Methodenartikel

Nachweis zielgerichteter Veränderungen bei nicht-kleinzelligem Lungenkrebs mittels Next-Generation-Sequencing

DOI:

10.3791/69091

⸱

10. Oktober 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, State Key Laboratory of Molecular Oncology, National Cancer Center/National Clinical Research Center for Cancer/Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 2Department of Education, National Cancer Center/National Clinical Research Center for Cancer/Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll beschreibt einen automatisierten, ISO15189-akkreditierten Next-Generation-Sequencing-Workflow zum Nachweis zielgerichteter genomischer Veränderungen in formalinfixierten, paraffineingebetteten Geweben des nicht-kleinzelligen Lungenkrebses (NSCLC).

Zusammenfassung

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Der Erfolg einer zielgerichteten Therapie bei nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) hängt von der präzisen Identifizierung von Treiberveränderungen ab, einschließlich Mutationen, Genfusionen und Amplifikationen. Die Next-Generation-Sequencing (NGS) hat sich zu einem umfassenden molekulardiagnostischen Instrument entwickelt, das in der Lage ist, sowohl bekannte als auch neuartige genomische Aberrationen zu erkennen und eine entscheidende Unterstützung für die personalisierte NSCLC-Behandlung bietet. NGS bleibt jedoch eine komplexe und technisch anspruchsvolle Methode. Trotz seiner weit verbreiteten Einführung steht NGS immer noch vor einigen Herausforderungen, darunter technische Komplexität und lange Bearbeitungszeiten. Hier wird der im klinischen Labor implementierte ISO15189-zertifizierte NGS-Workflow vorgestellt. Das standardisierte Protokoll umfasste die Beurteilung der Tumorzellularität (≥20 %), die DNA-Extraktion aus formalinfixierten, paraffineingebetteten (FFPE) Geweben (DNA-Eingabe ≥ 50 ng), die automatisierte Bibliotheksvorbereitung und die bioinformatische Analyse. Durch die Integration strenger Qualitätskontrollmaßnahmen (QC) in jedem Schritt gewährleistet der Workflow eine hohe Datenzuverlässigkeit. Außerdem war die wichtigste Innovation im Workflow die Automatisierung des Aufbaus von NGS-Bibliotheken. Das automatisierte System zur Erstellung von NGS-Bibliotheken umfasste Endreparatur, A-Tailing, Adapterligation, Hybridisierungserfassung und -reinigung, wodurch menschliche Fehler effektiv minimiert, die experimentelle Reproduzierbarkeit verbessert, die Hands-on-Zeit reduziert und somit die Effizienz verbessert wurden. Die Erfahrung zeigt, dass eine strenge Qualitätskontrolle und eine automatisierte Bibliothekserstellung für die Aufrechterhaltung der Genauigkeit und Skalierbarkeit klinischer NGS-Tests unerlässlich sind. Dieser optimierte Ansatz stellt nicht nur die Einhaltung ISO15189 Standards sicher, sondern unterstützt auch die wachsende Nachfrage nach Präzisionsonkologie im NSCLC-Management.

Einleitung

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Nicht-kleinzelliger Lungenkrebs (NSCLC) macht 75 % bis 85 % aller Lungenkrebsfälle aus und stellt sowohl eine klinische Priorität als auch eine therapeutische Herausforderung dar 1,2,3. In den letzten Jahren ist die Behandlung von fortgeschrittenem NSCLC mit der erfolgreichen Entwicklung und klinischen Anwendung von molekular zielgerichteten Medikamenten wie den Tyrosinkinase-Inhibitoren des epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors (EGFR-TKIs) in die Ära der personalisierten Präzisionstherapien eingetreten 4,5,6. Die zielgerichtete Therapie bietet eine präzise Wirksamkeit, eine hohe Spezifität und minimale Nebenwirkungen 7,8. Diese Verschiebung in der Behandlung hat gleichzeitig die Nachfrage nach molekulardiagnostischen Technologien erhöht.

Aktuell ist eine umfassende tumorgerichtete Testung zu einem unverzichtbaren Bestandteil der klinischen Praxis geworden, der zur Aufklärung genauer genetischer Mutationsprofile beitragen kann und somit eine verlässliche Grundlage für den späteren gezielten Medikamenteneinsatz, das Arzneimittelresistenzmonitoring und die Prognosebewertung von Patienten bietet. Insbesondere NGS-basierte Multigentests, die den hohen Durchsatz und die technischen Vorteile der hohen Empfindlichkeit nutzen, wurden bereits für die klinische Anwendung empfohlen 9,10,11,12.

Im Vergleich zu herkömmlichen molekulardiagnostischen Verfahren weist NGS bahnbrechende Vorteile auf. Der größte Vorteil von NGS liegt in seiner Hochdurchsatzfähigkeit. Es ermöglicht den gleichzeitigen Nachweis mehrerer Gene, einschließlich bekannter und unbekannter genetischer Veränderungen13,14. In der Zwischenzeit erreicht NGS umfassende Tests in einem einzigen Durchlauf, wodurch die Kosten, der Probenverbrauch und die Testdurchlaufzeit relativ reduziertwerden 15,16. Aufgrund dieser Vorteile wird NGS zunehmend in der klinischen Praxis eingesetzt. Die Prozesse des NGS sind jedoch komplex, einschließlich der Beurteilung der Tumorzellularität, der Nukleinsäureextraktion, der automatisierten Bibliothekserstellung und der bioinformatischen Analyse. Die Qualität der Erstprobenverarbeitung wirkt sich direkt auf die Leistung nachfolgender bioinformatischer Analysenaus 17. Insbesondere die Bibliotheksvorbereitung umfasst eine Reihe von Schritten, um rohe Nukleinsäureproben in standardisierte Bibliotheken umzuwandeln, die mit Sequenzierinstrumenten kompatibel sind. Die Vorbereitung der Bibliothek umfasst Fragmentierung, Endreparatur, Adapterligation und PCR-Amplifikation18. Dieser komplexe Prozess führt oft zu verschiedenen technischen Verzerrungen: Zum Beispiel kann die Fragmentierung zu einer Unterrepräsentation von Heterochromatinregionen führen; Die Substratpräferenz der Ligase während der Adapterligation kann zum Verlust bestimmter Sequenzen führen; und die PCR-Amplifikation führt in Regionen mit extremem GC-Gehalt tendenziell zu einer ungleichmäßigen Abdeckung19. Diese systemischen Verzerrungen verringern nicht nur die Qualität der Sequenzierungsdaten, sondern können auch zu falschen Schlussfolgerungen in nachfolgenden bioinformatischen Analysen führen. Daher ist die Einrichtung eines rigorosen QC-Systems unerlässlich, um die Zuverlässigkeit und Konsistenz der Versuchsergebnisse zu gewährleisten.

Um diese seit langem bestehenden technischen Herausforderungen zu bewältigen, hat das Labor ein vollautomatisches NGS-System eingeführt. Das System ist so konzipiert, dass es die manuelle Bearbeitungszeit reduziert und die Gesamtbearbeitungszeiten verkürzt. Es enthält programmierbare Protokolle, um sowohl betriebliche Flexibilität als auch Verarbeitungspräzision zu gewährleisten, während integrierte Module und Einheiten verwendet werden, um potenzielle technische Verzerrungen bei jedem Schritt effektiv zu minimieren. Darüber hinaus verbessert diese automatisierte Lösung nicht nur die Reproduzierbarkeit und den Durchsatz der Bibliotheksvorbereitung, sondern stellt vor allem sicher, dass die Sequenzierungsdaten die molekulare Zusammensetzung der Originalproben genauer widerspiegeln. Hier möchte das Labor das System durch die Detektion von Treiberveränderungen mittels DNA-basiertem NGS einführen.

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Protokoll

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Das Protokoll erhielt eine IRB-Ausnahmegenehmigung für anonymisierte Archivproben.

1. Schritte vor dem Test und QC

  1. Registrieren Sie Probeninformationen im Laborinformationsmanagementsystem (Tabelle 1). Füllen Sie die Einwilligungserklärung für Genmutationstests aus.
  2. NSCLC FFPE-Probe erhalten. Stellen Sie sicher, dass es sich bei der für den Test verwendeten Probe um eine Paraffingewebeprobe handelt, die nicht länger als 2 Jahre gelagert wurde. Stellen Sie sicher, dass die Proben nach pathologischen Standardmethoden verarbeitet und gelagert werden.
    HINWEIS: Diese Studie konzentriert sich in erster Linie auf den methodischen Arbeitsablauf und nicht auf die Durchführung einer groß angelegten klinischen Analyse. Daher wurde für diese Phase der Forschung keine spezifische Anforderung an die Stichprobenzahl festgelegt.
  3. Schneiden Sie die Abschnitte mit Einweg-Mikrotomklingen. Wechseln Sie Klingen, Pinzetten und 1,5-ml-Mikroröhrchen zwischen den Proben, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden und das Einbringen von vom Bediener abgeleiteten Verunreinigungen (z. B. Haare, Hautzellen, Speichel) zu vermeiden.
    HINWEIS: Große Probengröße (≥ 0,5 cm x 0,5 cm) 6-10 μL, fünf Blatt; kleine Probengröße (< 0,5 cm x 0,5 cm) und Punktionsproben, 6-10 μL, 10 Blatt.
  4. Führen Sie routinemäßige Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbungen durch, um den Gehalt an Tumorzellen zu bewerten.
  5. Ausgewählte Proben, die ≥20 % bösartige Tumorzellen enthalten, für die nachgelagerte Analyse. Der Tumorgehalt wird von Pathologen an HE-Objektträgern20 bewertet.
    HINWEIS: Wenn der Tumorgehalt weniger als 20 % beträgt, kratzen Sie unter Anleitung der markierten Tumorregionen auf dem HE-Objektträger den entsprechenden Tumorgewebebereich ab. Dieser Prozess erreicht eine Anreicherung des Tumorgewebes, indem umliegende nicht-neoplastische Bestandteile effektiv entfernt werden, wodurch der Anteil der Tumorzellen im gesammelten Material deutlich erhöht wird.
  6. Führen Sie die Nukleinsäureextraktion mit einem automatisierten Aufreinigungssystem durch, wie unten beschrieben.
    1. Schneiden Sie den FFPE-Block mit einem Mikrotom ab, um ein Farbband zu erhalten. Legen Sie das Farbband in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Übertragen Sie das Farbband an die angegebene Probeneingangsstelle auf dem automatischen Extraktionsgerät.
    2. Verwenden Sie ein automatisches Extraktionsinstrument mit einem automatischen Extraktionskit und ersetzen Sie das manuelle Pipettieren durch ein automatisches Magnetbead-Nukleinsäure-Extraktionssystem.
      HINWEIS: Die Automatisierung dieses Schritts trägt dazu bei, eine automatische Extraktion zu gewährleisten, um eine hochpräzise und reproduzierbare DNA-Produktion für nachgelagerte NGS-Anwendungen zu gewährleisten.
    3. Beachten Sie die Anweisungen des vollautomatischen Nukleinsäurereinigers und des Nukleinsäureextraktionsreagenzes zur Extraktion von Nukleinsäuren.
    4. Wählen Sie dann das C1102-Programm aus, wählen Sie die Inkubationszeit für die Deparaffination der Probe auf 16 Stunden und das Elutionsvolumen auf 100 μl.
      HINWEIS: Wenn die extrahierte DNA-Lösung nicht sofort getestet wird, darf sie nicht länger als 6 Monate bei -20 °C gelagert werden.
  7. Beurteilen Sie die Nukleinsäurequalität (Tabelle 2) wie unten beschrieben.
    1. Verwenden Sie die Agarose-Gelelektrophorese, um die Größe der DNA-Fragmente zu bestimmen. Verwenden Sie Agilent2100 und andere mikrofluidische Kapillarelektrophorese-Analysesysteme für Proben mit geringem Input.
    2. 1 g Agarose in 100 ml TAE-Lösung auflösen. Die Mischung in einem Wasserbad glasig erhitzen. Die Lösung auf ca. 60 °C abkühlen lassen.
    3. Anschluss an die positive Elektrode (rot) am Elektrophoresegerät. Minuspol (schwarz) auf Spannung 180 V betreiben, 15 min21,22 laufen lassen.
    4. Entsprechend den Ergebnissen der Agarose-Gelelektrophorese werden die Fragmentgrößen in vier Stufen (A-D; Tabelle 3) und wählen Sie die Nukleinsäure der Stufen A-C für nachfolgende Vorgänge aus.
    5. Verwenden Sie die Spektrophotometrie, um die Reinheit zu überprüfen. Stellen Sie sicher, dass ein OD260/OD280 > 1.8 vorhanden ist. OD260/OD230 > 2.0 zur Angabe akzeptabler Schadstoffgehalte23,24.
    6. Verwenden Sie ein Detektionskit (Materialtabelle) auf Basis sequenzspezifischer Fluoreszenzfarbstoffe für fluorometrische Assays, um die DNA-Konzentration präzise zu messen.
    7. Fügen Sie 1 μl der zu testenden DNA zu 199 μl Arbeitslösung hinzu, mischen Sie dann, zentrifugieren Sie kurz und messen Sie die Konzentration mit einem Fluorometer (Materialtabelle).

2. Bibliotheksvorbereitung und Qualitätskontrolle (Abbildung 1)

  1. Präparation der genomischen Fragment-DNA mittels Ultraschall (Materialtabelle) wie unten beschrieben.
    1. Mischen Sie 200 ng genomische DNA in 50 μl Puffer mit niedrigem Tris-EDTA (TE)-Gehalt. Bewahren Sie dann das Probenröhrchen in einem vorgekühlten (8 °C) Probengestell auf.
    2. Geräteparameter gemäß Tabelle 4 einstellen. Initiieren Sie dann die Fragmentierung.
    3. Verwenden Sie die Agarose-Gelelektrophorese, um den Fragmentierungseffekt zu überprüfen. In diesem Schritt werden DNA-Fragmente mit beschädigten Enden erzeugt, die repariert werden müssen, um sie für nachfolgende Schritte in stumpfe Enden umzuwandeln.
  2. Die Endreparatur und die Hinzufügung von A bei 3' wie unten beschrieben durchführen.
    1. Reparieren Sie die beschädigten Enden der FFPE-DNA mit Enzymen, um flache Enden zu bilden, die 3'-OH und 5'-P gewährleisten. Fügen Sie A zu den abgeflachten, doppelsträngigen 3'-Enden hinzu.
    2. Bereiten Sie die ERA-Mischung vor, indem Sie 7 μl Endreparaturpuffer und 3 μl Endreparaturenzym hinzufügen, vorsichtig manuell 3x-5x schnippen und 1-3 s zentrifugieren.
    3. Geben Sie die ERA-Mischung zu 50 μl zerbrochener DNA-Probe, mischen Sie sie vorsichtig und zentrifugieren Sie sie 1-3 s lang.
    4. Legen Sie es in das PCR-Gerät und wählen Sie das ERA-Programm (20 °C für 30 Minuten; 65 °C für 30 Minuten; 4 °C Halten; Deckel 85 °C). Führen Sie den nächsten Vorgang innerhalb von 2 h durch.
  3. Führen Sie die Adapterligation wie unten beschrieben durch.
    1. Bereiten Sie den LIG-Mix des Reaktionssystems vor, indem Sie 30 μl Ligationspuffer, 10 μl DNA-Ligase und 10 μl DNA-Adapter hinzufügen. Dann leicht manuell 3x-5x schnippen und 1-3 s zentrifugieren.
    2. Geben Sie 50 μl LIG-Mischung zu dem 60-μl-Produkt aus dem vorherigen Schritt, mischen Sie vorsichtig und zentrifugieren Sie dann 1-3 s lang.
    3. Geben Sie die Mischung in ein PCR-Gerät und wählen Sie dann das LIG-Programm (20 °C für 15 Minuten ohne Erhitzen des Deckels; 70 °C für 10 Minuten (Heizdeckel); 4 °C Halten; Deckel 85 °C).
  4. Führen Sie eine Reinigung der magnetischen Beads durch.
    1. Nehmen Sie 1,5 ml eines Zentrifugenröhrchens mit geringer Adsorption und fügen Sie 88 μl homogenisierte magnetische Kügelchen und 110 μl adapterligiertes Produkt hinzu. Vortexen und gut mischen und bei Raumtemperatur 5 min inkubieren.
    2. Zentrifugieren Sie die inkubierte Probe sofort für 1-3 s und stellen Sie das Zentrifugenröhrchen auf ein Magnetgestell. Warten Sie, bis die Lösung klar ist (ca. 3-5 Minuten).
    3. Wenn das Röhrchen auf dem Magneten befestigt ist, öffnen Sie die Kappe und saugen Sie den gereinigten Überstand vorsichtig mit einer Pipette an, ohne das Kügelchen zu stören.
    4. Lassen Sie das Röhrchen auf dem Magneten und geben Sie 300 μl frisch zubereitetes 75%iges Ethanol in jedes Röhrchen.
    5. Warten Sie 1 Minute, bis sich die magnetischen Kügelchen vollständig abgesetzt haben. Drehen Sie das Zentrifugenröhrchen einmal langsam horizontal, um Ethanol aufzunehmen.
    6. Wiederholen Sie die Schritte 2.4.4 und 2.4.5 einmal, also insgesamt 2x.
    7. Führen Sie eine sofortige Zentrifugation für 1-3 s durch, stellen Sie das Röhrchen wieder in das Magnetgestell und warten Sie 30 s. Verwenden Sie eine Pipette, um Ethanolreste zu entfernen, und halten Sie den Röhrchendeckel offen.
    8. Trocknen Sie die magnetischen Kügelchen 2 Minuten lang bei Raumtemperatur, bis die Perlenoberfläche matt erscheint und keine Risse aufweist.
    9. Eluieren Sie das Ligationsprodukt mit 28 μl Elutionspuffer (EB).
      HINWEIS: Magnetische Beads müssen vor der Verwendung mindestens 30 Minuten lang bei Raumtemperatur äquilibriert werden.
  5. Amplifizieren und reinigen Sie die Vorbibliothek wie unten beschrieben.
    1. Bereiten Sie die Vormischung des Reaktionssystems vor, indem Sie 10 μl PCR-Puffer, 10 μl PCR-Primer, 1,5 μl dNTP-Mix und 1 μl PCR-Enzym hinzufügen. 3x-5x vorsichtig manuell klopfen und 1-3 s zentrifugieren.
    2. 22,5 μl Vormischung zu 27,5 μl des gereinigten Produkts aus dem vorherigen Schritt hinzufügen, vorsichtig mischen und dann 1-3 s zentrifugieren.
    3. Wählen Sie das Programm PRE: 98 °C 45 s; (98 °C 15 s, 60 °C 30 s, 72 °C 30 s) 12 Zyklen; 72 °C 2 min; 4 °C halten; Deckel 105 °C.
    4. Führen Sie nach Abschluss des PCR-Programms eine magnetische Bead-Reinigung mit frisch zubereitetem 75%igem Ethanol durch. Eluieren Sie das Produkt mit 18 μl EB.
  6. Erfassen Sie Hybride wie unten beschrieben.
    1. Bereiten Sie Reaktionssystem A vor, indem Sie 15 μl Vorbibliothek und 4 μl Blockermischung hinzufügen.
    2. Auf PCR legen und PCR-Programm HYB ausführen (95 °C für 5 min; 65 °C Hold; Deckel 105 °C).
    3. Bereiten Sie den HYB-Mix des Reaktionssystems B vor, indem Sie 10 μl Hybridisierungspuffer, 0,5 μl RNase-Inhibitorblocker und 1 μl Sonde hinzufügen. 3x-5x vorsichtig schnippen und 1-3 s zentrifugieren.
      HINWEIS: Der Sondenname lautet LCOO1, und die Sondengene umfassen EGFR, KRAS, BRAF, ALK usw.
    4. Wenn die Temperatur des PCR-Instruments auf 65 °C sinkt, geben Sie 11,5 μl HYB-Mischung in Reaktionssystem A, mischen Sie vorsichtig, decken Sie dann den Deckel des PCR-Instruments ab und setzen Sie die Inkubation für 16-24 Stunden fort.
    5. Inkubieren Sie den Waschpuffer 2 in einem konischen 15-ml-Röhrchen mit einem Metallheizer bei 65 °C bei einer Dosierung von 600 μl pro Probe.
    6. SCB-Magnetkügelchen entnehmen, 5x invertieren und mischen, 10 s lang wirbeln und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur äquilibrieren. 10 s lang vortexen, 25 μl in ein 1,5 mL Zentrifugenröhrchen mit geringer Adsorption überführen, 3 min auf ein Magnetgestell stellen und den Überstand entsorgen.
    7. Geben Sie 200 μl Beads Wash Buffer zu den 25 μl SCB-Magnetkügelchen, wirbeln Sie es vor und mischen Sie es 3 s lang, zentrifugieren Sie es kurz für 1-3 s, lassen Sie es 3 Minuten auf dem Magnetgestell stehen und entsorgen Sie den Überstand.
    8. Wiederholen Sie Schritt 2.6.7 2x für insgesamt drei Mal.
    9. 200 μl beads wash buffer zu den magnetischen beads geben, vortexen und 3 s mixen, für die spätere Verwendung resuspendieren.
    10. Etwa 30 μl der Hybridprobe in resuspendierte SCB-Magnetbeads überführen, vortexen und mischen, auf einen rotierenden Mischer legen, 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und 1-3 s zentrifugieren.
    11. Stellen Sie das Mischröhrchen für 3 Minuten auf ein Magnetgestell und aspirieren Sie dann ca. 230 μl Überstand. 500 μl Waschpuffer 1 zugeben, 5 s wirbeln, auf einen Rotationsmixer geben und 15 min bei Raumtemperatur inkubieren. Durchlaufzentrifuge für 1-3 s.
    12. Legen Sie das Magnetbead-Probenmischröhrchen auf ein Magnetgestell und lassen Sie es 3 Minuten stehen. Anschließend werden ca. 500 μl Überstand und Restflüssigkeit abgesaugt.
    13. 150 μl Waschpuffer 2 auf 65 °C vorheizen, 10 s vortexen, auf einen Mixer mit konstanter Temperatur stellen, schütteln und 10 min bei 65 °C bei einer Geschwindigkeit von 600 U/min inkubieren. Führen Sie eine sofortige Zentrifugation für 1-3 s durch, legen Sie sie für 3 Minuten auf ein Magnetgestell und saugen Sie ca. 150 μl Überstand und Restflüssigkeit an.
    14. Wiederholen Sie Schritt 2.6.13 3x, insgesamt viermal.
    15. Zentrifugieren Sie sofort 1-3 s lang, um jegliche Restflüssigkeit aus dem Probenröhrchen zu entfernen. 20 μl EB hinzufügen, 8x-10x auf- und runtermischen, gut mischen und für die spätere Verwendung auf Eis legen.
  7. Vorbereitung und Reinigung der endgültigen Bibliothek.
    1. Bereiten Sie den POST-Mix des Reaktionssystems vor, indem Sie 25 μl Amplifikationsmix, 5 μl Index und 20 μl magnetische Bead-Bibliothek hinzufügen. 3x-5x vorsichtig klopfen und 1-3 s zentrifugieren. Vorsichtig mischen, 1-3 s zentrifugieren.
    2. Programm wählen POST: 98 °C 45 s; (98 °C 15 s, 60 °C 30 s, 72 °C 30 s) 12 Zyklen; 72 °C 10 min; 4 °C halten; Deckel 105 °C.
    3. Führen Sie nach Abschluss des PCR-Programms eine magnetische Bead-Reinigung mit frisch zubereitetem 75%igem Ethanol durch. Eluieren Sie die endgültige Bibliothek mit 20 μL EB.

3. Vollautomatische Bibliotheksvorbereitung (Tabelle 5)

  1. Drücken Sie die Ein- / Aus-Taste , um das System zu aktivieren, und warten Sie auf die Initialisierung. Navigieren Sie zu Programmeinstellungen, wählen Sie Protokoll ausführen und dann Protokoll: Burning Rock HS aus.
  2. Legen Sie die aliquoten QC-Parameter als Probentyp fest: DNA von hoher Qualität; Eingabemenge (ng): 50; Prä-PCR-Zyklen: 12; Post-PCR-Zyklen: 12. Klicken Sie auf AUSFÜHREN.
  3. Setzen Sie die vorverpackte Reagenzkassette in den dafür vorgesehenen Steckplatz ein (validiert automatisch die Platzierung und den Status des Reagenzes).
  4. Drücken Sie nach dem Laden der Proben auf Start , um das System autonom laufen zu lassen. Beobachten Sie die LED-Anzeigen, um den Fortschritt zu überwachen.
  5. Nachdem das Programm beendet ist, klicken Sie auf OK und das Programm überträgt die endgültige Bibliothek automatisch in die Bibliotheksröhre und schließt die Bibliotheksvorbereitung ab.

4. Sequenzierung und QC

  1. Führen Sie die Quantifizierung der Bibliothek und die Qualitätskontrolle wie unten beschrieben durch.
    1. Messen Sie die Konzentration in der Vorbibliothek und in der Gesamtbibliothek mit Hilfe der Fluorometrie.
    2. Ermitteln Sie die Fragmentgröße der Bibliothek. Verwenden Sie ein Kit, um die Fragmentgröße der Bibliothek und das Vorhandensein von Adaptern zu bewerten (Materialtabelle).
      HINWEIS: Wenn die endgültige Bibliothek Primer-Dimere enthält, muss ein zusätzlicher Aufreinigungsschritt hinzugefügt werden, bevor die Proben auf der Maschine gemischt werden. Der qualifizierte Standard für das Einfügen von Fragmenten liegt bei ≥ 150 bp, und die erwartete Abscheideeffizienz liegt bei ≥ 40 %.
    3. Verdünnen Sie die Sequenzierbibliothek auf 1,6 pM und 1300 μl für Sequenzierungsvorgänge.
  2. Führen Sie die Überwachung der Sequenzierungsumgebung wie unten beschrieben durch.
    1. Kontrollieren Sie die Sequenzierungsumgebung, einschließlich der Innentemperatur (19-25 °C) und der Luftfeuchtigkeit in Innenräumen (20 %-80 %).
    2. Vollständige QC der Geräteausgabedaten, einschließlich Basis über Q30 und Cluster-Dichtepassfilter (PF).

5. Sequenzierung, Datenanalyse und QC

  1. Führen Sie die Rohdatenverarbeitung und die molekulare Profilerstellung wie unten beschrieben durch.
    1. Verwenden Sie Burrows-Wheeler Aligner (Version 0.7.10), um Sequenzierungsdaten an hg19 auszurichten.
    2. Führen Sie lokale Ausrichtung, Optimierung, Duplikatmarkierung und Variantenaufrufe mit dem Genome Analysis Tool Kit (Version 3.2) und Vardict (Version 1.5.1) durch.
    3. Filtern Sie Varianten mit der fpfilter-Pipeline von VarScan (Version 2.4.3) und entfernen Sie Loci mit Tiefen unter 50. Klassifizieren und schließen Sie Varianten mit einer Populationshäufigkeit von mehr als 0,1 % in den Datenbanken ExAC, 1000 Genomes, dbSNP oder ESP6500SI-V2 als Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) aus.
    4. Annotieren Sie die restlichen Varianten mit SnpEff (Version 3.6).
    5. Analysieren Sie strukturelle Varianten (SVs), einschließlich großer genomischer Rearrangements (LGRs), mit MarkSV (Burning Rock Algorithm Tool). Analysieren Sie Kopienzahlvarianten (CNVs) basierend auf der Abdeckungstiefe von Erfassungsintervallen.
    6. Korrekte Abdeckungsdaten für Sequenzierungsverzerrungen, die sich aus dem Guanin-Cytosin-Gehalt und dem Sondendesign ergeben.
  2. Bewerten Sie die Probenqualität, einschließlich der mittleren Tiefe, der Mediantiefe, der eindeutigen Tiefe, der Einsatzgröße, der Lib-Komplexität, der Abdeckung, des Q30-Verhältnisses und des Korrelationsverhältnisses der gepaarten Stichprobe, wie in25 beschrieben.
  3. Überprüfen Sie für die Berichterstellung die Pipeline-Version und die Parameter, um die bioinformatische Überprüfung abzuschließen. Verwenden Sie relevante Richtlinien zur Bewertung der Pathogenität von Mutationen 26,27. Erstellung des Abschlussberichts.

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Ergebnisse

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Unter Verwendung eines automatisierten NGS-Analyse-Workflows mit strengen Qualitätskontrollen führte das Labor ein umfassendes genomisches Profiling von NSCLC-Proben durch. Der optimierte Detektionsablauf (Abbildung 2) identifizierte zuverlässig mehrere klinisch verwertbare genomische Veränderungen in repräsentativen Tumorproben (Abbildung 3).

Die Sequenzierungsergebnisse zeigten eine hochfrequente

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Diskussion

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Jedem qualifizierten NGS-Bericht liegt ein strenger Prozess zugrunde, der nach wie vor komplex und zeitaufwändig ist28. Um diese Probleme zu lösen, hat das Labor ein vollautomatisches NGS-System entwickelt. Dieser Vorgang reduziert manuelle Eingriffe erheblich, minimiert experimentelle Fehler und verkürzt die Durchlaufzeit erheblich. Daher hat dieses System eine zuverlässigere und effizientere Strategie für NGS bereitgestellt und ein neues Denken an die Datenquali...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

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Diese Studie wurde durch Zuschüsse der Beijing Natural Science Foundation der Volksrepublik China (7252122), der Beijing Xisike Clinical Oncology Research Foundation der Volksrepublik China (Y-HS202402-0021), des Residency Training Teaching Research Fund des Cancer Hospital, der Chinese Academy of Medical Sciences und des Peking Union Medical College (E2025004) sowie der National High Level Hospital Clinical Research Funding (2025-LYZX-R-B03) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
  Agilent  DNA-Kit mit hoher Empfindlichkeit  Agilent5067-4626Zur Verwendung mit the  Agilent 2100 Bioanalysator-System
  Agilent DNA 1000 Reagenzien-Kit  Agilent5067-1504Zur Verwendung mit the  Agilent 2100 Bioanalysator-System
Agilent 2100 BioanalyzerAgilentG2939ABewerten Sie die Fragmentgröße der Bibliothek und das Vorhandensein von Adaptern. 
Concert Vollautomatisches Nukleinsäure-ReinigungsinstrumentKONZERTMC1002Verwendet zur DNA-Extraktion
Gleich 1& mal; dsDNA HS Assay KitVazymeEQ121-02-AAZur Verwendung mit the  Qubit 3.0 Fluorometer
Kombiniertes Gen-Mutations-Kit für menschliche EGRR/KRAS/BRAF/ALK-GenmutationenBrennender FelsBR-LC00102Bibliotheksbau
Magnis BRAgilent TechnologienG7595AAAutomatisierte NGS-Bibliotheksvorbereitung
ME220 Fokussiert-UltraschallgeräterCovaris500396Ultraschalluntersuchung
NanoDrop One/OneCThermo FisherND-ONE-WVollwellenlänge UV-sichtbare spektrophotometrische Erkennung
NextSeq 550DxIllumina20005715Reihenfolge
NSQ 500/550 Hi Output KT v2.5 (300CYS)Illumina20024908Zur Verwendung mit dem NextSeq 550Dx
NukleinsäureextraktionsreagenzKONZERTRC1102Verwendet zur DNA-Extraktion
Qubit 3.0 FluorometerLebenQ33216Verwendet zur Detektion von Nukleinsäure- oder Bibliothekskonzentrationen
Qubit dsDNA HS Assay KitLebenQ32851Zur Verwendung mit the  Qubit 3.0 Fluorometer

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Feng, R. M., Zong, Y. N., Cao, S. M., Xu, R. H. Current cancer situation in China: Good or bad news from the 2018 global cancer statistics. Cancer Commun (Lond). 39 (1), 22(2019).
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