Bioinformatische Identifikation von potenziellen Biomarkern, die mit Parodontitis in zytokinbehandelten parodontalen Bandstammzellen assoziiert sind

Zusammenfassung

Die aktuelle Studie zielt darauf ab, dysregulierte Gene mittels bioinformatischer Analyse in zytokin-behandelten parodontalen Bandstammzellen zu erforschen. Hochregulierte ERC2-IT1 und herunterregulierte EPB41L4A-AS1 wurden als Schlüsselmoleküle in diesen Zellen identifiziert, die als potenzielle Biomarker für Parodontitis dienen könnten.

Zusammenfassung

Das Hauptziel der aktuellen Studie war es, den potenziellen molekularen Mechanismus zu untersuchen, der zytokin-induzierten parodontalen Bandstammzellen (PDLSCs) zugrunde liegt. Mikroarray-Daten aus dem GSE260558-Datensatz wurden aus der Genexpressions-Omnibus-Datenbank (GEO) abgerufen. Nach der Normalisierung wurden die dysregulierten Gene identifiziert. Anschließend wurden die verschiedenen exprimierten mRNAs (DE-mRNAs) Genontologie (GO) und Kyoto-Enzyklopädie der Gen- und Genomenanreicherung (KEGG) unterzogen. Anschließend wurden Hub-Gene basierend auf dem Protein-Protein-Interaktionsnetzwerk (PPI) aussortiert. Schließlich wurden die kompetitiven endogenen RNA (ceRNA)-Regulationsnetzwerke, die Hub-Gene enthalten, mittels der ENCORI-Website etabliert. Insgesamt wurden 739 verschiedene exprimierte lncRNAs (DE-lncRNAs) und 809 verschiedene exprimierte mRNAs (DE-mRNAs) mithilfe des Limma-Pakets in der Programmiersprache R identifiziert. Anschließend zeigten die GO- und KEGG-Analysen, dass die DE-mRNAs eng mit Entzündungen und der Bildung von extrazellulären Matrixen in zytokinbehandelten PDLSCs verbunden waren. Ein Protein-Protein-Interaktionsnetzwerk (PPI) wurde für DE-mRNAs aufgebaut, und Hub-Gene wurden durch Bewertung des Grades gewonnen. Insgesamt wurden 12 hochregulierte Hub-Gene und 12 downregulierte Hub-Gene untersucht. Diese hochregulierten und herunterregulierten Hub-Gene wurden dann verwendet, um jeweils ein ceRNA-Regulationsnetzwerk aufzubauen. In diesen Netzwerken galten hochregulierte ERC2-IT1 und herunterregulierte EPB41L4A-AS1 als Schlüssel-lncRNAs bei Parodontitis. Zusammenfassend zeigte die bioinformatische Analyse mehrere Schlüsselgene und ein ceRNA-Regulationsnetzwerk, das am Fortschreiten zytokininduzierter PDLSCs beteiligt war. Obwohl diese Studie mehrere potenzielle Biomarker identifiziert hat, die mit Parodontitis zusammenhängen, ist eine weitere experimentelle Validierung in Tiermodellen oder klinischen Proben notwendig.

Einleitung

Laut der Weltgesundheitsorganisation gilt Parodontitis als die sechsthäufigste, allgegenwärtige und irreversible chronische Entzündungskrankheit beim Menschen ^1,2. In der heutigen Zeit betrifft es fast 15 % der Weltbevölkerung ^1,2,3. Es wurde berichtet, dass Parodontitis stark mit verschiedenen Faktoren wie Alter, Geschlecht, Mundhygiene, Rauchstatus, Ethnie, niedrigerem sozioökonomischem Status und einer Reihe systemischer Erkrankungen^korreliert 2,3,4,5. Parodontitis, die bei älteren Erwachsenen eine bemerkenswert hohe Prävalität aufweist, wird pathologisch durch dysbiotische Veränderungen in der subgingiviven Mikrobiota, die an den Zähnen haftet, ausgelöst. Wenn diese Erkrankung unbehandelt bleibt, führt sie letztlich zu Knochenabbau, Zahnbewegung und dem unglücklichen Verlust der^Zähne. Daher ist ein umfassendes Verständnis der molekularen Mechanismen der Parodontitis und die Identifizierung diagnostischer Marker für die Krankheit dringend erforderlich.

Die strukturelle und interaktive Komplexität des parodontalen Gewebes gilt weithin als einer der wesentlichen Faktoren, die zu den erheblichen Schwierigkeiten beitragen, die beim Prozess der parodontalen Regeneration^{auftreten 9,10}. Unter den vielfältigen mesenchymalen Stammzellen (MSCs), die zur Parodontalregeneration verwendet werden, haben sich parodontale Bandstammzellen (PDLSCs) umfassend als äußerst zuverlässige Quelle für die Bildung neuer zementähnlicher Strukturen in der in vivo-Umgebung ^{erwiesen 11,12}. In den jüngsten präklinischen Studien zeigte die Behandlung auf Basis von PDLSCs äußerst vielversprechende Ergebnisse im Bereich der Geweberegeneration^13,14. Im Vergleich zum Gingivalgewebe des Patienten zeigte die Transkriptomik-Analyse der PDLSCs eine stärkere funktionelle Orientierung und ein stärkeres therapeutisches Transformationspotenzial^13,14.

Bioinformatik-Technologie und bioinformatische Analysemethoden ermöglichen es Forschern, potenzielle biologische Prozesse und Assoziationen mit proteomischen, genomischen und metabolomischen Statistiken zu identifizieren^15,16. Darüber hinaus ermöglicht die Hochdurchsatznatur der Bioinformatiktechnologie Forschern auch, groß angelegte biologische Datensätze zu analysieren, wie sie beispielsweise aus Next-Generation-Sequenzierung und Mikroarray-Experimenten^{stammen 17,18}. Diese Fähigkeit ermöglicht die Identifizierung potenzieller Biomarker für Krankheitsdiagnose und -prognose^19,20. So wurden beispielsweise eine Disintegrin- und Metalloproteinase 28 (ADAM28) sowie eine disintegrinähnliche Metalloprotease-Domäne mit Thrombospondin-Typ-I-Motiven wie 3 (ADAMTSL3) durch eine umfassende Analyse basierend auf bioinformatischer Technologie²¹ als neuartige Biomarker in Zahnfleischgeweben von Parodontitispatienten identifiziert. Darüber hinaus wurden mehrere ferroptose-bezogene Gene, darunter der Nuklearrezeptor-Koaktivator 4 (NCOA4), der Solute Carrier Transporter 1A5 (SLC1A5) und das Wärmeschockprotein B1 (HSPB1), als bei Parodontitis²² einen besseren diagnostischen Wert gemeldet. Der molekulare Mechanismus der Parodontitis verdient jedoch eine weitere Untersuchung. In der vorliegenden Studie bemühen sich Forscher, bioinformatische Technologien zu nutzen, um Hub-Gene in zytokin-induzierten PDLSCs zu untersuchen und potenzielle biologische Prozesse und Wege im Zusammenhang mit Parodontitis zu erkennen. Die bioinformatische Analyse zytokin-behandelter PDLSCs erfasst entzündungsgetriebene transkriptionelle Programme, die für die PDLSC-Dysfunktion relevant sind und die Lücke zwischen PDLSC-Dysfunktion und Parodontitis adressieren. Diese Kerngene und Signalwege in zytokininduzierten PDLSCs bieten wertvolle Einblicke in die einheitlichen Mechanismen, die Parodontitis zugrunde liegen.

Protokoll

1. Datensatz

Diese Analyse nutzte öffentlich zugängliche Daten und betraf weder menschliche noch tierische Probanden in Übereinstimmung mit institutionellen und JoVE-ethischen Leitlinien. Alle Informationen zu den verwendeten Plattformen sind in der Materialtabelle verfügbar.

1. Wählen Sie insgesamt 6 Proben (GSM8119437, GSM8119438, GSM8119439, GSM8119440, GSM8119441 und GSM8119442) aus dem GSE260558-Datensatz (National Center of Biotechnology Information Gene Expression Omnibus, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE260558) für die bioinformatische Analyse aus.
2. In diesen Proben werden parodontalen Bandstammzellen (PDLSCs) 7 Tage lang in einem normalen Medium oder in einem Medium mit entzündlichen Zytokinen kultiviert.
3. Extrahiere die gesamte RNA aus PDLSCs und unterziehe sie der^{Hochdurchsatz-Sequenzierung 23}. Der Prozess der bioinformatischen Analyse ist in Abbildung 1 dargestellt.

2. Identifizierung von DEGs

1. Analyse der Expressionsprofile von lncRNA und mRNA mit der Limma-Software (Version: 3.46.0), wie zuvor^{beschrieben 24}.
2. Führen paarweise Vergleiche zwischen Zytokinen und normalen Gruppen durch.
3. Verwenden Sie die Korrektur der False Discovery Rate (FDR) mit einem Standard-Cutoff von < 0,05, um signifikant differenziell exprimierte Gene zu identifizieren. Verwenden Sie die angepassten p-Werte (FDR), um den Anteil der falsch-positiven Ergebnisse bei statistisch signifikanten Ergebnissen zu kontrollieren.
4. Verwenden Sie einen angepassten P-Wert-Cutoff von < 0,05 und einen Fold-Change-Schwellenwert von > 1, um signifikant dysregulierte lncRNAs oder mRNAs zu identifizieren.
5. Präsentieren Sie die differentielle Genexpression in Vulkandiagrammen (ggplot2: Version 3.4.1), die mit der R-Software generiert wurden (Version 4.0.4).
6. Listen Sie die Top 10 dysregulierten lncRNAs und mRNAs in Tabellen auf.

3. Funktionale Anreicherungsanalyse

1. Führen Sie eine GO-Anreicherungsanalyse der DE-mRNAs mithilfe der Online-Datenbank DAVID durch (Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery, https://david.ncifcrf.gov/).
   1. Reichen Sie die dysregulierten Gene auf der Website ein und wählen Sie GO-Begriffe aus, darunter molekulare Funktion (MF), biologische Prozesse (BP) und zelluläre Komponenten (CC), um die GO-Analyse durchzuführen.
   2. Reichen Sie die dysregulierten Gene beim Cytoscape (Version: 3.8.2) Plugin ClueGO [16]+ und der Cluepedia-App ein.
   3. Wenden Sie die Benjamini-Hochberg-Korrektur für Mehrfachvergleiche an und setzen Sie die Signifikanzschwelle auf einen bereinigten P-Wert < 0,05.
   4. Laden Sie die Ergebnisse von Cytoscape herunter. Bewerten Sie die Anreicherungen in absteigender Reihenfolge basierend auf dem P-Wert und präsentieren Sie die fünf besten Anreicherungen in jeder Kategorie.
2. Die Kyoto-Enzyklopädie der Gene und Genome (KEGG) ist eine wertvolle Datenbankressource zur Erfassung der hochrangigen Funktionen und Auswirkungen biologischer Systeme (http://www.genome.jp/kegg/).
   1. Führen Sie die KEGG-Analyse ähnlich durch, indem Sie auf der Website KEGG-PATHWAY wählen.
   2. Setzen Sie die Signifikanzschwelle auf einen bereinigten P-Wert < 0,05 und präsentieren Sie die Top 10 Anreicherungen dieser Studie. Führen Sie diese Anreicherungsanalysen gemäß den berichteten Studien ^25,26 durch.

4. PPI-Netzwerk

1. Vorhersagen und konstruieren Sie ein Protein-Protein-Interaktionsnetzwerk (PPI) mithilfe des Suchwerkzeugs zur Abrufung interagierender Gene (STRING, Version 12.0).
2. Reichen Sie 318 hochregulierte mRNAs oder 465 herunterregulierte mRNAs auf der STRING-Website ein, um das PPI-Netzwerk aufzubauen.
3. Exportieren Sie die Interaktionsdaten aus dem PPI-Netzwerk und senden Sie die Daten an die Cytoscape-Software.
4. Verstecke den einzelnen Knoten im PPI-Netzwerk. Laden Sie das PPI-Netzwerk in dieser Studie herunter.
5. Berechnen Sie die topologischen Eigenschaften des Netzwerks, einschließlich der Gradverteilung, mit der CentiScaPe-App, einem Plug-in von Cytoscape.
6. Quantifizieren Sie die lokale Topologie jedes Gens, indem Sie die Anzahl seiner benachbarten Gene summieren, und zählen Sie die Interaktionen für einen bestimmten Knoten.
7. Ordne alle Gene des PPI-Netzwerks in absteigender Reihenfolge basierend auf ihrem Grad der Konnektivität.
8. Wählen Sie die Top 12 upregulierten und Top 12 downregulierten Gene aus dieser Liste als Hub-Gene aus.

5. miRNA-mRNA-Regulationsnetzwerk

HINWEIS: Die ENCORI-Datenbank (Version 12.0, https://rnasysu.com/encori/) wurde verwendet, um regulatorische Assoziationen zwischen MikroRNAs (miRNAs) und DE-lncRNAs (oder Hub-Genen) vorherzusagen.

1. Reichen Sie die upregulierten Hub-Gene oder die downregulierten Hub-Gene bei ENCORI ein und legen Sie das Cut-off-Kriterium-Programm ≥5 in insgesamt sechs Programmen fest, darunter PITA, RNA22, miRmap, miRanda, PicTar und TargetScan, für die Vorhersageanalyse in ENCORI.
2. Laden Sie die vorhergesagten miRNAs herunter und reichen Sie sie bei ENCORI ein, um potenzielle lncRNAs zu erhalten.
3. Laden Sie die vorhergesagten lncRAs herunter und identifizieren Sie die überlappenden lncRNAs zwischen Schritt 5.2 und Abbildung 2.
4. Reichen Sie die Hub-Gene, die in Abschnitt 5.1 gewonnenen miRNAs und die in Schritt 5.3 gewonnenen lncRNAs an die Cytoscape-Software (Version 3.4.0) ein, um das ceRNA-Netzwerk zu erstellen.

Ergebnisse

Identifikation von DEGs
Die Limma-R-Software wurde verwendet, um die differenziellen Expressionsprofile von lncRNAs und mRNAs zu analysieren. Die Unterschiede zwischen den beiden Gruppen wurden durch einen nicht gepaarten T-Test bestimmt. Wie im Vulkandiagramm (Abbildung 2) dargestellt, wurden insgesamt 739 verschiedene exprimierte lncRNAs (DE-lncRNAs, p-Wert<0,05, |log2FC|>1) identifiziert. Unter diesen DE-lncRNAs wurden im Verg...

Diskussion

Parodontalbandstammzellen (PDLSCs) gelten als Schlüsselzellen, die eine entscheidende Rolle bei der Unterdrückung von parodontalen Schäden sowohl während des Fortschreitungs- als auch der Genesungsphase der Parodontitis^spielen. Eine beträchtliche Menge an Belegen hat eindeutig gezeigt, dass die Inkubation unter einer entzündlichen Erkrankung das Potenzial hat, die Alterung von PDLSCs^34,35

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
R	R-Stiftung für statistische Berechnung	4.0.4	Kern-Open-Source-Umgebung für statistische Berechnungen. Dient als Grundlage für alle nachfolgenden Analysen. Typischerweise mit RStudio verwendet.
Limma	Bioconductor Community (Lead Dev: Walter & Eliza Hall Institute)	3.46.0	Spezialisiertes Paket für die differentielle Expressionsanalyse von Mikroarrays und RNA-seq.
Zytoscape	Cytoscape-Konsortium	3.8.2	Open-Source-Plattform für Netzwerkvisualisierung. Erfordert eine separate Installation; unterstützt Plugins wie ClueGO und cytoHubba über den App Store.
STRING	Europäisches Labor für Molekularbiologie	12	Die weltweit größte Datenbank für vorhergesagte und bekannte Protein-Protein-Interaktionen (PPI). Zugriff über Web- oder Cytoscape-Plugin; bietet Konfidenzwerte.
ENCORI	Sun Yat-sen Universität	3	Öffentliche Datenbank mit Schwerpunkt auf ceRNA-Netzwerken (miRNA-mRNA-lncRNA).