °C heißen Inkubator mit 5 % CO2 .

3. Poly-D-Lysin-Beschichtung der metabolischen Assay-Platten

HINWEIS: Die Mikroplatte für den Stoffwechselassay ist eine spezielle Mikroplatte, die für die Adhäsion von Zellsphäroiden während der extrazellulären Flussanalyse entwickelt wurde.

  1. Bereiten Sie eine Beschichtungslösung vor, indem Sie 5 mg Poly-D-Lysin in 50 ml sterilem Wasser auflösen. Gründlich mischen.
  2. Geben Sie 30 μl der Beschichtungslösung in jede Vertiefung der metabolischen Assay-Platte. Stellen Sie sicher, dass keine Blasen entstehen, indem Sie die überschüssige Lösung vorsichtig schütteln oder ansaugen.
  3. Inkubieren Sie die Platte und decken Sie sie 20 Minuten lang bei RT ab. Aspirieren Sie die Beschichtungslösung und waschen Sie die Vertiefungen zweimal mit 200 μl sterilem Wasser.
  4. Trocknen Sie die Platte mindestens 30 min an der Luft und erhitzen Sie sie dann 30 min lang bei 37 °Cohne CO 2 , um die Beschichtung zu stabilisieren.
  5. Geben Sie 175 μl vorgewärmtes Medium in jede Vertiefung und halten Sie die Platte bei 37 °C in einem CO2 -freien Inkubator, bis sie für den Zellsphäroidtransfer bereit ist.

4. Überwachung des Sphäroidwachstums

  1. Übertragen Sie die Sphäroidplatten nach 5 Tagen Kultur auf ein High-Content-Bildgebungssystem.
  2. Konfigurationsparameter für die Bildgebung: Stellen Sie die Temperatur auf 37 °C und den CO2 auf 5 % ein und passen Sie den Plattentyp, die Kanäle und den Fokusbereich an.
  3. Erfassen Sie Sphäroidbilder über ein konfokales Mikroskop mit 10-fach-Objektiven und einer Bildgebungssoftware.
  4. Identifizieren Sie Bohrlöcher mit intakten Sphäroiden (z. B. Abbildung 2A-C) und notieren Sie deren Positionen für den Transfer. Schließen Sie Vertiefungen mit unregelmäßigen Sphäroiden aus (z. B. Abbildung 2D)."

5. Sphäroid-Behandlung

HINWEIS: Die medikamentöse Behandlung wurde an reifen 3D-Sphäroiden durchgeführt, um die metabolischen Reaktionen zu beurteilen.

  1. Zuordnung von Sphäroidgruppen
    1. Ordnen Sie intakte Sphäroide zwei Gruppen zu:
      Kontrollgruppe: 6 Vertiefungen replizieren
      Behandlungsgruppe: 6 Replikatvertiefungen (mit Fenofibrat behandelt)
  2. Zubereitung der Arzneimittellösung
    1. Bereiten Sie die Fenofibrat-Arbeitslösung in frischem, vorgewärmtem Medium in der optimalen Konzentration (z. B. 100 μM) vor.
      HINWEIS:Die Behandlungsgruppen wurden in 100 % DMSO rekonstituiert, um Stammlösungen herzustellen, die anschließend in frischem, vorgewärmtem Medium verdünnt wurden. Den Kontrollgruppen wurde die gleiche Endkonzentration von DMSO (0,1 % v/v) verabreicht, die in den arzneimittelbehandelten Proben vorhanden war. Die endgültige Konzentration wurde mittels Dosis-Wirkungs-Assays bestimmt.
  3. Mittlerer Ersatz
    1. Aspirieren Sie 100 μl Medium aus jeder Vertiefung langsam entlang der Wand.
      HINWEIS: Vermeiden Sie den Kontakt mit dem Bohrlochboden, um eine Störung der Sphäroide zu vermeiden.
    2. 100 μl frisches Medium in die Kontrollvertiefungen geben.
    3. Geben Sie 100 μl Fenofibrat-Arbeitslösung in die Behandlungsvertiefungen.
  4. Inkubation nach der Behandlung
    1. Bringen Sie die Platte in einem 5 % CO2 - Inkubator vorsichtig auf 37 °C zurück. Kultur für 72 h.
  5. Morphologische Beurteilung
    1. Beurteilen Sie die Integrität der Sphäroide nach dem bildgebenden Verfahren in Schritt 4.

6. Übertragung von Zellsphäroiden

  1. Entfernen Sie vorsichtig die sphäroidhaltige Platte mit niedrigem Anhaftungsgrad aus dem Bildgebungssystem und legen Sie sie auf eine sterile Oberfläche in einer Biosicherheitswerkstatt. Legen Sie die mit Poly-L-Lysin beschichtete Assay-Platte für den Transfer nebeneinander.
  2. Schneiden Sie die Spitze einer 20-μl-Pipette ab, um eine sanfte Aspiration der Zellsphäroide ohne Beschädigung zu ermöglichen.
  3. Saugen Sie jedes intakte Sphäroid vorsichtig vom Boden der Vertiefung ab und übertragen Sie es in die entsprechende Vertiefung der Zellplatte, so dass es sich 20 s lang absetzen kann. Bestätigen Sie die Adhäsion durch das Fehlen von schwebenden Fragmenten unter 10× Mikroskopie.
  4. Wiederholen Sie den Vorgang für alle Sphäroide und überprüfen Sie die Übertragungseffizienz über das in Schritt 4 beschriebene Bildgebungssystem.

7. Metabolischer Assay

  1. Entgasung der Probe
    1. Legen Sie die mit dem Arzneimittel behandelte Sphäroid-Assay-Platte in eine voräquilibrierte 37 °C-Hydratationskammer, die frei von CO2 ist.
      HINWEIS: Die kontinuierliche Entgasung wurde 1 Stunde lang unter strenger Umgebungskontrolle durchgeführt, um die Genauigkeit der Stoffwechselmessung zu gewährleisten.
  2. Reagenzienvorbereitung und Arzneimittelverabreichung
    1. Parallel dazu das Reagenz vorbereiten und das Arzneimittel während der 1-stündigen Entgasungsphase beladen.
      HINWEIS: Das Hauptziel dieses Experiments besteht darin, den mitochondrialen Stress zu bewerten. Alle Verfahren müssen akribisch auf dieses Ziel ausgerichtet sein. Für unterschiedliche experimentelle Typen müssen spezifische Protokolle befolgt werden, um die Genauigkeit und Zuverlässigkeit der Daten zu gewährleisten.
    2. Arzneimittelvorbereitung: Verwenden Sie die folgenden Verbindungen:
      Oligomycin (mitochondrialer Komplex-V-Hemmer)
      Carbonylcyanid-4 (trifluormethoxy)phenylhydrazon (FCCP, Entkoppler)
      Eine Mischung aus Rotenon (ein Komplex-I-Hemmer) und Antimycin A (ein Komplex-III-Hemmer)
      HINWEIS: Die Arzneimittel wurden aus dem in dieser Studie verwendeten mitochondrialen Stresstestkit gewonnen. Einige Verbindungen sind biologisch gefährlich; Es müssen strenge Biosicherheitsprotokolle (persönliche Schutzausrüstung und Notfallvorsorge) verwendet werden.
    3. Formulierung des Arzneimittels
      1. Bereiten Sie die Stammlösungen der pulverförmigen Arzneimittel vor, wie in Tabelle 1 gezeigt.
      2. Die Stammlösungen werden auf die in Tabelle 2 angegebenen Arbeitskonzentrationen verdünnt.
        HINWEIS: Die Lösungen werden gründlich vortext oder gerührt, um Homogenität über Konzentrationsgradienten hinweg zu gewährleisten.
  3. Laden von Verbindungen in Detektionssondenpatronen
    HINWEIS: Die Detektionssondenkartusche ist eine Einwegkartusche mit Biosensorsonden für die Echtzeitmessung von Sauerstoff und pH.
    1. Aktivierung der Sondenkartusche (muss vor dem Laden der Verbindung gehen):
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Sensor aktiviert ist, indem Sie diese Schritte mindestens 12 Stunden vor der Verwendung ausführen:
      1. Geben Sie 200 μl der kalibrierenden Lösung in jede Vertiefung der Hydratationsplatte.
      2. Positionieren Sie die Detektionssondenkartusche vorsichtig auf der Hydratationsplatte, um sicherzustellen, dass alle Sonden vollständig in die kalibrierende Lösung eintauchen.
      3. Inkubieren Sie die zusammengebaute Einheit in einem 37 °CCO 2 -freien Inkubator für 12-24 h, um die Sensoren zu aktivieren.
        HINWEIS: Unvollständiges Eintauchen oder unzureichende Hydratation führt zu Messabweichungen (±15 % OCR-Fehler).
    2. Verwenden Sie Mehrkanal- oder elektronische Pipetten, um präzise Volumina in die Wells zu leiten und so Tröpfchenreste an den Rändern der Wells zu vermeiden.
      HINWEIS: Da keine akute Stimulation des Arzneimittels erforderlich ist, befolgen Sie die Standard-Belastungssequenzen.
    3. Stellen Sie die Sondenplatte nach dem Beladen auf eine stabile Unterlage, um Störungen während des Transports zu vermeiden.
      HINWEIS: Die Ladegenauigkeit wirkt sich erheblich auf die Ergebnisse aus.
  4. Software-Konfiguration
    1. Starten Sie die Software und wählen Sie das Assay-Protokoll für den mitochondrialen Stresstest aus.
    2. Weisen Sie Gruppen gemäß der vordefinierten experimentellen Gruppierung zu.
    3. Legen Sie den Dateinamen fest und klicken Sie auf Ausführung starten.
  5. Kalibrierung von Detektionssondenpatronen.
    1. Setzen Sie die eingelegte Sondenplatte vorsichtig in den Instrumentensteckplatz ein, je nach Systemaufforderung.
    2. Starten Sie die Kalibrierung (15-20 min). Aufrechterhaltung stabiler Bedingungen; Vermeiden Sie Vibrationen.
    3. Entfernen Sie die Trinkplatte sofort nach der Kalibrierung (gemäß den Anweisungen auf dem Bildschirm).
      HINWEIS: Entfernen Sie den Plattendeckel vor der Kalibrierung.
  6. Metabolisches Profiling von 3D-Sphäroiden
    1. Übertragen Sie die entgaste 3D-Sphäroid-Assay-Platte in den Messschlitz des Geräts. Stellen Sie eine präzise Ausrichtung mit dem Sondenarray sicher, indem Sie Folgendes bestätigen: (i) Schlitzführungen an den Plattenecken; (ii) Vertiefung A1 richtet sich an der indizierten Position aus; (iii) Kein sichtbarer Spalt zwischen Platte und Instrumentenoberfläche
    2. Klicken Sie auf Start , um mitochondriale Stress-Assays zu starten (Dauer: ~1,5 h). Überwachen Sie die Geräteparameter durchgehend.
      HINWEIS: Entfernen Sie vor der Messung die Deckel der 3D-Sphäroid-Assay-Platte.
  7. Datenanalyse
    1. Bildgebende Analyse
      1. Übertragen Sie 3D-Sphäroid-Assay-Platten auf ein High-Content-Bildgebungssystem.
        HINWEIS: Die Bilder wurden wie in Schritt 4 beschrieben aufgenommen. Die Bildgebung zeigte, dass die Mehrheit der Sphäroide intakt blieb, während eine Minderheit während des Transferprozesses Schäden erlitt, wie in Abbildung 3 gezeigt.
      2. Analysieren Sie die morphologischen Daten (z. B. Fläche, Länge, Breite) der Zellsphäroide mit der Harmony-Software Version 5.2, indem Sie die Schritte 7.7.1.3-7.7.1.7 befolgen.
      3. Wenden Sie das Modul Texturbereich grob an, um 3D-Sphäroide vom Hintergrund zu trennen, indem Sie den Bildinhalt auf der Grundlage der Texturmerkmale der Objekte in den Bildern in drei Cluster unterteilen.
      4. Wenden Sie das Modul "Bildbereich suchen" an, um die Trennung von vorisolierten 3D-Sphäroiden über volumenbasierte Größenmerkmale zu verfeinern, um Verunreinigungen zu entfernen und intakte Sphäroide zu erhalten.
      5. Messen Sie die morphologischen Parameter der 3D-Sphäroide über das Modul Morphologieeigenschaften .
      6. Wenden Sie das Modul Select Population an , um letztendlich echte 3D-Zellsphäroide herauszufiltern.
      7. Exportieren Sie die Ergebnisse der morphologischen Daten, wie in Tabelle 3 gezeigt.
    2. Datenverarbeitung
      HINWEIS: Normalisieren Sie die Zelldaten über Parameter aus den Bildgebungsausgaben, um experimentelle Artefakte zu minimieren.
      1. Öffnen Sie die metabolischen Rohdaten über die Analysesoftware.
      2. Wählen Sie die Option Normalisierung , um auf die Bearbeitungsoberfläche des Normalisierungsmodus zuzugreifen.
      3. Geben Sie die Querschnittsfläche der Sphäroide, die in den entsprechenden Vertiefungen der Assay-Platte enthalten sind, in das Feld Normalisierungswerte ein.
      4. Legen Sie den Parameter für den Skalierungsfaktor auf 1.000.000 fest.
      5. Klicken Sie auf die Schaltfläche Übernehmen , um den Normalisierungsprozess abzuschließen. Die endgültigen Ergebnisse sind in Abbildung 4 dargestellt.

8. Abfallentsorgung

  1. Entsorgen Sie alle Versuchsabfälle (Medien, Reagenzien, Verbrauchsmaterialien und Zellsuspensionen) gemäß den Protokollen für die Entsorgung von Biogefahren und Laborabfällen. Autoklavieren Sie die bioaktiven Abfälle oder desinfizieren Sie sie chemisch vor der Entsorgung, um eine Kontamination der Umwelt zu vermeiden.

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Ergebnisse

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Die drei kritischsten Schritte bei der Detektion des Energiestoffwechsels von 3D-Zellsphäroiden sind die Kultivierung von 3D-Zellsphäroiden, der Sphäroidtransferprozess sowie die Bildgebung und Quantifizierung von Sphäroiden nach der Detektion (Abbildung 1). Darüber hinaus ist die Beobachtung des Zustands der Zellsphäroide von großer Bedeutung. Wenn die Experimente nach den oben genannten experimentellen Verfahren durchgeführt wurden, wurden am 5. Tag Sphäroide nachgewiesen (

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Anpassung der extrazellulären Flussanalyse an 3D-Gliommodelle stellt einen entscheidenden methodischen Fortschritt in der Erforschung des Tumorzellstoffwechsels dar. Während traditionelle 2D-Kulturen lange Zeit als Grundlage für In-vitro-Experimente dienten, erfassen sie nicht die räumliche Architektur, die Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen sowie die Sauerstoff- und Nährstoffgradienten, die für In-vivo-Tumoren charakteristisch sind12. ...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Forschung wurde von der National Natural Science Foundation of China finanziert, Fördernummern 82471329 und 82001248.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
10 cm SchaleCorning430167
15 mL ZentrifugenröhrchenCorning430791
50 mL ZentrifugenröhrchenCorning430828
Calcein, AMInvitrogenNr. C1430
Gräfin 3Thermo FischerAutomatischer Zellzähler
Fötales RinderserumGibcoA5669701
Harmonie 5.2PerkinElmerBildgebungssoftware
Hoechst 33342Solarbio GmbHNr. C0031
MEM EBSS MediumHyCloneSH30024.01
Operette CLSPerkinElmerHigh-Content-Bildgebungsanalysesystem
PBSHyCloneSH30256.01
Poly-D LysinhydrobromidSigma Nr. 7280
96-Well-Platten mit rundem Boden und extrem niedrigem AufsatzCorning4515
Seahorse Wave Desktop-SoftwareAgilent
Seepferdchen XFe96AgilentExtrakorporale Stoffwechseltestmaschine
Sorvall ST8RThermo FischerZentrifuge
TRYPSIN 0,25 % EDTAGibco25200072
U87MG Zelllinie Nationale Infrastruktur von Zellressourcen
XF 1,0 M Glukoselösung, 50 mLAgilent103577-100
XF 100 mM Pyruvatlösung, 50 mLAgilent103578-100
XF 200 mM Glutaminlösung, 50 mLAgilent103579-100
XF Kalibrant Lösung 500 mL Agilent100840-000
XF Cell Mito Stresstest-KitAgilent103015-100
XF DMEM Medium, pH 7,4, 500 mLAgilent103575-100
XFe96/XF Pro Fluxpak-Detektionssonden-ArrayAgilent103792-100
XFe96/XF Pro Fluxpak-Metabolische Assay-PlattenAgilent103792-100

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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