Methodenartikel

Analysen des konkurrierenden endogenen RNA-Netzwerks bei Ratten mit Verschluss der mittleren Hirnarterie basierend auf lncRNA-, miRNA- und mRNA-Expression

DOI:

10.3791/68876

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7. Oktober 2025

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1Department of Pharmacy, The First Affiliated Hospital of Anhui University of Chinese Medicine, 2School of Pharmacy, Anhui University of Chinese Medicine, 3School of Medical Economics Management, Anhui University of Chinese Medicine, 4Xin'an Medical Research Institute, 5Key Laboratory of Xin'An Medicine, Ministry of Education, 6Anhui Province Key Laboratory of Chinese Medicinal Formula

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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In dieser Studie wurden bioinformatische Analysen und experimentelle Validierung verwendet, um die regulatorischen Rollen und zugrunde liegenden Mechanismen langer nichtkodierender RNAs (lncRNAs), die als kompetitive endogene RNAs (ceRNAs) beim ischämischen Schlaganfall fungieren, systematisch zu untersuchen.

Zusammenfassung

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Ziel dieser Studie ist es, die regulatorische Rolle und die zugrundeliegenden Mechanismen von lncRNAs zu untersuchen, die als ceRNAs beim ischämischen Schlaganfall wirken. Basierend auf der ceRNA-Hypothese wurden lncRNAs, miRNAs und mRNAs als Komponenten eines regulatorischen Netzwerks identifiziert, das am Schlaganfall beteiligt ist. Wichtige lncRNAs aus dem resultierenden Subnetzwerk wurden für eine detaillierte Analyse ausgewählt. Die Analyse der funktionellen Anreicherung mittels Gene Ontology und die Kartierung des Signalwegs durch die Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes zeigten kritische Wechselwirkungen innerhalb des lncRNA-assoziierten ceRNA-Netzwerks. Schlüsselsignalwege, einschließlich der Kalzium-Signalgebung, der Gap-Junction-Signalgebung und der neuroaktiven Ligandenrezeptor-Interaktion, wurden mit Hilfe der Western-Blot-Analyse weiter validiert. Das konstruierte ceRNA-Netzwerk umfasste 334 lncRNAs, miRNAs und mRNAs, wobei die funktionelle Anreicherungsanalyse ihre biologische Rolle vorhersagte. Drei lncRNAs mit hohem Grad an Zentralität wurden ausgewählt, um ein repräsentatives ceRNA-Subnetzwerk zu konstruieren. Die Western-Blot-Analyse zeigte, dass im Vergleich zur Scheingruppe die Expressionsniveaus der Schlüsselproteine CaMKII, Calmodulin, CX36, PKC, CX43, GRIA3, GABRA6 und NPY1R in der Modellgruppe signifikant herunterreguliert waren, während die Expression von CaN signifikant hochreguliert war (P < 0,05). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass lncRNAs signifikant an der Pathogenese von Schlaganfällen beteiligt sind. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass lncRNAs, die als ceRNAs fungieren, eine entscheidende regulatorische Rolle bei der Pathogenese des ischämischen Schlaganfalls spielen.

Einleitung

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Ein ischämischer Schlaganfall, eine weit verbreitete neurologische Störung, führt zu dauerhaften Hirnschäden, langfristigen Behinderungen oder zum Tod 1,2,3,4. MicroRNAs (miRNAs oder miR), lange nichtkodierende RNAs (lncRNAs) und Boten-RNAs (mRNAs) bilden RNA-vermittelte regulatorische Netzwerke 5,6,7,8. Diese Moleküle regulieren zelluläre Funktionen durch verschiedenekomplexe Mechanismen, 9,10 werden zunehmend als Mitwirkende an der Pathophysiologie des ischämischen Schlaganfalls anerkannt. Trotz ihrer zunehmenden Assoziation mit der Erkrankung bleibt die genaue Rolle dieser nicht-kodierenden RNAs unklar. Die weitere Erforschung neuer nicht-kodierender RNAs ist essentiell für die Aufklärung der molekularen Mechanismen, die dem ischämischen Schlaganfall zugrunde liegen.

LncRNAs fungieren als Schlüsselregulatoren der Genexpression während der Initiierung und des Fortschreitens verschiedener pathologischer Zustände. Als konkurrierende endogene RNAs (ceRNAs) binden lncRNAs an miRNAs, um spezifische regulatorische Effekte auszuüben11. Wei et al. berichten, dass lncRNA AK038897 als ceRNA wirkt, indem sie auf miR-26a-5p abzielt und dadurch die todesassoziierte Proteinkinase 1 (DAPK1) moduliert, um die zerebrale Ischämie-Reperfusionsschädigung zu verschlimmern12. Studien zeigen, dass die lange nichtkodierende RNA SNHG1 (lncRNA SNHG1) als ceRNA fungiert, um zerebrovaskuläre Erkrankungen zu regulieren, indem sie den HIF-1α/VEGF-Signalweg durch Interaktion mit miR-18amoduliert 13. Weitere Studien zeigen, dass das lange nicht-kodierende RNA-Gen 3 (lncRNA MEG3) die neuronale Apoptose über die miR-21/PDCD4-Signalkaskademoduliert 14. Während zahlreiche lncRNAs, miRNAs und mRNAs durch Hochdurchsatzsequenzierung oder Microarray-Analyse identifiziert werden konnten, sind die Funktionen dieser Moleküle beim Schlaganfall noch unklar und die systematische Etablierung von RNA-vermittelten regulatorischen Netzwerken ist dringend erforderlich.

Daher zielt diese Studie darauf ab, ein umfassendes lncRNA-miRNA-mRNA-Netzwerk basierend auf der ceRNA-Hypothese unter Verwendung zuvor gesammelter Daten zu konstruieren und ausgewählte ceRNA-Subnetzwerke durch Anreicherung durch Gene Ontology (GO) und Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) zu analysieren, um die lncRNA-Funktionen besser zu verstehen. Die Ergebnisse könnten zeigen, dass mehrere lncRNAs als ceRNAs fungieren und möglicherweise spezifische miRNAs und ihre Ziel-mRNAs regulieren. Die GO-Anreicherung könnte wichtige biologische Prozesse wie Zellentwicklung, Signaltransduktion und Zellzyklusregulation hervorheben, während die Anreicherung des Signalwegs ihre Beteiligung an schlaganfallbedingten Signalwegen, Immunantworten und dem Stoffwechsel aufdecken könnte. Diese Ergebnisse könnten die potenzielle Rolle von lncRNAs in verschiedenen zellulären Prozessen und Krankheitsmechanismen hervorheben.

Gegenüber bestehenden ceRNA-Netzwerkanalysemethoden in der Forschung zum ischämischen Schlaganfall werden mehrere wichtige Verbesserungen angeboten, die durch Vergleiche mit verwandten Studien unterstützt werden: erstens, Integration einer mehrschichtigen Validierung durch Kombination von Netzwerkaufbau und Verifizierung des funktionellen Signalwegs; Im Gegensatz zu Li et al.15, die sich hauptsächlich auf die bioinformatische Profilerstellung von immunbezogenen ceRNA-Netzwerken unter Verwendung öffentlicher Transkriptomdaten konzentrieren, konstruieren Sie ein ceRNA-Netzwerk, das 334 lncRNAs, miRNAs und mRNAs umfasst, und validieren Sie kritische Signalwege (Kalziumsignalweg, Gap-Junction-Signalweg und neuroaktive Liganden-Rezeptor-Interaktion) durch Western-Blot-Analyse, um die Begrenzung des übermäßigen Vertrauens in In-silico-Vorhersagen zu berücksichtigen, wie in Fan et al.16 zu sehen ist, das ein circRNA-assoziiertes ceRNA-Netzwerk aufbaut, aber keine experimentelle Validierung der nachgeschalteten Signalwege vorliegt, und die funktionelle Relevanz des vorhergesagten Netzwerks durch Quantifizierung der Proteinexpression (z. B. CaMKII, CX36, GRIA3) sowohl in der Modell- als auch in der Scheingruppe bestätigen; Fokussierung auf Kern-lncRNAs mit hoher topologischer Bedeutung, um die Spezifität der Ergebnisse zu erhöhen; Im Gegensatz zu Cheng et al.17, die ein lncRNA-miRNA-mRNA-ceRNA-Netzwerk mit 3 lncRNAs, 2 miRNAs und 24 mRNAs konstruieren, aber keine Schlüsselregulatoren priorisieren, identifizieren Sie 3 lncRNAs mit einem hohen Grad an Zentralität, um ein repräsentatives Subnetzwerk aufzubauen, wodurch sichergestellt wird, dass mechanistische Erkenntnisse an den einflussreichsten Knoten verankert sind, und die Interpretierbarkeit im Vergleich zu breiteren, weniger fokussierten Netzwerken wie den in Li et al.18 beschriebenen verbessert wird, die 62 lncRNAs umfasst, aber keine gezielte Subnetzwerkanalyse bietet; Bereitstellung detaillierter experimenteller Parameter zur Verbesserung der Reproduzierbarkeit: Verwendung von 500 ng-1 μg Gesamt-RNA, die aus Hirngewebe extrahiert wurde (6 Ratten pro Gruppe: 20 MCAO-Modelle und 20 scheinbetriebene Kontrollen) für die Bibliotheksvorbereitung, mit einer RNA-Integritätszahl (RIN) von > 8,0, um die Qualität zu gewährleisten, ein Detail, das in Wang et al.19 nicht spezifiziert ist, das circRNA-Biomarker validiert, aber RNA-Eingabespezifikationen auslässt; männliche SPF-SD-Ratten (220 ± 30 g) mit MCAO, einem weit verbreiteten Modell, verwenden, aber explizit auf seine Grenzen hinweisen, es repliziert nicht vollständig die vaskuläre Komplexität oder Immunreaktionen des menschlichen ischämischen Schlaganfalls, wie in Li et al. hervorgehoben wird -- und mildern Sie dies durch Stratifizierung von Ratten nach neurologischen Scores (1-3), um den Schweregrad des Infarkts zu standardisieren; Einschränkungen der Studie berücksichtigen: Das ceRNA-Netzwerk erfasst möglicherweise keine posttranslationalen Modifikationen, und die Stichprobengröße für die Western-Blot-Validierung (n = 6 pro Gruppe) könnte erweitert werden, wobei zukünftige Arbeiten größere Kohorten und Proteomanalysen einbeziehen werden, um diese Lücken zu schließen.

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Protokoll

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Die Tierversuche wurden von der Experimentellen Ethikkommission der Anhui University of Chinese Medicine (Lizenznummer: AHUCM-rats-2024006) genehmigt und in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien und den Tierverwendungsstandards von JoVE durchgeführt. In dieser Studie wurden vierzig männliche SD-Ratten mit Lichtschutzfaktor (220 g ± 30 g) verwendet. Die verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Versuchstiere

  1. Bringen Sie die Tiere im Tierversuchszentrum unter normalen Versuchsbedingungen unter. Halten Sie einen 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus ein, wechseln Sie täglich die Bettwäsche und bieten Sie freien Zugang zu Futter und Wasser.
  2. Die Tiere werden am Ende des Versuchs eingeschläfert, indem 150 mg/kg Natrium-Pentobarbital durch intraperitoneale Injektion verabreicht werden, um einen tiefen Anästhesiezustand herbeizuführen (gemäß den institutionell anerkannten Protokollen). Bestätigen Sie die Tiefenanästhesie durch das Fehlen einer reflexartigen Reaktion auf das Kneifen der Pfote, überwachen Sie die Atmung, um einen vollständigen Verlust der Vitalparameter sicherzustellen, und fahren Sie dann mit der Enthauptung fort.

2. Induktion des Modells des Verschlusses der mittleren Hirnarterie (MCAO) bei Ratten

  1. Induzieren Sie die Anästhesie durch Verabreichung einer intraperitonealen Injektion von 1% Pentobarbital-Natrium in einer Dosis von 40 mg/kg20 (gemäß institutionell anerkannten Protokollen). Beurteilen Sie die Narkosetiefe anhand des Zehenkneifens und der Hornhautreflexe.
    1. Überwachen Sie während des gesamten Eingriffs kontinuierlich die Atem- und Herzfrequenz. Tragen Sie unmittelbar nach der Narkoseeinleitung sterile Augensalbe auf Mineralölbasis auf, um die Augen zu schützen21.
  2. Sobald Sie vollständig betäubt sind, machen Sie einen Schnitt in der Mittellinie des Halses und legen Sie vorsichtig die rechte Arteria carotis communis (CCA), die Arteria carotis interna (ICA) und die Arteria carotis externa (ECA) frei. Verwenden Sie unter direkter Visualisierung geeignete mikrochirurgische Instrumente (z. B. Pinzette und Schere), um das umgebende Bindegewebe sanft zu trennen und jede Arterie vollständig freizulegen.
    1. Nach der Freilegung der Arterien wird die ECA und CCA mit chirurgischen Nähten ligiert. Binden Sie sichere chirurgische Knoten, um den Blutfluss zu blockieren und Blutungen bei nachfolgenden Eingriffen zu minimieren. Stellen Sie die richtige Spannung sicher, um ein stabiles Feld für das Einführen der Naht zu schaffen.
    2. Machen Sie mit einer Augenschere einen kleinen Schnitt an der Bifurkation von ECA und ICA, um das Einsetzen der Naht vorzubereiten. Wählen Sie eine Nylonnaht mit einem Durchmesser von 0,25 mm und einer Länge von 18 mm ab der Spitze des abgerundeten (kugelförmigen) Endes. Führen Sie die Naht durch die Inzisionsstelle am ECA-ICA-Übergang ein und schieben Sie sie vorsichtig entlang der ICA bis zu einer Tiefe von ca. 18,5 mm ± 0,5 mm vor, um die mittlere Hirnarterie zu verschließen und eine fokale zerebrale Ischämie zu induzieren.
    3. Befestigen Sie die eingesetzte Nylonnaht mit chirurgischen Nähten an dem umgebenden Gewebe oder den Blutgefäßen, um eine Verschiebung zu verhindern. Nach 2-stündiger Aufrechterhaltung der MCAO kommt es zu Ischämie-/Reperfusionsschäden. Verwenden Sie eine feine chirurgische Zange, um die Nylonnaht vorsichtig zu greifen, und ziehen Sie sie langsam etwa 5 mm zurück, um den zerebralen Blutfluss teilweise wiederherzustellen und eine Reperfusionsverletzung zu induzieren. In der Scheingruppe wird nur die Halsschlagader ligiert, ohne ein Fadenembolus zu legen22.
  3. Eine Woche nach der erfolgreichen Etablierung des MCAO-Modells betäuben Sie die Ratten tief. Sobald es keine Reaktion auf das Kneifen der Pfote gibt, enthaupte schnell das Gehirn und entferne es. Spülen Sie das Hirngewebe mit normaler Kochsalzlösung ab und lagern Sie es dann in einem Kühlschrank bei -80 °C zur Kryokonservierung23.
  4. Punktzahl für die neurologische Funktion
    1. Bewerten Sie die neurologische Funktion mit der Longa-Scoring-Methode, um den Erfolg des MCAO-Modellszu bestimmen 24. 24 Stunden nach der Reperfusion ist die neurologische Funktion jeder Ratte zu beurteilen und eine Punktzahl basierend auf den folgenden Kriterien zuzuweisen: Punktzahl 0: kein beobachtbares neurologisches Defizit; Score 1: Beugung der linken Vordergliedmaße während der Schweifaufhängung, Vordergliedmaße nicht vollständig gestreckt; Score 2: Beugung der linken Vordergliedmaße während der Schweifaufhängung mit deutlich reduziertem Widerstand auf der betroffenen (linken) Seite, wenn sie auf einer ebenen Fläche platziert wird; Punktzahl 3: wie Punktzahl 2, mit zusätzlichen Kreis- oder unwillkürlichen Drehbewegungen beim Krabbeln; Punktzahl 4: Bewusstlosigkeit oder Tod innerhalb von 24 Stunden.
      HINWEIS: Eine höhere Punktzahl weist auf eine schwerere Verhaltensstörung und eine größere neurologische Beeinträchtigung hin.
  5. Berechnung des Hirninfarktvolumens mittels 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC)-Färbung
    1. Jedes ex vivo Rattengehirn entlang der koronalen Ebene wird in fünf gleich dicke Scheiben geschnitten. Stellen Sie sicher, dass jede Scheibe genau 2,0 mm ± 0,1 mm dick ist. Tauchen Sie die Abschnitte vollständig in frisch zubereitete 2%ige (w/v) TTC-Färbelösung.
      1. Wickeln Sie den Färbebehälter in Aluminiumfolie ein, um die Lösung vor Licht zu schützen, und inkubieren Sie die Proben in einem Inkubator mit konstanter Temperatur bei 37 °C ± 0,5 °C für 30 Minuten. Nach der Färbung ist eine rosenrote Färbung im normalen Hirngewebe zu beobachten, während ischämische Infarktbereiche aufgrund des Verlusts der Dehydrogenase-Aktivität ungefärbt (weiß) bleiben.
    2. TTC-gefärbte Hirnschnitte in eine 4%ige (w/v) Paraformaldehyd-Lösung überführen und 24 h lang bei 4 °C fixieren, um die Gewebemorphologie zu erhalten. Nehmen Sie nach der Fixierung digitale Bilder der Scheiben mit einem hochauflösenden Bildgebungssystem auf. Aufzeichnung und Archivierung der Daten 24 h nach der Fixierung.
    3. Verwenden Sie die ImageJ-Software, um das Infarktvolumen und das Gesamtvolumen des Hirngewebes für jede Rattengruppe nach der TTC-Färbung zu quantifizieren. Berechnen Sie den korrigierten Prozentsatz des Infarktvolumens mit der folgenden Formel25:
      Korrigiertes Infarktvolumen (%) = {[Gesamtvolumen der Läsion − (Volumen der linken Hemisphäre − Volumen der rechten Hemisphäre)] / Volumen der rechten Hemisphäre} × 100%.
    4. Verwenden Sie die GraphPad Prism Software, um korrigierte Infarktvolumina über einen ungepaarten t-Test zu visualisieren und statistisch zu analysieren. Definieren Sie die statistische Signifikanz als P < 0,05.

3. RNA-Hochdurchsatz-Sequenzierung

  1. Wählen Sie Gehirngewebe von drei Ratten in jeder Gruppe aus. Entfernen Sie ribosomale RNA (rRNA) aus den gesamten RNA-Proben mit dem Ribo-Zero rRNA Removal Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    1. Erstellen Sie komplementäre DNA-Bibliotheken (cDNA) mit dem TruSeq RNA Library Prep Kit nach dem Standardprotokoll. Verwenden Sie aufgereinigte cDNA-Bibliotheken für die Clustergenerierung und Sequenzierung.
  2. Verwenden Sie die zuvor generierten Kerndaten26, die alle Sequenzierungsbibliotheken und Datensätze für diese Studie bereitstellten, ohne auf neu erstellte Bibliotheken angewiesen zu sein. Fokussierung der aktuellen Arbeiten auf die integrierte Fusionsanalyse dieser bestehenden Datensätze, ohne neue RNA-seq-Bibliotheken oder Sequenzierungsdaten zu generieren.
    1. Bestätigung der Genehmigung durch die zuständigen institutionellen Ethikkommissionen für die vorherige Studie. Durchführung einer Hochdurchsatz-Sequenzierung zur systematischen Bewertung des miRNA-Expressionsprofils bei Ratten mit MCAO unter Einhaltung standardisierter Protokolle, wie zuvor beschrieben27.
      HINWEIS: Die Qualitätskontrolldaten für die RNA-Sequenzierungsbibliothek sind in der Zusatzdatei 1 enthalten.

4. Differentielle Expressionsanalyse von langen nichtkodierenden RNAs, microRNAs und Boten-RNAs

  1. Erhalten Sie Annotationen für proteinkodierende Gene, miRNAs und lncRNAs aus Ensembl (https://www.ensembl.org/index.html), miRBase (https://www.mirbase.org/) und NONCODE (http://www.noncode.org/), je nach Bedarf 28,29,30. Quantifizieren Sie die Genexpression mit StringTie31 (https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/).
    1. Assemblieren Sie die ausgerichteten Reads aus jeder Probe mit dem StringTie-Assembler zu Transkriptomen. Verwenden Sie das StringTie-Merge-Modul, um die Transkriptom-Assemblierungen aus allen Proben zu integrieren und einen einheitlichen Satz von Transkripten zu generieren, der in der gesamten Kohorte konsistent ist. Verwenden Sie dieses zusammengeführte Transkriptom, um die Transkripthäufigkeitzu schätzen 32.
    2. Führen Sie eine Quantifizierung von proteinkodierenden Genen und lncRNAs durch, indem Sie die Normalisierung des getrimmten Mittelwerts der M-Werte (TMM) anwenden und die Fragmente pro Kilobasis des Transkripts pro Million kartierter Reads (FPKM) für jedes Transkriptberechnen 33,34.
  2. Führen Sie eine differentielle Expressionsanalyse mit dem edgeR-Paket (https://bioconductor.org/) durch, um differentiell exprimierte lncRNAs (DELs), miRNAs (DEMis) und mRNAs (DEMs) zwischen der MCAO und der Kontrollgruppe zu identifizieren. Konvertieren Sie die gefilterte Rohanzahlmatrix in ein edgeR DGEList-Objekt. Schätzen Sie die gemeinsame Dispersion und weisen Sie jedem Gen oder jeder miRNA denselben Dispersionswert zu.
    1. Führen Sie einen exakten Test durch, um die Genexpression zwischen Gruppen zu vergleichen. Rufen Sie die log2-fache Änderung (log2FC), die logarithmischen Zahlen pro Million (logCPM), die P-Werte und die an die Falschentdeckungsrate (FDR) angepassten P-Werte für jedes differentiell exprimierte Gen35 ab. Definieren Sie die statistische Signifikanz als P < 0,05 mit einer Faltungsänderungsschwelle von |log2(FC)| > 1.

5. Vorhersage langer nichtkodierender RNA- und Boten-RNA-Ziele von differentiell exprimierten microRNAs

  1. Rufen Sie die Sequenzen von DEMis und DELs aus den entsprechenden Datenbanken ab. Verwenden Sie die miRNA-lncRNA-Interaktionsvorhersagetools miRanda36 und RNAhybrid37 , um potenzielle Wechselwirkungen zwischen DEMis und DELs zu identifizieren. Beziehen Sie miRNA-mRNA-Interaktionspaare aus der miRWalk 3.0-Datenbank (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)38

6. Aufbau des langen nichtkodierenden RNA - microRNA - Boten-RNA-Regulationsnetzwerks

  1. Konstruktion des lncRNA-miRNA-mRNA-Regulationsnetzwerks basierend auf der ceRNA-Hypothese39,40.
    1. Berechnen Sie den Pearson-Korrelationskoeffizienten (PCC) zwischen DELs und DEMs. Wählen Sie lncRNA-mRNA-Paare für die weitere Analyse aus, wenn PCC 0,99 und P < 0,01 >.
    2. Identifizieren Sie für jedes co-exprimierte lncRNA-mRNA-Paar gemeinsame miRNAs, die auf beide Transkripte abzielen. Verwenden Sie diese gemeinsam genutzten miRNAs, um das miRNA-mRNA-lncRNA-Co-Expressionsnetzwerk aufzubauen.
    3. Verwenden Sie Cytoscape (https://cytoscape.org/), um das lncRNA-miRNA-mRNA-Interaktionsnetzwerk zu konstruieren und zu visualisieren 41,42. Gehen Sie folgendermaßen vor:
      1. Verwenden Sie das CytoNCA-Plug-in, um die Zwischenzentralität (BC), die Nähezentralität (CC) und die Gradzentralität (DC) für jeden Knoten zu berechnen.
      2. Wählen Sie Gene aus, deren Zentralitätswerte die Medianwerte aller drei Metriken überschreiten, um das endgültige Schlüsselsubnetzwerk zu konstruieren.
      3. Verwenden Sie das CytoHubba-Plugin, um die Top 10 Hub-Gene im Protein-Protein-Interaktionsnetzwerk zu identifizieren und Schlüsselknoten zu extrahieren, die in Schritt 2 identifiziert wurden.
      4. Berechnen Sie den Knotengrad für jede Komponente des ceRNA-Netzwerks.

7. Funktionale Anreicherungsanalysen

  1. Durchführung von Analysen der Anreicherung des GO- und KEGG-Signalwegs, um die RNA-Funktion weiter zu untersuchen43. Verwenden Sie das clusterProfiler-Paket (https://bioconductor.org/), um die Anreicherungsergebnissezu visualisieren 44.

8. Western-Blot-Analyse zum Nachweis der Expressionsniveaus von Schlüsselproteinen, die an lncRNA-ceRNA-verwandten Signalwegen beteiligt sind

  1. Entfernen Sie unter tiefer Narkose schnell das gesamte Gehirn. Nach vorsichtiger Entfernung der Hirnhäute und Blutgefäße wird das kortikale Gewebe im infarktierten Bereich der Ratteisoliert 45. Schneide das Taschentuch mit einer feinen Schere in kleine Stücke und achte darauf, dass jedes Stück zwischen 50 mg und 100 mg wiegt. Übertragen Sie die gewogenen Gewebeproben in vorgekühlte Homogenisierungsröhrchen.
    1. Bereiten Sie den Proteinlysepuffer bei einem Volumenverhältnis von PMSF zu RIPA-Lysepuffer von 1:100 (Endkonzentration 1 mM PMSF) vor. Geben Sie den Lysepuffer in einem Verhältnis von 200 μl pro 20 mg Gewebe hinzu. Homogenisieren Sie die Proben gründlich mit einem hitzesterilisierten Glashomogenisator, bis das Gewebe fein aufgespalten ist.
    2. Inkubieren Sie die Homogenate 30 Minuten lang auf Eis und rühren Sie alle 10 Minuten vorsichtig um, um eine vollständige Lyse zu ermöglichen. Die Proben werden bei 28.656,6 × g für 15 min bei 4 °C zentrifugiert. Den Überstand, der das Gesamtprotein enthält, vorsichtig absaugen, ohne das Pellet zu stören.
  2. Geben Sie 5× Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Ladepuffer (SDS-PAGE) in ein Verhältnis von 1:4 zur Proteinprobe (1 Volumen von 5× Puffer auf 4 Volumina der Proteinprobe). Nach der Verdünnung beträgt die endgültige Arbeitskonzentration des SDS-PAGE-Ladepuffers 1×.
    1. Gründlich mischen und 10 Minuten in einem kochenden Wasserbad erhitzen, um die Proteine vollständig zu denaturieren. Lassen Sie die Proben auf Raumtemperatur abkühlen. Laden Sie 30 μg jeder Probe in die SDS-PAGE-Gel-Wells.
    2. Führen Sie die Elektrophorese in zwei Stufen durch: Legen Sie 30 Minuten lang 80 V an, um Proteine durch das Stapelgel aufzulösen, und erhöhen Sie dann 1 Stunde lang auf 120 V, um die Proteine im Auflösungsgel zu trennen.
  3. Bereiten Sie vorgeschnittenes Filterpapier und Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membranen vor, die der Größe des Gels entsprechen. Weichen Sie die PVDF-Membran 3 Minuten lang in Methanol ein, um sie zu aktivieren. Tauchen Sie sowohl die PVDF-Membran als auch das Filterpapier für 5 Minuten in den Transferpuffer.
    1. Montieren Sie das Transfersandwich in der folgenden Reihenfolge (von oben nach unten): Anodenplatte, drei Lagen Filterpapier, PVDF-Membran, Gel, drei Lagen Filterpapier, Kathodenplatte. Stellen Sie sicher, dass die Gel-, Membran- und Filterpapierschichten richtig ausgerichtet sind. Entfernen Sie bei jedem Schritt alle Luftblasen, um eine gleichmäßige Übertragung zu gewährleisten.
  4. Spülen Sie die PVDF-Membran unmittelbar nach dem Proteintransfer 5 Minuten lang in Western Washing Buffer, um den restlichen Transferpuffer zu entfernen. Blockieren Sie die Membran 2 Stunden lang bei Raumtemperatur durch leichtes Schütteln in Western Blocking-Puffer mit 5 % Magermilchpulver oder verwenden Sie 5 % BSA, wenn phosphorylierte Proteine nachgewiesen werden.
  5. Nach der Blockierung wird die Membran mit dem Primärantikörper (1:1000) über Nacht bei 4 °C unter leichtem Schütteln inkubiert. Am nächsten Tag inkubieren Sie die Membran mit dem Sekundärantikörper (1:10.000) für 2 h bei Raumtemperatur.
  6. Führen Sie die Chemilumineszenz-Erkennung in einem dunklen Raum durch, um Lichtinterferenzen zu vermeiden. Platzieren Sie die Proteinseite der PVDF-Membran flach in der Mitte der Belichtungsplatte im automatischen Bildgebungssystem.
    1. Mischen Sie unmittelbar vor der Verwendung gleiche Volumina von ECL-Reagenz A und ECL-Reagenz B in einem sauberen Zentrifugenröhrchen. Tragen Sie die angemischte ECL-Lösung gleichmäßig auf die Membranoberfläche auf, um die Lumineszenzreaktion einzuleiten.
    2. Nach 1-2 min Inkubation bei Raumtemperatur überschüssige Flüssigkeit vorsichtig entfernen, ohne die Membranoberfläche zu stören. Passen Sie die Belichtungsparameter am Bildgebungssystem entsprechend der Lumineszenzintensität an, um die Signalerfassung zu optimieren.

9. Statistische Auswertung

  1. Analysieren Sie Western-Blot-Ergebnisse mit der ImageJ-Software, um die Grauwerte des Bandes zu quantifizieren. Verwenden Sie GraphPad Prism für die statistische Analyse experimenteller Daten. Drücken Sie alle Daten als Mittelwert ± Standardabweichung (x ± SD) aus. Bewerten Sie statistische Unterschiede zwischen Gruppen mit einem ungepaarten t-Test.
    1. Geben Sie die Daten aus den beiden unabhängigen Probengruppen in die Datentabelle der Software ein, wobei jede Gruppe einer separaten Spalte entspricht und die Stichproben unabhängig voneinander sind. Überprüfen Sie die Normalhaltung, indem Sie unter der Funktion "Analysieren" die Option "Normalitäts- und Symmetrietests" auswählen und den Shapiro-Wilk-Test auf beide Gruppen anwenden.
    2. Wenn P für beide Gruppen 0,05 >, betrachten Sie die Daten als normalverteilt. Wählen Sie auf dieser Grundlage unter t-Tests in der Funktion Analysieren die Option Ungepaarter t-Test aus, um die Analyse durchzuführen. Definieren Sie die statistische Signifikanz als P < 0,05.

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Ergebnisse

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Die experimentellen Ergebnisse der Erfolgsratenverifizierung jeder Gruppe von Rattenmodellen sind in Abbildung 1 dargestellt. Nach der Modellierung wurde eine neurologische Funktionsbewertung an den Ratten durchgeführt (Abbildung 1A). Die Modellgruppe wies schwere neurologische Defizite auf, und diejenigen mit Werten von 1 bis 3 wurden in die nachfolgenden Experimente einbezogen. Abbildung 1B und C zeigen die Ergebnisse der TTC-Färb...

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Diskussion

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Um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die der Schlaganfall-Pathogenese zugrunde liegen, und um potenzielle diagnostische und therapeutische Ziele zu identifizieren, wurden RNA-Seq- und kleine RNA-Seq (sRNA-Seq)-Analysen an Hirngeweben von Ratten nach MCAO durchgeführt. Diese Studie zielt in erster Linie darauf ab, die komplexen regulatorischen Netzwerke zu untersuchen, an denen lncRNAs, miRNAs und mRNAs beteiligt sind. Eine umfassende Analyse der RNA-Seq- und sRNA-Seq-Datensätze...

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Offenlegungen

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Die Autoren stellen fest, dass es keine konkurrierenden Interessen gibt.

Danksagungen

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Dieses Manuskript wurde unterstützt durch das Anhui Province Academic Leader Reserve Candidate Funding Project (Nr. 2022H287), das Anhui Provincial Health Research Key Project (Referenz: AHWJ2022a013), das Anhui Provincial College Natural Science Research Key Project (NO.2023AH050745) und das Anhui Provincial Hygiene and Health Outstanding Talents Project (NO. ahsjhmypygc20230074).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2% (w/v) TTC-FärbelösungVerifizierter Lieferant - Beijing Kangle Clone Biotechnology Co., Ltd.20230805TTC-Färbung
4%ige (w/v) Paraformaldehyd-LösungBeyotimeNr. P0099Fixiertes Hirngewebe
40 männliche SD-Ratten mit LichtschutzfaktorHagzhou Ziyuan Labortierzucht Co., LtdSCXK [zhe] 2024-0004Versuchstier
5 % MagermilchpulverWissenschaftliche PhygeneNr. PH1519WB
Agarose-Elektrophorese-SystemBeijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.DYCP-44PWB
Automatisches BelichtungsinstrumentShanghai Peiqing Technology Co., Ltd.JS-M6PWB
Automatischer BelichtungsmesserShanghai Peiqing Technology Co., LTDJS-M6PWB
Automatische EismaschineChangshu City Xueke Elektrogeräte Co., LtdIMS-20WB
CalmodulinAffinitätArtikel-Nr.: 49B2443WB
CamKIIAffinitätArtikel-Nr.: 14G0796WB
ZentrifugeHaimen Qilinbeier Instrument Manufacturing Co., Ltd.LX 300WB
clusterProfiler-PaketBioleiterclusterProfiler_4.17Anreicherungs-Analysen
CX36ZENBION24AP24WB
CX43ZENBIOM08NO01WB
ECL ultra-empfindliches Chemilumineszenz-KitBioscharfBL520BWB
Elektrischer thermostatischer LufttrockenofenShanghai Sanfa Scientific Instrument Co., LTDDHG-9070WB
Elektrophorese-GerätShanghai Tianeng Technology Co., LTD. (Tanon)EPS300WB
Elektrophorese-GerätShanghai Tanon Wissenschaft & Technology Co., Ltd.EPS300WB
Elektrophorese-TankShanghai Tanon Wissenschaft & Technology Co., Ltd.VE-180WB
GABRA6AffinitätArtikel-Nr.: 46V5371WB
Anti-Maus-IgG für ZiegenZs-BIO142637WB
Ziege Anti-Kaninchen IgGZs-BIO139931WB
GRIA3AffinitätNr. 0C33051WB
Kühlzentrifuge mit hoher GeschwindigkeitAnhui Jiawen instrument equipment Co., LTDJW-3021HRWB
HiSeq 2500 SystemIllumina/RNA-Hochdurchsatz-Sequenzierung
ImageJ SoftwareNationale GesundheitsinstituteBildJ 1,54 KBTTC-Färbung
Magnetisches HeizrührwerkStadt Changzhou und InstrumentenfabrikJJ-79-1WB
MikropipetteDeutschland Eppendorf/WB
Mikrozentrifuge mit normaler TemperaturHaimen Qi Limber Instrument Manufacturing Co., LTD. LX300LX300WB
NPY1RAffinitätArtikel-Nr.: 2D38248WB
PipetteEppendorf0,5-10 ulWB
PKCAffinitätArtikel-Nr.: 17E3745WB
vorgefärbtes Protein MarkerBioscharfBL712CWB
PVDF-MembranMilliporeIPVH00010WB
Ribo-Zero rRNA-EntfernungskitIllumina, San Diego, Kalifornien, USA/RNA-Extraktion
RIPA-LysatBioscharfBL504AWB
Natrium-PentobarbitalBeijing Think-Far Technology Co., Ltd.MERCKAnästhetikum
Transfer-MembraninstrumentShanghai Tanon Wissenschaft & Technology Co., Ltd.VE-186WB
Transmembran-ApparaturShanghai Tianeng Technology Co., LTD. (Tanon)VE-186WB
β-AktinZs-BIOArtikel-Nr.: 19AW0505WB

Referenzen

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