Integriertes PCR-basiertes molekulares Detektionssystem zum gleichzeitigen Nachweis von vier zoonotischen Darmparasiten aus mehreren Quellen

Summary

Hier stellen wir ein Protokoll zum gleichzeitigen Nachweis von vier zoonotischen Darmparasiten aus mehreren Quellen vor, das auf einer Kombination aus Polymerase-Kettenreaktion (PCR) basiert, einem integrierten molekularen Nachweissystem.

Abstract

Infektionskrankheiten sind kritische Faktoren, die sich auf die menschliche Gesundheit, die wirtschaftliche Entwicklung und die soziale Stabilität auswirken. Unter ihnen sind zoonotische parasitäre Darmerkrankungen zunehmend in den Fokus der globalen Besorgnis gerückt, da neu auftretende Infektionskrankheiten, insbesondere Cryptosporidium, Enterocytozoon bieneusi, Blastocystis und Giardia. Es wurden nur wenige Studien zur Epidemiologie der oben genannten Parasiten veröffentlicht, begleitet von Themen wie einzelnen Nachweiszielen, niedrigen Nachweisraten und hohen fehlenden Nachweisraten. Ziel dieser Studie ist es, ein integriertes molekulares Nachweissystem zu etablieren, das auf einer Kombination von PCR-Tests zum gleichzeitigen Nachweis der oben genannten vier zoonotischen Darmparasiten in Proben von wilden Mäusen, Haustieren und Nutztieren (Rinder und Schafe) basiert, um eine effiziente technische Unterstützung für den routinemäßigen Parasitennachweis in mehreren Szenarien zu bieten, einschließlich Tier-Umwelt-Schnittstellen insbesondere in lokalen Überwachungseinrichtungen.

In dieser Studie, bei der der Nachweis von Enterocytozoon bieneusi im Kot von 95 Wildmäusen und 30 Katzen und Hunden (25 von Katzen und 5 von Hunden) als primärer Test verwendet wurde, waren die positiven Ergebnisse jeder PCR genau gleich (5,26%), aber die Kombination von 2 Sätzen Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Tests führte zu einer höheren Positivrate (6,32%) für Enterocytozoon bieneusi. Für Giardia wurden 9 positive Proben mit dem Beta-Giardin (BG)-Gen nachgewiesen, während keine positiven Proben mit den Genen Glutamatdehydrogenase (GDH) und Triosephosphat-Isomerase (TPI) nachgewiesen wurden. Die oben genannten Ergebnisse zeigten, dass eine Kombination von PCR-Tests für mehrere genetische Zielsegmente die Nachweiskapazität für bestimmte Krankheitserreger im Vergleich zu jedem einzelnen PCR-Test erhöhte. Die Zielsequenzen wurden durch Sanger-Sequenzierung bestätigt. Dieses System wurde entwickelt, um die Überwachung des Infektionsstatus, der Verteilung und der phylogenetischen Evolution von zoonotischen Darmparasiten aus verschiedenen Quellen zu verbessern und zu erleichtern und eine Grundlage für genaue und empfindliche Warnungen in einem frühen Stadium zu schaffen. Ziel ist es, eine technische Brücke zur Erreichung des One Health-Ziels über die Schnittstellen Mensch-Tier-Umwelt hinweg zu bauen.

Introduction

Die Cryptosporidium, Enterocytozoon bieneusi, Blastocystis und Giardia sind häufige und leicht zu vernachlässigende Protozoen-Erreger mit weltweiter Prävalenz. In den letzten Jahren ist aufgrund von Faktoren wie der Rückgewinnung und dem Eindringen in die ökologischen Nischen natürlicher Herde, der Popularität der Heimtierzucht und der Entwicklung der Nutztier- und Geflügelzucht die Prävalenz von zoonotischen Darmparasitenkrankheiten aus mehreren Quellen bei Nagetieren, Haustieren (Katzen und Hunden) und Nutztieren (Rinder und Schafe) zunehmend in den Mittelpunkt des Entstehens gerückt. Ausbruch un....

Protocol

Die Studie wurde von der Tierethikkommission des Jiangsu Provincial Center for Disease Control and Prevention genehmigt und durchgeführt. Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit der Ausgabe 2020 der American Veterinary Medical Association Guidelines on Animal Euthanasia, den Leitprinzipien der Vorschriften über die Verabreichung von Versuchstieren (Verordnung Nr. 2 der Staatlichen Wissenschafts- und Technologiekommission der Volksrepublik China, 1988) und den Leitprinzipien für die humane Behandlung von Tieren, die vom Ministerium für Wissenschaft und Technologie der Volksrepublik China herausgegeben wurden, durchgeführt.

Results

PCR-Testergebnisse für Mäuse Cryptosporidium, Blastocystis SSU rRNA-Gen, Enterocytozoon bieneusi ITS-Gen und Giardia BG-Gen
Alle 95 rektalen Stuhlproben von Mäusen wurden mit zwei Primersätzen auf das ITS-Gen von Enterocytozoon bieneusi getestet, was zu 5 positiven Proben für jede Methode führte, was zu insgesamt 6 positive.......

Discussion

Cryptosporidium, Enterocytozoon bieneusi, Blastocystis und Giardia sind häufige zoonotische Darmparasiten; Die ersten beiden werden von den US-amerikanischen National Institutes of Health (NIH) als biologische Krankheitserreger der Kategorie B eingestuft, und alle vier werden von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) als 24 der wichtigsten durch Lebensmittel übertragenen Parasiten weltweit aufgeführt. Sie können potenziell Menschen und Tiere infizieren.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Qingke Tech	TSJ001
Qiaquick Gel-Extraktionsset	Qiagen	28704	DNA-Gel-Extraktionsset
100 bp Plus DNA-Leiter	TransGen  Biotech	BM311	DNA-Leiter
4S Green Plus Nukleinsäure-Färbung	BBI	A616696-0500	DNA-Färbung
10&Times; TBE-Puffer	Solarbio	T1051	Elektrophoreisispuffer
Qubit 4.0	Thermo	https://www.thermofisher.com/in/en/home /industrielle/spektroskopie-elementar -Isotopenanalyse/molekulare Spektroskopie/ fluorometers/qubit/models/qubit-4.html? ef_id=:G:s& s_kwcid=AL!3652!10!77515 785702067!!!! 77516061528018!! 380468 453!1240249321530142& cid=bid_pca_ aqb_r01_co_cp1359_pjt0000_bid 00000_0se_bng_bt_pur_con	Fluoreszenzquantitatives Instrument
MINI Space 1000	Tanon	http://en.biotanon.com/PRODUCT/ PRODUCTLIST?ID=3040& TYPE=DETAIL	Gel-Bildgeber
Fast DNA Stool Mini Kit zur DNA-Extraktion	QIAGEN	51604	Nukleinsäureextraktions-Set
ProFlex-Basis	Thermo	https://www.thermofisher.com/ in/en/home/life-science/pcr/ thermal-cyclers-realtime- instruments/thermal-cyclers /proflex-pcr-system.html	PCR
Dream Taq Green PCR Mix	Thermo	K1082	PCR-Amplifikation