Eine einfache und schnelle Methode zur gleichzeitigen Isolierung von primären Inselchen und primären Pankreas-Acinarzellen von Mäusen

Summary

Diese Studie entwickelte eine vereinfachte Methode, um funktionelle primäre Inselchen und Acinarzellen effizient aus der Bauchspeicheldrüse der Maus zu extrahieren, was ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der interzellulären Kommunikation in der Pathogenese des akuten Pankreatitis-induzierten Diabetes bietet.

Abstract

In der Forschung zur Pathogenese der postakuten Pankreatitis diabetes mellitus (PPDM-A) steht die abnormale bidirektionale Kommunikation zwischen pankreatischen Acinarzellen (PACs) und Inselzellen im zentralen Fokus. Unsterbliche Zelllinien können jedoch keine pathophysiologischen Bedingungen replizieren, weshalb die Gewinnung hochwertiger Primärzellen entscheidend ist. Aktuelle Methoden zur Extraktion von primären Inselchen von Mäusen basieren hauptsächlich auf in-vivo Pankreasperfusion mittels Gallengangskanulierung, die eine hohe technische Hürde darstellt und für Forscher ohne Erfahrung nicht förderlich ist.

Diese Studie modifizierte die Methode und entfiel der Bedarf an komplexer, in vivo Perfusion. SPF-fähige C57BL/6J-Mäuse (6-8 Wochen alt) wurden betäubt und eingeschläfert, gefolgt von der Pankreas-Isolierung. Die Bauchspeicheldrüse wurde in vitro mit Kollagenase P verdaut; Primärinseln wurden durch Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation getrennt, und Acinarzellen wurden durch Zellfilterung und Zentrifugation gewonnen. Die Zelllebensfähigkeit und -funktion wurden mittels Calcein/Propidiumiodid (Calcein/PI)-Färbung, glukosestimuliertem Insulinsekretionstest und Amylaseaktivitätsnachweis bewertet.

Die Ergebnisse zeigten, dass die modifizierte Methode einfach zu bedienen war: Der Ertrag pro Maus betrug (120 ± 5) primäre Inselchen und 1,6–1,95 × 10⁷ Acinarzellen; Die Viabilitätsraten von Inselchen und Acinarzellen betrugen (97,52 ± 0,16)% bzw. (96,55 ± 0,95%) %). Außerdem zeigten die Inselchen eine normale Insulinsekretionsfähigkeit, und die Acinarzellen waren empfindlich gegenüber Cerulein-Stimulation. Diese Methode ist einfach und zuverlässig und bietet einen praktikablen Rahmen zur Untersuchung der exokrin-endokrinen Wechselwirkungen der Pankreatus und PPDM-A. Allerdings gibt es Einschränkungen, wie etwa eine nicht validierte Anwendung bei Ratten.

Introduction

Akute Pankreatitis (AP) kann die endokrine Funktion der Pankreasfrucht über mehrere Wege stören, wie z. B. eine parenchymale Verletzung der Pankreasbildung und entzündliche Kaskaden, wodurch postakute Pankreatitis diabetes mellitus (PPDM-A^{) ausgelöst wird1,2}. Derzeit bleibt die Kernpathogenese von PPDM-A unklar, und die abnormale bidirektionale Kommunikation zwischen den endokrinen und exokrinen Kompartimenten der Pankreatus ist ein zentraler Forschungsschwerpunkt³. Obwohl bestehende immortalisierte β-Zelllinien (z. B. INS-1, MIN6) häufig für in-vitro-diabetische Zellmodelle verwendet werden, führt ihre tumorabgeleitete Natur zu signifikanten Unterschieden zu normalen primären Inselzellen hinsichtlich der Glukosereaktion und zellulärer Heterogenität. Daher können sie den pathophysiologischen Zustand unter der Mikroumgebung der akuten Pankreatitis ^4,5 nicht wirklich replizieren. Daher ist die Gewinnung hochwertiger primärer Inselchen und Acinarzellen die technische Grundlage für die Aufklärung des Mechanismus ihrer Wechselwirkung geworden.

Aktuelle Methoden zur Isolierung von primären Inselchen von Mäusen basieren hauptsächlich auf der Kanalkanulierungstechnologie, die eine präzise Lokalisierung und Kanüle des Gallengangs beinhaltet, um Kollagenaslösung in das Pankreasparenchym für eine in vivo Perfusion ^6,7 zu injizieren. Für die Isolierung der primären Inselchen von Neugeborenenmäusen erzielten Huang et ^al.8 jedoch hervorragende Ergebnisse mit In-vitro-Verdauung ohne in-vivo Pankreasperfusion. Basierend auf der praktischen Erfahrung unseres Forschungsteams ist die optimale Pankreasperfusion durch Gallengangskannulation ohne spezialisierte Schulung schwer schnell und effektiv umzusetzen. Inspiriert von der Methode zur Isolierung primärer Inselchen aus Neugeborenenmäusen modifizierte unser Team das Extraktionsprotokoll, um es für Forscher ohne Perfusionserfahrung einfacher und zugänglicher zu machen. Dieser modifizierte Ansatz bietet auch eine einfachere Alternative, um primäre Inselchen von jungen Mäusen oder solchen mit empfindlichen Gallengängen zu isolieren. Darüber hinaus bietet diese Methode Vorteile sowohl in der Isolationseffizienz (Menge) als auch in der Reinheit (Qualität) von Inselchen und Acinarzellen. Sie ermöglicht es Forschern, Experimente im selben pathologischen und physiologischen Kontext durchzuführen und so eine tiefgehende Analyse des Wechselwirkungsmechanismus zwischen Inselchen und Acinarzellen zu ermöglichen.

Die Methode erfordert eine strenge Kontrolle der Verdauungszeit der Bauchspeicheldrüse; Das Zerkleinern der Bauchspeicheldrüse vor der Verdauung ist ebenfalls ein entscheidender Schritt. Außerdem sollte auf die Intensität der mechanischen Verteilung des Pankreasgewebes nach der Verdauung geachtet werden. Diese Faktoren beeinflussen alle die Menge und Qualität der isolierten Inselchen und Acinarzellen. Diese Methode wurde bei Ratten nicht validiert und kann derzeit nicht für die Produktion hochskaliert werden.

Protocol

Verfahren mit Tieren wurden vom Ethikausschuss oder dem Ethikausschuss des Labortierzentrums des Changhai Hospital genehmigt (Genehmigungsnummer: CHEC (A.E)-2025-026). SPF-Grade C57BL/6J-Mäuse (6-8 Wochen alt, 18-25 g, männlich oder weiblich, n = 3) wurden in einem 12-Stunden-Hell/Dunkel-Zyklus mit freiem Zugang zu Nahrung (Erhaltungsdiät) und Wasser gehalten.

Scharfe Abfälle wie Spritzen und Nadeln werden in den speziellen Behältern des Labors gesammelt und von qualifizierten Fachkräften entsorgt. Gemäß den Richtlinien für ethisches Verhalten bei der Pflege und Verwendung nichtmenschlicher Tiere in der Forschung werden Mäusekadavere im speziellen Gefrierschrank für Mäusekadaver des Labors untergebracht und von Fachorganisationen verbrannt.

1. Reagenzvorbereitung

HINWEIS: Lösungen wie sterile Dichtegradientenmedium werden in der "Chemical Waste Collection Drum" des Labors gesammelt. Alle chemischen Abfälle sind von qualifizierten Fachleuten, wie vom Labor organisiert, entsorgt zu werden.

1. Herstellung der Kollagenase-P-Lösung
   1. In einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen wiegen Sie sequentiell 25 mg Kollagenase P, 42 mg wasserfreies Calciumchlorid und 0,02 g Trypsininhibitor. Fügen Sie 45,5 ml Hank's Balanced Salt Solution und 500 μL HEPES-Lösung hinzu, dann wirbeln Sie, bis es vollständig gelöst ist. Sterilisieren Sie die Lösung durch Filtration durch einen 0,22-μm-Filter und übertragen Sie die gefilterte Lösung in ein neues, steriles 50-mL-Zentrifugenrohr. Dies ergibt eine 0,5 mg/mL Kollagenase-P-Lösung, die für die anschließende Verdauung des Bauchspeicheldrüsengewebes verwendet wird.
2. Behandlung der sterilen Dichtegradientenlösung
   1. Filtern Sie die sterile Dichtegradientenlösung durch einen 0,22-μm-Filter zur Sterilisation und übertragen Sie sie dann in ein neues steriles 50-mL-Zentrifugenrohr. Beschriften Sie die Lösungsinformationen deutlich und lagern Sie sie bei 4 °C für spätere Gebrauch. Danach wird sie als "Ficoll" bezeichnet.
3. Vorbereitung von Stopppuffer und vollständigem Medium
   1. Fügen Sie 10 % fetales Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin-Lösung in das leere DMEM-Medium bzw. RPMI-1640-Medium hinzu, um das DMEM-Komplettmedium und das RPMI-1640-Komplettmedium (auch als Stopppuffer für die Pankreasverdauung) herzustellen. Kennzeichnen Sie die Lösungsinformationen klar und lagern Sie sie bei 4 °C für spätere Gebrauch.
4. Herstellung von Glukoselösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen
   1. In einem 50-mL-Zentrifugenrohr werden 50 ml Krebs-Ringer-Bicarbonat-HEPES-Puffer (KRBH) und 0,25 g Bovine Serum Albumin (BSA)-V hinzugefügt, um eine KRBH-Lösung mit 0,5 % BSA herzustellen. Anschließend werden in 28,33 ml der 0,5 % BSA-haltigen KRBH-Lösung 168 μL Glukose (1 M) und 1,5 ml Calciumchloridlösung (50 mM) hinzugefügt, um eine 5,6 mM Glukoselösung herzustellen. In 9,28 ml der 0,5 % BSA-haltigen KRBH-Lösung werden 220 μL Glukose (1 M) und 500 μL Calciumchloridlösung (50 mM) hinzugefügt, um eine 22 mM Glukoselösung herzustellen.

2. Isolierung von Pankreasinseln und pankreatischen Acinarzellen (PACs)

HINWEIS: Alle chirurgischen Instrumente müssen einer Autoklavensterilisation unterzogen werden.

1. Gib Hank's Balanced Salt Solution und Kollagenase-P-Lösung der 12-Well-Platte hinzu. Und geben Sie 3 ml Kollagenase-P-Lösung in ein 50 ml Zentrifugenrohr für die spätere Verdauung.
   HINWEIS: Gib 2 ml Hank's Balanced Salt Solution zu drei Brunnen und 2 ml Kollagenase-P-Lösung zu einem Brunnen.
2. Vor der Operation wiegen und betäuben Sie die Maus mit einer intraperitonealen Injektion von 1,25 % Tribromoethanol in einer Dosis von 0,025 mL/g, überprüfen Sie den Anästhesiestatus, indem Sie das Fußpad der Maus kneifen: Die Tiefe der Anästhesie wird durch eine allmähliche Abnahme der Atemfrequenz und keine Reaktion auf das Kneifen der Fußpolster bestimmt. Sobald die tiefe Anästhesie bestätigt ist, werden die Mäuse durch eine zervikale Verrenkung eingeschläfert. Tauchen Sie die Mäuse für 5 Minuten in 75 % Ethanol zur Desinfektion ein und bringen Sie sie dann in einen Biosicherheitsschrank zur Pankreasisolierung.
   HINWEIS: Tribromoethanol (1,25 %) wird beim Kauf als vorgefertigte Lösung bereitgestellt; Manuelle Vorbereitung ist nicht erforderlich. Die Forscher müssen während des gesamten Experiments Handschuhe und Masken tragen. Wenn während der Injektion von 1,25 % Tribromoethanol Hautkontakt auftritt, wischen Sie sofort die Restreste mit wasserfreiem Ethanol ab, spülen Sie 5 Minuten mit fließendem Wasser ab und tragen Sie eine Feuchtigkeitscreme auf, um die Trockenheit zu lindern. In dieser Studie sind keine ätzenden Chemikalien beteiligt. Abfallchemische Reagenzien, wie 1,25 % Tribromoethanol, sollen in speziell versiegelten Behältern mit der Bezeichnung "Gefährlicher chemischer Abfall" gesammelt werden.
3. Machen Sie einen V-förmigen Bauchschnitt, um die Bauchhöhle der Maus zu öffnen. Das dunkelrote lymphoide Organ im linken hypochondrischen Bereich ist die Milz, und das weiße Organ, das an der Milz befestigt ist, ist die Bauchspeicheldrüse. Führen Sie vorsichtig eine stumpfe Sektion der Bauchspeicheldrüse entlang des unteren Magenrandes und des Pankreatikoduodenalübergangs durch.
4. Waschen Sie das isolierte Bauchspeicheldrüsengewebe in Hank's Balanced Salt Solution und entfernen Sie restliche mesenteriale Ansätze, die Milz und das peripankreatische Fettgewebe.
5. Bringen Sie die vorverarbeitete Bauchspeicheldrüse auf eine 12-Well-Platte mit 2 ml Kollagenase-P-Lösung. Halten Sie die Bauchspeicheldrüse mit einer Pinzette in der linken Hand fest und verwenden Sie mit der rechten Hand eine 1-mL-Spritze, um Kollagenase-P-Lösung in das Pankreas-Parenchym zu injizieren, bis das Bauchspeicheldrüsengewebe durchscheinend und ödematös erscheint.
   HINWEIS: Das Volumen der Kollagenase-P-Lösung für die Perfusion beträgt 600–800 μL.
6. Schneiden Sie die Bauchspeicheldrüse schnell mit einer chirurgischen Schere in 1–2 mm³ Gewebestücke.
   HINWEIS: Die Größe der Gewebestücke entspricht ungefähr dem Innendurchmesser einer Standard-Pipettenspitze von 200 μL.
7. Schneiden Sie die distale 1–1,5 cm Spitze einer 1 ml Pipettenspitze ab (um die Öffnung zu vergrößern) und verwenden Sie diese modifizierte Spitze, um die Pankreasgewebestücke zusammen mit 2 ml Kollagenase-P-Lösung in ein 50 ml großes Zentrifugenrohr zu übertragen, das mit 3 ml Kollagenase-P-Lösung vorgeladen ist.
8. Inkubieren Sie das Zentrifugenrohr 12 Minuten lang in einem 37 °C Wasserbad und schütteln Sie das Rohr während dieser Zeit alle 5–6 Minuten sanft.
   HINWEIS: Der Zweck des Schüttelns der Zentrifugenröhre ist es, den vollständigen Kontakt zwischen dem Bauchspeicheldrüsengewebe und der Kollagenase-P-Lösung sicherzustellen.
9. Fügen Sie 10 ml RPMI-1640-Komplettmedium hinzu, um die Verdauungswirkung der Kollagenase-P-Lösung zu beenden.
10. Pipettieren Sie das Pellet wiederholt mit einer 5-mL Pasteur-Pipette (15–20 Auf-und-Ab-Stöße), bis keine offensichtlichen großen Gewebeklumpen mehr übrig sind.
11. Fügen Sie 10 ml RPMI-1640 Complete Medium hinzu, zentrifugieren Sie dann mit 180 × g für 2 Minuten bei 4 °C und entsorgen Sie das Übersetzungsmittel.
12. Die Kugel mit 20 mL RPMI-1640 Komplettmedium wieder aufhängen. Filtern Sie die Suspension durch ein 40-Mesh-Sieb und zentrifugieren Sie dann bei 180 × g für 2 Minuten bei 4 °C.
13. Entsorge das Überstandsmittel vorsichtig, gib 20 ml Ficoll-Lösung hinzu, um das Pellet wieder aufzuhängen, und gib langsam 15 ml RPMI-1640-Komplettmedium hinzu.
    HINWEIS: An diesem Punkt kann eine klare Flüssigkeitsgrenze beobachtet werden.
14. Zentrifugieren Sie sanft bei 640 × g für 20 Minuten bei 25 °C.
    HINWEIS: Vermeiden Sie heftiges Erschüttern während der Zentrifugation, um eine Störung der Schnittstelle zu verhindern.
15. Entfernen Sie vorsichtig das Zentrifugenrohr und saugen Sie die obere rote Mittelschicht mit einer 5-mL Pasteur-Pipette ab. Dann wird die Flüssigkeit mit den Inseln an der Grenzfläche der Flüssigkeitsschicht vorsichtig aspiriert und in ein neues 50-mL-Zentrifugenrohr übertragen. Fügen Sie 20 ml RPMI-1640 Complete Medium hinzu, zentrifugieren Sie mit 180 × g für 2 Minuten bei 4 °C und entsorgen Sie das Überlagermittel.
16. Das Pellet wird mit 20 ml RPMI-1640 Komplettmedium wieder suspendiert, bei 180 × g für 2 Minuten bei 4 °C zentrifugiert und der Überstandsstoff entsorgt.
17. Das Pellet wird mit 10 ml RPMI-1640 Complete Medium wieder aufgehängt und in eine 60-mm-Zellkulturschale übergereicht.
18. Unter einem umgekehrten biologischen Mikroskop (100-fache Vergrößerung) werden Inselchen manuell mit einer 20-μL-Pipette ausgewählt. Übertragen Sie die ausgewählten Inselchen auf eine 24-Well-Zellkulturplatte, vorgeladen mit 500 μL RPMI-1640-Komplettmedium pro Bohrloch.
19. Entsorge die Ficoll-Lösungsschicht, suspendiere das Pellet (ab Schritt 2.15) mit 10 mL DMEM-Komplettmedium, filtere durch ein 100 μm Zellsieb, zentrifugiere bei 180 × g für 2 Minuten bei 4 °C und entsorge das Supernatant.
20. Setzen Sie das Pellet mit 10 mL DMEM Complete Medium wieder auf, zentrifugieren Sie bei 180 × g für 2 Minuten bei 4 °C und entsorgen Sie das Supernatant. Anschließend wird das Pellet mit 5 ml DMEM-Komplettmedium für weitere Experimente wieder suspendiert.

3. Nachweis der Lebensfähigkeit von Bauchspeicheldrüseninseln und Acinarzellen

1. Übertragen Sie die isolierten Inselchen und eine passende Anzahl von Acinarzellen auf 12-Brunnen/24-Bohrloch-Zellkulturplatten, die jeweils 1 ml RPMI-1640-Komplettmedium und 1 ml DMEM-Komplettmedium enthalten. Stellen Sie die Platten für 15 Minuten in einen 37 °C, 5 % CO₂-Zellinkubator, um das Gleichgewicht zu erreichen.
2. Zentrifugieren Sie die 12-Well/24-Well-Zellkulturplatten bei 180 × g für 30 Sekunden bei 25 °C. Bereiten Sie in der Zwischenzeit das Färbereagenz gemäß den Anweisungen des Calcein/Propidium Iodid (Calcein/PI) Cell Viability and Cytotoxicity Assay Kit vor (Schutz vor Licht während der Vorbereitung).
3. Das Medium vorsichtig entsorgen, die Inselchen und Acinarzellen einmal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) waschen und dann unter denselben Bedingungen wie Schritt 3.2 zentrifugieren.
4. Entsorgen Sie das PBS und suspendieren Sie die Inselchen und Acinarzellen mit dem vorbereiteten Färbereagenz erneut. Wickle die Kulturplatte mit Alufolie (zum Schutz vor Licht) und brüte sie 30 Minuten in einem 37 °C-Inkubator mit 5 % CO₂-Zellen.
5. Unter einer lichtgeschützten Umgebung werden Bilder mit einem Fluoreszenzmikroskop (100-fache Vergrößerung) aufgenommen und die Zellviabilitätsanalyse mit ImageJ durchgeführt.

4. Acinar-Amylase-Assay

1. Säen Sie die Acinarzellen in einer 12-Well-Platte mit einer Dichte von 1,5 × 10⁶ Zellen pro Brunnen mit 1 ml Medium. Richte die Kontrollzellen (Ctrl) und cerulein-stimulierte Zellen ein (10 nM, 20 nM, 50 nM; gekennzeichnet als C10, C20, C50). Nach 30 Minuten Stimulation sammeln Sie Supernatanten zur Erkennung der Amylaseaktivität gemäß den Anweisungen des Herstellers.

5. Glukosestimulierter Insulinfreisetzungstest

1. Säe 10 Inselchen pro Brunnen in einer 24-Loch-Platte. Stabilisiere die Inselchen im vollständigen RPMI-1640-Medium für 2 Stunden und entsorge dann das Medium.
2. Inkubieren Sie die Inselchen in 1 ml 5,6 mM Glukoselösung für 1 H. Sammle danach das Supernatant.
3. Wasche die Inselchen mit einem KRBH-Puffer. Als Nächstes inkubieren Sie die Inselchen in einer 22 mM Glukoselösung für 1 Stunde und sammeln Sie das Supernatant erneut.
4. Erkennen Sie die Insulinkonzentrationen in den beiden Supernatanten (aus den niedrigen und hohen Glukosezuständen) mit einem Mouse INS (Insulin) ELISA-Kit. Berechnen Sie den glukosestimulierten Insulinindex (GSI):
   GSI = Insulinkonzentration im Medium mit hohem Glukoseniveau / Insulinkonzentration in einem Medium mit niedrigem Glukoseniveau

Results

Nach der Zentrifugation des Ficoll-Lösungsdichte-Gradienten wurden Inselchen nahe der Grenzfläche zwischen der transparenten, farblosen Flüssigkeitsschicht und dem Medium beobachtet, wobei PACs als Sediment am Boden des Rohrs vorhanden waren (Abbildung 1).

Unter einem optischen Mikroskop waren die Inselchen typischerweise rund oder oval und goldbraun gefärbt, mit einer stabilen Ausbeute von (120 ± 5) Inselchen pro Maus (Abbildung 2A,B). Frisch isolierte PACs waren kugelförmig und hauptsächlich in Clustern verteilt (3–8 Acinarzellen pro Cluster). Die apikalen Enden der Acinarzellen waren dunkler gefärbt, mit deutlich sichtbaren Zymogengranulaten; Um die Zellen wurden keine Granulen oder vesikuläre Strukturen beobachtet, und der Hintergrund der Lösung war klar. Der Ertrag der Acinarzellen lag zwischen 1,6 und 1,95 × 10⁷ Zellen pro Maus [(1,77 × 10⁷) ± (1,75 × 10⁶)] (Abbildung 2C,D).

Die Calcein/PI-Färbungsergebnisse von Inselchen und Acinarzellen sind in Abbildung 3A dargestellt: Calcein-gefärbte Zellen (grün) machten die Mehrheit aus, während PI-gefärbte Zellen (rot) selten waren. Eine quantitative Analyse der lebenden/toten Färbungsbilder wurde mit ImageJ durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass die Lebensfähigkeit der isolierten Inselchen und Acinarzellen (97,52 ± 0,16)% bzw. (96,55 ± 0,95%) % betrug (Abbildung 3B).

Die basale Amylaseaktivität der isolierten pankreasischen Acinarzellen betrug (0,79 ± 0,01) U/mL. Nach der Stimulation mit Caerulein in Konzentrationen von 10 nM, 20 nM und 50 nM betrugen die Amylase-Aktivitäten der Acinarzellen (1,45 ± 0,03) U/mL, (1,65 ± 0,05) U/mL bzw. (1,39 ± 0,02) U/mL. Einweg-ANOVA-Ergebnisse zeigten, dass im Vergleich zur Kontrollgruppe (Ctrl) alle cerulein-stimulierten Gruppen signifikante Unterschiede in der Amylaseaktivität zeigten (alle P < 0,001). Zusätzlich wurde ein signifikanter Unterschied in der Amylaseaktivität zwischen den 20 nM- und 10 nM-Cerulein-Gruppen beobachtet (P < 0,001) (Abbildung 4A).

Bei Stimulation mit 5,6 mM Glukoselösung betrug die Insulinsekretion der isolierten Inselchen (0,27 ± 0,04 ng/mL/Insel/H. Bei Stimulation mit 22 mM Glukoselösung betrug die Insulinsekretion der isolierten Inselchen (0,94 ± 0,04 ng/mL/Insel/H, mit einem GSI von 3,44. Die Ergebnisse zeigen, dass die isolierten Inselchen unter Stimulation mit Glukoselösungen unterschiedlicher Konzentration eine typische und effektive Insulinsekretionsreaktion zeigen (Abbildung 4B).

Mitglieder unseres Forschungsteams beobachteten, dass die Menge und Qualität der isolierten Inselchen und Acinarzellen eng mit der Verdauungszeit zusammenhängt, die während des Betriebs strenge Kontrolle erfordert und weniger von verschiedenen Akteuren beeinflusst wird. Gleichzeitig stehen Schwankungen in Ausbeute und Lebensfähigkeit auch in engem Zusammenhang mit der vollständigen Zerlegung der Bauchspeicheldrüse und der mechanischen Trennung des Bauchspeicheldrüsengewebes, was während des Betriebs Aufmerksamkeit erfordert.

Abbildung 1: Ergebnisse der Zentrifugation der Ficoll-Lösungsdichte. Die Inselschicht befindet sich an der Grenzfläche zwischen der farblosen, transparenten Flüssigkeitsschicht und dem Kulturmedium. Der Niederschlag am Boden des Zentrifugenrohrs sind PACs. Abkürzung: PACs: Pankreas-Acinarzellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: Morphologische und quantitative Eigenschaften von Inselchen und PACs. (A) Morphologie von aus Maus-Pankreasgewebe isolierten Inselchen. Skalenbalken = 100 μm. (B) Quantitative Analyse der Anzahl der aus Maus-Pankreasgewebe isolierten Inselchen (n = 3). (C) Morphologie von PACs, die aus dem Bauchspeicheldrüsengewebe der Maus isoliert wurden. Skalenbar = 100 μm. (D) Quantitative Analyse der Anzahl der aus Maus-Pankreasgewebe isolierten PACs (n = 3). Alle Daten wurden als Mittelwert ± SD angegeben. Abkürzung: PACs: pankreasische Acinarzellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3: Viabilitätsbewertung von Inselchen und PACs. (A) Calcein/Propidiumiodid-Fluoreszenzfärbung zur Bewertung der Lebensfähigkeit von Mausinselchen und PACs. Grün: lebende Zellen. Rot: Tote Zellen. Skalenleiste = 100 μm. (B) Quantitative Analyse der Lebensfähigkeit von Inselchen und PACs (n = 3). Alle Daten wurden als Mittelwert ± SD angegeben. Abkürzungen: PACs: Pankreas-Acinarzellen; PI = Propidiumiodid. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4: Bewertung der Amylaseaktivität von PACs und der Insulinsekretionskapazität der Inselchen. (A) Amylaseaktivität von PACs unter Stimulation mit unterschiedlichen Ceruleinkonzentrationen (Ctrl: Kontrollgruppe; C10, C20 und C50: Die Cerulein-Konzentrationen betrugen 10 nM, 20 nM und 50 nM (n = 3). (B) Quantitative Analyse der glukosestimulierten Insulinsekretionskonzentrationen (n = 3). Alle Daten wurden als Mittelwert ± SD angegeben. ***P < 0,001. Abkürzungen: GSI = Glukosestimulierter Insulinindex; PACs: Pankreas-Acinarzellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Discussion

In den letzten Jahren hat postpankreatitis diabetes mellitus (PPDM)^{breite Aufmerksamkeit} erhalten^. Die Untersuchung der molekularen Mechanismen, durch die PACs die Sekretion von Inselhormonen im Zusammenhang mit AP beeinflussen, ist von großer Bedeutung.

Die Pathogenese von AP ist hauptsächlich mit der übermäßigen Aktivierung von Pankreasenzymen in den Acinarzellen verbunden, was zur Autoverdauung des Bauchspeicheldrüsengewebes^führt. Obwohl derzeit Zelllinien wie AR42J, 266-6 (Acinar-Zelllinien) und MIN6, INS-1 (β-Zelllinien) verfügbar sind, können diese In-vitro-Zellmodelle die physiologische Komplexität primärer Acinarzellen und Inselchen ^4,5 nicht vollständig replizieren. Daher ist die Isolierung primärer Acinarzellen und -inselchen entscheidend für tiefgehende Studien zur Wechselwirkung zwischen den exokrinen und endokrinen Kompartimenten der Bauchspeicheldrüse. Derzeit sind Methoden zur Isolierung von Inselchen gut etabliert; Die meisten decken jedoch nicht den Forschungsbedarf zur Untersuchung der Wechselwirkung zwischen Inselchen und Bauchspeicheldrüsenzellen ^6,7,8.

Dieses experimentelle Protokoll optimiert das Pankreas-Perfusionsverfahren, senkt die technische Hürde und ermöglicht so Forschern ohne spezialisierte Ausbildung in der Gallengangskanulierung, Experimente durchzuführen. Gleichzeitig gewährleistet es die Menge und Qualität isolierter Inselchen und Acinarzellen und bietet eine einfache und schnelle Methode zur gleichzeitigen Isolierung primärer Mausinselchen und primärer pankreasischer Acinarzellen.

Obwohl diese Methode den Isolationsprozess der Inselchen vereinfacht, erfordern wichtige Schritte dennoch eine strenge Kontrolle, um hohe Erträge und eine effektive Trennung von Inseln und Pankreas-Acinarzellen sicherzustellen. Zu diesen Maßnahmen gehören eine ausreichende Pankreasperfusion, eine ordnungsgemäße Gewebestörung (gründliches Zerkleinern), die Pankreasverdauung (präzise Kontrolle der Verdauungszeit und manuelles Schütteln während der Verdauung) sowie mechanisches Pipetteren (Kontrolle von Anzahl und Intensität der Pipettierstreiche). Vor der Inselauswahl sollten neu suspendierte Inselchen etwa 10 Minuten in einem Zellinkubator stabilisiert werden, um das Inselpflücken effizienter zu ermöglichen.

Es ist wichtig zu beachten, dass bei der Pankreasperfusion bessere Ergebnisse erzielt werden, wenn klarere Flüssigkeitsbläschen injiziert werden; Das gesamte Bauchspeicheldrüsengewebe sollte vollständig perfundiert sein, aber die Perfusionszeit sollte innerhalb von 1–2 Minuten kontrolliert werden. Wenn eine geringe Zelllebensfähigkeit festgestellt wird, passen Sie die Kontaktzeit zwischen Pankreasgewebe und Kollagenase P an (einschließlich Perfusionszeit und Wasserbadverdauungszeit). Achten Sie außerdem auf mechanische Schäden während der Isolation – zum Beispiel vermeiden Sie übermäßige Gewalt beim Verteilen des Bauchspeicheldrüsengewebes. Die aseptische Technik muss während der gesamten Isolierung von Inselchen und Acinarzellen aufrechterhalten werden, um eine Kontamination zu verhindern. Vorbereitete Reagenzien sollten durch einen 0,22-μm-Filter gefiltert werden. Der Isolationsprozess sollte in einem Biosicherheitsschrank durchgeführt werden, und alle während der Isolierung verwendeten Instrumente und Verbrauchsmaterialien müssen steril sein. Die beiden vorbereiteten Komplettmedien enthalten außerdem 1% Penicillin-Streptomycin-Lösung.

Bei der Mausanästhesie: Fixiere die Haut des Halses der Maus mit dem linken Daumen und Zeigefinger und stütze den Bauch mit Ring- und kleinen Fingern (mit Kopf nach unten und Bauch nach oben, um die Bauchhöhle freizulegen). Halten Sie die Spritze mit der rechten Hand, führen Sie sie in einem 30°-Winkel in die Haut des unteren linken Bauches der Maus ein (1 cm von der Leiste und 0,5 cm von der Mittellinie), injizieren Sie das Anästhetikum langsam und drücken Sie nach dem Nadelabzug 10 Sekunden lang mit einem sterilen Wattestäbchen auf die Injektionsstelle, um ein Medikamentenauslaufen zu verhindern. Man kann die Maus erst durch eine zervikale Verrenkung einschläfern, wenn sie vollständig betäubt ist.

Wenn man von einer kontaminierten Nadel (mit Mausblut oder Gewebe in Kontakt kommt) gestochen oder von einer Maus gebissen wird, drückt man sofort den Bereich um die Wunde am nächstgelegenen Waschbecken zusammen (drücken Sie vom proximalen bis zum distalen Ende der Wunde, um eine kleine Menge Blut auszustoßen), spülen Sie die Wunde 15 Minuten kontinuierlich mit fließendem Wasser aus und desinfizieren Sie sie dann mit 75 % Ethanol oder 0,5 % Povidon-Jod.

Ergebnisse der Acinarzell-Amylase-Aktivitätstests zeigten, dass die isolierten Pankreas-Acinarzellen einen niedrigen Basalaktivierungsgrad aufwiesen und empfindlich auf Cerulein-Stimulation reagierten: Die Amylase-Aktivität nahm allmählich mit steigender Ceruleinkonzentration zu, erreichte den höchsten Wert bei 20 nM Cerulein und nahm leicht ab, wenn die Ceruleinkonzentration 50 nM betrug. Die Ergebnisse des glukosestimulierten Insulinsekretionstests zeigten, dass die isolierten Inselchen unter Stimulation mit Glukoselösungen unterschiedlicher Konzentrationen eine typische und effektive Insulinsekretionsantwort zeigten. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die durch dieses Protokoll extrahierten Acinarzellen und -inselchen für weitere In-vitro-Experimente geeignet sind.

Das Isolierungsverfahren für Inseln und Acinarzellen dieses experimentellen Protokolls ist einfach zu bedienen. Experimentelle Ergebnisse zeigen, dass die mit diesem Protokoll isolierten Inselchen und Acinarzellen eine ausgezeichnete Anzahl und Lebensfähigkeit aufweisen. Zusätzlich haben mehrere Teammitglieder dieses Protokoll mit mehreren Mäusen validiert; Die Validierungsergebnisse zeigen, dass sie eine gute Reproduzierbarkeit, zuverlässige Daten und minimale Schwankungen im Zellertrag aufweist. Dieses Protokoll hat jedoch auch gewisse Einschränkungen. Obwohl sie wenig von den technischen Fähigkeiten des Bedieners abhängig ist, erfordert sie dennoch grundlegende Kenntnisse in der Mausanatomie, um die Bauchspeicheldrüse vollständig zu sezieren – dies ist eine Voraussetzung für den gesamten Isolationsprozess. Wenn Pankreasgewebe gleichzeitig aus mehreren Mäusen isoliert wird, muss die Menge an Kollagenase-P-Lösung und anderen Reagenzien entsprechend angepasst werden. Außerdem wird eine gleichzeitige Isolierung von mehr als zwei Mäusen nicht empfohlen: Die Zeitunterschiede zwischen der Verarbeitung von Pankreasgeweben verschiedener Mäuse während der Dissektion, Perfusion und Zerkleinerung beeinflusst die Kontaktzeit zwischen Pankreasgewebe und Kollagenase P und beeinträchtigt so die Effizienz und Lebensfähigkeit der Zellisolation. Daher könnte seine großflächige Anwendung begrenzt sein. Außerdem wurde dieses Protokoll bei Ratten nicht validiert. Wenn Inselchen und Acinarzellen von Ratten isoliert werden, müssen die Dosierung einiger Reagenzien und die Verdauungszeit möglicherweise weiter angepasst werden.

Abschließend bietet dieses experimentelle Protokoll eine einfache und schnelle Methode zur gleichzeitigen Isolierung primärer Mausinselchen und primärer pankreasischer Acinarzellen. Es eignet sich besser für unerfahrene Forscher, um Insel- und Acinarzellisolierungen durchzuführen und gleichzeitig einen praktischen experimentellen Rahmen für In-vitro-Studien zu pankreasischen exokrin-endokrinen Interaktionen zu bieten.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,22 μ M-Filter	Millex	SLGPR33RB	Filtern Sie die vorbereitete Collagenase-P-Lösung
0,25 m Calciumchlorid (steril)	Beyotime	ST365	Kalziumabhängiger Signalweg zur Aktivierung der Insulinsekretion
1 ml Spritze	Jierui	10084692516405	Verwendet zur Kollagenase-P-Perfusion in das Bauchspeicheldrüsengewebe.
1,25 % Tribromoethanol-Lösung	Beijing Yosida Biotechnology Co., Ltd.	JT0781	Anästhesie
1,5 mL Zentrifugenröhre	Eppendorf	30121589	Sammeln Sie den Zellüberstand für Zentrifugation und Lagerung.
1x Hank' s ausgewogene Salzlösung	Biosharp	BL561A	Bereiten Sie die Kollagenase-P-Lösung vor und spülen Sie das Bauchspeicheldrüsengewebe aus
12-Well-Zellkulturplatte	SARSTEDT	83.3921	Halten Sie das Bauchspeicheldrüsengewebe und das extrahierte Acinar aus der Kultur
15 mL Zentrifugenröhre	Beijing Labgic Technology Co., Ltd.	CT-002-15A	Halten von Lösungen während des Experiments
24-Bohrloch-Zellkulturplatte	SARSTEDT	83.3922	Kultivierung der gewonnenen Inselchen
40-mesh  Sieb	Weidan-Instrumente	N/A	Pankreasgewebe filtern
5 mL Pasteur-Pipette	Biosharp	BS-XG-03L	Pipettieren von Flüssigkeiten und physikalische Störung des Bauchspeicheldrüsengewebes
50 mL Zentrifugenrohr	Beijing Labgic Technology Co., Ltd.	CT-002-50A	Halten von Lösungen während des Experiments, Gewebeeindämmung und Zentrifugation
60-mm-Zellkulturschalen	Beijing Labgic Technology Co., Ltd.	12211	Behälter zum Aufbewahren von Kulturmedium mit Inselchen zum einfachen Pflücken
75%ige Ethanollösung	HYNAUT	N/A	Weichen Sie die Mäuse zur Desinfektion ein.
Adobe Photoshop 2023	Adobe Inc.	N/A	Erzeugen Sie Bilder.
Beckman Allegra X-12/X-12R Zentrifuge	BECKMAN	Allegra X-12/X-12R	Zentrifuge
Rinderserumalbumin (BSA)-V	Solarbio	A8020	Die normale physiologische Funktion der Inselchen aufrechterhalten und (dieses) zur Herstellung von Glukoselösungen unterschiedlicher Konzentration verwenden.
C57BL/6J Mäuse, SPF-Qualität, 6 & Dash; 8 Wochen alt, 7,5 km/t; 25 g	Labortierzentrum der Naval Medical University
Calcein/PI-Zell-Viabilitäts- und Zytotoxizitäts-Assay-Kit	Beyotime	C2015L	Nachweis der Zelllebensfähigkeit und Zytotoxizität von Tierzellen basierend auf der gleichzeitigen Färbung von lebensfähigen und toten Zellen durch Calcein-AM (Calcein AM) und Propidiumiodid (PI) Doppelfluoreszenzfärbung.
Calciumchlorid (wasserfrei)	Sangon Biotech	10043-52-4	Bereite die Kollagenase-P-Lösung vor.
Zell-Sieb (100 & mu; m)	Biosharp	BS-100-XBS	Filterung von Acinarzellen
Kollagenase P	Sigma	11213857001	Verdauungsgewebe der Bauchspeicheldrüse
D-(+)-Glukoselösung (20 %, steril)	Beyotime	ST491	Stimulieren Sie die Insulinsekretion aus den Inselchen.
DMEM Basic (1x) (Dulbecco' s modifiziertes Eagle Medium)	Gibco	C11995500BT	Acinarzellen kultivieren
Fetales Rinderserum (FBS)	Biowest	S140B-500	Bereite das Kulturmedium vor.
Ficoll-Paque PREMIUM sterile Lösung	Cytiva	17544203	Dichtegradientenmedium für die Dichtegradientenschichtung
GraphPad Prism 8.0.1	GraphPad Software, LLC	N/A	Erzeugen Sie Bilder und führen Sie statistische Analysen durch.
HEPES-Lösung (1 M)	Biosharp	BL1061A	Bereite die Kollagenase-P-Lösung vor.
Hochgeschwindigkeits-/gekühlte Zentrifuge	Sigma	3K15	Zentrifuge
ImageJ	National Institutes of Health Labor für Optische und Computergestützte Instrumentierung (LOCI)	N/A	Analysieren Sie Zellfluoreszenzbilder und berechnen Sie die Lebensfähigkeit der Zelle.
Invertiertes biologisches Mikroskop	Leica	N/A	Beobachte die Zellmorphologie und wähle die Inselchen aus.
Invertiertes Fluoreszenzmikroskop	OLYMPUS	IX73	Beobachten Sie die zellulären Fluoresziersignale und machen Sie fluoreszierende Bilder.
Krebs-Ringer-Bicarbonat-HEPES-Puffer	LEAGENE	CZ0103	Die normale physiologische Funktion der Inselchen aufrechterhalten und (dieses) zur Herstellung von Glukoselösungen unterschiedlicher Konzentration verwenden.
Maus INS (Insulin) ELISA Kit	Wuhan Fine Biotech Co., Ltd.	EM0260	Erkennen Sie den Insulinsekretionsstand der Inselchen.
Augenzwange (10 cm, mit Haken gebogen)	Qingyi Medizinische Geräte	N/A	Unterstützung bei der Sektion
Augenzwange (10 cm, gerade mit Zahn)	Qingyi Medizinische Geräte	N/A	Unterstützung bei der Sektion und plötzlichen Trennung des Bauchspeicheldrüsengewebes sowie bei der Extraktion des Bauchspeicheldrüsengewebes
Penicillin-Streptomycin-Lösung	Gibco	15140-122	Bereiten Sie das Kulturmedium vor, um eine Verunreinigung zu verhindern
RPMI-1640 Medium,	KeyGEN BioTECH	KGL1501-500	Beenden Sie die Kollagenase P-Verdauungslösung und kultivieren Sie die Inselchen
Trypsininhibitor von Glycine Max (Sojabohne)	Sigma	T6522	Bereite die Kollagenase-P-Lösung vor.
Urgische Schere (10 cm, gerade spitz)	Qingyi Medizinische Geräte	N/A	Unterstützung bei der Anatomie und Zerschneiden des Bauchspeicheldrüsengewebes in kleine Stücke
Wasserbad	OAICLAB	OW-HF	Halten Sie die Verdauungstemperatur aufrecht.
Α-Amylase- und Β-Amylase-Aktivitätsassay-Kit	Elabscience	E-BC-K006-M	Erkennen Sie die Amylasespiegel, die von Acinarzellen unter verschiedenen Bedingungen ausgeschieden werden.